산화질소 탐구!! 산소와 산화질소의 관계...

[문형철]

Review Article

Breathing new life into nitric oxide signaling: A brief overview of the interplay between oxygen and nitric oxide☆

Author links open overlay panelDouglas D. Thomas

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https://doi.org/10.1016/j.redox.2015.05.002Get rights and content

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Abstract

Nitric oxide (•NO, nitrogen monoxide) is one of the most unique biological signaling molecules associated with a multitude of physiologic and pathological conditions. In order to fully appreciate its numerous roles, it is essential to understand its basic biochemical properties. Most signaling effector molecules such as steroids or proteins have a significant life-span and function through classical receptor–ligand interactions. •NO, however, is a short-lived free-radical gas that only reacts with two types of molecules under biological conditions; metals and other free radicals.

These simple interactions can lead to a myriad of complex intermediates which in turn have their own phenotypic effects. For these reasons, responses to •NO often appear to be random or contradictory when outcomes are compared across various experimental settings. This article will serve as a brief overview of the chemical, biological, and microenvironmental factors that dictate •NO signaling with an emphasis on •NO metabolism. The prominent role that oxygen (dioxygen, O2) plays in •NO metabolism and how it influences the biological effects of •NO will be highlighted. This information and these concepts are intended to help students and investigators think about the interpretation of data from experiments where biological effects of •NO are being elucidated.

• 산소는 산화질소 합성 및 신진대사 속도를 결정하는 주요 요인입니다.
• ●생물학적 조건에서 산화질소는 금속 및 기타 자유 라디칼과만 반응합니다.
• 산소는 산화질소의 반감기, 농도 및 확산 거리를 결정합니다.
• ●단백질은 농도와 시간에 따라 산화질소에 반응합니다.
• 산소와 산화 환원 환경은 산화질소에 대한 신호 반응에 큰 영향을 미칩니다.
  
  

Abstract

산화질소(-NO, 일산화질소)는

다양한 생리적 및 병리학적 상태와 관련된

가장 독특한 생물학적 신호 전달 분자 중 하나입니다.

산화질소의 다양한 역할을 제대로 이해하기 위해서는

기본적인 생화학적 특성을 이해하는 것이 필수적입니다.

스테로이드나 단백질과 같은

대부분의 신호 전달 효과 분자는

고전적인 수용체-리간드 상호작용을 통해 상당한 수명과 기능을 갖습니다.

-그러나-

NO는

생물학적 조건에서

금속 및 기타 자유 라디칼이라는 두 가지 유형의 분자와만 반응하는

수명이 짧은 자유 라디칼 기체입니다.

이러한

단순한 상호작용은

무수히 많은 복잡한 중간체를 생성할 수 있으며,

이 중간체들은 각각 고유한 표현형 효과를 가지고 있습니다.

These simple interactions can lead to a myriad of complex intermediates which in turn have their own phenotypic effects. For these reasons, responses to •NO often appear to be random or contradictory when outcomes are compared across various experimental settings. 

이러한 이유로

다양한 실험 환경에서 결과를 비교할 때

-NO에 대한 반응이 무작위로 나타나거나 모순되는 경우가 많습니다.

이 글에서는

-NO대사에 중점을 두고

-NO신호를 결정하는 화학적, 생물학적, 미세 환경적 요인에 대해

간략하게 설명합니다.

산소(dioxyten, O2)가

-NO대사에서 수행하는 중요한 역할과

-NO의 생물학적 효과에 미치는 영향에 대해 중점적으로 설명합니다.

The prominent role that oxygen (dioxygen, O2) plays in •NO metabolism and how it influences the biological effects of •NO will be highlighted. This information and these concepts are intended to help students and investigators think about the interpretation of data from experiments where biological effects of •NO are being elucidated.

이 정보와 이러한 개념은 학생과 연구자가 -NO의생물학적 효과를 규명하는 실험의 데이터 해석에 대해 생각할 수 있도록 돕기 위한 것입니다.

Graphical abstract

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Keywords

Nitric oxide

Diffusion

Oxygen

Metabolism

Half-life

Signaling

Introduction to nitric oxide

Nitric oxide is a free radical, which is any molecule with an unpaired electron. Before •NO was found to be endogenously synthesized in humans in the 1980s, most free radicals were largely thought to have deleterious biological effects [1]. For example oxygen-, nitrogen-, and carbon-centered radicals are strong oxidants that can indiscriminately damage a host of macromolecules including DNA, lipids, and proteins. The most notable examples include the hydroxyl radical (•OH), superoxide (O2-), nitrogen dioxide (•NO2), and carbonate anion radical (•CO2−) [2]. Nitric oxide, on the other hand, is considered a relatively stable free radical and under biological conditions it only reacts with two types of molecules: metals and other free radicals [3]. In this context, •NO is designated to be stable because it does not spontaneously decay or react with itself (dimerize) [4]. Although •NO rapidly reacts with other free radicals, the reaction of •NO with another •NO molecule to form N2O2 does not occur under biological conditions based largely on entropic grounds [1].

Unlike other biologically relevant free radicals, •NO does not directly undergo one-electron oxidation/reduction reactions to form the nitrosonium cation (NO+) or nitroxyl anion (NO−), or its conjugate acid (HNO), respectively [5], [6]. Although these species can be formed via redox reactions between •NO and metals or O2, a significant thermodynamic barrier precludes their direct formation. For these reasons, •NO is not considered a particularly good oxidant or reductant. Nevertheless •NO does rapidly react with numerous cellular targets that contribute to its short biological life-time, which in most circumstances is less than 2 s [7]. When compared to other signaling molecules, this is extremely short. However, in relation to other free radicals, whose life-span is often on the order of milliseconds, this is a relatively long time. Being composed of only one atom of nitrogen and one atom of oxygen, •NO is one of the smallest known signaling molecules. Although it is a free radical with an unpaired electron, it does not possess an electrical charge. These are important properties because they allow •NO to readily cross biological membranes by passive diffusion. In addition, •NO is soluble in both hydrophobic and hydrophilic environments. In fact, it is more soluble in hydrophobic environments by a factor of about 10, which turns out to be an important determinant of its biological actions and reactivity [8].

산화 질소 소개

산화 질소는

자유 라디칼로,

전자가 짝을 이루지 않은 분자입니다.

1980년대에

-NO가 인체에서 내인성적으로 합성되는 것으로 밝혀지기 전에는

대부분의 자유 라디칼은

대부분 생물학적으로 해로운 영향을 미치는 것으로 여겨졌습니다 [1].

예를 들어

산소, 질소, 탄소 중심의 활성산소는

DNA, 지질, 단백질 등 다양한 거대 분자를 무차별적으로 손상시킬 수 있는

강력한 산화제입니다.

가장 대표적인 예로는

하이드 록실 라디칼 (-OH),

슈퍼 옥사이드 (O2-),

이산화질소 (-NO2) 및

탄산염 음이온 라디칼 (-CO2-) [2]이 있습니다.

반면

산화 질소는

비교적 안정적인 자유 라디칼로 간주되며

생물학적 조건에서 금속 및 기타 자유 라디칼의 두 가지 유형의 분자와만 반응합니다 [3].

이러한 맥락에서

-NO는 자연적으로 붕괴하거나

스스로 반응(이량 체화)하지 않기 때문에

안정한 것으로 지정됩니다 [4].

NO는

다른 자유 라디칼과 빠르게 반응하지만,

-NO와 다른 -NO 분자가 반응하여

N2O2를 형성하는 것은

주로 엔트로피에 근거한 생물학적 조건에서는 일어나지 않습니다 [1].

다른 생물학적으로 관련된

자유 라디칼과 달리

-NO는 니트로소늄 양이온(NO+) 또는

니트록실 음이온(NO-) 또는

그 공액산(HNO)을 각각 형성하기 위해

직접 1전자 산화/환원 반응을 거치지 않습니다 [5], [6].

이러한 종은

-NO와 금속 또는 O2 사이의 산화 환원 반응을 통해 형성될 수 있지만,

상당한 열역학적 장벽으로 인해 직접 형성되지 못합니다.

이러한 이유로

-NO는 특별히 좋은 산화제나 환원제로 간주되지 않습니다.

그럼에도 불구하고

-NO는 수많은 세포 표적과 빠르게 반응하여

대부분의 상황에서

2초 미만의 짧은 생물학적 수명에 기여합니다 [7].

다른 신호 분자와 비교할 때

이는

매우 짧은 시간입니다.

그러나

수명이 밀리초 수준인 다른 활성산소와 비교하면

비교적 긴 시간입니다.

질소 원자와 산소 원자로만 구성된 -NO는

알려진 신호 분자 중

가장 작은 분자 중 하나입니다.

전자가 짝을 이루지 않은 자유 라디칼이지만

전하를 가지고 있지 않습니다.

이러한 특성은

-NO가 수동적 확산을 통해

생체막을 쉽게 통과할 수 있도록 하기 때문에

중요한 특성입니다.

또한

-NO는 소수성 환경과

친수성 환경 모두에 용해됩니다.

실제로

소수성 환경에서 약 10배 더 잘 용해되며,

이는 생물학적 작용과 반응성을 결정하는 중요한 요인으로 밝혀졌습니다 [8].

Biological targets of •NO

Iron

As mentioned above, in a cellular setting, •NO will only react with transition metals and other free radicals. The majority of •NO/metal reactions involve ferrous iron (Fe2+) and to a lesser extent copper (Cu+) [3]. There are several forms of iron in cells and •NO is known to react with all of them, albeit to varying degrees. A large proportion of iron of exists in the form of heme (iron protoporphyrin), where it is used for enzyme catalysis or to transport O2. In erythrocytes and myocytes, the prominent heme-containing proteins are hemoglobin and myoglobin. The main function of these proteins is to transport dioxygen (O2), which binds directly to the ferrous heme. In these proteins, •NO can bind reversibly to the ferrous heme in the absence of O2, or it can react with an O2 bound to the heme [9]. The reaction and binding of •NO to reduced heme leads to the formation of iron-nitrosyls via a process called nitrosylation Eq. (1). In the absence of O2, this is a relatively stable bond. On the other hand, in the presence of O2, its reaction with the •NO-bound iron center converts it to nitrate (NO3−) Eq. (2). Conversely, •NO can react with oxyHb, which also forms NO3− Eq. (3). Reactions (2), (3) are extremely fast, diffusion limited reactions, and result in the rapid scavenging of •NO. This is one of the main consumptive mechanisms of •NO in the vasculature [4].(1)Fe2++•NO→Fe2+−•NO(2)Fe2+−•NO+O2→Fe3++NO−3(3)Fe2+−O2+•NO→Fe3++NO−3

In non-erythroid cells, the reactions of •NO with heme-proteins have important signaling consequences as opposed to merely scavenging bioavailable •NO. One of the most important examples is the reaction of •NO with soluble guanylyl cyclase (sGC). This protein converts GTP to cGMP and binding of •NO to its heme center leads to a 100-fold increase in its catalytic activity [10].

Another key population of cellular iron is “chelatable iron” or the chelatable iron pool (CIP). This is iron in transition between cellular uptake and incorporation into iron storage protein (ferritin) or the catalytic site of enzymes. The CIP is methodologically defined as being the population of cellular iron that is accessible to chemical iron chelators [11]. It is mostly cytosolic but also has mitochondrial and nuclear components. The CIP is redox-active and represents a small but chemically significant population of total cellular iron (<3%). The rapid reaction of •NO with the CIP and cellular thiols results in the formation of dinitrosyliron complexes (DNIC, (RS−)2Fe+(NO+)2) Eq. (4) [12]. In fact, 100% of the CIP is quantitatively converted into DNIC upon cellular exposure to •NO [13]. Moreover, DNIC are the most abundant population of •NO-derived cellular adducts, much more than S-nitrosothiols, heme nitrosyls, or nitrotyrosine [14]. The consequences of DNIC formation can range from iron sequestration and signaling to participating in S-nitrosothiol (RSNO) formation [15], [16], [17], [18], [19], [20].(4)Fe2++3•NO+2RS−+H+→{(RS−)2Fe+(NO+)2}+½(N2O+H2O)

Cellular iron is also used for the activity of non-heme iron oxygenases, which are important enzymes that catalyze a wide variety of degretory and biosynthetic reactions. The source of iron for these enzymes is the CIP [21], [22], [23]. Nitric oxide can bind reversibly to the catalytic iron and inhibit a variety of these enzymes to varying degrees. As O2 is the normal substrate for these enzymes, the reaction of •NO at the iron site is competitive and it will depend on the relative concentrations of the two gases. As a general rule, any protein that will bind O2 will also bind •NO (and CO) with either greater or lesser affinity. This will depend on the iron coordination and other bound ligands as well as the oxidation state. Lastly, there are iron–sulfur proteins which are used for redox and electron transfer reactions in a diverse set of proteins. The interaction of •NO with iron–sulfur proteins is usually destructive but they may also be involved in the formation of protein-bound DNIC [24], [25].

NO의 생물학적 표적

철

위에서 언급했듯이,

세포 환경에서 -NO는

전이 금속 및 기타 자유 라디칼과만 반응합니다.

대부분의 -NO/금속 반응은

철(Fe2+)과 구리(Cu+)가 관여하며,

그 정도는 덜합니다 [3].

세포에는 여러 형태의 철이 존재하며

-NO는 정도는 다르지만

모든 철과 반응하는 것으로 알려져 있습니다.

철의 대부분은

헴(철 프로토포르피린)의 형태로 존재하며,

효소 촉매 작용이나 산소 운반에 사용됩니다.

적혈구와 근세포에서 대표적인 헴 함유 단백질은

헤모글로빈과 미오글로빈입니다.

이 단백질의 주요 기능은

철 헴에 직접 결합하는 산소(O2)를 운반하는 것입니다.

이러한 단백질에서

-NO는 O2가 없는 경우

철 헴에 가역적으로 결합하거나

헴에 결합된 O2와 반응할 수 있습니다 [9].

NO와 환원된 헴의 반응 및 결합은 니트로실화 식 (1)이라는 과정을 통해

철-니트로실의 형성으로 이어집니다.

O2가 없는 경우,

이는 비교적 안정적인 결합입니다.

반면, O2가 존재하면

-NO 결합 철 중심과 반응하여

질산염(NO3-)으로 전환됩니다(식 (2)).

반대로,

-NO는 oxyHb와 반응하여 NO3-를 형성할 수 있습니다(식 (3)).

반응 (2), (3 )은 매우 빠르고 확산이 제한된 반응으로,

-NO를 빠르게 제거합니다.

이것은 혈관계에서

-NO의 주요 소모 메커니즘 중 하나입니다 [4].

(1)Fe2++-NO→Fe2+--NO

(2)Fe2+--NO+O2→Fe3++NO-3

(3)Fe2+-O2+-NO→Fe3++NO-3

비적혈구 세포에서

-NO와 헴 단백질의 반응은

단순히 생체 이용 가능한 -NO를 제거하는 것과는

달리 중요한 신호 결과를 가져옵니다.

가장 중요한 예 중 하나는

-NO와 가용성 구아닐 시클라제 (sGC)의 반응입니다.

이 단백질은 GTP를 cGMP로 전환하고

-NO가 헴 중심에 결합하면

촉매 활성이 100배 증가합니다 [10].

세포 철의 또 다른 주요 집단은

"킬러블 철" 또는 킬러블 철 풀(CIP)입니다.

이는 세포 흡수와 철 저장 단백질(페리틴) 또는

효소의 촉매 부위로의 통합 사이의 전환기에 있는

철분입니다.

CIP는 방법론적으로 화학적 철 킬레이터에 접근할 수 있는 세포 철의 집단으로 정의됩니다 [11]. 대부분 세포질이지만 미토콘드리아 및 핵 성분도 포함되어 있습니다. CIP는 산화 환원 활성이며 작지만 화학적으로 중요한 총 세포 철분(<3%) 집단을 나타냅니다.

NO와 CIP 및 세포 티올의 빠른 반응은 디니트로실철 복합체(DNIC, (RS-)2Fe+(NO+)2) 식 (4) [12]의 형성을 초래합니다.

실제로 세포가 -NO에 노출되면 CIP의 100%가 DNIC로 정량적으로 전환됩니다 [13]. 또한 DNIC는 S-니트로소티올, 헴 니트로실 또는 니트로티로신보다 훨씬 더 풍부한 -NO 유래 세포 부가체 집단입니다 [14]. DNIC 형성의 결과는 철 격리 및 신호 전달부터 S-니트로소티올(RSNO) 형성 참여에 이르기까지 다양합니다 [15], [ 16 ], [17], [18], [19], [20].

(4)Fe2++3-NO+2RS-+H+→{(RS-)2Fe+(NO+)2}+½(N2O+H2O)

세포 철분은 또한 비헴철 산소화 효소의 활성에도 사용되는데, 비헴철 산소화 효소는 다양한 배설 및 생합성 반응을 촉매하는 중요한 효소입니다. 이러한 효소의 철분 공급원은 CIP [21], [ 22], [23]입니다.

산화 질소는

촉매 철에 가역적으로 결합하여

이러한 다양한 효소를 다양한 정도로 억제할 수 있습니다.

O2는

이러한 효소의 정상적인 기질이기 때문에

철 부위에서 -NO의 반응은 경쟁적이며

두 가스의 상대적 농도에 따라 달라집니다.

일반적으로 O2와 결합하는

모든 단백질은 -NO(및 CO)와도 더 크거나 더 작은 친화력으로 결합합니다.

이는 철 배위 및 기타 결합 리간드와 산화 상태에 따라 달라집니다.

마지막으로,

다양한 단백질에서 산화 환원 및 전자 전달 반응에 사용되는

철-황 단백질이 있습니다.

NO와 철-황 단백질의 상호 작용은

일반적으로 파괴적이지만

단백질 결합 DNIC의 형성에도 관여할 수 있습니다 [24], [25].

Free radicals

Paired electrons are stable and nearly 100% of all electrons in our bodies are paired. Just as •NO reacts with iron and other transition metals because they have unpaired elections (in their d orbitals), •NO reacts with free radicals because they possess unpaired elections as well. In addition to •NO, there are several free radicals of biological interest. Superoxide (O2-) is probably the most notable. Superoxide is the one electron reduction product of O2 and it is formed as a natural byproduct of oxidative metabolism. It is also the substrate for several types of enzymes as well as the product; superoxide dismutase and xanthine oxidase, respectively. The reaction of •NO with O2- is near diffusion limited and the product is peroxynitrite (ONOO−) [26]. Peroxynitrite can go on to react with numerous other molecules including •NO and O2- [27]. In general, ONOO− performs strong oxidative chemistry. Depending on the relative flux rates of •NO and O2-, however, the net effect of ONOO− formation is a decrease in the concentrations of both species. The most significant effect of ONOO− may simply be attributed to scavenging of •NO and O2-, thereby diminishing their signaling capabilities [28]. There are other radical–radical reactions with •NO that have biological consequences (for detailed reviews on oxidative stress see and •NO reactivity see [3], [6], [9], [29], [30]).

자유 라디칼

짝을 이룬 전자는 안정적이며

우리 몸의 모든 전자의 거의 100%가 짝을 이루고 있습니다.

NO가

철 및 기타 전이 금속과 반응하는 이유는

이들이 짝을 이루지 않은 전자를 가지고 있기 때문이며,

-NO도 짝을 이루지 않은 전자를 가지고 있기 때문에

자유 라디칼과 반응합니다.

NO 외에도

생물학적으로 관심의 대상이 되는

자유 라디칼은 여러 가지가 있습니다.

가장 주목할 만한 활성산소는

아마도 슈퍼옥사이드(O2-)일 것입니다.

슈퍼옥사이드는

O2의 전자 환원 생성물 중 하나로

산화 대사의 자연적인 부산물로 형성됩니다.

또한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 크산틴 산화효소 등

여러 종류의 효소의 기질이 되기도 합니다.

NO와 O2-의 반응은

거의 확산이 제한되며

생성물은 과산화아질산염(ONOO-)입니다 [26].

퍼옥시니트라이트는

-NO 및 O2-를 포함한 수많은 다른 분자와 계속 반응할 수 있습니다 [27].

일반적으로

ONOO-는 강력한 산화 화학 작용을 수행합니다.

그러나

-NO와 O2-의 상대적 플럭스 속도에 따라

ONOO- 형성의 순 효과는 두 종의 농도를 감소시키는 것입니다.

ONOO-의 가장 중요한 효과는

단순히 -NO와 O2-의 제거로 인한 신호 전달 능력 감소에 기인할 수 있습니다 [28].

생물학적 결과를 초래하는 -NO와의 다른 라디칼-급진적 반응이 있습니다( 산화 스트레스에 대한 자세한 검토는 [3], [ 6], [9], [29], [ 30] 참조 및 -NO 반응성 참조).

Nitric oxide production

In mammalian systems the dominant mode of •NO production is via enzymatic synthesis from one of three isoforms of nitric oxide synthase (neuronal nNOS, inducible iNOS, and endothelial eNOS, or NOSI, NOSII, and NOSIII, respectively). The differences between each NOS are based on a variety of factors including their tissue distributions as well as their modes of expression‎ and regulation. nNOS and eNOS are constitutively expressed and generally produce lower amounts of •NO (nM) for short periods of time. iNOS however is “inducible” and it becomes upregulated in response to various stimuli including cytokines and bacterial endotoxins. It is capable of producing greater amounts of •NO for prolonged periods of time. The NOS enzymes are flavoproteins that transfer electrons via NADH, FAD, FMN, and Fe2+. They also require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4). Substrates for NOS enzymes are dioxygen (O2) and the amino acid l-arginine (Arg), with the products being •NO and the amino acid l-citrulline Eq. (5) [31], [32].(5)L-Arg+O2+NADPH→NOSL-Cit+NADP++•NO

The amount of •NO being synthesized from NOS depends on a variety of factors including substrate and cofactor availability. Posttranslational modifications, such as phosphorylation, as well as tetrahydrobiopterin (BH4) availability can both influence the rate of •NO synthesis. For example, BH4 deficiency can result in uncoupling of the enzyme and favor the generation of O2- [33]. Arginine is usually not a limiting substrate except in disease states but other enzymes such as arginase can compete with NOS for its availability. Under conditions where there is an abundance of substrates and cofactors, the most significant determinant of the rate/amount of •NO synthesis is the local O2 concentration. The KM for O2 for each of the NOS isoforms varies widely (eNOS=23 µM, iNOS=135 µM, and nNOS=350 µM) [32]. At O2 concentrations below the KM for O2, the rate of •NO synthesized from each NOS will be proportional to the O2 concentration and it will increase linearly as the O2 concentration raises. For example, eNOS, with the lowest KM, will maximally produce •NO over a range of physiologic O2 concentrations. For nNOS, however, the production of •NO will increase over a wide range of O2 concentrations. Fig. 1A demonstrates how differences in O2 concentrations affect total •NO production from iNOS in cultured macrophages [34]. At 24 h, total •NO synthesis at 1% O2 is about half the amount that is produced at 21% O2. This is what would be predicted as 1% O2 is well below the KM for O2 for iNOS.

산화질소 생성

포유류 시스템에서

-NO 생성의 지배적인 방식은

산화질소 합성효소의

세 가지 동형 (신경 nNOS, 유도성 iNOS 및 내피 eNOS, 또는 각각 NOSI, NOSII 및 NOSIII) 중

하나에서

효소 합성을 통해 이루어집니다.

각 NOS의 차이는

조직 분포, 발현 및 조절 방식 등

다양한 요인에 기반합니다.

nNOS와 eNOS는

구성적으로 발현되며

일반적으로 짧은 기간 동안 적은 양의 -NO(nM)를 생성합니다.

그러나

iNOS는 "유도 가능"하며

사이토카인과 박테리아 내독소를 포함한

다양한 자극에 반응하여 상향 조절됩니다.

따라서

장기간에 걸쳐 더 많은 양의

-NO를 생성할 수 있습니다.

NOS 효소는

NADH, FAD, FMN 및 Fe2+를 통해 전자를 전달하는

플라보단백질입니다.

또한 보조 인자인

테트라하이드로비옵테린 (BH4)이 필요합니다.

NOS 효소의 기질은

산소(O2)와 아미노산 l-아르기닌(Arg)이며,

생성물은 -NO와 아미노산 l-시트룰린입니다. (5) [31], [32].(

5)L-Arg+O2+NADPH→NOSL-Cit+NADP++-NO

NOS에서 합성되는 -NO의 양은

기질 및 보조인자 가용성을 포함한

다양한 요인에 따라 달라집니다.

인산화와 같은번역 후 변형과

테트라하이드로비옵테린(BH4) 가용성 모두

-NO 합성 속도에 영향을 미칠 수 있습니다.

예를 들어,

BH4가 결핍되면 효소의 결합이 해제되어

O2-의 생성이 촉진될 수 있습니다 [33].

아르기닌은 일

반적으로 질병 상태를 제외하고는

제한적인 기질이 아니지만

아르기나아제와 같은 다른 효소는 가용성을 위해 NOS와 경쟁할 수 있습니다.

기질과 보조 인자가 풍부한 조건에서

-NO 합성 속도/량을 결정하는 가장 중요한 요소는

국소 O2 농도입니다.

각 NOS 이소폼에 대한 O2의 KM은 매우 다양합니다(eNOS=23 µM, iNOS=135 µM, nNOS=350 µM) [32].

O2의 KM 이하의 O2 농도에서는 각 NOS에서 합성되는 -NO의 비율이 O2 농도에 비례하며, O2 농도가 높아질수록 선형적으로 증가합니다. 예를 들어, 가장 낮은 KM을 가진 eNOS는 다양한 생리적 산소 농도 범위에서 -NO를 최대로 생성합니다. 그러나 nNOS의 경우, -NO의 생성은 광범위한 O2 농도에 걸쳐 증가합니다. 그림 1A는배양된 대식세포에서 O2 농도의 차이가 iNOS의 총 -NO 생성에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다 [34].

24시간 동안 1% O2에서 총 -NO 합성은 21% O2에서 생성되는 양의 약 절반입니다.

이는 1% O2가 iNOS의 O2에 대한 KM보다 훨씬 낮기 때문에 예측할 수 있는 수치입니다.

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Fig. 1. Oxygen determines the rate of •NO production. (A) Enzymatic synthesis of •NO is a function of O2 concentration. RAW 264.7 murine macrophages were cultured at 1% or 21% O2 and stimulated with LPS (t=0). Total •NO synthesis was assessed by measuring NO2-/NO3− in the media at the indicated time points by chemiluminescence. (B) NOS independent mechanisms of •NO synthesis.

그림 1. 산소는 -NO 생성 속도를 결정합니다.

(A) -NO의 효소 합성은 O2 농도의 함수입니다. RAW 264.7 쥐 대식세포를 1% 또는 21% O2에서 배양하고 LPS로 자극했습니다(t=0). 총 -NO 합성은 화학발광을 통해 지정된 시점에 배지 내 NO2-/NO3-를 측정하여 평가했습니다.

(B) -NO 합성의 NOS 독립적 메커니즘.

In addition to •NO synthesis from NOS enzymes, there are other biological mechanisms to generate •NO. These include nitrite reduction by heme proteins such as hemoglobin Eq. (6) as well as enzymatic reduction of nitrite by non-NOS enzymes such as xanthine oxidoreductase Eq. (7) (Fig. 1B) [35], [36], [37].

(6)NO−2+HbFe2++H+→•NO+HbFe3++OH−

(7)XO+NO−2+e-→•NO

Unlike NOS-mediated •NO synthesis which requires O2, the generation of •NO by the above reactions is enhanced at low O2. They are thought to serve as compensatory mechanisms for •NO synthesis under hypoxic conditions. Nitric oxide can also be generated by the acidification of nitrite in tissue compartments or cellular organelles where the pH is low Eq. (8) [38]. This reaction is known to occur in the low pH environment of the stomach from dietary nitrite.

(8)NO−2+H+→HNO2, 2HNO2→N2O3+H2O, N2O3→•NO+•NO2

As far as total body •NO synthesis, the above 3 mechanisms appear to be minor contributors. However, they do account for the physiologic and therapeutic effects of dietary and pharmacologic nitrite. Although nitrate and nitrite were once thought to be carcinogenic, it is now becoming increasingly clear that the physiologic benefits derived from their ability to generate •NO far outweigh their deleterious properties [39].

NOS 효소에 의한

-NO 합성 외에도

-NO를 생성하는 다른 생물학적 메커니즘이 있습니다.

여기에는 헤모글로빈 (식 (6) 과 같은 헴 단백질에 의한 아질산염 환원과 크산틴 산화환원효소 (식 ( 7) (그림 1B) [35], [ 36], [37]와 같은 비 NOS 효소에 의한 아질산염의 효소적 환원이 포함됩니다.

(6)NO-2+HbFe2++H+→-NO+HbFe3++OH-

(7)XO+NO-2+e-→-NO

O2가 필요한 NOS 매개 -NO 합성과 달리, 위의 반응에 의한 -NO 생성은 낮은 O2에서 향상됩니다. 이는 저산소 조건에서 -NO 합성에 대한 보상 메커니즘으로 작용하는 것으로 생각됩니다. 산화 질소는 또한 pH가 낮은 조직 구획이나 세포 소기관에서 아질산염의 산성화에 의해 생성될 수 있습니다(식 (8) [38]). 이 반응은 식이 아질산염으로 인한 위장의 낮은 pH 환경에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다.

(8)NO-2+H+→NO2, 2NO2→N2O3+H2O, N2O3→NO+-NO2

체내 -NO 합성에 관한 한, 위의 3가지 메커니즘은 미미한 기여를 하는 것으로 보입니다. 하지만 식이 및 약리학적 아질산염의 생리적 및 치료 효과를 설명하는 데는 중요한 역할을 합니다. 질산염과 아질산염은 한때 발암 물질로 여겨졌지만, 이제는 -NO 생성 능력에서 파생되는 생리적 이점이 해로운 특성보다 훨씬 더 크다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다 [39].

Nitric oxide consumption

Although it is well understood how •NO is produced under biological conditions, much less is known about its mode of catabolism. The half-life of •NO is short (0.1–2 s), which is a function of the mechanisms by which •NO is consumed by cells [7]. These consumptive mechanisms are determined by the rate at which •NO reacts with various cellular targets. Although •NO only reacts with transition metals and other free radicals including O2, there are a multitude of potential reactants that will differ based on the cell type and local redox environment. Regardless of what the cellular reactants are, cellular consumption of •NO most likely is not simply the result of stoichiometric reactions with cellular targets. Continuous exposure to •NO demonstrated that cells consume •NO at a constant rate which did not appear to be saturable [7]. This indicates that the reactants for •NO are either continuously produced or rapidly recycled. As mentioned above one well-known reaction of •NO is with oxyhemoglobin to form nitrate (NO3−) (Eqs. (2), (9)). This is an extremely rapid reaction and is the major consumptive mechanism of •NO in the vasculature.

(9)•NO+oxyHb→MetHb+NO−3

In non-erythroid cells, however, there are a multitude of other potential reactants for •NO including radicals like superoxide (O2-), which forms nitrate (NO3−), or hypervalent metal oxo species (Fe4+=O), which form nitrite [9]. Nitric oxide will also react with many heme and non-heme iron proteins as well as chelatable iron, ultimately being oxidized to nitrate and nitrite. It is important to point out that the exact mechanism(s) by which •NO is metabolized by cells is not precisely known. This is because •NO has numerous cellular targets and therefore the means by which it is consumed is the sum of several dominant reactions. The contribution of each reaction toward the rate of •NO consumption is a function of the rate of each reaction and the concentration of each reactant. Fig. 2A demonstrates that when a bolus of 200 nM •NO is added to a suspension of cells, it disappears over time via its reactions with various cellular targets. It can be seen that the rate of •NO disappearance in the presence of cells is much more rapid than its disappearance in the absence of cells, which is known to occur via a direct reaction with O2 in solution [7], [34].

산화질소 소비

생물학적 조건에서

-NO가 어떻게 생성되는지는 잘 알려져 있지만,

그 이화 작용 방식에 대해서는 알려진 바가 훨씬 적습니다.

NO의 반감기는

짧으며(0.1-2초),

이는 세포에서 -NO가 소비되는 메커니즘의 기능입니다 [7].

이러한 소모 메커니즘은

-NO가 다양한 세포 표적과 반응하는 속도에 따라 결정됩니다.

NO는 전이 금속 및 O2를 포함한 기타 자유 라디칼과만 반응하지만, 세포 유형과 국소 산화 환원 환경에 따라 반응할 수 있는 잠재적 반응물은 다양합니다. 세포 반응물이 무엇이든 간에, -NO의 세포 내 소비는 단순히 세포 표적과의 화학량론적 반응의 결과가 아닐 가능성이 높습니다. NO에 지속적으로 노출하면 세포가 포화 상태가 되지 않는 일정한 속도로 -NO를 소비하는 것으로 나타났습니다 [7]. 이는 -NO의 반응물이 지속적으로 생성되거나 빠르게 재활용된다는 것을 나타냅니다. 위에서 언급했듯이 -NO의 잘 알려진 반응 중 하나는 옥시헤모글로빈과 질산염(NO3-)을 형성하는 것입니다(식 (2), (9)). 이것은 매우 빠른 반응이며 혈관계에서 -NO의 주요 소모 메커니즘입니다.

(9)-NO+oxyHb→MetHb+NO-3

그러나 비적혈구 세포에서는 질산염(NO3-)을 형성하는 슈퍼옥사이드(O2-)나 아질산염을 형성하는 고가 금속 옥소 종(Fe4+=O)과 같은 라디칼을 포함하여 -NO의 잠재적 반응물이 다양하게 존재합니다 [9]. 산화 질소는 또한 많은 헴 및 비헴 철 단백질과 킬레이트화 가능한 철과 반응하여 궁극적으로 질산염과 아질산염으로 산화됩니다. 중요한 점은 -NO가 세포에서 대사되는 정확한 메커니즘은 정확히 알려져 있지 않다는 점입니다. 이는 -NO가 수많은 세포 표적을 가지고 있기 때문에 -NO가 소비되는 수단은 여러 가지 지배적인 반응의 합이기 때문입니다. NO 소비 속도에 대한 각 반응의 기여도는 각 반응의 속도와 각 반응물의 농도의 함수입니다. 그림 2A는세포 현탁액에 200nm의 -NO를 첨가하면 다양한 세포 표적과의 반응을 통해 시간이 지남에 따라 사라지는 것을 보여줍니다. 세포가 있을 때 -NO가 사라지는 속도는 세포가 없을 때 사라지는 속도보다 훨씬 빠르며, 이는 용액에서 O2와 직접 반응을 통해 발생하는 것으로 알려져 있습니다 [7], [34].

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Fig. 2. Oxygen determines the rate of •NO catabolism.

RAW 264.7 cells were trypsinized and suspended into a sealed, water-jacketed, temperature-controlled (37 °C) reaction chamber with constant stirring. The reaction chamber was equipped with both •NO and O2 electrodes connected to an Apollo 4000 free radical analyzer (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Headspace in the vessel was negligible compared to the vessel volume to ensure that the rate of •NO volatilization was insignificant compared with its reaction in solution. Reactions were initiated by injection of a saturated •NO solution with a gas-tight syringe, and •NO metabolism was measured using an •NO-selective electrode (amiNO-700, Innovative Instruments, Tampa, FL, USA). (A) At time “0”, the cells were treated with a bolus of •NO (200 nM) and the disappearance of •NO was measured over time. Or •NO added to the reaction chamber in the absence of cell. (B) Disappearance of •NO was measured in cells treated with 200 nM •NO (at 21% O2) or the cells were allowed to consume O2 in the reaction chamber until a level of 1% O2 was achieved before the addition of •NO. (C) The direct relationship between the O2 concentration and the rate of •NO metabolism.

그림 2. 산소는 -NO 이화 작용의 속도를 결정.

RAW 264.7 세포를 트립신화하여 밀폐된 워터 재킷의 온도 조절(37°C) 반응 챔버에 넣고 계속 저어주었습니다. 반응 챔버에는 Apollo 4000 자유 라디칼 분석기(미국 플로리다주 사라소타에 위치한 World Precision Instruments)에 연결된 -NO 및 O2 전극이 모두 장착되어 있었습니다. 용기의 헤드 스페이스는 용기의 부피에 비해 무시할 수 있을 정도로 작아 -NO 휘발 속도가 용액에서의 반응에 비해 미미했습니다. 기밀 주사기로 포화 -NO 용액을 주입하여 반응을 시작하고, -NO 선택적 전극(amiNO-700, Innovative Instruments, 미국 플로리다주 탬파)을 사용하여 -NO 대사를 측정했습니다.

(A) 시간 "0"에서 세포를 -NO(200 nM)로 처리하고 시간에 따른 -NO의 소멸을 측정했습니다. 또는 세포가 없는 상태에서 반응 챔버에 -NO를 추가했습니다.

(B) -NO의 소멸은 200 nM -NO(21% O2에서)로 처리된 세포에서 측정하거나 -NO를 첨가하기 전에 1% O2 수준에 도달할 때까지 반응 챔버에서 세포가 O2를 소비하도록 허용했습니다.

(C) O2 농도와 -NO 대사 속도 사이의 직접적인 관계.

Although the types of specific cellular reactants for •NO may differ between cell types, research has shown that the predominant mechanisms of •NO metabolism require O2 [7]. This is illustrated in Fig. 2B, which demonstrates the rates of •NO disappearance in the presence of cells at two different O2 concentrations (21% and 1%). For the same number of cells, •NO is metabolized much more rapidly at 21% O2 than at 1% O2. Therefore, there is a direct relationship between the O2 concentration and the rate of cellular •NO metabolism (Fig. 2C). The discovery that •NO is metabolized by cells in an O2-dependent manner may not at first seem surprising as it is well-known that •NO directly reacts with O2 (autoxidation, Eq. (10)).

(10)4•NO+O2+2H2O→4H++4NO−2

Rate law: −d[•NO]/dt =4kaq[•NO]2[O2]

There are two critical pieces of evidence that rule out autoxidation as a significant means of •NO metabolism. First, the autoxidation reaction is second-order in •NO concentration whereas the metabolism of •NO by cells follows first-order kinetics Eq. (11) [7], [8].(11)−d[•NO]/dt =kobs[O2][•NO][Cell]kobs=5.38=±0.3×10−4 M−1 s−1(cell/mL)−1

Second, if •NO were reacting directly with O2, its rate of disappearance would be exceedingly slow at physiologic •NO concentrations. Because the rate of •NO autoxidation is second-order with respect to •NO, it means that at high •NO concentrations, the autoxidation reaction is much faster than at low concentrations. Fig. 3 illustrates how the half-life of •NO via autoxidation changes over a range of physiologic •NO and O2 concentrations. What should be emphasized is that if the dominant reaction of •NO within cells was directly with O2 (autoxidation), the half-life of •NO would be on the order of hours to days at physiologic •NO and O2 concentration. Even when the O2 concentration is high (21%), •NO could last for hours. This is not to say that •NO autoxidation does not occur under biological conditions. Experiments have shown that this reaction preferentially occurs in hydrophobic environments such as cell membranes and may be an important source of reactive nitrogen intermediates (N2O2, •NO2) [8], [40]. We know, however, that the biological half-life of •NO is short (<2 s), therefore, autoxidation cannot quantitatively account for the loss of a significant proportion of total •NO.

세포 유형에 따라 -NO의 특정 세포 반응물 유형이 다를 수 있지만, 연구에 따르면 -NO 대사의 주요 메커니즘은 O2를 필요로 합니다 [7]. 이는 두 가지 다른 산소 농도(21%와 1%)에서 세포가 존재할 때 -NO가 사라지는 속도를 보여주는 그림 2B에나와 있습니다. 같은 수의 세포에서 -NO는 1% 산소보다 21% 산소에서 훨씬 더 빠르게 대사됩니다. 따라서 O2 농도와 세포의 -NO 대사 속도 사이에는 직접적인 관계가 있습니다(그림 2C). 세포에서 -NO가 O2 의존적으로 대사된다는 발견은 -NO가 O2와 직접 반응(자가 산화, 식 (10))한다는 것이 잘 알려져 있기 때문에 처음에는 놀랍지 않게 보일 수 있습니다.

(10)4•NO+O2+2H2O→4H++4NO−2

속도 법칙: -d[-NO]/dt =4kaq[-NO]2[O2]

자가 산화를 -NO 대사의 중요한 수단으로 배제하는 두 가지 중요한 증거가 있습니다.

첫째, -NO 농도에서 자가 산화 반응은 2차 반응인 반면 세포에 의한 -NO 대사는 1차 반응식 (11) [7], [8]을 따릅니다.(11)-d[-NO]/dt =kobs[O2][-NO][Cell]kobs=5.38=±0.3×10-4 M-1 s-1(세포/mL)-1.

둘째, -NO가 O2와 직접 반응하는 경우 생리적 -NO 농도에서는 사라지는 속도가 매우 느립니다. NO 자가 산화 속도는 -NO에 대해 2 차이기 때문에 -NO 농도가 높을 때 자가 산화 반응이 낮은 농도보다 훨씬 빠르다는 것을 의미합니다. 그림 3은 생리적 -NO 및 O2 농도 범위에 따라 자가 산화를 통한 -NO의 반감기가 어떻게 변화하는지를 보여줍니다. 강조해야 할 점은 세포 내에서 -NO의 주된 반응이 O2와 직접적으로 일어나는 경우(자가 산화), -NO의 반감기는 생리학적 -NO 및 O2 농도에서 수 시간에서 수 일 정도라는 것입니다. 산소 농도가 높은 경우(21%)에도 -NO는 몇 시간 동안 지속될 수 있습니다. 그렇다고 해서 -NO 자가 산화가 생물학적 조건에서 발생하지 않는다는 것은 아닙니다. 실험에 따르면 이 반응은 세포막과 같은 소수성 환경에서 우선적으로 발생하며 반응성 질소 중간체(N2O2, -NO2)의 중요한 원천이 될 수 있습니다 [8], [40]. 그러나 -NO의 생물학적 반감기가 짧기 때문에(<2초), 자가 산화는 총 -NO의 상당 부분의 손실을 정량적으로 설명할 수 없다는 것을 알고 있습니다.

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Fig. 3. Concentrations of •NO and O2 determine the rate autoxidation. Calculated theoretical half-lives of •NO via autoxidation at various O2 concentrations based on initial starting •NO concentrations of 50, 100, 200, 500, and 1000 nM. The half-life of a reaction is the amount of time it takes for the concentration of a reactant (•NO) to decrease to one-half of its initial value. These values represent the first half-life of •NO. Since the autoxidation reaction is a second-order reaction (with respect to the •NO concentrations), the half-life will change over time as the concentration of •NO changes.

그림 3. NO와 O2의 농도에 따라 자가 산화 속도가 결정됩니다. 50, 100, 200, 500 및 1000 nM의 초기 시작 -NO 농도를 기준으로 다양한 O2 농도에서 자가 산화를 통한 -NO의 이론적 반감기를 계산했습니다. 반응의 반감기는 반응물(-NO)의 농도가 초기 값의 절반으로 감소하는 데 걸리는 시간입니다. 이 값은 -NO의 첫 번째 반감기를 나타냅니다. 자가 산화 반응은 2차 반응(-NO 농도에 대한)이므로 -NO 농도가 변함에 따라 반감기도 시간이 지남에 따라 변합니다.

Oxygen determines the steady-state concentration of •NO

Oxygen determines the rate of •NO synthesis by acting as a substrate for NOS and it also determines the rate of •NO metabolism. Therefore, the local O2 concentration will play a significant role in determining the steady-state concentration of •NO (Fig. 4A). If we think of the steady-state concentration of •NO as water in a bathtub, then the water level will be determined by the rate of water flow into the tub (•NO synthesis) relative to its rate of flow out of the drain (•NO metabolism). Since O2 differentially controls the rates of both •NO synthesis and metabolism, the steady-state concentration of •NO will be a function of the relative differences in their respective rates. At both the macroscopic and microscopic level, O2 gradients exist within the human body. Differences in O2 concentrations can vary widely based on the organ, tissue, cell type, and even the intercellular location. What determines the microenvironmental O2 concentration depends on the rate of O2 delivery from the vasculature as well as the rate of mitochondrial O2 consumption. Fig. 4B illustrates differences in the half-life of •NO calculated from average tissue O2 concentrations. This model, however, does not take into account the effects of O2 on •NO synthesis only the effect of O2 on the rate of •NO disappearance [7]. It does, however, emphasize how over a range of physiologic O2 concentrations the biological half-life of •NO can vary significantly.

산소는 -NO의 정상 상태 농도를 결정

산소는

NOS의 기질로 작용하여

-NO 합성 속도를 결정하고

-NO 대사 속도도 결정합니다.

따라서

국소 O2 농도는

-NO의 정상 상태 농도를 결정하는 데 중요한 역할을 합니다(그림 4A).

정상 상태의 -NO 농도를 욕조의 물로 생각하면,

수위는 욕조로 유입되는 물의 속도(-NO 합성)와

배수구에서 흘러나오는 속도(-NO 대사)에 따라 결정됩니다.

O2는

-NO 합성과 대사의 속도를 차등적으로 제어하므로

-NO의 정상 상태 농도는 각각의 속도에 따른 상대적 차이의 함수가 됩니다.

거시적 수준과 미시적 수준 모두에서

인체 내에는 O2 구배가 존재합니다.

산소 농도의 차이는 장기, 조직, 세포 유형, 심지어 세포 간 위치에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 미세 환경 산소 농도를 결정하는 것은 혈관으로부터의 산소 전달 속도와 미토콘드리아 산소 소비 속도에 따라 달라집니다. 그림 4B는평균 조직 O2 농도로부터 계산된 -NO의 반감기 차이를 보여줍니다. 그러나 이 모델은 -NO 합성에 대한 O2의 영향은 고려하지 않고 -NO 소실 속도에 대한 O2의 영향만 고려합니다 [7]. 그러나 이 모델은 생리적 산소 농도 범위에 따라 -NO의 생물학적 반감기가 크게 달라질 수 있다는 점을 강조합니다.

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Fig. 4. Oxygen determines the concentration of •NO and its half-life. (A) The steady-state concentration of •NO is a function of its rate of synthesis relative to its rate of degradation. (B) Different tissues have different average O2 concentrations. The half-life of •NO changes with respect to the O2 concentration.

그림 4. 산소는 -NO의 농도와 반감기를 결정

(A) -NO의 정상 상태 농도는 분해 속도에 대한 합성 속도의 함수입니다.

(B) 조직마다 평균 산소 농도가 다릅니다. NO의 반감기는 O2 농도에 따라 변화합니다.

Adapted from Ref. [7].

Why is the half-life of •NO important? The broad answer is that it ultimately determines the magnitude of •NO signaling. To properly understand this, it is important to appreciate how •NO moves within the cellular environment, i.e., by diffusion. Nitric oxide is small and uncharged and is soluble in both hydrophobic and hydrophilic environments. For these reasons, it is freely diffusible and cell membranes pose no barrier to its movement. With a relatively large diffusion coefficient (≈3800 µm2/s), •NO can travel considerable distances in a short period of time depending on the local environment (≈1 cell length/25 ms) [41]. Once •NO is synthesized, it moves away from its point of origin by random diffusion (Fig. 5A). Movement of •NO in any direction is equally likely at any point in time, however, net movement of molecules in one direction will occur if there is a spatial concentration gradient. The movement will always occur from a region of higher •NO concentration, such as in an •NO-producing cell, to a region of lower •NO concentration, an adjacent cell (Fig. 5B) [42].

NO의 반감기가 중요한 이유는 무엇인가요?

대략적인 대답은

-NO 신호의 크기를 궁극적으로 결정하기 때문입니다.

이를 제대로 이해하려면

-NO가 세포 환경 내에서 어떻게 이동하는지,

즉 확산을 통해 이해하는 것이 중요합니다.

산화 질소는

크기가 작고 전하를 띠지 않으며

소수성 및 친수성 환경 모두에 용해됩니다.

이러한 이유로

산화질소는 자유롭게 확산할 수 있으며

세포막은 산화질소의 이동에 아무런 장벽이 되지 않습니다.

상대적으로 큰 확산 계수 (≈3800 µm2/s)를 가진 -NO는 현지 환경에 따라 단기간에 상당한 거리를 이동할 수 있습니다(≈1 세포 길이/25 ms) [41]. 일단 -NO가 합성되면 무작위 확산에 의해 발생 지점에서 멀어집니다(그림 5A). 어떤 방향으로든 -NO의 이동은 어느 시점에서나 똑같이 가능하지만, 공간 농도 구배가 있는 경우 분자의 한 방향으로의 순 이동이 발생합니다. 이동은 항상 -NO 생성 세포와 같이 -NO 농도가 높은 영역에서 인접한 세포인 -NO 농도가 낮은 영역으로 발생합니다(그림 5B) [42].

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Fig. 5. Nitric oxide moves by random diffusion. (A) Once •NO is synthesized by NOS, it diffuses away in all directions. (B) Net movement of •NO occurs from an area of high concentration (a cell “A” where •NO is being made) to a region of lower concentration (“B” surrounding cells). The movement of •NO is random but down a concentration gradient.

The distance •NO will diffuse is proportional to its concentration and half-life. This brings up the importance of O2. The O2 concentration is an important determinant of the •NO concentration, which is a factor in determining how far •NO diffuses. At high O2 concentrations, the half-life of •NO is short and so is the distance it can diffuse. The opposite is true for low O2 concentrations (Fig. 6A). Just as the half-life of •NO can be calculated as a function of O2 concentration, so can its diffusional distance (Fig. 6B). It can be seen that differences in physiologic O2 concentrations dramatically affect the diffusional distance of •NO [7]. This has important implications for predicting the magnitude of •NO signaling under various O2 concentrations. At a high pO2, for example, the half-life of •NO is short and so is the distance it will diffuse. At low pO2, •NO will travel significantly longer distances and potentially exert its influence many cell lengths away (Fig. 6B). What this means in terms of cell signaling is that the size of the diffusional sphere surrounding a •NO-producing cell will change in response to changes in the O2 concentration. This will ultimately determine the amount and types of cellular targets by changing the number of neighboring cells being affected in a spatially heterogeneous tissue environment.

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Fig. 6. Oxygen determines the concentration of •NO and its diffusional distance. (A) At a constant rate of •NO synthesis, the lower the O2 concentration, the slower •NO is metabolized and the greater its steady-state concentration is. At high O2 concentrations, the steady-state •NO concentration is lower. The •NO concentration will determine its half-life as well as its diffusional distance. (B) The O2 concentration determines the half-life of •NO, which influences how far it will diffuse.

Although this discussion has focused on the impact of O2 on •NO bioavailability it would not be complete without mentioning how •NO can affect local O2 concentrations. One of the earlier discoveries about the biological functions of •NO was the observation that it could inhibit cellular respiration [43]. It was determined that •NO could regulate mitochondrial function and metabolism through its ability to interact at several sites in the respiratory chain. This is another example that emphasizes the importance of •NO/metal interactions. At Complex IV (cytochrome c oxidase) subnanomolar amounts of •NO competitively inhibit respiration. Here •NO binds to the ferrous heme-iron or oxidized copper, but not both simultaneously at the heme iron:copper binuclear center (a(3)/Cu(B)) [44]. At Complex 1 greater amounts of •NO were shown to be inhibitory but this was attributed to •NO-mediated oxidation or S-nitrosation of specific thiols [45]. The majority of total body O2 utilization is via its four-electron reduction to water at mitochondrial complex IV. Inhibition of mitochondrial respiration by •NO, therefore, prevents O2 consumption which extends the half-life of O2. This mechanism is thought to participate in O2 homeostasis by increasing local O2 delivery from the vascular and extending its delivery into tissues. Therefore, there is a reciprocal relationship between •NO and O2 whereby each molecule plays a role in regulating the concentration of the other [46].

Oxygen and •NO signaling

As we have seen, the O2 concentration is a key determinant of both the half-life of •NO as well as its diffusional distance. These parameters are important because they influence signaling responses to •NO. Most cellular targets for •NO respond in a concentration and time dependent manner [47], [48], [49]. Numerous examples have demonstrated that the activation of specific proteins or the induction of signal transduction cascades respond to distinct concentration thresholds of •NO. For example, soluble guanylyl cyclase (sGC) is one of the most important biological targets for •NO. It is activated by very low steady-state amounts of •NO ([0.5–5 nM]SS). ERK is another protein that becomes phosphorylated in the presence of •NO but it requires slightly higher amounts (>[100 nM]SS). Another class of proteins, non-heme iron oxygenases, are also targets for •NO. These include the HIF prolyl hydroxylases and the lysine histone demethylase (KDM) enzymes [28], [50]. These are inhibited by intermediate concentrations of •NO ([100– 400 nM]SS). Proteins like p53 are regulated by •NO at the upper limits of physiologic concentrations. Phosphorylation of this protein occurs in the presence of high concentrations of •NO (>[500 nM]SS) (Fig. 7).

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Fig. 7. Oxygen is an upstream driving force of cell phenotype by regulating the •NO concentration. Many proteins differ in the threshold amounts of •NO necessary for regulation. Since O2 determines the concentration (dose) of •NO, it will indirectly influence proteins regulated by •NO in a concentration-dependent manner. •NO-mediated changes in the protein profile will result in altered cellular phenotypes. This will ultimately have a positive or negative effect on disease outcome.

A long-standing challenge for researchers in the •NO field has been to provide plausible mechanisms to explain opposite biological responses to •NO under seemingly similar circumstances. There are many physiologic and pathological examples where •NO has been shown to have a positive signaling effect and an equal number of situations where •NO has been shown to have a negative effect in the same system. For example, •NO has numerous purported roles in cancer etiology [49], [51], [52]. In some cases, •NO is beneficial in that it decreases tumor size, is cytotoxic, induces apoptosis, and is an antioxidant. There are other reports, however, where •NO is a negative prognostic indicator by virtue of its ability to increase angiogenesis, stimulate migration and invasion, and induce DNA damage. The question that is often raised, “is •NO good or bad?”. The answer is “both”. To appreciate how •NO can have such dissimilar and opposing responses, one has to understand the concentration and temporal-dependent effects of •NO signaling. Differences in tissue O2 concentrations will partially determine the steady-state concentration of •NO. The concentration of •NO will dictate what cellular targets it interacts with. The types and distributions of cellular targets will determine cell phenotype, ultimately leading to positive or negative effects on disease outcome (Fig. 7).

High O2 concentrations will maximize •NO production from NOS, however, it will also increase the rate of •NO metabolism. Conversely, low O2 concentrations will reduce enzymatic •NO synthesis while also decreasing the rate of •NO metabolism. Is there an optimal O2 concentration where a balance between •NO production and consumption is achieved to maximize steady-state •NO concentrations? One study showed that the amount of cGMP produced by the activation of sGC in •NO-producing cells was biphasic over a range of O2 concentrations [34]. The maximal amount of cGMP was measured at an O2 concentration of ≈8%. The interpretation was that this O2 concentration resulted in the highest steady-state •NO concentration and therefore maximal sGC activation.

Just as the concentration of •NO is a key determinant of cell phenotype, so is the duration of •NO exposure. Not only do the three NOS isoforms produce different amounts of •NO, they can also differ in the duration of synthesis. This becomes important because some proteins are activated (or inhibited) immediately by •NO whereas others require continuous and sometimes prolonged •NO exposure [47]. Also, the effect of •NO on certain proteins is reversible such that they become inactivated (or reactivated) when the •NO source is removed. Yet in other cases, prolonged activation is achieved long after •NO synthesis has ceased. This indicates that some proteins are real-time •NO sensors whose regulation parallels the duration of •NO synthesis. In cases where the effects of •NO result in prolonged protein regulation, even short bursts of •NO exposure could have long-lasting phenotypic effects.

Spatial constraints are also contributing factors that influence phenotypic responses to •NO. As described above, the concentration of •NO will diminish at further distances from its point of synthesis (Fig. 8). Since most proteins respond to •NO in a concentration-dependent manner, distance will ultimately dictate the population of targets being regulated by •NO. Proteins, with different concentration threshold requirements for activation by •NO, will be differentially regulated depending on their proximity to the •NO source. For example, a protein that requires small amounts of •NO like sGC may be fully activated at locations both near and far from the point of •NO synthesis (Fig. 8, green protein). Whereas a different protein requiring intermediate amounts of •NO (HIF-1α) will be fully activated when it is close to the point of •NO synthesis. At further distances where the steady-state •NO concentration has diminished, this protein may not be activated at all (Fig. 8, orange protein). Proteins with the highest •NO-concentration requirements such as p53 may not respond to •NO at all regardless of whether they are proximal or distal to the •NO source (Fig. 8, red protein). These examples demonstrate how spatial differences in the location of target proteins can dictate phenotypic outcomes based solely on the differences in their concentration thresholds for activation by •NO.

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Fig. 8. The location of target proteins relative to the •NO source will influence their degree of regulation. The concentration of •NO diminishes at further distances from an •NO-producing cell (red cell). Proteins requiring small amounts of •NO will be regulated even at distances far away from the •NO source (green protein). Proteins with higher concentration requirements for •NO must be closer to the •NO source (orange protein). Proteins requiring high steady-state amounts of •NO may not be regulated at any location within the radius of •NO diffusion if the threshold •NO concentration requirement is not achieved (red protein). Green arrows indicate the regulation, activation, or deactivation by •NO (relative sensitivity to •NO green>orange>red protein).

Fig. 9 illustrates the complexities surrounding the interpretation of phenotypic data from cultured cells treated with •NO when there are differences in both •NO concentration and exposure time. In this simple experiment, cancer cells in culture were exposed to different concentrations of •NO for 48 h and cell viability was measured at 3 separate time points (24, 30, and 48 h). If the experiment was terminated at 24 h, the interpretation would be that •NO stimulates tumor cell growth (•NO is bad). If end-point measurements were not made until 30 h, the interpretation might be that •NO has no effect on cell viability. However, if the cells were exposed to •NO for a full 48 h before measuring cell viability, the logical conclusion would be that •NO is cytotoxic to tumor cells (•NO is good). Furthermore, if we only looked at low concentrations of •NO (5 µM DETA/NO), the outcome would be that •NO has no effect on tumor cell viability from 0 to 48 h. However, if we only looked at higher concentrations of •NO, the interpretation would be completely different at every time point.

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Fig. 9. Both the concentration and the duration of •NO exposure determine the phenotypic outcome. MDA-MB-231 breast cancer cells were exposed to a range of physiologic •NO concentrations using the •NO-donor DETA/NO. DETA/NO has a long half-life (t½=22 h), which enables prolonged and continuous •NO exposure. Real-time measurements of cell proliferation was conducted using the xCELLigence® DP system (ACEA Biosciences, Inc.) MDA-MB-231 cells were seeded in E-plates containing 10% serum and allowed to adhere for 12 h before the addition of •NO (5–1000 µM DETA/NO). Cell proliferation was measured continuously for 48 h following •NO treatment.

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Fig. 10. Oxygen is a dominant and vital regulator of •NO chemical biology.

Conclusion

The concepts that have been presented herein are undoubtedly an oversimplification of numerous interrelated complex biochemical and signaling mechanisms of •NO. The aim of this short review, however, was to provide a framework for experimental design and data interpretation by taking into consideration these numerous confounding parameters. Although •NO may appear to have contradictory effects under seemingly similar biological situations, a careful look at the environmental conditions will often reveal logical explanations for these differences. By understanding the importance of O2, target location, •NO concentration, and exposure time on •NO signaling responses, it becomes much easier to comprehend the sheer magnitude of potential outcomes (Fig. 10). Phenotypic responses attributed to •NO suddenly do not appear to be random at all but rather predictable outcomes that are simply a reflection of the local redox environment. Nitric oxide, being a free radical, is unique among signaling molecules. It does not act indiscriminately and it follows the same rules of chemistry and physics as all molecules. With a better appreciation of its complex chemical biology, meaningful information will continue to be discovered about this fascinating and important molecule.

결론
여기에 제시된 개념은 상호 관련된 수많은 복잡한 생화학 및 신호 전달 메커니즘을 지나치게 단순화한 것임에 틀림없습니다. 그러나 이 짧은 리뷰의 목적은 이러한 수많은 혼란스러운 매개변수를 고려하여 실험 설계 및 데이터 해석을 위한 프레임워크를 제공하는 것이었습니다. 유사한 생물학적 상황에서 -NO가 모순적인 영향을 미치는 것처럼 보일 수 있지만, 환경 조건을 주의 깊게 살펴보면 이러한 차이에 대한 논리적 설명이 드러나는 경우가 많습니다.

산소, 표적 위치,

-NO 농도,

노출 시간이

-NO 신호 반응에 미치는 영향을 이해하면

잠재적 결과의 규모를 훨씬 더 쉽게 이해할 수 있습니다(그림 10).

NO로 인한 표현형 반응은

갑자기 무작위로 나타나는 것이 아니라

국소 산화 환원 환경을 반영하는 예측 가능한 결과로 나타납니다.

산화질소는

자유 라디칼로서 신호 전달 분자 중에서도 독특합니다.

무차별적으로 작용하지 않으며

모든 분자와 동일한 화학 및 물리학 규칙을 따릅니다.

산화질소의 복잡한 화학 생물학을 더 잘 이해하면

이 매력적이고 중요한 분자에 대한 의미 있는 정보가

계속 발견될 것입니다.

Acknowledgements

This project was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (NIH) under award number R01GM085232. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. The authors also acknowledge ongoing support from the UIC Cancer Center.

References

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