스크랩 매독검사

[남채식(에스병원)]

1. Rapid Plasma Reagin(RPR) Circle(card) 반응

1) 의 의

RPR circle test는 매독의 혈청학적 검사방법 중 비특이성 항체를 검출하는 방법으로 검사실의 시설이나 준비가 부족할 경우에도 어려움 없이 시행할 수 있도록 개발된 전형적인 방법이다. 이 검사는 혈장(plasma)이나 혈청(serum) 어느 것을 사용해도 좋으며 micro-hematocrit를 하고 난 후 결과를 판독한 다음 그 상층을 사용해도 되므로 혈액을 채혈하기 위한 복잡한 기구가 필요없다.

이 검사의 원리는 cardiolipin-lecithin 항원을 흡착시킨 carbon 입자를 매독환자의 혈청에 가하면 혈청 중에 존재하는 reagin과 반응하여 응집이 일어나는데 이 flocculation 현상은 plastic coated card상의 흰 배경 위에 검은 덩어리로 나타나므로 이 응집은 육안적으로 읽을 수 있다.

2) 기 구

① 수평회전기 (slide rotating machine)

② Pipette

③ 기타 기구는 kit 중에 모두 포함되어 있다.

3) 시 약(Kit에 포함되어 있는 것)

① RPR card test의 항원

VDRL 항원을 carbon 입자에 흡착시켜 놓은 것으로 cardiolipin, lecithin, cholesterol, EDTA, Na₂HPO₄ 등이 쓰였다.

② Needle

직각으로 절구를 낸 20 gauze의 항원 적하용 바늘로 1 drop이 1/60㎖가 되도록 만들어져 있어 야 한다.

③ 플라스틱제 점적병

④ 플라스틱제를 코팅한 반응카드(직경 18㎜의 원이 10개 그려져 있다)

⑤ 모세관

내용 0.05㎖가 되는 곳에 표시가 되어있다. 반응카드에 혈청이나 혈장을 옮기는데 사용한다.

⑥ 고무 cap

⑦ 교반용 stick

4) 검사방법

이 검사는 VDRL slide test와 동일하게 실온의 영향을 받기 때문에 23∼29℃의 실온에서 실시할 필요가 있다.

① 불활성화 하지 않은 혈청이나 혈장 0.05㎖를 모세관이나 pipette을 이용해서 반응카드의 원 속에 넣고 교반용 stick으로 원내에 꽉 차도록 넓힌다.

② 이어서 양성 대조혈청 0.05㎖, 음성 대조혈청 0.05㎖를 동일하게 각각 다른 원내에 넣는다. 냉 장고에 보관했던 혈청은 미리 실온으로 데운 후에 사용해야 한다.

③ 항원이 들어있는 ampoule을 가볍게 흔들어 항원이 평등하게 부유되도록 한 후 ampoule을 개봉 하고 needle을 넣어서 항원을 점적병 속에 흡입한다.

④ 반응카드의 혈청 위에 항원을 1drop 가하고 교반봉으로 교반하지 말고 수평회전기 상에 올려놓 는다.

⑤ 수평회전기 상에 올려놓은 반응카드에 플라스틱제 뚜껑을 씌우고 반응카드가 건조하지 않게 한 다.

⑥ 100rpm에서 8분간 수평회전 한다.

⑦ 곧 육안으로 응집유무를 집광장치나 강한 일광하에서 관찰한다. 그러나 형광등 아래서 관찰해 서는 안된다. 양성 대조와 음성 대조의 성적이 정상으로 나타났는가를 확인한 다음 검사혈청의 성적이 양성인지 음성인지 확인한다. 판단이 잘 안될 때는 다시 한 번 단 시간 수평회전하여 확인한다.

⑧ RPR test가 양성인 경우에는 다른 반응 특히 TPHA test나 FTA-ABS test를 행해서 확인한다.

2. TPHA(Treponema pallidum hemagglutination assay)

1) 의 의

Treponema pallidum(Nichols 균주)의 균체성분을 적혈구에 흡착시킨 후 이 감작적혈구를 매독환자의 혈청 중에 가하면 적혈구에 흡착된 TP의 균체성분과 환자의 혈청 중에 존재하는 TP에 대한 항체가 반응해서 응집이 일어난다. 이 반응을 매독 Treponema 감작적혈구 응집반응(TPHA)이라 한다. 이는 간접 혈구응집 반응이다(Passive hemagglutination).

2) 기 구

① 소시험관 및 tube rack

② pipette(첨단에 눈금이 있는 것. 0.5㎖, 1.0㎖, 10.0㎖)

③ 원심침전기(3,000 rpm 정도로 소시험관을 여러 개 넣어 원심침전 시킬 수 있는 것)

④ 적혈구 응집반응판(tray) : 아크릴 수지제로 되어있으며 직경 16㎜, 반경 8㎜의 구면을 가진 것.

⑤ 냉장고

⑥ 교반봉

3) 시 약

① 흡수용 시약

고정한 면양 적혈구 …………………………………………………… 0.1㎖

건강한 토끼고환 acetone 처리분말 ………………………………… 5㎎

Treponema pallidum(Reiter 균주) 균체성분 ……………………… 0.05㎖

Arabic gum …………………………………………………………… 25㎎

Polysorbate …………………………………………………………… 0.0001㎎

Thimerosal …………………………………………………………… 1㎎

을 0.15M 인산 완충식염수로 전량 10㎖로 희석하여 동결건조 시켜 시판되고 있으므로 사용할 때 지시서대로 증류수에 용해하여 사용한다.

② 희석용 용액

건강한 토끼혈청 ……………………………………………………… 0.25㎎

Arabic gum …………………………………………………………… 6.25㎎

Polysorbate 80 ……………………………………………………… 0.0025㎎

Thimerosal …………………………………………………………… 2.5㎎

을 0.15M 인산 완충식염수(pH 7.2)로 전량 25㎖로 한 것.

③ 감작 적혈구

Formalin으로 고정한 면양 적혈구를 탄닌산으로 처리하고 여기에다 초음파로 파괴한 TP 균체성 분을 흡착시킨 것이다. 희석용액으로 2.5%의 비율로 부유시켜 있고, 보존을 위해서 동결건조 되 어있기 때문에 사용할 때에는 지시서에 표시된 증류수를 가해서 용해한다.

④ 대조혈청(미감작 적혈구 : sheep cell로만 구성)

희석용액으로 80배로 희석한 양성 및 음성대조 혈청을 준비한다. 시판품은 동결건조 되어있다.

4) 검사방법

(1) 정성법

① 검사혈청 0.05㎖를 정확히 소시험관에 넣는다.

② 여기에 흡수용 시약 0.95㎖를 가해서(20배 희석) 충분히 혼합한다.

③ 2∼6℃의 냉장고 속에 30분 이상 방치한다. 이 조작에 의해서 환자의 혈청 중에 포함되어 있 는 면양 적할구에 대한 이종응집소와 매독 이외의 Treponema(비병원성주)에 대한 항체가 흡수된 다. 사람은 매독 Treponema 이외의 Treponema(비병원성)의 침입을 받는 경우가 있기 때문에 이것에 대한 항체를 흡수해 주지 않으면 비특이적으로 감작적혈구가 응집할 때가 있다. 흡수용 시약 속에는 비병원성 Treponema(Reiter 균주)의 균체성분이 포함되어 있으므로 흡수조작에 의 해서 Treponema 속 공동항원에 대한 항체가 흡수된다.

④ 원심침전(2,500 rpm 5분)해서 상층을 분리한다.

⑤ 상층 0.2㎖와 희석용액 0.6㎖를 소시험관에 넣는다(1:80배 희석이 된다).

⑥ 1:80 희석혈청 0.5㎖를 pipette으로 채취하여 반응접시(tray) 속에 넣는다.

⑦ 이어서 감작적혈구 부유액 0.05㎖를 넣는다.

⑧ 반응접시를 가볍게 두들겨서 내용을 충분히 혼합한다.

⑨ 건조하지 않도록 뚜껑을 하고 반응접시를 실온에 3∼4시간 조용히 방치한 후 응집유무를 관찰 한다.

⑩ 다음날(18시간 후) 재차 관찰한다. 18시간 후에 관찰하면 응집이 뚜렷하게 되므로 판정이 용 이하다.

(2) 정량법

① 흡수가 끝난 80배 혈청을 아래와 같이 4배수 희석한다.

Tube No.	1	2	3	4	5	……
희석용 용액 1:80 흡수혈청	0.3	0.9 0.3	0.9 0.3	0.9 0.3	0.9 0.3	…… ……
혈청 희석배수	1:80	1:320	1:1,280	1:5,120	1:10,240	……

② 4배수 희석한 혈청 0.5㎖씩을 반응접시의 well에 각각 넣는다.

③ 이어서 정성법과 똑같은 조작을 해서 응집이 일어난 최고 희석배수를 역가로 판정한다.

5) 판 정

실험이 끝난 hemagglutination tray는 흔들리지 않는 책상 위에 하얀 종이를 깔고 그 위에 조용히 올려 놓은 다음 응집여부를 관찰하여 아래와 같은 요령으로 결과를 기록한다.

(-) : 붉은 세포가 중앙에 모여있고, 그 둘레에 과립의 침전이 없이 깨끗하다.

(±) : 붉은 세포가 원을 만들고 있으며 원둘레가 두껍고 비교적 크다. 원둘레의 테두리는 비교적 매끄럽다.

(+) : 붉은 세포의 원둘레는 주위의 많은 과립침전으로 거칠고 둘레의 두께가 얇다.

(++) : 붉은 세포는 넓게 퍼져있고, 원둘레는 얇은 막으로 덮혀있는 형태로 나타난다.

(+++) : 밑바닥에 넓게 퍼져서 침전되어 있고 가끔 붉은 세포의 일부는 중앙을 향하여 부분적으로 slip되어 질 수도 있다.

6) 결과의 해석

TPHA는 특이도와 예민성도 높고 재현성도 우수한 반응이지만 매독감염 초기에는 cardiolipin 항원을 사용하는 반응보다 늦게 양성으로 나타나고 또 자연치유가 되었거나 치료에 의해서 STS(Serologic test for syphilis)가 음성화 한 환자라도 양성을 나타낸다. 따라서 TPHA 단독으로 매독 이환의 유무를 판정하지 말고 STS와 조합해서 실시하여 종합판정을 해야한다.

7) 반응 실시상의 주의

① 접시의 well이 일정하지 않으면 반응상이 변화한다.

② 접시를 진동하면 반응상이 변화하여 위음성을 나타낼 때가 있다.

③ 판정기준을 동일하게 통일시켜 놓지 않으면 판정이 상당히 애매할 때가 있다.

표. STS와 TP항원을 사용하는 반응의 종합판정

STS	TPHA· FTA-ABS	해 석
－	－	매독이 극히 초기나 매독 감염이 없을 때
＋	－	매독 감염의 초기나 erythematous 등에 의한 BFP
－	＋	매독 감염 후 수년이 경과했거나 치료 후의 매독 또는 매독 Treponema와 공통항원을 갖는 Treponema의 감염
＋	＋	매독이나 매독 Treponema와 공통항원을 갖는 Treponema에 의한 감염