Re: 귀한 녹용을 전처리(특히 효소)해서 100도, 24시간 끓일때 가장 효과적 2020

[문형철]

J Microbiol Biotechnol

. 2020 May 8;30(8):1116–1123. doi: 10.4014/jmb.2004.04009

Optimization and Pretreatment for Hot Water Extraction of Korean Deer (Cervus canadensis Erxleben) Velvet Antlers

Dong Wook Jang 1,†, Kashif Ameer 2,3,†, Jun-Hyun Oh 4, Mi-Kyung Park 1,5,*

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PMCID: PMC9728161  PMID: 32423187

Abstract

Velvet antler (VA) is a historically traditional medicinal supplement and is well known in Asian countries for its pharmaceutical and health benefits. The objectives for this study were to optimize the hot water extraction (HWE) of VA for the Korean VA industry, and to determine the most effective pretreatment method among microwave (MW), ultrasonication (US), and enzymatic (EZ) techniques. Using response surface methodology, optimum extraction temperatures and times were determined by central composite design configuration based on extraction yield and sialic acid content. Various quality parameters of VA extract including yield, soluble solid, protein, and sialic acid contents were also compared with the conjunction of HWE and pretreatment. The yield and sialic acid content of VA extract were determined to be 40% and 0.73 mg/g, respectively, under an optimum temperature of 100°C at 24 h of extraction time. The yields from VA extracts pretreated with MW, US, and EZ were 17.42%, 19.73%, and 29.15%, respectively. Among the tested commercial enzymes, pepsin was the most effective proteolytic enzyme and led to the highest yield (47.65%), soluble solids (4.03 ˚brix), protein (1.12 mg/ml), and sialic acid (3.04 mg/ml) contents from VA extract.

녹용(VA)은 역사적으로 전통적인 의약품 보조제이며,

아시아 국가에서 약리학적 및 건강상의 이점으로 널리 알려져 있습니다.

본 연구의 목적은

한국 VA 산업을 위해 VA의 열수 추출(HWE)을 최적화하고,

마이크로웨이브(MW),

초음파(US),

효소(EZ) 기술 중 가장 효과적인 전처리 방법을 결정하는 것입니다.

응답 표면 분석법을 사용하여 추출 수율과 시알산 함량을 기반으로

중앙 복합 설계 구성에 따라 최적의 추출 온도와 시간을 결정했습니다.

HWE와 전처리 방법을 결합하여

VA 추출물의 다양한 품질 파라미터(수율, 용해성 고체, 단백질, 시알산 함량)를 비교했습니다.

최적 온도 100°C 및 추출 시간 24시간 조건에서

VA 추출물의 수율과 시알산 함량은

각각 40%와 0.73 mg/g로 확인되었습니다.

MW, US, EZ로 전처리된 VA 추출물의 수율은

각각 17.42%, 19.73%, 29.15%로 나타났습니다.

시험된 상업용 효소 중 페프신은 가장 효과적인 단백질 분해 효소로,

VA 추출물에서 가장 높은 수율(47.65%),

용해성 고형물(4.03 ˚brix), 단백질(1.12 mg/ml), 시알산(3.04 mg/ml) 함량을 나타냈습니다.

Keywords: Velvet antler, response surface methodology, Cervus canadensis Erxleben, sialic acid

Introduction

Recently, health awareness has escalated worldwide, which has resulted in an increasing demand of natural healthful products [1]. In this regard, published literature offers many notable examples of natural products (e.g., Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, and Panax ginseng), all of which have been exploited in Chinese pharmacopeia (traditional Chinese medicine: TCM) and through development of patents for the medicinal sector [2, 3]. The active compounds found in these plants exhibit pharmacological benefits for blood circulatory, cardiovascular, nervous, endocrine, and immune systems [4]. Moreover, phytochemicals are considered to be value-added chemical compounds in terms of development of medicinal foods, supplements, and nutraceutical products [3]. When compared with phytochemicals, however, there are few published reports concerning functional foods or medicinal compounds of animal origins [2]. Moreover, animal sources also provide a wide range of bioactive compounds such as fatty acids, peptides, prostaglandins, glycosaminoglycans, proteins, minerals, dietary fiber, vitamins, carotenoids, and essential oils [5]. All these important bioactive components can be used to treat various lifestyle and metabolic disorders [6].

Among TCM treatments, deer velvet antler (VA) has been exploited for medicinal purpose for more than 2,000 years and possesses various pharmacological benefits, such as improvement of the physical strength, sexual function, and immunity [2, 7]. VA has a cartilaginous composition and is usually found in members of Cervidae family, which includes elk, deer, moose, and caribou [7]. The global supply of antlers usually comes from the red deer (Cervus elaphus), sika deer (C. nippon), elk (C. canadensis), or wapiti (Elaphurus davidianus). Historically, antlers have been employed in TCM under the Chinese name of Pinyin Lu Rong to provide various health benefits, such as blood nourishment, virility promotion, bones strengthening, and enhancement of sexual fertility in both males and females [8]. For many years, antlers from elk or wapiti have been described as medicinal antlers in pharmacopeias of China, Korea, and Japan [9]. According to an estimate, the global production of VA is approximately 1,300 tons/year and demand is increasing every day in order to meet the requirements of the medicinal sector. Therefore, researchers from around the globe are keen to investigate new bioactive VA compounds [10]. Among the bioactive compounds present in VA, sialic acid has been considered to be a biomarker compound in the Korean VA industry.

Recently, many improved extraction methods have been developed to efficiently extract bioactive components and researchers are interested in optimizing the extraction process with reduced resource consumption and maximum recovery of active principles from natural products. Response surface methodology (RSM) is a sophisticated mathematical technique used for analyzing processes and product optimization, and can be applied to complex relationships between independent and response variables [1, 11]. Previous research has employed this technique for the physical characterization and preformulation of Indonesian deer VA [12], and extraction of skin rejuvenation compounds like proteins and insulin-like growth factor-1 through probe sonication, precipitation, and conventional ethanol extraction [13].

The objectives of this study were to optimize hot water extraction (HWE) conditions for VA extract, which is significant to the VA industry, and to determine the most effective pre-treatments using microwave, ultrasonication, and commercial enzymes. The effects of independent variables, such as extraction temperatures and extraction time, were eval‎uated according to a central composite design configuration for total yield and sialic acid content. Furthermore, the most effective enzymatic pretreatment was determined based on analysis of several quality parameters for VA extract (e.g., yield, soluble solid, protein and sialic acid contents).

서론

최근 전 세계적으로 건강에 대한 인식이 높아지면서

자연 건강 제품에 대한 수요가 증가하고 있습니다 [1].

이와 관련하여, 출판된 문헌은

자연 제품(예: Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, 및 Panax ginseng)의

많은 주목할 만한 예를 제시하며,

이들 모두는 중국 약전(전통 중국 의학: TCM)에서 활용되었으며

의약품 분야를 위한 특허 개발을 통해 활용되었습니다[2, 3].

이러한 식물에서 발견된 활성 성분은

혈액 순환, 심혈관, 신경, 내분비, 면역 시스템에 대한

약리학적 효과를 나타냅니다 [4].

또한,

식물 화학 성분은

의약품, 보충제, 기능성 식품 개발 측면에서 부가가치 화학 성분으로 간주됩니다 [3].

그러나

식물 화학 성분과 비교할 때,

동물 기원 기능성 식품이나 의약품 성분에 대한 발표된 보고서는 매우 적습니다 [2].

또한 동물성 원천은

지방산, 펩타이드, 프로스타글란딘, 글리코사미노글리칸, 단백질, 미네랄, 식이 섬유, 비타민, 카로티노이드, 필수 오일 등

다양한 생물활성 화합물을 제공합니다 [5].

이러한 중요한 생물활성 성분은

다양한 생활습관 및 대사 장애 치료에 활용될 수 있습니다 [6].

한방 치료법 중 사슴 뿔(VA)은

2,000년 이상 의약 목적으로 활용되어 왔으며,

신체적 강도, 성기능, 면역력 개선 등

다양한 약리학적 효과를 가지고 있습니다[2, 7].

VA는 연골성 구성물을 가지고 있으며,

엘크, 사슴, 무스, 카리부 등을 포함하는 Cervidae 과의 동물에서 주로 발견됩니다[7].

전 세계적인 뿔 공급은

주로 적사슴(Cervus elaphus), 시카 사슴(C. nippon), 엘크(C. canadensis),

또는 와피티(Elaphurus davidianus)에서 유래합니다.

역사적으로 뿔은 중국어 이름인 Pinyin Lu Rong으로

전통 중국 의학(TCM)에서

혈액 보양, 정력 증진, 뼈 강화, 남녀의 성 기능 향상 등

다양한 건강 혜택을 제공하기 위해 사용되었습니다 [8].

수십 년 동안 엘크나 와피티의 뿔은

중국, 한국, 일본의 약전(pharmacopeias)에서

약용 뿔로 기록되어 왔습니다 [9].

추산에 따르면 전 세계 VA 생산량은 약 1,300톤/년이며,

의약 분야 수요가 매일 증가함에 따라

연구자들은 새로운 생물활성 VA 화합물을 탐구하는 데 열의를 보이고 있습니다[10].

VA에 존재하는 생물활성 화합물 중 시알산은

한국 VA 산업에서 생물표지 화합물로 간주되어 왔습니다.

시알산은 주로 글리코프로틴과 글리콜리피드의 말단 부위에 존재하며 세포 간 통신과 기능에 중요한 역할을 합니다. 시알화(sialylation)는 포스트트랜스레이셔널 변형의 한 형태로, 시알산이 올리고사카라이드와 글리코프로틴의 말단 잔기에게 공액 결합을 통해 부착되는 과정을 말합니다. 이 변형은 세포에 정전기적 반발력을 제공하는 동시에 다양한 생물학적 신호 전달 경로의 수용체 역할을 합니다. 시알릴화는 여러 병리생리학적 과정에 관여합니다. 세포 기능에 다각도로 관여하는 특성 때문에 시알릴화는 치료적 개입의 유망한 분야로 부상하고 있습니다. 현재 연구는 시알글리칸의 시알산 잔기나 시알릴화 과정 자체를 표적으로 하는 약물을 탐색하고 있습니다. 이러한 노력은 특히 암 치료, 뇌졸중 치료, 항바이러스 전략, 중추 신경계 장애 치료 분야에 집중되고 있습니다. 본 리뷰에서는 시알산의 생물학적 기능과 시알화 과정을 요약하고, 다양한 병리생리학적 맥락에서의 역할을 탐구하며, 새로운 치료제 개발에 대한 잠재적 응용 가능성을 논의했습니다.

최근에는 생물활성 성분을 효율적으로 추출하기 위해 개선된 추출 방법이 개발되었으며,

연구자들은 자원 소비를 줄이고

천연 제품에서 활성 성분의 최대 회수를 달성하기 위해

추출 과정을 최적화하는 데 관심을 보이고 있습니다.

응답 표면 방법론(RSM)은 과정 분석과 제품 최적화에 사용되는 고급 수학적 기술로,

독립 변수와 응답 변수 간의 복잡한 관계를 분석하는 데 적용될 수 있습니다 [1, 11].

이전 연구에서는 이 기술을

인도네시아 사슴 VA의 물리적 특성 분석 및 사전 제형화에 적용했으며 [12],

프로브 초음파,

침전,

전통적인 에탄올 추출을 통해 피부 재생 성분인 단백질과 인슐린 유사 성장 인자-1을 추출하는 데

활용되었습니다 [13].

본 연구의 목적은

VA 산업에 중요한 VA 추출물의 열수 추출(HWE) 조건을 최적화하고,

마이크로웨이브, 초음파,

상업용 효소를 이용한 가장 효과적인 전처리를 결정하는 것입니다.

추출 온도와 추출 시간과 같은 독립 변수의 영향을

중앙 복합 설계 구성에 따라 총 수율과 시알산 함량에 대해 평가했습니다.

또한,

VA 추출물의 여러 품질 파라미터(예: 수율, 용해성 고체, 단백질 및 시알산 함량) 분석을 기반으로

가장 효과적인 효소 전처리를 결정했습니다.

Materials and MethodsHot Water Extraction of Velvet Antler

Sliced velvet antler (Cervus canadensis Erxleben) cultivated in a local Korean farm was provided by the Deer Cluster (Republic of Korea). Equal amounts (approximately 1,000 g) of sliced VA samples taken from the top, middle, and bottom sections of the antler were ground into a fine powder (passed through a 160-180 mesh sieve) using a grinder. The powdered VA mixture (5.625 g) was placed in a reflux extractor containing 1 L of distilled water (DW) for extraction at specified temperatures (80, 85, 90, 95, and 100°C) and time intervals (12, 18, 24, 30, and 36 h) in a reflux extractor for hot water extraction (HWE). After extraction, the extracts were filtered through a piece of filter paper and centrifuged at 4,032 ×g for 30 min. The supernatant of the velvet antler extracts from 1,000 g of sliced VA was concentrated using a rotary evaporator (N-2110, Sunileyela Co., Korea), freeze-dried, and stored at -20°C prior to experimentation [14].

Experimental Design

Optimum extraction conditions of HWE were determined by performing experiments in accordance with a central composite design (CCD) based configuration of RSM. These independent variables were expressed at five levels (-2, -1, 0, 1, and 2) as presented in Table 1. The independent variables were extraction temperatures (80, 85, 90, 95, and 100°C) and time intervals (12, 18, 24, 30, and 36 h). The dependent variables were expressed as extraction yield (%) and sialic acid content (mg/g) [15]. All the experimental runs were performed under CCD configurations and the results were used for multiple linear regression (MLR) analysis. Experimental data was analyzed to obtain the regression equation as indicated below:

재료 및 방법: 온수 추출을 통한 사슴 뿔 추출물

국내 농장에서 재배된 사슴 뿔(Cervus canadensis Erxleben)의 슬라이스된 뿔은

한국 사슴 클러스터(대한민국)에서 제공되었습니다.

뿔의 상부, 중간, 하부 부분에서 채취한 슬라이스된 뿔 샘플(약 1,000g)을

분쇄기(160-180 메쉬 체를 통과)를 사용하여

미세한 분말로 분쇄했습니다.

분말화된 VA 혼합물(5.625g)을 증류수(DW) 1L를 담은 회류 추출기에 넣고

지정된 온도(80, 85, 90, 95, 및 100°C) 및 시간 간격(12, 18, 24, 30, 및 36시간) 동안

열수 추출(HWE)을 진행했습니다.

추출 후 추출액은

필터 종이를 통해 필터링한 후 4,032 ×g에서

30분 동안 원심분리했습니다.

1,000g의 슬라이스된 VA에서 추출된 사슴 뿔 추출물의 상층액은

회전 증발기(N-2110, Sunileyela Co., Korea)를 사용하여

농축한 후 동결 건조하고 실험 전 -20°C에서 보관했습니다 [14].

실험 설계

HWE의 최적 추출 조건은 RSM의 중앙 복합 설계(CCD) 기반 구성에 따라 실험을 수행하여 결정되었습니다. 이 독립 변수는 표 1에 제시된 대로 5개 수준(-2, -1, 0, 1, 2)으로 표현되었습니다. 독립 변수는 추출 온도(80, 85, 90, 95, 100°C)와 시간 간격(12, 18, 24, 30, 36시간)이었습니다. 종속 변수는 추출 수율(%)과 시알산 함량(mg/g)으로 표시되었습니다 [15]. 모든 실험은 CCD 구성에서 수행되었으며, 결과는 다중 선형 회귀 분석(MLR)에 사용되었습니다. 실험 데이터는 아래에 표시된 회귀 방정식을 얻기 위해 분석되었습니다:

Table 1.

Independent variables of the process and their corresponding levels.

Independent variableLevels-2-1012

X 1: Extraction temperature (°C)	80	85	90	95	100
X 2: Extraction time (h)	12	18	24	30	36

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Y = 𝛽0+𝛽1⁢𝑋1+𝛽2⁢𝑋2+𝛽12⁢𝑋1⁢𝑋2+𝛽11⁢𝑋12+𝛽22⁢𝑋22

In this equation, Y represents the target response and X1 and X2 denote the independent process variables. β0 shows the constant term and bn is the regression coefficient which includes the intercept, linear, quadratic, and cross product terms.

Measurement of Yield

The extracts from HWE, at experimental conditions specified by CCD, were put into round bottom flasks filled with 50 ml of DW. Then, the extracts were evaporated via rotary evaporation under vacuum followed by freeze- drying of the samples. The samples were further subjected to freeze-drying until a constant weight was attained in accordance with methods described in the Korean Food Standard Code [16]. The extraction yield was calculated by weighing the dried samples obtained after freeze-drying according to the equation below:

Extraction yield (%) =Freeze.dried extract weight (g)VA powder weight (g)×100

The differences in the weights of freeze-dried extract and total VA powder weight corresponded to the total extraction yield.

Measurement of Sialic Acid Content

Sialic acid content of the VA extract was determined by a thiobarbituric acid (TBA) assay and N-acetylneuraminic acid (Sigma-Aldrich Co., USA) was used as a standard [17]. An aliquot of 0.2 ml of VA extract (10 mg/ml) was mixed with 0.1 ml 0.2 M sodium periodate solution for 20 min at room temperature. Then, 1 ml of 10% sodium arsenite and 3.0 ml of 0.6% TBA solutions were added to the mixture and boiled for 15 min. Afterward, it was allowed to stand for 5 min to cool down. One ml of reaction mixture was added into 1 ml of cyclohexanone for centrifugation at 11,200 ×g for 3 min. The optical density of the supernatant, 549 nm, was measured using a spectrophotometer (UVmini 1240, Shimadzu Co., Japan).

Microwave, Ultrasound, and Enzyme Pretreatments Prior to Hot Water Extraction

The powered VA mixture (5.625 g) was added into 1 L DW and subjected to pretreatment through a microwave extractor (Soxwave 100, Prolab, France) at 180 W for 3 min for microwave treatment (MW), and subjected to sonication through an ultrasonicator at 320 W and 15 min for ultrasound treatment (US). For enzymatic treatment (EZ), powdered VA mixture (1.12 g) was added into 100 ml of 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 2.0) containing 10 mg of pepsin ( Promega co., USA) for incubation at 37°C for 8 h. The yield and sialic acid content were compared in order to determine the most effective pretreatment method. The commercial proteolytic enzymes used in this research were proteAX (Amano Enzyme Inc., Japan), protease A (Amano Enzyme Inc.), trypsin (Sigma-Aldrich Co.), papain (Sigma-Aldrich Co.), and pepsin (Amano Enzyme Inc.). The powdered VA mixture (1.12 g) was separately added into 100 ml of DW containing 10 mg of either proteAX or protease A for incubation at 60°C for 5 h. For the trypsin, papain, and pepsin treatments, equal amount (1.12 g) of the VA mixture were added into phosphate buffer (pH 8.0) containing 10 mg of each enzyme incubated at 37°C for 8 h. After incubation, the enzymes were inactivated via heating the mixture at 100°C for 10 min. The yield and sialic acid content of pretreated VA mixture were measured in order to determine the optimum enzymatic treatment [18, 19].

Characterization of VA Extract

The yields and sialic acid content of VA pretreated via HWE were determined, as previously described. Other quality properties such as soluble solid and protein contents were also determined. The soluble solid content was determined using a refractometer (N-1E, Atago Co., Japan) and expressed as °Brix. The protein contents were measured via BCA assay [20].

수율 측정

CCD에서 지정된 실험 조건 하에서 HWE에서 추출한 추출물을 50ml의 DW로 채운 원뿔형 플라스크에 넣었습니다. 이후 진공 회전 증발기를 사용하여 추출물을 증발시킨 후 시료를 동결 건조했습니다. 시료는 한국 식품 표준 규정 [16]에 기재된 방법에 따라 일정 무게가 달성될 때까지 추가로 동결 건조되었습니다. 추출 수율은 동결 건조 후 얻은 건조 시료를 아래 방정식에 따라 측정했습니다:

추출 수율 (%) =동결 건조 추출물 무게 (g)VA 분말 무게 (g)×100

동결 건조 추출물 무게와 총 VA 분말 무게의 차이는 총 추출 수율에 해당합니다.

시알산 함량 측정

VA 추출물의 시알산 함량은

티오바르비투르산 (TBA) 분석법을 사용하여 측정했으며,

표준물질로 N-아세틸뉴라민산 (Sigma-Aldrich Co., USA)을 사용했습니다 [17].

VA 추출물 0.2 ml (10 mg/ml)를 0.1 ml의 0.2 M 나트륨 페리오데이트 용액과

실온에서 20분간 혼합했습니다.

그 다음,

혼합물에 10% 나트륨 아세나이트 1 ml와 0.6% TBA 용액 3.0 ml를 추가하고

15분간 가열했습니다.

이후 5분 동안 식히도록

방치했습니다.

반응 혼합물 1ml를 사이클로헥산론 1ml에 넣고 11,200 ×g에서 3분 동안 원심분리했습니다.

상층액의 광학 밀도(549 nm)는 분광광도계(UVmini 1240, Shimadzu Co., Japan)로 측정했습니다.

열수 추출 전 마이크로웨이브, 초음파, 및 효소 전처리

분말화된 VA 혼합물(5.625 g)을

1 L의 DW에 넣고 마이크로웨이브 추출기(Soxwave 100, Prolab, 프랑스)에서

180 W로 3분 동안 가열하여

마이크로웨이브 처리(MW)를 수행한 후,

초음파 발생기에서 320 W로 15분 동안 초음파 처리(US)를 수행했습니다.

효소 처리(EZ)를 위해 분말 VA 혼합물(1.12 g)을

0.1 M 글리신-HCl 완충액(pH 2.0) 100 ml에 10 mg의 펩신(Promega Co., USA)을 첨가한 후

37°C에서 8시간 동안 배양했습니다.

수율과 시알산 함량을 비교하여

가장 효과적인 전처치 방법을 결정했습니다.

본 연구에서 사용된 상업용 단백질 분해 효소는

proteAX (Amano Enzyme Inc., 일본),

protease A (Amano Enzyme Inc.),

트립신 (Sigma-Aldrich Co.),

파파인 (Sigma-Aldrich Co.), 및 펩신 (Amano Enzyme Inc.)입니다.

분말 형태의 VA 혼합물 (1.12 g)은

각각 proteAX 또는 protease A 10 mg을 함유한 100 ml의 DW에 분리하여 첨가한 후

60°C에서 5시간 동안 배양했습니다.

트립신, 파파인, 및 펩신 처리의 경우,

VA 혼합물 1.12 g을 각 효소 10 mg을 함유한 인산 완충액(pH 8.0)에 추가하여

37°C에서 8시간 동안 배양했습니다.

배양 후, 혼합물을 100°C에서 10분간 가열하여

효소를 불활성화했습니다.

사전 처리된 VA 혼합물의 수율과 시알산 함량을 측정하여

최적의 효소 처리 조건을 결정했습니다 [18, 19].

Statistical Analysis

Each experiment was repeated three times. One-way analysis of variance (ANOVA) was performed using SPSS software (version 11.5, SPSS Inc., USA). Differences among means were analyzed using Duncan’s Multiple Range Test (DMRT), and the significance level was defined at p < 0.05.

Results and DiscussionEffects of Extraction Parameters on Total Yield

VA extraction was performed in accordance with the CCD matrix as presented in Table 2. A total of 10 runs were performed, and target responses were determined as function of independent variables, such as extraction temperatures and time. Both extraction temperatures and time varied over ranges of 80°C-100°C and 12-36 h, respectively. As presented in Table 2, the maximum total yield (39.29%) was obtained from run No. 7 at an extraction temperature of 100°C and 24 h of extraction time. The minimum yield (21.33%) was obtained from run No. 8 at an extraction temperature of 80°C and 24 h of extraction time. The total yield displayed an increasing tendency with corresponding increases of the independent variables, while the yield decreased at extraction temperatures below 100°C.

VA 추출물의 특성 분석

HWE를 통해 사전 처리된 VA의 수율과 시알산 함량은 이전에 설명된 방법에 따라 측정되었습니다. 용해성 고체 및 단백질 함량과 같은 다른 품질 특성도 측정되었습니다. 용해성 고형분 함량은 굴절계(N-1E, Atago Co., Japan)를 사용하여 측정하고 °Brix로 표시했습니다. 단백질 함량은 BCA 분석법[20]을 통해 측정했습니다.

통계 분석

각 실험은 세 번 반복되었습니다. 일원 분산 분석(ANOVA)은 SPSS 소프트웨어(버전 11.5, SPSS Inc., USA)를 사용하여 수행되었습니다. 평균 간의 차이는 Duncan의 다중 범위 검정(DMRT)을 사용하여 분석했으며, 유의 수준은 p < 0.05로 정의되었습니다.

결과 및 논의 추출 매개변수가 총 수율에 미치는 영향

VA 추출은 표 2에 제시된 CCD 매트릭스에 따라 수행되었습니다. 총 10회의 실험이 수행되었으며, 추출 온도와 시간과 같은 독립 변수에 따라 목표 응답이 결정되었습니다.

추출 온도와 시간은

각각 80°C~100°C 및 12~36시간 범위에서 변동되었습니다. 

표 2에 제시된 바와 같이,

최대 총 수율(39.29%)은 추출 온도 100°C 및 추출 시간 24시간에서 수행된

실험 7번에서 얻어졌습니다.

최소 수율(21.33%)은 추출 온도 80°C 및 추출 시간 24시간에서 수행된

실험 번호 8에서 얻어졌습니다.

총 수율은 독립 변수의 증가에 따라 증가하는 경향을 보였으며,

추출 온도가 100°C 미만일 때는 수율이 감소했습니다.

Optimization and Pretreatment for Hot Water Extraction of Korean Deer (Cervus canadensis Erxleben) Velvet Antlers - PMC

Table 2.

Central composite design with experimental values of yield and sialic acid content of velvet antler extract from hot water extraction using temperature and time as independent variables.

Run No.Independent variablesDependent variablesTemperature (°C)Time (h)Yield (%)Sialic acid (mg/g)

1	95	30	40.23 ± 2.14	0.62 ± 0.06
2	95	18	37.84 ± 1.51	0.55 ± 0.07
3	85	30	30.20 ± 0.51	0.53 ± 0.06
4	85	18	25.78 ± 0.88	0.44 ± 0.06
5	90	24	33.11 ± 0.44	0.50 ± 0.01
6	90	24	33.40 ± 1.76	0.49 ± 0.03
7	100	24	39.79 ± 0.60	0.73 ± 0.11
8	80	24	21.33 ± 1.24	0.45 ± 0.04
9	90	36	37.07 ± 1.05	0.56 ± 0.04
10	90	12	31.52 ± 0.77	0.36 ± 0.04

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Multiple linear regression (MLR) was utilized to develop the model equation to explain the inherent variability due to independent process parameters and to explore the interaction effects with regard to the second-order (i.e., quadratic) nature of the relationship between independent variables and target responses. The coefficients of the linear, quadratic, and interaction terms were used to develop a model equation for total yield (Table 3) which is given below:

Table 3.

Polynomial equations with determination coefficients calculated by multiple linear regression for determining optimized conditions of velvet antler hot water extraction.

ResponsePolynomial equationR2Significance

Yield (%)	-348.055357 + 7.051190X1 + 1.494464 X2 -0.031546 X21-0.016917 X1⁢ X2⁢+ 0005766 X22	0.9867	0.0008
Sialic acid (mg/g)	5.770476 + 0.141476X1 + 0.036825 X2 + 0.000879 X21-0.000167 X1⁢ X2+ 0.000293 X22	0.9663	0.0048

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Yield (%) = -348.055357 + 7.051190X1 + 1.494464X2⁢ -031546X21-0.016917X1⁢X2⁢ + 0005766X22

The MLR also generated the regression coefficient (R ) based on the model equation which was 0.9867. The result implied that the model was acceptable to describe 98.67% of the inherent variation as a function of two independent process parameters and the relatively high R2 value confirmed model validity (Table 3). In order to clarify the interaction effects, three-dimensional (3D) response surface (Fig. 1A) and contour plots (Fig. 1B) were generated. The rising ridge of the response surface plot was observed and both extraction temperatures and time influenced the yield of VA extract. At start of the HWE, the yield displayed an increasing tendency in a linear fashion with corresponding rises in extraction time and temperatures. Additionally, the interaction effects were significant after 24 h of extraction time and maximum slope of the surface plot suggests that the influence of extraction temperature on recovery of yield beyond 85°C is highly significant. Moreover, the optimum conditions for both target responses (yield and sialic acid) were overlapped to determine the optimum region of operability (optimum zone) with the highest predicted yield (40%) and sialic acid content (0.73 mg/g) at optimized parameters of 100°C extraction temperature at 24 h of extraction time for HWE of VA extract (Fig. 3).

This increased recovery of yield with corresponding independent variables could be due to enhanced mass transfer of solutes from the sample matrix to the solvent as HWE may allow higher mass transfer due to ruptured sample matrix molecules. At high temperatures, the polarity of the water is changed in a decreasing manner and it leads to enhanced dissolution of polar and non-polar components. The experimental yield was a fair match with the predicted yield. Similar results have been reported by Hassas-Roudsari et al. [21] regarding HWE of bioactive compounds from Canola meal. HWE showed comparable extract yield (0.19-0.21 g/g meal) compared to that obtained from subcritical water extract at an extraction temperature of 80°C and yield showed increasing tendency with increased extraction temperature. In another study by Lan et al. [22], the authors reported similar results to that of the present study. The enzymatic extraction of water extract from the middle and lower sections of deer antler was optimized by RSM to prepare antioxidant peptides. The optimum extraction conditions were found to be an extraction time of 56 min, 1.4% (w/w) enzymatic addition at a pH 5.60 and an extraction temperature of 60°C.

MLR는 모델 방정식을 기반으로 회귀 계수(R²)를 산출했으며, 그 값은 0.9867이었습니다. 이 결과는 모델이 두 개의 독립적인 공정 매개변수에 따라 내재된 변동의 98.67%를 설명할 수 있음을 의미하며, 상대적으로 높은 R² 값은 모델의 유효성을 확인했습니다(표 3). 상호작용 효과를 명확히 하기 위해 3차원(3D) 응답 표면(그림 1A)과 등고선도(그림 1B)를 생성했습니다.

응답 표면도의 상승하는 능선이 관찰되었으며,

추출 온도와 시간 모두 VA 추출물의 수율에 영향을 미쳤습니다.

HWE 시작 시 수율은

추출 시간과 온도가 증가함에 따라

선형적으로 증가하는 경향을 보였습니다.

또한 추출 시간 24시간 이후 상호작용 효과가 유의미했으며,

표면 플롯의 최대 경사도는 85°C를 초과하는 추출 온도가

수율 회복에 미치는 영향이 매우 유의미함을 나타냈습니다.

또한, 두 목표 응답(수율과 시알산 함량)의 최적 조건이 중첩되어

최적의 운영 지역(최적 구역)을 결정했으며,

최적 조건(추출 온도 100°C, 추출 시간 24시간)에서

VA 추출물의 HWE 시 예측된 최대 수율(40%)과 시알산 함량(0.73 mg/g)이 달성되었습니다(그림 3).

수율의 증가와 독립 변수 간의 상관관계는

HWE가 샘플 매트릭스의 분자 파괴로 인해

용매로의 용질 전달이 향상되었기 때문일 수 있습니다.

고온에서 물의 극성은 감소하며,

이는 극성 및 비극성 성분의 용해도를 향상시킵니다.

실험적 수율은

예측 수율과 잘 일치했습니다.

Hassas-Roudsari 등 [21]은

카놀라 가루에서 생물활성 화합물의 HWE에 대해 유사한 결과를 보고했습니다.

HWE는 80°C 추출 온도에서 초임계 물 추출물과 비교해

유사한 추출 수율(0.19-0.21 g/g 가루)을 보였으며,

추출 온도가 증가함에 따라 수율이 증가하는 경향을 나타냈습니다.

Lan 등[22]의 다른 연구에서도

본 연구와 유사한 결과가 보고되었습니다.

사슴 뿔의 중간 및 하부 부위에서 수성 추출물을 효소 추출하여

항산화 펩타이드를 제조하기 위해 RSM을 통해 최적화되었습니다.

최적의 추출 조건은

추출 시간 56분, 효소 첨가량 1.4%(w/w), pH 5.60,

추출 온도 60°C로 확인되었습니다.

Fig. 1.

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Response surface plot (A) and contour map (B) for yield obtained from velvet antler extract as a function of extraction temperature and time.

Fig. 3.

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Optimal extraction temperature and time of sialic acid and yield for hot water extraction of velvet antler.

Effects of Extraction Parameters on Sialic Acid Content

As sialic acid serves as a biomarker for VA extract in the industry, extraction conditions were optimized for optimum recovery of sialic acid from VA extract in addition to the total yield. The extraction experiments were performed as specified by the CCD matrix. Extracts from all of the experimental runs were analyzed for sialic acid content and the results were tabulated in Table 2. Total yield is indicative of the inherent recovery of sialic acid from VA extract as a higher total extract yield corresponds to increases in sialic acid content from VA extract. As presented in Table 2, the highest sialic acid amount (0.73 mg/g) was obtained from the extracts which were recovered from run No. 7 under the following extraction conditions: 100°C of extraction temperature and 24 h of extraction time. Overall, an increasing trend was observed in sialic acid content with corresponding increases in independent process parameters up to an extraction time of 24 h. Further increases in extraction time did not reveal any positive impact on sialic acid content and a significant decline (p < 0.05) was observed, as seen in Table 2. On the other hand, minimum sialic acid content was recovered from extracts obtained from run No. 10 which was 0.36 mg/g. The MLR model equation suggested a non-linear (i.e., quadratic) relationship between independent variables and target response (sialic acid in this case). A significantly high R2-value (0.9663) for sialic acid content was demonstrated by the developed model which suggested that the model was sufficient to explain 96.63% of the variation caused by the interaction of independent variables. The model equation was developed by using the linear, quadratic, and interaction terms given in Table 3 and is shown below:

Sialic acid (mg/g) = 5.770476-0.141476 X1+0⁢.036825 X2 +0.000879 X21-0.000167 X1⁢X2-0.000293X22

The 3D plots in conjunction with contour plots are presented in Fig. 2A, B. The response surface plot depicted gradual increases of sialic acid with corresponding increases in time and temperature. Sialic acid content demonstrated sharp increases when the extraction temperature and time rose above 90°C and 12 h, respectively. A similar trend was observed from the contour plot in which sharp convexity indicated increases in sialic acid content in a significant manner as function of extraction temperature and extraction time. Moreover, the experimentally obtained sialic acid content was found in agreement with the predicted sialic acid content, as shown in Fig. 3. Hence, optimized HWE led to increased recovery of sialic acid from VA extract owing to increased mass transfer during the extraction process. Similar results have been reported about ultra-high pressure extraction (UHPE) of sialic acid and solvent ratio was the most significant factor for maximum recovery of sialic acid; thus, UHPE proved to be more efficient economically compared to traditional extraction methods [15].

추출 조건이 시알산 함량에 미치는 영향

시알산은

산업에서 VA 추출물의 생물학적 지표로 사용되므로,

총 수율 외에도 VA 추출물로부터 시알산을 최적의 수율로 회수하기 위해

추출 조건을 최적화했습니다.

추출 실험은

CCD 매트릭스에 따라 수행되었습니다.

모든 실험 조건에서 얻은 추출물은

시알산 함량을 분석했으며,

결과는 표 2에 정리되었습니다.

총 수율은 VA 추출물로부터 시알산산의 내재적 회수율을 나타내며,

총 추출 수율이 높을수록 VA 추출물로부터의 시알산산 함량이 증가합니다.

표 2에 제시된 바와 같이, 추

출 온도 100°C 및 추출 시간 24시간 조건 하에서 실험 번호 7에서 추출된 추출물에서

가장 높은 시알산산 함량(0.73 mg/g)이 얻어졌습니다.

전체적으로,

추출 시간 24시간까지 독립적인 공정 파라미터의 증가에 따라

시알산 함량이 증가하는 경향이 관찰되었습니다.

추출 시간을 추가로 연장해도 시알산 함량에 긍정적인 영향은 관찰되지 않았으며,

표 2에서 볼 수 있듯이 유의미한 감소(p < 0.05)가 관찰되었습니다.

반면, 추출 실험 10에서 얻은 추출물에서 시알산 함량의 최소값인 0.36 mg/g이 회복되었습니다. MLR 모델 방정식은 독립 변수와 목표 응답(이 경우 시알산) 사이의 비선형(즉, 2차) 관계를 나타냈습니다. 개발된 모델은 시알산 함량에 대해 매우 높은 R² 값(0.9663)을 보여주었으며, 이는 모델이 독립 변수의 상호작용으로 인한 변동의 96.63%를 설명할 수 있음을 의미합니다. 모델 방정식은 표 3에 제시된 선형, 2차, 및 상호작용 항을 사용하여 개발되었으며, 아래에 표시되어 있습니다:

시알산(mg/g) = 5.770476 - 0.141476 X1 + 0.036825 X2 + 0.000879 X21 - 0.000167 X1⁢X2 - 0.000293X22

3차원 플롯과 등고선 플롯은 Fig. 2A, B에 제시되었습니다. 반응 표면 플롯은 시간과 온도가 증가함에 따라 시알산 함량이 점차 증가하는 것을 보여주었습니다. 시알산 함량은 추출 온도와 시간이 각각 90°C와 12시간을 초과할 때 급격히 증가했습니다. 등고선 그림에서도 유사한 경향이 관찰되었으며, 급격한 볼록함은 추출 온도와 추출 시간에 따라 시알산 함량이 유의미하게 증가함을 나타냈습니다.

또한 실험적으로 얻어진 시알산 함량은

그림 3에 표시된 예측된 시알산 함량과 일치했습니다.

따라서

최적화된 HWE는 추출 과정 중 질량 전달이 증가함에 따라

VA 추출물로부터 시알산 회수율이 증가했습니다.

초고압 추출(UHPE)에 대한 유사한 결과가 보고되었으며,

시알산 회수율 최대화에 있어 용매 비율이

가장 중요한 요인으로 확인되었습니다.

따라서

UHPE는 전통적인 추출 방법에 비해

경제적 효율성이 더 높다는 것이 입증되었습니다 [15].

Fig. 2.

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Response surface plot (A) and contour map (B) for sialic acid obtained from velvet antler extract as a function of extraction temperature and time.

Effects of Pretreatments on VA Extraction

VA extracts were treated with different types of pretreatments, such as MW, US, and EZ treatments in order to improve the recovery of sialic acid and yields. A comparison of each pretreatment is presented in Table 4. The yields from all VA extracts pretreated using the MW, US, and EZ techniques were 17.42%, 19.73%, and 29.15%, respectively. Hence, proteolytic EZ pretreatment was considered to be a more effective treatment than the MW and US treatments in order to attain the highest yield from the VA extracts.

전처리 방법이 VA 추출에 미치는 영향

VA 추출물은

시알산 회수율과 수율을 향상시키기 위해

MW, US, 및 EZ 처리와 같은 다양한 전처리 방법을 적용하여 처리되었습니다.

각 전처리의 비교 결과는 표 4에 제시되어 있습니다.

MW, US, 및 EZ 기술을 사용하여 전처리된

모든 VA 추출물의 수율은 각각 17.42%, 19.73%, 및 29.15%였습니다.

따라서,

가장 높은 수율을 얻기 위해

VA 추출물에서 MW 및 US 처리보다 더 효과적인 처리로

프로테올리티크 EZ 전처리가 고려되었습니다.

Table 4.

Total yield of velvet antler extract pretreated with microwave, ultrasonication, and pepsin enzyme.

PretreatmentTotal yield (%)

Microwave	17.42 ± 1.33c
Ultrasonication	19.73 ± 0.25b
Enzyme (pepsin)	29.15 ± 0.18a

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Different letters (a, b, and c) in columns represent significant differences at p < 0.05.

For EZ pretreatment of VA extract, various commercial and hydrolytic enzymes including protease A, proteAX, papain, pepsin, and trypsin were eval‎uated in this study (Table 5). Among all commercial enzymes, pepsin was the most effective proteolytic enzyme, which led to the highest yield, soluble solid, protein, and sialic acid contents from VA extract. However, in the case of protein content, VA extract treated with papain had the most protein content followed by pepsin. Pepsin showed prominent activity regarding enhanced VA extraction as compared to other proteolytic enzymes. The possible reason for this phenomenon might be the fact that pepsin is well-known aspartate protease in terms of biochemical nature, whereby its active sites comprise of highly conserved aspartates having optimal activity at an acidic pH [23]. Pepsin as an aspartate protease exhibits higher tendency to cleave dipeptide bonds having hydrophobic residues as well as a beta-methylene group in their structural configuration [24].

녹용(VA) 추출물의 EZ(효소) 전처리를 위해 본 연구에서는

프로테아제 A, 프로테AX, 파파인, 펩신, 트립신 등

다양한 상업용 및 수분해 효소를 평가했습니다(표 5).

모든 상업용 효소 중 펩신이 가장 효과적인 단백질 분해 효소로,

VA 추출물로부터 가장 높은 수율, 용해성 고체, 단백질, 시알산 함량을 나타냈습니다.

그러나

단백질 함량 측면에서는 파파인으로 처리된 VA 추출물이

가장 높은 단백질 함량을 보였으며,

그 다음으로 펩신이 이어졌습니다.

펩신은

다른 단백질 분해 효소에 비해 VA 추출 효율이 현저히 높았습니다.

이 현상의 가능성 있는 원인은

펩신이 생화학적 특성상 아스파르트산 프로테아제로 잘 알려져 있으며,

그 활성 부위가 산성 pH에서 최적의 활성을 보이는

고도로 보존된 아스파르트산으로 구성되어 있기 때문일 수 있습니다 [23].

아스파르테이트 프로테아제인 펩신은

구조적 구성에 친수성 잔기 및 베타-메틸렌 그룹을 포함하는

디펩티드 결합을 분해하는 경향이 더 높습니다 [24].

Table 5.

Yield, soluble solid content, protein content, and sialic acid content of velvet antler extraction using proteolytic enzymes.

EnzymeYield (%)Soluble solid content (°brix)Protein content (mg/ml)Sialic acid content (mg/ml)

Protease A	1.91 ± 0.07c	0.50 ± 0.10c	0.23 ± 0.08c	0.45 ± 0.10ab
ProteAX	1.57 ± 0.04d	0.37 ± 0.06c	0.12 ± 0.49c	0.16 ± 0.40b
Papain	1.84 ± 0.13c	2.13 ± 0.12b	1.99 ± 0.03a	0.67 ± 0.39ab
Pepsin	21.88 ± 0.18a	4.07 ± 0.06a	1.34 ± 0.20b	2.15 ± 1.73a
Trypsin	15.33 ± 0.16b	3.93 ± 0.06a	0.51 ± 0.20c	1.03 ± 0.41ab

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Different letters (a, b, c, and d) in columns represent significant differences at p < 0.05.

Other researches have also reported enzymatic production of bioactive peptides from various protein sources using non-gastrointestinal (non-GI) proteases, such as papain, alcalase and thermolysin from plant and microbial sources [25, 26]. The use of non-GI proteases including pepsin and papain may render recovery of more potent bioactive peptides, as proteases vary with to their hydrolytic specificities that may lead to generation of peptide sequences at varying yields and bioactivitie [27]. Among these bioactive components, sialic acid is also one of these which also comprises of different biological recognition sites for a variety of molecules upon enzymatic hydrolysis. Sialic acids chiefly occur in form of N-glycolylneuraminic acid in glycans of various mammals [23]. Hence, the presence of protein fragments of varying lengths and decreases in molecular weight has been reported in recovered hydrolysates enzymatically hydrolyzed by pepsin followed by pancreasin, protease P, protease M, protex 26 L and pronase. In case of two hydrolysates among all, the lowest amount of sialic acid yield might be due to the applied acidic pH (pH 3.0) during digestion and high temperature (95°C) during deactivating the enzyme, which were known to release or degrade sialic acid [28, 29]. Moreover, the lower susceptibility of low-molecular weight peptides to proteolytic enzymes have been reported in a previous study by Zhao et al. [9]. The results of current study are consistent with findings of Lan et al. [22] where the authors obtained the fully exploited deer antler resources by treating with papain enzyme to prepare antioxidant peptide. The target antioxidant peptides were attained after exposure to enzymatic hydrolysis with an enzyme addition of 1.4% (w/w) at pH 5.60 and 60°C of extraction temperature. Moreover, enzymatic pretreatment with papain led to an increase in radical scavenging activity by to 83.09%. Protease and ProteAX are also known to belong peptidases or proteinases. These proteolytic enzymes catalyze proteolysis by carrying out breakdown of protein molecules by fragmenting into smaller polypeptides and further leading to generation of single amino acids [30]. During this proteolytic activity, cleavage of peptide bonds occurs in molecular configuration of proteins through process of hydrolysis [31].

Papain also caused proteolysis by rendering its function through underpinning mechanism of cysteine-25 portion of the triad in active site [32]. Carbonyl carbon exiting in peptide backbone is attacked by papain, which leads to release of amino terminal portion. This process continues throughout protein peptide chains and causes their breakdown [33]. The underlying mechanism of breaking peptide bonds involves deprotonation of Cys-25 by His-159. Moreover, this deprotonation is facilitated by asparagine-175 which also plays influential role in orientation of imidazole ring of His-159 [34].

다른 연구에서도 식물 및 미생물 기원으로부터 유래한

파파인, 알칼라제, 테르모리신과 같은

비위장관(비GI) 프로테아제를 사용하여

다양한 단백질 원료로부터 생물활성 펩타이드의 효소적 생산이 보고되었습니다 [25, 26].

GI 외 프로테아제(예: 펩신과 파파인)의 사용은

프로테아제의 가수분해 특이성에 따라

다양한 수율과 생물학적 활성을 가진 펩타이드 시퀀스의 생성을 유발할 수 있어

더 강력한 생물활성 펩타이드의 회수 가능성을 높일 수 있습니다[27].

이러한 생물활성 성분 중 하나인

시알산은 효소적 가수분해 시 다양한 분자들에 대한

생물학적 인식 부위를 포함하는 성분입니다.

시알산은

주로 다양한 포유류의 글리칸에 N-글리콜릴뉴라민산 형태로

존재합니다 [23].

따라서

펩신으로 효소 분해된 후

펩신, 프로테아제 P, 프로테아제 M, 프로텍스 26 L, 프로나스로 분해된 수화물에서

다양한 길이의 단백질 조각과 분자량 감소가 보고되었습니다.

모든 가수분해물 중 두 가지 경우에서

시알산 수율이 가장 낮은 것은

소화 과정에서 적용된 산성 pH(pH 3.0)와

효소 불활성화 시 높은 온도(95°C) 때문일 수 있습니다.

이는

시알산을 방출하거나 분해하는 것으로

알려져 있습니다[28, 29].

또한, 저분자량 펩타이드가

프로테아제 효소에 대한 저항성이 낮다는 점은

Zhao 등[9]의 이전 연구에서도 보고되었습니다.

본 연구 결과는 Lan 등[22]의 연구 결과와 일치하며,

이들은 파파인 효소를 사용하여 항산화 펩타이드를 제조하기 위해

사슴 뿔 자원을 완전히 활용했습니다.

목표 항산화 펩타이드들은

pH 5.60 및 추출 온도 60°C에서 1.4% (w/w)의 효소 첨가량으로

효소적 가수분해에 노출된 후 얻어졌습니다.

또한 파파인 효소 전처리는

라디칼 소거 활성을 83.09%까지 증가시켰습니다.

프로테아제와 ProteAX는

펩티다제 또는 프로테아제에 속하는 것으로 알려져 있습니다.

이러한 프로테아제 효소는

단백질 분자를 더 작은 폴리펩타이드로 분해하여

단일 아미노산으로 생성하는 단백질 분해 반응을 촉매합니다 [30].

이 프로테아제 활성 과정에서

단백질 분자 구조 내의 펩타이드 결합이 가수분해 과정을 통해 절단됩니다 [31].

파파인은

활성 부위의 트라이드 중 시스테인-25 부분의 기전 메커니즘을 통해 기능을 발휘하여

프로테올리시를 유발합니다 [32].

펩티드 골격에 존재하는 카르보닐 탄소는

파파인에 의해 공격받아 아미노 말단 부분이 방출됩니다.

이 과정은

단백질 펩티드 사슬 전체에 걸쳐 진행되어 분해됩니다 [33].

펩타이드 결합 분해의 기본 메커니즘은

시스테인-25의 히스티딘-159에 의한 탈프로토네이션을 포함합니다.

또한 이 탈프로토네이션은

히스티딘-159의 이미다졸 고리 방향에 영향을 미치는

아스파라긴-175에 의해 촉진됩니다 [34].

Pepsin is one of the members of aspartic protease enzymes family. It is characteristics for members of this family to exhibit two aspartic acid residues in their structural configuration to act as the active site [35]. In majority of instances, acidic pH is requirement for these enzymes’ activities. Highly acidic pH range (1-4) is mandatory for optimal activity of pepsin. Pepsin brings about catalysis of proteins though acid hydrolysis of peptide bonds into smaller sub units for efficient digestive process [36]. Trypsin also causes peptides breakdown though hydrolysis reaction into smaller structural subunits of basic protein building blocks like amino acids. It is implied that such general catalytic mechanism is common for all enzymes that belong to serine proteases [31]. This mechanism occurs at active site of trypsin having structural configuration comprising of three amino acids also known as catalytic triad. The three amino acid residues in catalytic triad are serine 195, histidine 57, and aspartate 102 [30]. During catalytic activity, histidine imidazole ring bonds to serine residue. Serine donates a proton to histidine followed by formation of alkoxide nucleophile. In the presence of substrate, this nucleophile catalyzes the substrate. Aspartate has a role to allow bondage of histidine in proper position for precise protonation as proton acceptor [37]. The actual underlying formation of pocket configuration from combination of three residues ensures mechanism working, and the three residues function to hold each other in proper position for nucleophilic attack [38].

Similarly, the effects of enzymatic pretreatment at various concentrations of pepsin was investigated in another study concerning the extraction ratio of collagen protein from deer antler [39]. Enzymolysis was carried out for period of 12 h at a pepsin concentration range of 1%-5%. The authors reported that the pepsin concentration and extraction ratio of collagen protein were positively correlated. At below 2% concentration, pepsin did not cause any significant changes, however, further increases in concentration (≥ 3%) caused the hydrolysis of collagen protein into small-sized polypeptides and improved the extraction ratio from deer VA. Compared to conventional extraction, enzymolysis led to the conjugation of benzene double bonds with various amino acids, such as tyrosine, tryptophan, and phenylalanine.

Finally, HWEs with and without pepsin pretreatments were also compared for various parameters (e.g., yield, soluble solid, protein, and sialic acid contents), as presented in Table 6. The pepsin pretreatment significantly increased the yield, soluble solid, protein, and sialic acid contents of the VA extracts (p < 0.05).

페프신은

아스파르트산 프로테아제 효소 가족의 일원입니다.

이 가족의 구성원들은

구조적 구성에 두 개의 아스파르트산 잔기를 포함하여

활성 부위로 작용하는 것이 특징입니다 [35].

대부분의 경우,

이 효소들의 활성은 산성 pH를 요구합니다.

페프신의 최적 활성을 위해

고산성 pH 범위(1-4)가 필수적입니다.

페프신은

펩타이드 결합을 산성 가수분해로 분해하여

더 작은 단위로 분해함으로써

단백질의 분해를 촉진합니다[36].

트립신도

가수분해 반응을 통해 펩타이드를 분해하여

아미노산과 같은 기본 단백질 구성 단위로 분해합니다.

이러한 일반적인 촉매 메커니즘은

세린 프로테아제 가족에 속하는 모든 효소에 공통적이라는 것이 제안되었습니다[31].

이 메커니즘은

트립신의 활성 부위에서 발생하며,

세 개의 아미노산으로 구성된 구조적 배열을 갖습니다.

이 세 개의 아미노산 잔기는

세린 195, 히스티딘 57, 아스파르트산 102로 알려져 있습니다 [30].

촉매 활성 중

히스티딘의 이미다졸 고리가 세린 잔기와 결합합니다.

세린은

히스티딘에 프로톤을 기부한 후 알코xide 핵ophile를 형성합니다.

기질이 존재할 때 이 핵ophile은 기질을 촉매합니다.

아스파르트산은

히스티딘이 정확한 위치에 결합하여

정확한 프로톤화(프로톤 수용체로서의 역할)를 가능하게 합니다 [37].

세 개의 잔기 조합으로 형성되는 포켓 구조의 실제 형성은

메커니즘의 작동 원리를 보장하며,

세 개의 잔기는 서로를 적절한 위치에 고정하여 핵ophile 공격을 가능하게 합니다 [38].

또 다른 연구에서는 사슴 뿔에서

콜라겐 단백질의 추출 비율에 대한 펩신 농도에 따른 효소 전처리의 영향을 조사했습니다 [39].

펩신 농도 범위 1%-5%에서 12시간 동안

효소 분해가 수행되었습니다.

저자들은

펩신 농도와 콜라겐 단백질의 추출 비율이

양의 상관관계를 보였다고 보고했습니다.

2% 미만의 농도에서는

펩신이 유의미한 변화를 일으키지 않았으나,

농도를 3% 이상으로 증가시키면 콜라겐 단백질이 작은 크기의 폴리펩타이드로 가수분해되어

사슴 VA에서의 추출 비율이 개선되었습니다.

전통적인 추출 방법과 비교할 때,

효소 분해는 티로신, 트립토판, 페닐알라

닌과 같은

다양한 아미노산과의 벤젠 이중 결합 결합을 유도했습니다.

마지막으로,

펩신 전처리를 한 경우와 하지 않은 경우의 HWEs를

다양한 파라미터(예: 수율, 용해성 고체, 단백질, 시알산 함량)에 대해 비교했습니다(표 6 참조).

펩신 전처리는

VA 추출물의 수율, 용해성 고체, 단백질, 시알산 함량을

유의미하게 증가시켰습니다(p < 0.05).

Table 6.

Comparison of yield, soluble solid, protein, and sialic acid contents of velvet antler extract pretreated with and without pepsin.

Yield (%)Soluble solids content (°brix)Protein content (mg/ml)Sialic acid content (mg/ml)

VA extraction without pepsin pretreatment	39.29 ± 0.54b	1.43 ± 0.06b	0.86 ± 0.07b	2.11 ± 0.36b
VA extraction with pepsin pretreatment	47.65 ± 0.38a	4.03 ± 0.15a	1.12 ± 0.03a	3.04 ± 0.45a

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Different letters (a and b) in columns represent significant differences at p < 0.05.

Conclusively, the optimum HWE extraction condition for VA which is most applicable to the industry was determined based on RSM. The optimum extraction conditions were 100°C extraction temperature and 24 h of extraction time. Additionally, the pepsin treatment was found to be the most effective pretreatment method among the microwave, ultrasound, and enzymatic pretreatments, and resulted in the highest total yield and sialic acid contents. Hence, this research clearly suggests that pepsin pretreatment prior to optimized HWE could result in maximum target responses for yield and sialic acid content and could be applied to the VA industry.

결론적으로, 

산업에 가장 적합한 VA의 최적 HWE 추출 조건은

 RSM을 기반으로 결정되었습니다. 

최적의 추출 조건은 

추출 온도 100°C와 

추출 시간 24시간으로 확인되었습니다.

또한, 마이크로웨이브, 초음파, 효소 전처리 방법 중

페프신 전처리가 가장 효과적인 전처리 방법으로 확인되었으며,

총 수율과 시알산 함량이 가장 높았습니다.

따라서

본 연구는 최적화된 HWE 전 단계에 페프신 전처리를 적용하면

수율과 시알산 함량에 대한 최대 목표 응답을 달성할 수 있으며,

VA 산업에 적용 가능함을 명확히 제시합니다.

Acknowledgment

This research was supported by the Deer Cluster (CME 2016-04) in 2016.

Footnotes

Conflict of Interest

The authors have no financial conflicts of interest to declare.

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