번식기술은 가축개량의 실행수단이다. 이제까지 인공수정, 수정란이식, 임상번식치료 등 중요한 기술이 개발되어 왔다. 특히, 소의 인공수정은 정액의 동결보존법의 확립에 의해 널리 보급되어, 유우의 비유능력을 비약적으로 향상시켰고, 육우의 산육능력을 개선시켰으며, 생식기전염병을 구제하는 등 크다란 경제적 효과를 가져왔다. 이는 인공수정에 의해 고능력 종모우의 정액을 효율적으로 이용할 수 있게되어 소의 육종개량이 되어온 결과이다.
수정란이식(ET)은 우량한 암컷의 난자를 유효하게 이용할 목적으로 개발된 기술이다. 수정란이식의 경우도 인공수정을 병용하므로서 육종개량 효과는 인공수정 단독의 효과보다 훨씬 크다. 특히 소의 수정란이식은 고능력비유우의 자손을 단기간에 증식 시키는데 유효한 수단이다. 이러한 수정란이식 기술의 이용분야는 ① 우수한 암컷의 개체를 선발하여 과배란처리로 다수의 난자를 생산하여 능력이 불량한 개체나 다른 개체에 이식하여 우수한 유전형질을 이어받은 산자를 다수 생산하여 가축개량이 촉진된다. ② 공란축을 특정품종으로 하고 수란축은 일반 암컷을 이용한다면 산업적으로 요망되는 특정품종의 산자를 생산하는 것이 가능하다. 예를들면 유우에 육우의 수정란을 이식하면 우유 생산량을 감소시키지 않고 육우생산의 증산을 기할 수 있다. ③ 수정란동결에 의한 장기보존기술을 이용하면 가축수정란의 국제무역이 가능하며 고가의 가축을 많은 수송비를 들여 수입할 필요가 없어진다. 농가에서는 번식능력이 있는 암컷을 소유하고 있다면 동결보존란을 구입하여 이식함으로써 원하는 산자를 저렴한 경비로 도입이 가능하다. ④ 수정란을 2개 이식하여 쌍자생산이 가능하다. 쌍자생산에 의한 불충실한 쌍자의 사육기술 및 다른 문제점도 있지만 기대할 만한 분야이다. 이와같은 수정란이식 기술의 현황과 산업화의 이용시의 문제점 및 앞으로의 연구방향 등에 관하여 소개하고자 한다.
Ⅱ. 수정란의 채취
1. 공란우의 선정
최근에 소의 과배란처리 기술의 진전에 따라 공란우 1두로부터 회수되는 정상란 수가 평균 6-8개로 향상되고, 이식기술도 간편화되어 수태율이 향상되게 되었다. 우군의 비유능력의 상위 10-20%를 공란우로 선택한다면, 2-3년내에 우량우의 비율이 70%에 도달하여 우군 전체의 개량이 가능하게 된다. 또한 홀스타인종 등의 대형우의 배를 빌려 육용우의 쌍자생산도 가능하게 된다.
공란우로서의 평가는 시장성도 중요하지만 본질적으로 유용우에서는 비유능력이 높은 개체와, 육용우에서는 육질과 증체량이 많은 것이 대상이 된다. 또한 강건성이나 번식능력이 높은 것도 경제적인 측면에서 볼때 무시할 수가 없다. 따라서 공란우의 선정에는 다음과 같은 요인을 주의하여 선정하여야 한다.
① 유전적으로 우수한 형질을 가진 유전질환이 없는 개체 ② 번식능력이 높은 개체 ③ 건강하며 전염성 질환이 없는 개체 ④ 시장가치가 높은 개체 등.
또한 공란우로서의 직접적인 선정조건은 ① 産歷이 명료한 개체 ② 성주기가 정상인 개체 ③ 임신의 유지에 장해를 가져오는 질병이 없는 개체 ④ 노령이 아닌 개체 등이다.
일반적으로 1두당 회수란 수와 수정란 수는 연령, 분만후의 일수, 비유량, 성주기에 대한 성선자극호르몬 투여개시일, 계절, 품종, 산차 등에 관련된다. 공란우로 선택하는 연령은 10세가 초과하면 원시난포가 적어서 배란수가 감소하므로 초산부터 10세까지의 범위내에서 선택하는 것이 좋다. 성 성숙과정에 있는 소는 외인성의 성선자극호르몬에 대해서 민감한 반응을 나타내지만 자궁이나 난관의 상태는 수정란을 정상적으로 발육시킬 수 없고 능력판정도 불가능하므로 공란우의 후보축으로 제외하는 것이 좋다. 분만후 6개월간 즉, 번식기능이 활발히 활동하고 있는 시기를 선정하여 과배란처리를 한다면 좋은 성적을 얻을 수 있다. 착유우와 공태우에서는 착유우 편이 과배란에 의한 반응이 좋다. 과배란을 유기하기 위한 성선자극호르몬의 투여일은 성주기의 9-14일의 범위가 좋다. 자궁내막염, 생식기질병, 난소낭종, 장기공태 등의 번식장해우 및 노령우 등은 공란우로 부터 제외하는 것이 좋다.
2. 과배란 처리법
종전에 일반적으로 사용되었던 소에 대한 과배란유기는 난포의 발육촉진작용이 강한 난포자극호르몬(FSH) 또는 임마혈청성 성선자극호르몬(PMSG)을 발정주기의 16일째(전회의 발정을 0으로 할 때)에 투여하고· 이들 성선자극호르몬(GTH)을 투여후 3일과 4일째에 난포호르몬 estraiol을 2회 주사하고 발정이 발현한 당일에 난포의 과배란을 촉진시키기 위해 황체형성호르몬(LH) 도는 성선자극호르몬(hCG)을 정맥주사하는 방법이다. 이 방법은 과배란처리법으로서는 우수하지만 발정주기에 대한 소의 개체차 등이 영향을 미쳐 발정발현에 1-2일정도 어긋나는 결점이 있다.
다른 방법으로서는 전회의 발정후 9-14일째에 성선자극호르몬을 투여하는 방법이다. 과배란처리로서 FSH를 50, 36, 24 mg 투여한 경우 정상란의 비율이 29, 29, 50%로서 소량 투여한 예에서 높은 회수율을 나타내었다. PMSG를 투여한 경우 투여량은 미경산우에서 2,500-3,000 IU, 경산우에서 3,500-4,000 IU로서 1회 투여가 좋으며 발정후 15일 아침에 근육주사한다. 과배란처리에 의한 회수란중 정상란 수가 차지하는 비율은 대단히 중요하다. 1두당 평균 회수란 수는 PMSG처리군의 6.58±4.81에 비하여 FSH, LH처리군에서는 12.78±9.75로 유의하게 높다고 한다. 또한 Crister 등(1980)은 소에 있어서 PMSG와 FSH로 과배란처리를 했을 때, FSH처리군에서는 PMSG처리군에 비해 1두당 정상란 수의 비율이 높다고 하였다.
Prostagladin F2a(PGF2a)는 강한 황체퇴형작용을 하는 것이 알려진 후 발정동기화에 응용되었다. 과배란 처리우의 발정을 유기시키기 위해서는 PGF2a를 FSH 투여개시로부터 3 일째의 아침, 정오, 저녁에 각각 15 mg, 10 mg, 5 mg을 3 회로 나누어 근육내에 투여한다. PGF2a를 3회로 나누어 근육내에 투여하면 발정의 발현이 명료하고 강한 경우가 많다. 또한 GTH와 PGF2a를 병용하는 경우는 GTH투여일을 9-14 일의 범위로 이동하더라도 무방하며, 투여량은 PMSG 3,000 IU(미경산우 : 2,000 IU; 고령우 : 4,000 IU), FSH의 경우는 40-50 mg(1 일 2 회에 걸쳐 4-5 일 연속투여)이 적당하며 병용하는 PGF2a는 25-40 mg이 적당하다.
Donaldson 등(1983)은 PGF2a 50 mg을 3 회로 나누어 근육내 투여한 경우와 2 회로 나누어 투여한 경우를 비교할 때 발정발현은 각각 96%, 86.6%, 수정란 회수율은 62%, 51%, 1두당 정상란 수는 5.4개, 3.8개로서 3 회로 나누어 투여한 경우가 양호하였다고 한다.
FSH의 5 mg을 매회 동일한 양으로 8 회에 걸쳐 총 40 mg을 투여한 경우와, 감량하여 8 회(5, 5, 4, 4, 3, 3, 2, 2 mg)에 걸쳐 총 28 mg을 투여한 경우와 비교할 때 유의한 차는 없으나, 1두당 정상란 수에 있어서 감량투여(5.8 개)가 동량투여보다 높았다고 하였다.
3. 공란우의 발정과 인공수정
대개 PGF2a 투여후 다음날 저녁부터 2 일째의 아침 사이에 발정이 나타난다. 2 일째의 이른 아침에 발정이 보이는 소에는 오후 1 회의 인공수정을 하고, 다음날 아침 2 회째의 인공수정을 실시한다. 공란우의 인공수정시에는 아직 배란이 개시되지 않고 난관채가 팽대되어 난소를 싸고 있는 상태이다. 따라서 이 시기에 난소를 촉진하면 배란 또는 수정을 저해할 우려가 있기때문에 인공수정의 조작은 주의깊게 조작해야 한다. 또한 발정기에 들어간 외음부의 소독을 철저히하여 인공수정에 의한 자궁내부의 오염을 야기시키지 않도록 주의해야 한다. 오염된 상태로서의 인공수정은 정상란이 감소를 가져오고, 변성란과 비수정란의 증가를 가져온다. 발정징후가 나타나지 않았거나 순성발정의 경우는 좋은 결과가 얻어지지 않기때문에 인공수정 및 그 후의 계획을 중지하고 다음 기회를 기다리는 것이 좋다.
4. 수정란의 회수
1) 수정란의 발육과 난관하강
배란후 난과팽대부에서 수정한 수정란은 약 1 일 후에 2 세포기, 2 일 경과후에 4 세포기, 3-4 일후에는 8-16 세포기로되어 난관협부를 하강하여 약 5 일후에는 자궁각 선단부까지 하강한다(그림 1). 따라서 비외과적 관류에서는 수정후 5 일 이후가 아니면 난회수가 불가능하다.
그림 1. 수정란의 난관 하강
2) 수정란의 회수
(1) 수정란의 회수준비
인공수정후 5-6 일째에 난소를 검사하여 황체수를 확인하고 그 수에대한 수란우의 준비를 한다. 수정란의 회수에 있어서 준비해야할 기자재로는 표 1과 같다. 이들 기자재는 소정의 방법에 따라 세척, 건조 및 멸균해 두어야 한다. 관류액은 수정란의 회수에 앞서 37℃의 항온수조에 넣어서 보온해야하며 관류액을 회수하는 메스실린더도 똑같이 항온수조에 넣어 보존해 두어야 한다.
표 1 수정란 회수에 필요한 기자재
(2) 공란우의 보정과 마취
공란우는 오물이 뭍어 있다면 깨끗이 씻은 후 마른 수건으로 청경하게 한 후 보정한다. 전구는 상면보다 약 20 Cm높게 하여 관류가 잘되도록 한다. 보정한 후 직장을 통해 뇨변을 제거한다. 이어서 미근부의 털을 가위로 깍고 알코올면으로 소독한 후 10 ml의 주사기에 2% xylocaine의 5-7 ml를 미추경막외에 주사하여 마취시킨다. 마취를 끝낸 후 미부를 보정한다.
(3) Balloon catheter의 삽입
시술자는 외음부를 세정한 후 마른 수건으로 깨끗이 닦고 알코올면으로 소독한 후 자궁경관확장봉으로 자궁경관을 확장한다. 경산우의 경우는 경관점액을 제거할 목적으로 사용하며, 미경산우의 경우는 처음에는 가느다란 확장봉으로 확장한 후 다시 굵은 확장봉으로 확장하여 balloon cathter 의 삽입을 용이하게 하기 위해 사용한다. 또한 확장봉의 삽입은 경관내의 경로를 알기위해서도 중요하다. 자궁경관의 형은 다양하기 때문에 확장봉을 삽입할 때는 자궁경관을 상하-좌우로 조작하면서 삽입하는 것이 좋다. 확장봉을 조작할 때 무리한 힘을 가하면 점막에 상처가 나서 출혈하거나, 점막이 비후하여 그후의 조작이 곤란하게 된다.
다음으로 소분해둔 관류액을 20 ml 용량의 주사기에 흡입하여 balloon catheter 외구부로부터 내부에 주입하여 스틸제 내심의 활면을 좋게한 후 balloon catheter 외구부에 있는 접합장치와 스틸제 내심의 접합장치와 결합시킨다. 시술자는 스틸제 내심으로 보정된 balloon catheter를 자궁경관을 경유하여 자궁각의 분기로부터 약 5 cm부위에 삽입한다. 이때 자궁경관을 확장하는 것이 아니기때문에 무리한 조작을 피해야 한다. Balloon catheter를 자궁각 심부에 삽입할 때에는 직장을 통해 보정하고 있는 손의 내측에 balloon catheter 의 선단을 감싸듯 안전하게 삽입하여야 한다. Catheter의 선단이 자궁각 분기부의 중격으로 부터 약 5 Cm정도에 달했을 때, 조수는 30 ml 용량의 주사통으로 공기를 주입하여 balloon catheter선단의 풍선을 팽창시킨다. 공기를 주입할 때 처음은 10 ml의 공기를 일시에 주입하고 이어서 11, 12, 13 ml....로 세어가면서 시술자의 지시에 따라 주입한다. 공기량은 미경산우에서는 11-16 ml, 경산우에서는 18-25 ml가 적당하다. Catheter의 풍선이 팽창되어 자궁경관을 막기때문에 자궁각 선단부까지 씻어내려 관류시키는 원리이다.
Balloon catheter 에는 2 way 와 3 way가 있다. 2 way 는 관류액의 유입-유출이 동일한 관을 통해서 이루어지게 되어 있다. 이것에 비해 3 way는 관류액의 유입-유출관이 별도로 되어있어 관류가 잘된다(그림 2)
(4) 관류방법
수정란은 대체로 수정후 4 일간은 난관내에, 5 일째는 자궁-난관접합부에, 6 일째는 자궁관 선단에 존재한다. 따라서 난회수를 위한 관류는 수정후 4 일까지는 난관, 5 일째는 난관과 자궁각의 양측에, 6 일 이후에는 자궁각에서 실시하고 있다. 난회수를 위한 관류방법으로는 난관관류법(상향식, 하향식 난관관류법), 자궁관류법 및 자궁내 순환관류법 등이 있는데 현재 자궁내 순환관류법이 널리 이용되고 있다. 여기에서도 자궁내 순환관류법에 대하여 논하기로 하겠다.
그림 2. Balloon catheter의 삽입 위치
* 자궁내 순환관류법
자궁세정과 유사한 방법이지만 관류액이 자궁경이나 질쪽으로 흐르지 않도록 풍선이 붙은 catheter 를 자궁각 또는 자궁체에 삽입하여 회수하는 방법이다.
- 특징 : 다량의 관류액(300-1,000 ml)이 필요하지만 모체나 자궁에 손상을 주지않기때문에 기술적으로 숙련된다면 60-70%의 난회수율이 얻어진다.
관류액은 소의 외음부보다 약 1 Cm 높이에 고정한다. 3 way balloon catheter의 경우는 유입관이 가늘기때문에 150 Cm의 높이에 고정하는 것이 관류가 잘된다. 관류액의 양은 자궁각의 크기, 기술의 숙련도 등에 의해 차이에 따라 약 500 ml정도이면 충분하다. 관류는 난관-자궁이행으로부터 하행으로 향하여 관류시킨다.
① 관류액의 30 ml정도를 자궁내에 주입하고 자궁각선단의 난관, 자궁이행부를 잡고 위로 들어올리는 형태로 회수한다 ② 관류액의 30-50 ml 정도를 자궁내로 주입하고 자궁선단부로 부터 5-10 Cm정도의 지점을 위로 향하여 2-3회 밀어올린 후 자궁각선단의 난관, 자궁이행부를 상행으로 향하여 회수한다. 자궁선단부를 밀어올리는 것은 자궁점막에 붙어있는 수정란을 부유시키기 위한 때문이다. ③ 자궁각의 선단으로부터 자궁각을 마사지하면서 수정란을 회수한다. 마사지 방법은 우자궁각을 씻어내릴 때는 좌측손으로 직장벽을 쥐어 자궁각선단으로 부터 마사지하면서 씻어내린다. 죄자궁각을 씻어내릴 때는 우측손으로 조작한다.
관류가 끝나면 balloon catheter 선단의 풍선으로 부터 공기를 뽑아낸 후 balloon catheter를 제거시킨다. 빼낸 catheter 의 선단을 위로 들어올려 catheter 내에 남아있는 관류랙을 회수한다.
(5) 관류후의 처리
관류후 공란우에 대해서는 항생제를 자궁각 내에 주입하여 자궁내막염을 예방한다. 또한 비유중의 소에 대해서는 PGF2a 25 mg을 근육내에 투여하여 황체퇴형을 촉진시켜 유량의 저하를 방지한다. 과배란 처리우의 75%가 유량의 저하를 나타내기때문에 그 예방조치로서 PGF2a를 투여한다.
Ⅲ. 수정란의 검사 및 처리
1. 수정란의 검사
수정란의 발육단계에 따라 세포의 형태가 달라진다. 형태학적인 관찰에 의한 수정란의 질과 수태성은 거의 일치하는 것으로 알려져 있다. 현미경하에서 형태를 관찰하여 일정의 기준과 비교하여 난의 질을 판정하므로 수정란의 형태관찰은 경험이 요구된다.
1) 수정란의 형태학적 주안점
a. 윤곽 b. 색조 c. 분할구의 크기와 난황의 균일성 d. 세포의 밀도와 균일성 e. 세포와 투명대의 간격 f. 돌출한 세포수와 변성된 세포수 g. 수포의 수와 크기 등이 있다.
각 할구나 세포윤곽의 명료, 불명료의 차이는 수정란의 질에 영향을 미친다. 윤곽이 명료한 세포는 세포에 변성이 없는 것으로 생각된다. 색조의 명암은 수정란의 발육단계에 따라 다르지만 일반적으로 상실배, 후기 배반포기배는 어둡고, 포배강이 형성되는 초기 배반포기배로부터 배반포로 발육이 진행됨에 따라 밝아진다. 배반포가 이상하게 어둔운 색조고 윤곽이 불명료한 경우는 변성되어 있는 경우가 많다.
2) 수정란의 크기와 색조
소 수정란의 크기는 직경 150-190 um이고, 투명대는 12-15 um이다. 투명대를 갖지 않은 성숙한 세포의 직경은 120-160 um로서 색조는 엷은 갈색을 띄고 있다.
3) 발육단계의 구분
회수시 일령에 비교하여 발육단계가 늦은 수정란은 난의 회수시 이미 사멸, 또는 변성과정을 거치는 경우가 많다. 예를들면 성주기의 7 일째에 회수한 수정란으로부터 16 세포기의 난이 얻어지는 경우 이세포는 이미 변성과정을 거치고 있다고 보아도 무방하다. 즉 수정후 8일째에 회수된 수정란의 정상적인 발육단계는 후기상실배, 초기배반포기 및 배반포이다. 이와같이 후기상실배보다 2 단계 어린 16 세포기는 이식하더라도 수태가 되지 않고 동결보존에도 견디지를 못한다.
4) 소 수정란의 발생학적 형태
표 3. 우 수정란의 분할 모식도
a. 투명대(zona pellucida) : 16세포기가 되면 분할구가 결합을 시작하지만 접착은 약한 편이다. 투명대는 세포의 분할구를 보호하는 기계적 보호역할과 난세포에 접한 위난강의 조절기능을 가지고 있다. 투명대의 주성분은 당단백질로서 투명대는 여러 단백질분해효소로서 용해된다.
b. 분할구(blastomere) : 2 세포, 4 세포, 8 세포로 분할해 가는 구상의 세포를 분할구라 한다. 분할구가 16 개로 되었을 때 16 세포기라고 한다. 16세포기 이상으로 분할하면 분할구의 산정이 어러워지게 되는데 이것을 상실배라 한다.
c. 위난강(perivitelline space) : 세포와 투명대의 간격을 말하며 후기 상실배에서는 세포가 수축하기 때문에 위난강이 확장되지만, 배반포에서는 위난강이 세포로 채워져있다.
d. 포배강(blastocyst cabity, blastocoele) : 초기배반포로부터 세포의 일부에 명확한 강이 형성된다.
e. 내부세포괴(inner cell mass) : 배반포의 일부에 불투명한 세포괴가 형성된다. 이것을 내부세포괴라 하며 이것은 태아, 난황낭 및 배로되는 부분이다.
f. 영양막 및 영양배엽(trophoblast) : 배반포로 되면 세포의 주위에 불투명한 조직이 세포를 둘러싸게 되며, 이것을 영양배엽이라 한다. 영양배엽은 태막이나 태아의 태반이 되는 부분이다.
<그림 3> 소의 수정란 분할 모식도
5) 수정후 6-8 일째에 회수되는 수정란의 특징
수정후 6-8 일째에 회수되는 정상란의 형태를 나타내는 소 수정란의 특징은 다음과 같다.
a. 상실배(morula) : 대체로 수정후 5 일째에 회수되는 수정란으로서 구상의 세포괴로 보이며, 개개의 분할구를 분별하는 것은 불가능하다. 세포괴는 투명대의 대부분을 차지하고 있다.
b. 후기상실배(compacted morula) : 개개의 분할구의 결합은 강하여져 소형화한 괴로 된다. 배의 괴는 투명대내강의 60-70%를 차지하여 위난강이 확대된 형태로 되어있다.
c. 배반포(blastocyst) : 수정후 7 일째에 회수되는 수정란으로서 세포의 일부에 소형화한 내세포괴가 보인다. 세포는 투명대내강을 점유하며 포배강이 분명하게 되어 위난강이 보이지 않게 된다.
d. 확장배반포(expanded blastocyst) : 이 형태의 배는 대체로 수정후 8 일째에 회수된다. 포배강의 확장이 현저하여 세포 전체의 크기가 이때가지는 세포의 1.2-1.5 배에 달한다. 또한 투명대의 두께가 본래의 1/3 정도로 작아진다.
2. 수정란의 위생적 조작
수정란 자체 또는 이식기술 과정에서의 미생물의 오염은 난의 발육장해나 불수태의 원인의 하나로 생각된다. 따라서 수정란이식기술을 성공시키기 위한 제일의 조건은 미생물오염의 예방이라고 해도 과언이 아니다. 오염의 원인으로서는
① 기구로부터의 오염 ② 관류액, 보존액 또는 체외배양액 등의 주입액으로부터의 오염 ③ 실험실 및 채란실 또는 인공수정시의 공기로부터의 오염 ④ 시술자로부터의 오염 ⑤ 공란우로부터의 오염 ⑥ 수란우로부터의 오염 등이 있다.
수정란이식에 사용되는 기구, 관류액 및 보존액 등은 사용전에 반드시 멸균처리에 의해 미생물을 제거하여야 한다. 수정란이식 기술은 세균학적으로 무균의 상태에 있는 공란우의 자궁내로부터 수정란을 인위적으로 채란하여 다시 수란우의 자궁내에 이식하는 작업이다. 따라서 작업과정중에 세균의 오염이 일어날 수 있기 때문에 항상 무균적으로 조작하도록 유의하여야 한다. 또한 수정란을 얻기 위해서는 난자와 정자를 제공하는 암-숫소가 필요하다. 그러나 이들이 미생물에 의해 오염되었을 경우에는 난자, 정자 및 수정란도 오염되게 된다. 그 결과 수정란은 세포분열의 이상이나 발육장해를 일으킨다. 또한 그것을 이식한 수란우는 자궁이나 수란관 등의 생식기가 오염되어 불수태나 태아의 발육장해, 특히 유산, 사산, 조산 및 선천성 기형자우 분만 등의 이상분만을 야기시킨다. 따라서 정자나 난자를 제공하는 소는 미생물학적으로 청결하여야 한다. 수란우의 선택을 엄밀히 행하더라도 수정란의 이식작업이 시술적으로 만족할 수 있는 경우라도 수란우가 공란우와 같이 미생물학적으로 청결하지 못하다면 수정란 이식기술의 성공은 얻기가 힘들다. 즉 수란우가 수정란 이식전에 미생물에 오염되어 있거나 임신후 위생관리의 불량으로 미생물에 오염된다면 불수태나 유산 등을 일으킬 수 있다.
Ⅳ. 수정란 이식
1. 수란우의 선정조건
수정란이식을 위하여 먼저 수란우를 선발하여야 하는데 수란우는 공란우와 달라서 혈통이나 능력을 기대할 필요는 없지만 번식기능이 정상적인 것을 선발하여야 한다.
① 정상적인 성주기를 가진것, ② 2 회 이상 인공수정을 실시하여 수태하지 않은 소는 사용하지 말것, ③ 강건성 및 내병성이 있고 임신을 장해하는 질병이 없을것, ④ 포유능력이 높은 것, ⑤ 체격이 큰것 등을 선발하여 수정란이식 대상우로 이용하며,
이와같은 선발기준을 엄격히 적용하여야 만이 이식후 수태율이 향상될 것이나, 그렇지 못할 경우에는 아무리 우수한 수정란을 이식하여도 수태율이 저조하여 사육자가 직접적인 손해를 볼 수 밖에 없는 실정이다.
엄격한 선발기준에 선발된 수란우는 자연발정 및 발정유기를 실시하여 이식을 위한 준비를 실시한다. 발정유기는 분만후 50-60일경의 젖소에 prostaglandin F2Ձ(Lutalyse : Upjohn)를 대상우에 5 ml씩 근육주사한 후 2-3 일후에 발정이 발현되었을 경우에는 7-8 일후에 수정란이식을 실시하고, 2-3 일후에 발정이 발현안된 경우에는 11 일후에 2 차로 prostaglandin F2Ձ를 재 주사하여 2-3 일후 발정을 관찰하여 발정발현된 소에게는 7-8 일후에 수정란이식을 실시한다.
발정발현이 완료되고 7-8 일이 경과한 수란우의 직장내의 분비물을 제거한 후 외음부를 깨끗하게 세척한다. 수정란이식 5-10 분 전에 미근부에 국소마취제(Lidocain)를 주사하여 수란우를 진정시키고 이식을 위한 준비를 실시한다. 0.25 ml Cassou rod에 수정란이 주입된 straw를 장착하고 Cassou rod의 오염을 방지하기 위하여 sheath(덮게)를 쉬우고 그위에 외음부와 질에서 오염방지를 위하여 sheath cover를 장착하여 질을 통과한다. 자궁경관 입구에서 sheath cover를 제거하고 sheath와 Cassou rod만 자궁경관을 통과시킨다. 자궁경관을 통과한 후에는 배란이 확인된 자궁쪽으로 Cassou rod를 유도하여 자궁선단 부위까지 전진시킨후 수정란이 안전하게 이식될 수 있도록 sheath를 약간 뒤로 후퇴시켜 수정란을 주입힌다. 임신확인은 이식후 약 21 일이 경과하여도 발정이 발현되지 않는 소는 일단 임신 가능성을 가지고 이식후 약 60 일까지 예의 주시하면서 발정관찰을 한다. 이식후 약 60 일경에 직장촉진에 의한 임신감정을 실시하며 또한 필요시에는 우유의 progesteron의 측정으로 임신유무를 확인한다. 그러나 이식후 21 일만에 발정발현이 일어난 수란우는 임신실패로 판단하고 인공수정 또는 제 2차 수정란이식을 실시하도록 한다.
2. 수정란의 이식
공란우로부터 체외로 회수한 수정란을 수란우의 자궁내에 이식하는 방법은 수술적방법과 비수술적방법이 있다. 1972-1973년대에 소의 수정란이식이 북미대륙에서 실용화 될 당시는 거의 전신마취에 의한 정중선절개로서 난의 회수와 이식이 행하여졌다. 그후 경비와 시간을 절약하기 위해 여러방법이 검토되었지만 수정란이식은 전신마취보다 간단한 국소마취에 의한 겸부개복수술로 바뀌어갔다. 그러나 근래에는 마취나 수술도하지 않고 인공수정의 직장, 질법에 준한 자궁경관 경유법으로 이식하는 방법이 개발되어 널리 이용되고 있다. 본 장에서는 현재 주로 이용되고 있는 자궁경관 경유법(비수술적 이식방법)에 대하여 기술하고자 한다.
* 자궁경관 경유법
수란우에 상처를 주지 않고 농가나 목장 등의 야외에서 실시가 가능하며 1-2 인의 기술자로서 간단히 행할 수 있는 비수술적 이식방법은 수술적방법에 비해 대단히 실용적이다. 자궁경관 경유법은 인공수정의 요령으로서 이식기구를 자궁경관으로부터 자궁질내에 삽입하여 수정란을 주입하는 방법이다.
1) 수란우의 보정과 이식
보정대에 수란우를 보정하고 직장으로부터 분변을 제거한 후에 10 ml lidocaine으로 미추경막외 마취를 한다. 이어서 외음부를 잘 세척한 후에 타올로 깨끗이 닦고 알코올면으로 소독한 후 수정란이 장착된 이식기를 질내로 삽입한다.
2) 이식의 위치
외통의 선단이 자궁경관의 외구부에 달했을 때 이식기를 자궁경관을 경유하여 자궁체까지 이식기를 밀어넣어 자궁각을 2-3 회 전방으로 확장시킨 후 손으로 자궁각을 감사듯이 하여 이식기 선단을 그 속으로 밀어넣어 가능한한 자궁각심부에 삽입한다.
자궁경관에서는 가능한한 출혈이 되지 않도록 부드럽게 조작하고 이식기가 자궁각에 삽입된 후에는 곧바로 수정란을 이식하는 것이 좋다. 또한 자궁각에서 이식기를 좌우-상하로 조작하지 않도록하고 이식기의 선단이 가능한한 자궁벽에 접촉되지 않도록 한다.
3) 이식기술과 수태율
경험이 풍부한 기술자와 미숙한 기술자가 이식한 경우의 수태율은 각각 58%(23/40)와 35%(14/40)로서 큰차이가 있다(Rowe 등, 1982).
Ⅴ. 수정란이식 기술의 실용화에 있어서의 문제점
수정란이식 기술은 가축의 증식과 개량의 장점도 있으나, 실용화 함에 있어서 문제점으로는 기술적으로 복잡하고 여러 단계를 요하는 고도의 복합된 기술을 필요로 하며, 호르몬제 사용의 악영향, 경제적으로 고가의 경비를 요하는 단점도 있다. 이와같은 수정란이식의 장,단점을 비교하여 보면 다음과 같다.
* 수정란이식의 장점
① 유전적 개량효과가 대단히 높다
번 식 방 법
선발강도의 차이에 의한 개량효과
종모우
종빈우
자연종부
낮다
낮다
인공수정
대단히 높다
낮다
수정란 이식
생체에서 과배란
인공수정 비외과적으로 채란
대단히 높다
상당히 높다
도축후 난포란 채란
체외수정 체외배양
대단히 높다
다소 도움은 되나 주 목적
은 개량효과의 향상 보다
쌍자생산 등에 있다.
초음파 난포란 채란
체외수정 체외배양
대단히 높다
대단히 높다
초음파 난포란 채란
정자미세주입에 의한 체외수정
체외배양
극도로 높다
대단히 높다
배의 핵이식
체외배양
극도로 높다
극도로 높다
초음파 난포란 채란
정자 미세주입에 의한 체외수정
배의 핵이식 체외배양
최대로 높다
최대로 높다
② 쌍자생산이 가능하다. ③ 수정란의 성감별(PCR)에 의한 송아지의 성조절이 가능하다. ④ 유전자전이 등 유전공학적 기술개발의 기반을 조성한다.
* 수정란이식 기술의 문제점
① 수태율이 낮다 : 신선란의 이식으로 약 50-60%의 수태율을 얻고 있으나 농가에서는 인공수정에 필적하는 성적을 기대한다.
② 수정란의 공급 한계 : 우량계통의 소수정란의 절대수가 부족하다. 공란우의 수정란 채취수의 변이라 할 생리적인 한계가 제한요인이 되고있다.
③ 수정란이식 기술이 인공수정보다 복잡하고 그 실시에 노력이 필요하며, 숙련도도 요구된다. 따라서 높은 기술료와 소수정란 비용이 소요하다. 소오경비 보다 많은 수익이 보장될 때에만 수정란이식이 이용될 수 있을것이다.
④ 고능력우를 작출하였을 때 사양 및 관리기술이 병행 발전되어야 한다.
⑤ 유산 기타 문제점 해결을 위한 연구가 더욱 발전되어야 한다.
Ⅵ. 수정란이식에 관한 연구방향
수정란이식 기술의 실용화에 높은 관심과 열의를 가지고 있는 이유는 농업에 있어서도 신기술의 응용으로 생산성을 향상할 수 있는 방법이기 때문이다. 특히 소의 수정란이식에 관해서는 1982년 양분절단 수정란이식에 의한 일란성 쌍자우생산의 성공(Willadsen 등), 1982년의 체외수정란의 이식에 의한 자우생산의 성공(Brackett 등) 등 장래에 기대감을 갖게하는 신기술이 개발되었다. 그 후에도 수정란의 동결보존법의 개발, 난자의 체외성숙-체외수정-체외배양-비수술적 수정란이식에 의한 자우생산기술의 개발, 핵이식에 의한 복제수정란의 이식으로 자우생산에 성공, PCR법에 의한 수정란의 성판별성공 등 신기술의 개발은 계속되고 있다.
이러한 연구성과 가운데 현재상황에서 실용기술로 평가받을 수 있는 것은 소수정란의 양분절단기술과 체외수정란의 생산기술이다. 전자는 주로 고가의 유우수정란의 효율적 이용에 활용되고, 육우에서는 연구용 일란성쌍자의 생산목적으로 사용되고 있다. 후자는 주로 육우 수정란의 대량생산과 공급목적에 활용되어, 일부는 신기술개발을 위한 연구재료 공급수단으로 이용되고 있다.
2개의 수정란이식에 의한 쌍자생산은 육우자원의 확대에 직결되므로 많은 연구가 이루어지고 있다. 일본의 경우 1991년에 547조의 쌍자우가 생산되었다. 소의 쌍자생산은 번식연구에도 중요한 과제로 인식되어 초음파화상진단장치에 의한 쌍태임신의 조기진단, 수정란 사멸발생시기의 조사, 태아의 성판별 등이 시도되고 있다. 쌍태임신에 있어서 수정란배의 조기사멸이나 유-조산의 발생빈도는 단태임신보다 높으나, 인공수정후 7일째 수정란이식을 하면 분만우의 약 50%가 쌍자생산할 수 있다고 보고되고있다.
핵이식에 의한 복제우생산과 수정란의 성판별에 의한 암-수 구별생산과 같은 수정란조작기술의 연구가 활발히 진행되고 있다. 유전자공학의 진보에 의해 가축생산기술에도 새로운 연구의 흐름이 조성되고 있다. 생쥐를 시작으로 형질전환동물의 작출기술은 가까운 장래에 가축생산에도 적용될 가능성이 있다. 시급한 것은 가축을 의학용에 유용한 생리활성물질의 생산공장으로 혹은 장기이식의 공급원으로 이용함이 연구목적이다. 수정란이식 기술은 그 기반이 되는 것으로 수정란에의 외래유전자 도입에 관한 연구도 활발해지고 있다. 그 도입효율을 높이기 위하여 배성간세포(ES cells)의 분리와 배양기술의 수립을 목적으로 연구가 가축에서도 시도되고 있다.
21세기를 눈앞에 두고 가축생산 기술연구는 축산의 현실대응과 신기술개발경쟁의 양방향을 눈앞에 두고 추진하지 않으면 안되는 상황이다. 인류의 장래문제로서 인구의 증가에 따른 식량생산의 의의는 점차 중요성을 띠게된다. 영양가 높은 축산물의 안정적인 공급을 위해서도 가축의 개량증식에 직결되는 신기술개발 연구의 의의는 높아질 것으로 생각한다.
끝으로 앞에서 논급한 각종 연구진행상황이나 기술개발은 우리들의 노력의 목표다. 현재로서는 젖소의 육종을 위한 가장 실용적인 수단은 능력검정과 인공수정이며 수정란이식에 대한 실용화를 위하여는 여러가지 문제점들을 해결하기 위하여 많은 연구를 해나가야 할 것이다.
참고문헌
1. Donaldson et al., 1983. The effect of prostagladin F2a traetments in superovulated cattle on estrus response and embryo production. Theriogenology 20:279-285.
2. Rowe etal., 1982. Embryo transfer in cattle : Nonsurgical transfer. Am. J. Vet. Res., 41:1024-1028.
3. Seidel G. E. and R. Peter Elsden. 1993. Embryo transfer in dairy cattle. Hoard's Dairyman.
