단백질 정량

<STYLE>P{margin-top:2px;margin-bottom:2px;}</STYLE> <TABLE cellSpacing=0 cellPadding=0 width=591 border=0> <TBODY> <TR> <TD width=591 bgColor=#99ff99 height=7> <H2 style="MARGIN: 0pt 0% 0pt 0pt" align=center>Protein Assay by Bradford's Method</H2></TD></TR></TBODY></TABLE>   <DIV id=layer1 style="Z-INDEX: 1; LEFT: 613px; WIDTH: 134px; POSITION: absolute; TOP: 41px; HEIGHT: 215px" _fl_pos="1" _fl_pos_top="41" _fl_pos_left="613"> <TABLE cellSpacing=0 borderColorDark=white width=132 borderColorLight=black border=1> <TBODY> <TR> <TD width=122 bgColor=#5bb203 height=98>     <A href="http://www.elpisbio.com/html-sub/protocols/Protocols.htm" target=_parent>홈으로</A></TD></TR></TBODY></TABLE></DIV> <DL> <TABLE borderColor=gray cellSpacing=0 borderColorDark=white width=593 borderColorLight=silver border=1> <TBODY> <TR> <TD width=583> <DL> <DT>Reagents <TABLE cellSpacing=0 borderColorDark=white width=591 borderColorLight=black border=1> <TBODY> <TR> <TD width=250 bgColor=#ebfaeb height=67> Bradford Reagent (home made)</TD> <TD width=331 height=67> 0.1g brilliant Blue G-250         in 50ml Methanol (high purity) 100ml 85% phosphoric acid (H3PO4) 50ml DW 필터후 4C에 보관</TD></TR> <TR> <TD width=250 bgColor=#ebfaeb height=15> BSA (bovine serum albumin)</TD> <TD width=331 height=15> 10mg/ml in DW</TD></TR></TBODY></TABLE> <DT style="MARGIN-LEFT: 64px; TEXT-INDENT: -64px; MARGIN-RIGHT: 160px"> <DT style="MARGIN: 0px 160px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%"> <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">1. Bradford reagent를 1:5의 비율로 증류수에 희석한다 (working solution). <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">    (10ml 용액을 만드는 경우 2ml Bradford reagent와 8ml 증류수를 섞어준다) <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%"> <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">2. BSA standard를 준비한다 (1mg, 2mg, 4mg, 6mg, 8mg, 10mg, 12mg, 14mg, 16mg,18mg, 20mg) <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%"> <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">3. 1ml Bradford reagent working solution에 BSA standard를 넣어주고 5분간 상온에 방치한 후 spectrophotometer를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정한다. <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%"> <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">4. 최신 spectrophotometer는 자체적으로 regression curve를 그려주고 샘플의 단백질량을 찾아주는 프로그램이 내장되어 있으나 옛버젼인 경우에는 계산기를 이용하여 linear regression curve에서 기울기와 y절편을 직접 계산해야한다. <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%"> <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">5. 시료단백질을 같은 방법으로 처리하여 step4에서 얻은 standard curve로부터 단백질량을 도출한다. <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%"> <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">주의 : Bradford 방법은 다른 단백질 정량법에 비해 민감도가 우수하나 단백질간의 차이가 많기 때문에 정제된 단백질의 절대량을 구하기는 어려운 방법이다.그러나 단순히 전기영동을 위한 목적이라면 아주 간편하고 우수한 방법이다. <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">     Bradford reagent를 10배 희석하여 100ml 용액을 사용하면 100ng까지 정량이 가능하다. <DT style="MARGIN: 0px 2px 0px 20px; TEXT-INDENT: -20px; LINE-HEIGHT: 100%">     High pure reagent를 사용하지 않는한 home made reagent는 시약회사로부터 구입한 reagent보다 다소 성능이 떨어지나 큰 지장은 없다. </DT></DL></TD></TR></TBODY></TABLE></DL>