Re: 새싹 보리 발효, GABA 증가 2024!!

[문형철]

Open AccessArticle

Effects of Pretreatment Methods on Gamma-Aminobutyric Acid Enrichment and Quality Improvement in Highland Barley Beverages

by 

Xiaoqing Yin

 1,

Shanshan Wang

 1,

Zhirong Wang

 2,

Huaying Wen

 1,

Ting Bai

 1 and

Yuhong Zhang

 1,*

1

Institute of Food Processing, Xizang Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850000, China

2

School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China

*

Author to whom correspondence should be addressed.

Foods 2024, 13(24), 4053; https://doi.org/10.3390/foods13244053

Submission received: 18 October 2024 / Revised: 5 November 2024 / Accepted: 6 November 2024 / Published: 16 December 2024

(This article belongs to the Special Issue Bioactive Compounds in Foods: Extraction, Analysis, Encapsulation, Delivery and Health-Promoting Properties)

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Abstract

Gamma-aminobutyric acid (GABA) is an important neurotransmitter that promotes sleep and reduces anxiety, but its natural synthesis in the body is insufficient, necessitating dietary intake. This study utilized a combination of germination, the addition of active barley powder, and fermentation to enhance GABA content in an enzymatically hydrolyzed highland barley beverage. The samples were divided into five groups: highland barley (HB), germinated highland barley (GB), highland barley supplemented with another high-glutamic-acid decarboxylase-active highland barley powder TB13 (BT), germinated barley supplemented with TB13 (GBT), and germinated barley supplemented with TB13 followed by fermentation (GBTF). The results indicated that all the pretreatments significantly elevated GABA levels, with the GBT sample showing the highest GABA content, which was 2.4 times that of the HB sample. Germination had minimal impact on the taste and aroma of the beverage, while the addition of TB13 active barley powder caused only slight changes to the aroma. The GABA content in the GBTF sample was 2.2 times higher than in the HB sample, and the GBTF sample also exhibited the highest total phenolic content, demonstrating the strongest antioxidant and free-radical scavenging abilities. Furthermore, the GBTF treatment increased acidity, reduced bitterness, and significantly altered the flavor profile of the barley beverage, enhancing its overall quality and consumer appeal as a GABA-rich functional drink.

감마-아미노부티르산(GABA)은 

수면을 촉진하고 불안감을 감소시키는 중요한 신경전달물질이지만, 

체내에서의 자연적 합성이 부족하여 식이 섭취가 필요합니다. 

본 연구에서는 

발아, 활성 보리 분말 추가, 발효를 결합한 방법을 통해 

효소적 가수분해 고지대 보리 음료의 GABA 함량을 향상시켰습니다. 

This study utilized a combination of germination,

the addition of active barley powder,

and fermentation to enhance GABA content in an enzymatically hydrolyzed highland barley beverage. 

시료는 5개 그룹으로 나누었습니다: 

고지대 보리(HB), 발아 고지대 보리(GB), 고지대 보리에 고글루탐산 디카르복실라제 활성 고지대 보리 분말 TB13을 추가한 시료(BT), 발아 보리에 TB13을 추가한 시료(GBT), 발아 보리에 TB13을 추가한 후 발효시킨 시료(GBTF). 

결과는 모든 전처리 방법이 GABA 함량을 유의미하게 증가시켰으며, 

GBT 시료가 가장 높은 GABA 함량을 보였으며 

이는 HB 시료의 2.4배였습니다. 

발아는 음료의 맛과 향에 거의 영향을 미치지 않았으며, 

TB13 활성 보리 분말의 추가은 향에 약간의 변화를 일으켰습니다. 

GBTF 시료의 GABA 함량은 HB 시료의 2.2배로 높았으며, 

GBTF 시료는 가장 높은 총 페놀 함량을 보여 가장 강력한 항산화 및 자유 라디칼 제거 능력을 나타냈습니다. 

또한 

GBTF 처리는 산도를 증가시키고 쓴맛을 감소시키며 

보리 음료의 풍미 프로파일을 크게 변화시켜, 

GABA가 풍부한 기능성 음료로서의 전체적인 품질과 소비자 선호도를 향상시켰습니다.

Keywords: 

highland barley; enzymatic hydrolysis; GABA; antioxidant activity; flavor; beverages

1. Introduction

Highland barley, an ancient cereal grain, has been a staple in human diets for millennia, renowned for its rich nutritional profile and health benefits [1,2]. In recent years, there has been growing interest in the development of functional beverages derived from barley, particularly those enriched with bioactive compounds, such as γ-aminobutyric acid (GABA). GABA, a nonprotein amino acid, is known for its role in promoting relaxation, reducing stress, and improving sleep quality, making it a highly desirable component in health-oriented products [3,4]. Due to extreme climatic conditions, such as intense UV radiation, drought, and hypoxia [5], the GABA content in highland barley ranges from 18 to 28 mg/100 g, which is higher than that in rice (10.75 to 18.62 mg/100 g) [6], soybeans (2.99 mg/100 g) [7], and wheat (0.12 mg/100 g) [8]. However, it is still necessary to employ various pretreatment methods to increase the concentration of GABA in highland barley.

Different pretreatment techniques, including germination, fermentation, and enzyme hydrolysis, have been explored for their potential to increase GABA levels in barley. The main metabolic pathway of GABA in plants and lactic acid bacteria is the GABA shunt, and the polyamine degradation pathway is also one of the synthesis pathways of GABA in plants [9,10]. During germination, enzymes such as proteases and glutamic acid decarboxylase (GAD) in highland barley are activated, leading to protein hydrolysis and an increase in glutamate content, which is further converted into GABA under the action of GAD [11]. Sprouting not only increases the GABA content in HB but also enhances the antioxidant activity of free phenolic compounds and their end products [12]. Phenolic compounds in barley itself can directly participate in scavenging free radicals, transforming peroxyl radicals into stable byproducts, or indirectly clearing free radicals by inhibiting enzymes that can generate free radicals [13]. Interestingly, different varieties of highland barley exhibit varying levels of GAD activity, with higher GAD activity favoring GABA enrichment [11]. Therefore, adding barley flour with a high GAD enzyme activity is also a new strategy for enhancing GABA levels. Fermentation further boosts the nutrition, digestibility, and sensory properties of cereal beverages, facilitating easier absorption of antioxidants and micronutrients while reducing the content of antinutrients (such as phytic acid) and substances like hexanal, which may lead to undesirable flavors [14].

The application of these pretreatment methods has implications not only for GABA enrichment but also for the overall quality of the barley beverage. Factors such as taste, aroma, texture, and shelf life are critical to consumer acceptance and can be significantly influenced by the chosen pretreatment strategy. For instance, fermentation can enhance flavor profiles by introducing desirable organic acids, while germination can improve mouthfeel by increasing the soluble fiber content. Therefore, optimizing these pretreatment processes is essential to developing a barley beverage that is both nutritionally enhanced and organoleptically appealing.

This study aims to investigate the effects of various pretreatment methods on the enrichment of GABA in barley beverages, with the goal of identifying the most effective strategies for producing a functional barley beverage that meets the increasing consumer demand for health-promoting products.

1. 서론

고대 곡물인 고지대 보리는

수천 년 동안 인간의 식단에 필수적인 식품으로 자리 잡았으며,

풍부한 영양 성분과 건강 혜택으로 유명합니다 [1,2].

최근에는 보리를 원료로 한 기능성 음료 개발에 대한 관심이 증가하고 있으며,

특히 생체 활성 화합물인 γ-아미노부티르산 (GABA)와 같은

생물활성 화합물로 강화된 제품에 대한 관심이 증가하고 있습니다.

GABA는 비단백질 아미노산으로,

이완 촉진, 스트레스 감소, 수면 품질 개선 등에 기여하는 것으로 알려져 있어

건강 지향적 제품의 주요 성분으로 주목받고 있습니다 [3,4].

극한 기후 조건(강렬한 자외선, 가뭄, 저산소 환경 [5]과 같은 극한 기후 조건으로 인해

고지대 보리의 GABA 함량은 18~28 mg/100 g으로,

쌀 (10.75~18.62 mg/100 g) [6],

대두 (2.99 mg/100 g) [7],

밀 (0.12 mg/100 g) [8].

그러나

고지대 보리의 GABA 농도를 높이기 위해

다양한 전처리 방법을 적용하는 것이 여전히 필요합니다.

발아, 발효, 효소 가수분해 등 다양한 전처리 기술이

보리에서 GABA 수준을 증가시키는 잠재력을 탐구되었습니다.

식물과 젖산균에서 GABA의 주요 대사 경로는

GABA 분기 경로이며,

폴리아민 분해 경로는 식물에서 GABA 합성의 또 다른 경로 중 하나입니다 [9,10].

발아 과정에서

고지대 보리의 프로테아제와 글루탐산 디카르복실라제(GAD)와 같은 효소가 활성화되어

단백질 가수분해가 발생하며,

이는 글루탐산 함량이 증가하고 GAD의 작용으로 GABA로 전환됩니다 [11].

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8908996/

발아는

HB의 GABA 함량을 증가시킬 뿐만 아니라

자유 페놀 화합물과 그 최종 산물의 항산화 활성을 강화합니다 [12].

보리 자체의 페놀 화합물은

자유 라디칼 제거에 직접 참여하여 페록실 라디칼을 안정적인 부산물로 전환하거나,

자유 라디칼을 생성하는 효소를 억제하여 간접적으로 자유 라디칼을 제거합니다 [13].

흥미롭게도 고지대 보리의 다양한 품종은

GAD 활성 수준이 다르며, 높은 GAD 활성은 GABA 풍부화에 유리합니다 [11].

따라서

고 GAD 효소 활성을 가진 보리 가루를 추가하는 것은

GABA 수준을 향상시키는 새로운 전략입니다.

발효는

곡물 음료의 영양가, 소화성, 감각적 특성을 더욱 향상시키며,

항산화 물질과 미량 영양소의 흡수를 용이하게 하고,

피티산과 같은 항영양소 및 불쾌한 향을 유발할 수 있는 헥사날과 같은 물질의 함량을 감소시킵니다 [14].

이러한 전처리 방법의 적용은

GABA 풍부화뿐만 아니라

보리 음료의 전반적인 품질에도 영향을 미칩니다.

맛, 향, 텍스처, 유통기한 등은 소비자 수용도에 결정적인 역할을 하며, 선택된 전처리 전략에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 예를 들어, 발효는 바람직한 유기산을 도입하여 풍미 프로파일을 향상시킬 수 있으며, 발아는 수용성 식이섬유 함량을 증가시켜 입안에서 느껴지는 텍스처를 개선할 수 있습니다. 따라서 이러한 전처리 과정을 최적화하는 것은 영양적으로 강화되고 관능적으로 매력적인 보리 음료를 개발하는 데 필수적입니다.

이 연구는 보리 음료의 GABA 함량 증진에 대한 다양한 전처리 방법의 영향을 조사하여 건강 증진 제품을 원하는 소비자의 증가하는 수요를 충족시키는 기능성 보리 음료를 생산하기 위한 가장 효과적인 전략을 식별하는 것을 목표로 합니다.

2. Materials and Sample Preparation

2.1. Materials and Chemicals

The experimental material, Tibetan highland barley variety (Zangqing 2000), was cultivated in Lhasa, Tibet, in 2017 at an altitude of 3658 m. The oxygen content at this high altitude was 15.09%, with an average temperature of 18.6 °C. The whole barley powder, obtained through cyclone grinding, was stored in a self-sealing bag in a refrigerator at 4 °C.

GABA, 4-dimethylaminobenzene-4′-sulfonyl chloride, acetonitrile, and methanol were purchased from Aladdin (Shanghai, China). The amino acid assay kit, flavonoid assay kit, and DPPH radical scavenging capacity assay kit were obtained from Solarbio (Beijing, China). The total antioxidant assay kit, hydroxyl radical scavenging capacity assay kit, superoxide anion radical scavenging capacity assay kit, and total phenol assay kit were purchased from Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). Cellulase was provided by Heshibi Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). High-temperature α-amylase, flavor protease, and amylase were supplied by Novonesis (Beijing, China) Biotechnology Co., Ltd. All other chemicals and reagents used in the experiments were of analytical grade and were purchased from Kelon Chemical Reagents Factory (Chengdu, China).

2.2. The Germination Process of HB

The processed barley was soaked for 6 h and germinated in a humidity chamber with constant temperature and humidity at 30 °C for 36 h, and then the temperature was adjusted to 50 °C for an additional 2 h of germination. Afterward, the samples were sun-dried for approximately 3 to 5 days until the moisture content in the highland barley powder reached 7–9%.

2. 재료 및 시료 준비

2.1. 재료 및 화학물질

실험 재료로 사용된 티베트 고원 보리 품종(Zangqing 2000)은 2017년 티베트 라사 지역에서 해발 3,658m에서 재배되었습니다. 이 고지대의 산소 함량은 15.09%였으며 평균 온도는 18.6°C였습니다. 사이클론 분쇄를 통해 얻은 전체 보리 분말은 4°C의 냉장고에 자체 밀봉 봉지에 보관되었습니다.

GABA, 4-디메틸아미노벤젠-4′-설폰일 클로라이드, 아세토니트릴, 메탄올은 알라딘(상하이, 중국)에서 구매했습니다. 아미노산 분석 키트, 플라보노이드 분석 키트, DPPH 라디칼 소거 능력 분석 키트는 솔라바이오(베이징, 중국)에서 공급받았습니다. 총 항산화 분석 키트, 하이드록실 라디칼 제거 능력 분석 키트, 슈퍼옥사이드アニ온 라디칼 제거 능력 분석 키트 및 총 페놀 분석 키트는 난징 Jiancheng Bioengineering Institute (난징, 중국)에서 구매했습니다. 셀룰라제는 Heshibi Biotechnology Co., Ltd. (베이징, 중국)에서 제공받았습니다. 고온 α-아밀라제, 향미 프로테아제 및 아밀라제는 Novonesis (베이징, 중국) Biotechnology Co., Ltd.에서 공급받았습니다. 실험에 사용된 모든 기타 화학물질 및 시약은 분석 등급이며, Kelon Chemical Reagents Factory (청두, 중국)에서 구매했습니다.

2.2. HB의 발아 과정

가공된 보리는 6시간 동안 침지된 후,

30°C의 일정 온도와 습도 조건에서 습도 챔버에서 36시간 동안 발아시켰으며,

이후 온도를 50°C로 조정하여 추가로 2시간 동안 발아시켰습니다.

이후 시료를 약 3~5일간 햇빛에 건조시켜 고

지대 보리 분말의 수분 함량이 7~9%가 될 때까지

건조시켰습니다.

2.3. Sample Coding and Pretreatment Preparation

2.3.1. HB Powder

Fifty grams of highland barley powder was added to water in a 1:10 ratio and pregelatinized at 85 °C for 10 min. Alpha-amylase was added at a dose of 0.5‰ and enzymatically hydrolyzed at 85 °C for 2 h (enzymatic hydrolysis phase 1). Then, this was cooled to 50 °C, glucoamylase was added at a dosage of 1.8‰, 0.18 g/mL of flavor protease was added at a dosage of 6‰, and 0.045 g/mL of cellulase was added at a dosage of 1‰. Enzymatic hydrolysis was continued for 2 h (enzymatic hydrolysis phase 2). This solution was then centrifuged at 4000 rpm for 5 min, and the supernatant was taken, sealed, and sterilized, and its enzymes were deactivated in a 90 °C water bath for 30 min and cooled before being stored in the refrigerator. Untreated highland barley samples were eval‎uated as controls and coded by HB.

2.3.2. Germinated Highland Barley Powder

Highland barley powder was replaced with germinated highland barley powder (50 g), and the same procedures as described in Section 2.3.1 were followed. This sample group was coded as GB.

2.3.3. Highland Barley Powder: TB13 Addition

After 1 h into the second stage of enzymatic hydrolysis, 5 g of active highland barley powder (TB13) was added and mixed thoroughly, and enzymatic hydrolysis was continued. The same procedures as described in Section 2.3.1 were followed. Samples for this pretreatment were coded as BT.

2.3.4. Germinated Highland Barley Powder: TB13 Addition

We substituted 50 g of germinated highland barley powder for highland barley powder, and, after 1 h into the second stage of enzymatic hydrolysis, we added 5 g of TB13, mixed thoroughly, and continued enzymatic hydrolysis. We followed the same procedures as described in Section 2.3.1. This sample group was coded as GBT.

2.3.5. TB13 Was Added and Fermented After Enzymatic Digestion

We substituted 50 g of germinated highland barley powder for highland barley powder, and, after 1 h into the second stage of enzymatic hydrolysis, we added 5 g of TB13, mixed thoroughly, and continued enzymatic hydrolysis. After completion of enzymatic hydrolysis, we conducted high-pressure sterilization. After cooling, we inoculated Lactobacillus plantarum (1‰ g/mL) with 20 uL in a sterile laminar flow hood. We added Tianjiuqu at a rate of 4‰ (0.2 g) and cultivated it in a constant-temperature incubator at 36 °C for 24 h. After high-pressure sterilization, it was centrifuged at 4000 r/min for 5 min, the supernatant was collected and sealed, and we performed sterilization in a water bath at 90 °C for 30 min, left it to cool, and stored it in the refrigerator. This sample group was coded as GBTF.

2.3. 시료 코딩 및 전처리 준비

2.3.1. HB 분말

고지대 보리 분말 50g을 물과 1:10의 비율로 혼합한 후 85°C에서 10분간 전젤라틴화시켰습니다. 알파-아밀라아제를 0.5‰의 용량으로 추가하고 85°C에서 2시간 동안 효소적 가수분해(효소적 가수분해 단계 1)를 진행했습니다. 이후 50°C로 냉각한 후 글루코아밀라아제를 1.8‰의 용량으로 추가, 향미 프로테아제 0.18 g/mL를 6‰의 용량으로, 셀룰라제 0.045 g/mL를 1‰의 용량으로 추가했습니다. 효소적 가수분해는 2시간 동안 계속되었습니다(효소적 가수분해 단계 2). 이 용액을 4000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 채취하여 밀봉하고 살균한 후, 90°C 물욕에서 30분간 효소를 불활성화시킨 후 냉장고에 보관했습니다. 처리되지 않은 고지대 보리 샘플은 대조군으로 사용되었으며 HB로 코드화되었습니다.

2.3.2. 발아 고지대 보리 분말

고지대 보리 분말을 발아 고지대 보리 분말(50 g)로 대체하고, 2.3.1절에 설명된 동일한 절차를 따랐습니다. 이 시료 그룹은 GB로 코드화되었습니다.

2.3.3. 고지대 보리 가루: TB13 추가

제2단계 효소 분해 시작 후 1시간이 경과한 시점에 활성 고지대 보리 가루(TB13) 5g을 추가하여 완전히 혼합한 후 효소 분해를 계속 진행했습니다. 2.3.1절에 설명된 동일한 절차를 따랐습니다. 이 전처리 시료는 BT로 코드화되었습니다.

2.3.4. 발아 고지대 보리 가루: TB13 추가

고지대 보리 가루 50g을 발아 고지대 보리 가루로 대체하고, 제2단계 효소 분해 시작 후 1시간이 경과한 시점에 TB13 5g을 추가하여 완전히 혼합한 후 효소 분해를 계속했습니다. 2.3.1절에 설명된 동일한 절차를 따랐습니다. 이 시료 그룹은 GBT로 코딩되었습니다.

2.3.5. 효소 분해 후 TB13을 추가하고 발효

고원 보리 가루 50g을 발아 고원 보리 가루로 대체한 후, 효소 분해의 두 번째 단계 시작 후 1시간이 경과한 시점에 TB13 5g을 추가하여 완전히 혼합한 후 효소 분해를 계속했습니다. 효소 분해가 완료된 후 고압 살균을 수행했습니다. 냉각 후 무균 층류 흐름 캐비넷에서 Lactobacillus plantarum (1‰ g/mL)을 20 μL로 접종했습니다. Tianjiuqu를 4‰ (0.2 g)의 비율로 추가하고 36°C의 일정 온도 배양기에서 24시간 배양했습니다. 고압 살균 후 4000 r/min에서 5분간 원심분리하여 상층액을 수집하고 밀봉한 후 90°C 수조에서 30분간 살균한 후 냉각시켜 냉장고에 보관했습니다. 이 시료군은 GBTF로 코딩되었습니다.

3. Experimental Methods3.1. Determination of Active Components in Highland Barley Enzyme-Treated Beverage

3.1.1. Determination of GABA

The extraction of GABA was conducted following the method outlined by Jannoey et al. with some modifications [6]. Anhydrous ethanol was used as the extraction solvent, and the sample was shaken in a 1:3 ratio of sample to extraction solution for 10 min. The mixture was then centrifuged at 4000 rpm for 5 min, and the supernatant was collected for further analysis. Next, 1 mL of sample/standard was mixed with 0.2 mL of sodium bicarbonate solution (0.04 g/mL) and 0.4 mL of 4-dimethylaminoazobenzene-4′-sulfonyl chloride solution (2 mg/mL). The mixture was stirred and subjected to derivatization at 70 °C for 20 min. After cooling, it was filtered through a 0.2 μm organic membrane for further use. The HPLC detection conditions were set as follows: Mobile phase A consisted of a sodium acetate solution prepared by dissolving 3.689 g of sodium acetate in 900 mL of water, which was then filtered. Mobile phase B was chromatographic acetonitrile. An Agilent 20RBAX SB-C18 column (4.6 × 250 mm, 5 μm) was used. The flow rate was maintained at 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 436 nm, the column temperature was 30 °C, and the injection volume was 20 μL. The elution program was as follows: 0–30 min, 73% A, 27% B; 30.01–40 min, 30% A, 70% B; 40.01–45 min, 73% A, 27% B.

3.1.2. Determination of Free Amino Acid

We utilized the Solarbio Amino Acid Assay Kit (BC1575) to determine the amino acid content [15]. We modified the sample extraction process to aspirate 0.1 mL of the sample and 0.5 mL of reagent 1. We followed the instructions provided in the kit manual for other procedures and result calculations. No sample dilution was performed.

3.1.3. Determination of Total Phenols and Flavonoids

We employed the Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Total Phenol Assay Kit (A143-1-1) and the Solarbio Flavonoid Content Assay Kit (BC1335) to measure the levels of total phenols and flavonoids in the samples, respectively. We conducted the experiments and performed calculations in accordance with the instructions provided in the respective assay kit manuals. Briefly, 0.1 g of barley drink was weighed; 2 mL of 60% ethanol solution was added, crushed for 5 s, reduced from 8 s, extracted by ultrasonic extraction for 30 min (300 W, 60 °C), and centrifuged at 4000 rpm and 25 °C for 10 min; and the supernatant was taken to measure the total phenol content. Slightly differing from the method of Wang et al. [16], 0.1 g of barley drink was weighed, 1 mL of 60% ethanol solution was added, ultrasonic extraction was carried out for 30 min (300 W, 60 °C) at 12,000 rpm and 25 °C, centrifugation was performed for 10 min, and the supernatant was fixed to 1 mL with 60% ethanol solution to be measured. The standard curve was plotted with rutin standard to calculate the flavonoid content, and the obtained standard curve was y = 0.7288x − 0.0031, with R2 = 0.998.

3. 실험 방법3.1. 고지대 보리 효소 처리 음료의 활성 성분 분석

3.1.1. GABA의 정량

GABA의 추출은

Jannoey 등[6]의 방법을 일부 수정하여 수행했습니다.

무수 에탄올을 추출 용매로 사용했으며,

시료와 추출 용액의 비율을 1:3으로 조정하여

10분간 흔들었습니다.

혼합물을 4000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 수집하여

추가 분석에 사용했습니다.

다음으로, 시료/표준 1 mL에 0.04 g/mL 농도의 나트륨 bicabonate 용액 0.2 mL와 2 mg/mL 농도의 4-dimethylaminoazobenzene-4′-sulfonyl chloride 용액 0.4 mL를 혼합했습니다. 혼합물을 저어준 후 70°C에서 20분 동안 유도체화 처리했습니다. 냉각 후 0.2 μm 유기막 필터를 통해 필터링하여 추가 사용을 위해 보관했습니다. HPLC 검출 조건은 다음과 같이 설정되었습니다: 이동상 A는 3.689 g의 나트륨 아세테이트를 900 mL의 물에 용해시킨 후 필터링한 나트륨 아세테이트 용액으로 구성되었습니다. 이동상 B는 크로마토그래픽 아세토니트릴입니다. Agilent 20RBAX SB-C18 컬럼 (4.6 × 250 mm, 5 μm)을 사용했습니다. 유속은 1.0 mL/min으로 유지되었습니다. 검출 파장은 436 nm, 컬럼 온도는 30 °C, 주입량은 20 μL로 설정되었습니다. 엘루션 프로그램은 다음과 같습니다: 0–30분, A 73%, B 27%; 30.01–40분, A 30%, B 70%; 40.01–45분, A 73%, B 27%.

3.1.2. 자유 아미노산 함량 측정

우리는 Solarbio 아미노산 분석 키트 (BC1575)를 사용하여 아미노산 함량을 측정했습니다 [15]. 시료 추출 과정을 수정하여 시료 0.1 mL와 시약 1 0.5 mL를 흡입했습니다. 기타 절차 및 결과 계산은 키트 매뉴얼의 지침에 따라 수행했습니다. 시료 희석은 수행하지 않았습니다.

3.1.3. 총 페놀 및 플라보노이드 함량 측정

우리는 난징 지안청 생물공학 연구소 총 페놀 분석 키트 (A143-1-1)와 Solarbio 플라보노이드 함량 분석 키트 (BC1335)를 사용하여 시료의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 각각 측정했습니다. 실험은 각 분석 키트 매뉴얼에 기재된 지침에 따라 수행했으며, 계산도 이에 따라 진행했습니다. 간단히 설명하면, 보리 음료 0.1g을 계량한 후 60% 에탄올 용액 2mL를 추가하고 5초간 분쇄한 후 8초간 환원시켰습니다. 이후 초음파 추출을 30분간 진행한 후 (300 W, 60 °C)로 초음파 추출을 수행한 후, 4000 rpm 및 25 °C에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 채취하여 총 페놀 함량을 측정했습니다. Wang 등 [16]의 방법과 약간 다르게, 보리 음료 0.1g을 계량하고 60% 에탄올 용액 1mL를 추가한 후, 300W, 60°C에서 12,000rpm으로 30분간 초음파 추출을 수행한 후, 25°C에서 10분간 원심분리했습니다. 상층액을 60% 에탄올 용액으로 1 mL로 조정하여 측정했습니다. 루틴 표준을 사용하여 플라보노이드 함량을 계산하기 위해 표준 곡선을 작성했으며, 얻어진 표준 곡선은 y = 0.7288x − 0.0031이며, R² = 0.998입니다.

3.2. Determination of Antioxidant Capacity in Highland Barley Enzyme-Treated Beverage

We utilized colorimetry kits from the Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute (A015-1, A052-1-1, A018-1-1) to individually measure the total antioxidant capacity, superoxide anion clearance ability, and hydroxyl free-radical clearance ability of the samples. We conducted the experiments and performed calculations in accordance with the instructions provided in the respective assay kit manuals [17,18]. We employed the Solarbio assay kit (BC4750) to assess the DPPH free-radical clearance capacity of the samples. The sample extraction process was modified to include the aspiration of 0.6 mL of the sample and 0.4 mL of the extraction solution. The mixture was vortexed and centrifuged at 10,000 rpm for 10 min at room temperature, and the supernatant was collected and placed on ice for analysis. Vitamin C was used as a positive control. We followed the instructions provided in the kit manual for the other procedures and result calculations. No sample dilution was performed.

3.2. 고지대 보리 효소 처리 음료의 항산화 능력 측정

우리는 난징 장청 생물공학 연구소(A015-1, A052-1-1, A018-1-1)의 색상 측정 키트를 사용하여 시료의 총 항산화 능력, 슈퍼옥사이드 음이온 제거 능력, 및 하이드록실 자유 라디칼 제거 능력을 각각 측정했습니다. 실험은 각 분석 키트 매뉴얼에 명시된 지침에 따라 수행되었으며, 계산도 이에 따라 진행되었습니다 [17,18]. DPPH 자유 라디칼 제거 능력을 평가하기 위해 Solarbio 분석 키트(BC4750)를 사용했습니다. 시료 추출 과정은 시료 0.6 mL와 추출 용액 0.4 mL를 흡입하는 단계가 추가되었습니다. 혼합물을 vortex로 혼합한 후 실온에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 수집하여 분석을 위해 얼음 위에 보관했습니다. 비타민 C를 양성 대조군으로 사용했습니다. 기타 절차 및 결과 계산은 키트 매뉴얼의 지침에 따라 수행했습니다. 시료 희석은 수행하지 않았습니다.

3.3. Sensory Quality Eval‎uation of Barley Enzyme-Treated Beverage

3.3.1. Determination of Taste and Odor by Electronic Tongue and Nose

Previous studies have detailed the TS-5000Z electronic tongue (Insent Inc., Atsugi-Shi, Japan) and the PEN3.5 electronic nose (Insent Inc., Kyoto, Japan), with slight modifications to the measurement methods [19]. When utilizing the electronic tongue, the sample injection volume amounted to 35 mL, the data collection duration was set at 120 s with a sampling frequency of 1 s, and the cleaning duration lasted 10 s. When employing the electronic nose, 10 mL of the sample was accurately measured, 3 g of sodium chloride was added, the mixture was sealed in a 50 mL bottle, and it was immersed in a water bath at 50 °C for 30 min before testing. The sample preparation took 5 s; sensor cleaning persisted for 120 s; sensor zeroing required 10 s; the injection rate was 400 mL/min; analysis sampling took 90 s; and feature extraction spanned 57–59 s.

3.3.2. Determination of Volatile Components

We combined 5 mL of the sample and 3 g of NaCl within a 20 mL headspace vial, followed by subjecting the mixture to a 5 min thermal shock at 50 °C. The adsorption–desorption process and quantification method were consistent with a previous study [19], but the temperature profile of the GC was modified as follows: it was initiated at 40 °C and held steady for 2 min, increased to 90 °C at a rate of 2 °C/min, and further raised to 250 °C at 10 °C/min, where it was kept for 5 min. The ion source temperature was set at 230 °C, and the quadrupole temperature was set at 250 °C.

3.3. 보리 효소 처리 음료의 감각 품질 평가

3.3.1. 전자 혀와 코를 이용한 맛과 냄새 측정

이전 연구에서는 TS-5000Z 전자 혀(Insent Inc., Atsugi-Shi, Japan)와 PEN3.5 전자 코(Insent Inc., Kyoto, Japan)를 설명했으며, 측정 방법에 약간의 수정 사항이 적용되었습니다[19]. 전자 혀를 사용할 때 시료 주입량은 35 mL, 데이터 수집 시간은 120초, 샘플링 빈도는 1초, 청소 시간은 10초로 설정되었습니다. 전자 코를 사용할 때는 시료 10 mL를 정확히 측정하고, 염화나트륨 3 g을 추가한 후 50 mL 병에 밀봉하여 50 °C 수조에서 30분 동안 침지시킨 후 테스트를 진행했습니다. 시료 준비는 5초가 소요되었으며, 센서 청소는 120초 동안 진행되었고, 센서 제로는 10초가 필요했습니다. 주입 속도는 400 mL/분이었으며, 분석 샘플링은 90초가 소요되었고, 특징 추출은 57~59초 동안 진행되었습니다.

3.3.2. 휘발성 성분 측정

시료 5mL와 NaCl 3g을 20mL 헤드스페이스 바이알에 혼합한 후, 혼합물을 50°C에서 5분간 열충격 처리했습니다. 흡착-탈착 과정 및 정량화 방법은 이전 연구[19]와 동일했으나, GC의 온도 프로파일은 다음과 같이 수정되었습니다: 40°C에서 시작하여 2분 동안 유지한 후, 2°C/분의 속도로 90°C까지 상승시킨 후, 10°C/분의 속도로 250°C까지 추가로 상승시켜 5분 동안 유지했습니다. 이온 소스 온도는 230°C로 설정되었으며, 쿼드러폴 온도는 250°C로 설정되었습니다.

3.4. Statistical Analysis

All data were subjected to a one-way analysis of variance (ANOVA) using IBM SPSS Statistical 26. Statistical significance was defined as p < 0.05. Data analysis and plotting were performed using Excel, GraphPad Prism (version 8.3.0), and Origin 2021.

4. Results and Discussion

4.1. The Impact of Different Treatments on the Active Components in Highland Barley Enzyme-Treated Beverages

4.1.1. GABA and Amino Acid Content

GABA is a valuable four-carbon free amino acid that has many health and nutrition benefits [20]. As shown in Figure 1A,B, compared to the HB sample, the GABA and amino acid content significantly increased in all the pretreated samples. The GABA content ranged from 34.46 to 83.28 ug/mL, and the amino acid content ranged from 7.68 to 12.29 umol/mL, with a consistent increasing trend. Germination, enzymatic hydrolysis, and fermentation all facilitate the breakdown of proteins into amino acids under the action of proteases, and these amino acids can promote GABA synthesis through multiple amino pathways [10]. Among them, the GBT sample, treated by germination and the addition of TB13 barley powder during the enzymatic hydrolysis process, exhibited the highest GABA and amino acid content. Germination treatment led to an 80% and 47% increase in GABA and amino acid content, respectively. It has been reported that germination can cause glutamate decarboxylase to convert glutamate to GABA [21]. The addition of TB13 resulted in a 60% and 34% increase in GABA and amino acid content, respectively, clearly demonstrating that highland barley with elevated GAD activity facilitates GABA enrichment [11]. However, the effect of germination treatment was significantly superior to the addition of active barley powder. Compared with the GBT sample, the GBTF sample, after fermentation treatment, showed a significant decrease in GABA and amino acid content, but both were still significantly higher than in the GB and BT samples. Although lactic acid bacteria can synthesize GABA during fermentation [22], the amino acid molecules obtained through germination and enzymatic hydrolysis may also be directly utilized by the bacteria, resulting in the lower GABA content in the GBTF sample compared to the GBT.

4.1.1. GABA 및 아미노산 함량

GABA는

건강과 영양에 많은 이점을 가진 귀중한

4탄소 free 함유 아미노산입니다 [20].

GABA is a valuable four-carbon free amino acid

that has many health and nutrition benefits

그림 1A, B에서 볼 수 있듯이,

HB 샘플에 비해 모든 전처리 샘플에서 GABA 및 아미노산 함량이 유의미하게 증가했습니다.

GABA 함량은 34.46에서 83.28 ug/mL 사이,

아미노산 함량은 7.68에서 12.29 umol/mL 사이로 일관된 증가 추세를 보였습니다.

발아, 효소 분해, 발효는

모두 프로테아제의 작용으로 단백질을 아미노산으로 분해하며,

이러한 아미노산은 다양한 아미노산 경로를 통해 GABA 합성을 촉진합니다

[

Germination, enzymatic hydrolysis, and fermentation all facilitate the breakdown of proteins into amino acids under the action of proteases, and these amino acids can promote GABA synthesis through multiple amino pathways

TB13의 첨가는 GABA와 아미노산 함량을 각각 60%와 34% 증가시켰으며, 이는 고지대 보리가 높은 GAD 활성을 통해 GABA 풍부화를 촉진함을 명확히 보여주었습니다 [11]. 그러나 발아 처리의 효과는 활성 보리 분말 추가보다 유의미하게 우수했습니다. 발효 처리 후 GBTF 샘플은 GABA 및 아미노산 함량이 유의미하게 감소했지만, 두 함량 모두 GB 및 BT 샘플보다 여전히 유의미하게 높았습니다. 젖산균은 발효 과정에서 GABA를 합성할 수 있지만 [22], 발아와 효소 분해로 얻어진 아미노산 분자는 박테리아에 의해 직접 이용될 수 있어 GBTF 샘플의 GABA 함량이 GBT보다 낮은 것으로 추정됩니다.

그림 1. 다양한 처리 방법이 고지대 보리 효소 처리 음료의 (A) GABA, (B) 아미노산, (C) 총 페놀, 및 (D) 플라보노이드 함량에 미치는 영향. 고지대 보리 (HB), 발아 보리 (GB), TB13을 첨가한 보리 (BT), TB13을 첨가한 발아 보리(GBT), 및 TB13을 첨가한 발아 보리를 발효시킨 GBTF. 결과는 3개 시료의 평균 ± 표준 편차입니다. 동일한 열 내의 다른 문자(a–e)는 유의미한 차이를 나타냅니다(p < 0.05).

Figure 1. The impact of different treatments on the (A) GABA, (B) amino acids, (C) total phenols, and (D) flavonoid content in highland barley enzyme-treated beverages. Highland barley (HB), germinated barley (GB), barley with TB13 (BT), germinated barley with TB13 (GBT), and germinated barley with TB13 added and then fermented (GBTF). The results are the mean of three samples ± standard deviation. Different letters in the same column (a–e) represent significant differences (p < 0.05).

4.1.2. Total Phenol and Flavonoid Content

Phenolic compounds are important metabolites in barley, typically including free phenols and bound phenols. Phenols bound to cellulose in the seed coat are crucial defense mechanisms for seeds; hence, the content of bound phenols is usually higher than that of free phenols [23]. Bound polyphenols mainly involve chemical bonds such as ester bonds, glycosidic bonds, ether bonds, etc., with large molecules like proteins, cellulose, and plant matrices. They are physically trapped in the plant matrix or embedded in cell structures [24]. Different treatments such as germination, enzymatic hydrolysis, microwave-assisted extraction, and fermentation can disrupt the structure of bound phenols, thereby altering the content and composition of phenolic compounds in barley [25,26]. For example, lignin in seeds can be degraded into hydroxybenzoic acid and vanillin under enzymatic reactions, increasing the content of free phenols [27].

As shown in Figure 1C,D, the total phenol content increased in all the pretreatments, except for the GB sample, where the other treatments significantly elevated the total phenol content of the beverages. The total phenolic content increases gradually with the duration of germination, and it is possible that a shorter duration of germination leads to a smaller increase in phenolics [28]. Among the samples, the total phenol content in the GBTF sample increased the most, from 0.59 mmol/L in HB to 0.94 mmol/L, representing a 60% increase. This result is consistent with the findings of Al-Ansi [29] and others, who observed an increase in total phenol content through germination and subsequent fermentation. Under the influence of fermentation, the regular degradation of cell wall-degrading enzymes, such as esterases, on these linkages leads to the release of new phenolic compounds during the pretreatment process [30]. Meanwhile, the total phenol content in the BT sample was higher than that in the GB sample, indicating that the added TB13 released more phenolic substances during the enzymatic hydrolysis process. However, the total phenol content in the GB sample also slightly increased, possibly because essential enzymes in phenolic biosynthesis, such as phenylalanine ammonia-lyase, could be activated during germination [31]. As shown in Figure 1D, compared to the HB sample, the flavonoid content in the GB, BT, GBT, and GBTF samples increased by 37%, 62%, 76%, and 40%, respectively. However, notably, the flavonoid content in the fermented GBTF sample significantly decreased compared to the nonfermented GBT sample. Some studies suggest that fermentation by Lactobacillus plantarum can metabolize complex flavonoids into simpler compounds [32]. In summary, through four different processing methods, the content of total phenols and flavonoids in barley enzyme-treated beverages can be increased.

4.1.2. 총 페놀 및 플라보노이드 함량

페놀 화합물은 보리에서 중요한 대사산물로, 일반적으로 자유 페놀과 결합 페놀로 구분됩니다. 종피에 결합된 페놀은 종자의 방어 메커니즘으로 작용하므로, 결합 페놀의 함량은 자유 페놀보다 일반적으로 높습니다 [23]. 결합 폴리페놀은 에스터 결합, 글리코시드 결합, 에테르 결합 등 화학 결합을 통해 단백질, 셀룰로오스, 식물 매트릭스와 같은 큰 분자와 결합되어 있습니다. 이들은 식물 매트릭스에 물리적으로 포집되거나 세포 구조에 내장되어 있습니다 [24]. 발아, 효소 분해, 마이크로웨이브 보조 추출, 발효 등 다양한 처리는 결합된 페놀의 구조를 파괴하여 보리 내 페놀 화합물의 함량과 구성비를 변화시킬 수 있습니다 [25,26]. 예를 들어, 종자 내 리그닌은 효소 반응을 통해 히드록시벤조산과 바닐린으로 분해되어 자유 페놀의 함량이 증가합니다 [27].

그림 1C, D에서 볼 수 있듯이, 모든 전처리 조건에서 총 페놀 함량이 증가했으며, GB 샘플을 제외하고 다른 처리 조건에서 음료의 총 페놀 함량이 유의미하게 증가했습니다. 총 페놀 함량은 발아 기간에 따라 점차 증가하며, 발아 기간이 짧을수록 페놀 함량의 증가가 작을 수 있습니다 [28]. 시료 중 GBTF 시료의 총 페놀 함량이 가장 크게 증가했으며, HB의 0.59 mmol/L에서 0.94 mmol/L로 60% 증가했습니다. 이 결과는 Al-Ansi [29] 등 연구진의 결과와 일치합니다. 이들은 발아 및 후속 발효 과정에서 총 페놀 함량이 증가함을 관찰했습니다. 발효의 영향으로 세포벽 분해 효소(예: 에스테라제)가 이러한 결합을 분해함에 따라 전처리 과정에서 새로운 페놀 화합물이 방출됩니다 [30]. 한편, BT 시료의 총 페놀 함량은 GB 시료보다 높았으며, 이는 추가된 TB13이 효소 분해 과정에서 더 많은 페놀성 물질을 방출했기 때문입니다. 그러나 GB 시료의 총 페놀 함량도 약간 증가했으며, 이는 발아 과정에서 페놀 생합성에 필수적인 효소인 페닐알라닌 암모니아 리아제 등이 활성화되었기 때문일 수 있습니다 [31]. 그림 1D에서 볼 수 있듯이, HB 샘플에 비해 GB, BT, GBT, GBTF 샘플의 플라보노이드 함량은 각각 37%, 62%, 76%, 40% 증가했습니다. 그러나 주목할 점은 발효된 GBTF 샘플의 플라보노이드 함량이 발효되지 않은 GBT 샘플에 비해 유의미하게 감소했다는 것입니다. 일부 연구에서는 Lactobacillus plantarum에 의한 발효가 복잡한 플라보노이드를 단순한 화합물로 대사시킬 수 있다고 제안되었습니다 [32]. 요약하면, 네 가지 다른 가공 방법을 통해 보리 효소 처리 음료의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 증가시킬 수 있습니다.

4.2. Impact of Pretreatment on Highland Barley Beverage Antioxidants

As shown in Figure 2, compared to the HB sample, the GB sample had significantly increased ability to eliminate superoxide anions and hydroxyl radicals. Germination treatment aids in the release of phenolic compounds, thereby enhancing the antioxidant activity of highland barley [12]. It was reported that ferulic acid contributed the most to ABTS activities [33]. Meanwhile, the findings of Fogarasi et al. [34] indicate that no significant increases in DPPH and total antioxidant capacity were observed during wheat malting, which is consistent with the results of this study. In the case of the BT sample, apart from a significant decrease in DPPH free-radical scavenging capacity, the other three antioxidant activities were significantly enhanced, with a remarkable 126% increase in superoxide anion scavenging capacity. The GBT sample showed a significant improvement in its DPPH free-radical, superoxide anion, and hydroxyl radical scavenging capacities. Meanwhile, the GBTF sample exhibited a significant increase in all four antioxidant capabilities, with a notable 96% enhancement in total antioxidant capacity. There is a significant positive correlation between the total phenol content and total antioxidant capacity of barley enzyme-treated beverages. Phenolic compounds with higher antioxidant activity in barley include Prodelphinidin B3, catechin, epicatechin gallate, and luteolin-3-ol [35]. Phenolic compounds in barley itself can directly participate in scavenging free radicals, transforming peroxyl radicals into stable byproducts, or indirectly clearing free radicals by inhibiting enzymes that can generate free radicals [13]. While the GBTF sample ranked second in terms of superoxide anion scavenging capacity, lower than the BT sample, it took the top position in terms of the other three antioxidant activities, indicating that fermentation significantly enhanced the antioxidant activity of barley enzyme-treated beverages.

4.2. 전처리 방법의 고지대 보리 음료 항산화 성분への 영향

Figure 2에 표시된 바와 같이, HB 샘플에 비해 GB 샘플은 슈퍼옥사이드 음이온과 하이드록실 라디칼 제거 능력이 유의미하게 증가했습니다. 발아 처리는 페놀 화합물의 방출을 촉진하여 고지대 보리의 항산화 활성을 향상시킵니다 [12]. 페룰산이 ABTS 활성에 가장 크게 기여했다는 보고가 있습니다 [33]. 한편, Fogarasi 등[34]의 연구 결과에 따르면 밀 맥아화 과정에서 DPPH 및 총 항산화 능력에 유의미한 증가가 관찰되지 않았으며, 이는 본 연구 결과와 일치합니다. BT 샘플의 경우 DPPH 자유 라디칼 제거 능력에서 유의미한 감소가 관찰되었으나, 나머지 세 가지 항산화 활성은 유의미하게 향상되었으며, 특히 슈퍼옥사이드 음이온 제거 능력은 126% 증가했습니다. GBT 샘플은 DPPH 자유 라디칼, 슈퍼옥사이드 음이온, 히드록실 라디칼 제거 능력에서 유의미한 개선을 보였습니다. 한편, GBTF 시료는 모든 네 가지 항산화 능력에서 유의미한 증가를 보였으며, 총 항산화 능력은 96% 증가했습니다. 보리 효소 처리 음료의 총 페놀 함량과 총 항산화 능력 사이에 유의미한 양의 상관관계가 있습니다. 보리에서 항산화 활성이 높은 페놀 화합물에는 프로델피니딘 B3, 카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 루테올린-3-올이 포함됩니다 [35]. 보리 자체의 페놀성 화합물은 자유 라디칼 제거에 직접 참여하여 페록실 라디칼을 안정적인 부산물로 전환하거나, 자유 라디칼을 생성하는 효소의 활성을 억제함으로써 간접적으로 자유 라디칼을 제거할 수 있습니다. [13]. GBTF 샘플은 슈퍼옥사이드 음이온 제거 능력에서 BT 샘플보다 낮은 2위를 차지했지만, 다른 세 가지 항산화 활성에서는 1위를 차지해 발효가 보리 효소 처리 음료의 항산화 활성을 크게 향상시켰음을 나타냅니다.

그림 2. 다양한 처리 방법에 따른 (A) 총 항산화 능력, (B) 총 항산화 능력, (C) 슈퍼옥사이드 음이온 제거 능력, 및 (D) 하이드록실 라디칼 제거 능력의 변화. 고지대 보리(HB), 발아 보리(GB), TB13 처리 보리(BT), TB13 처리 발아 보리(GBT), TB13 처리 후 발효된 발아 보리(GBTF). 결과는 3개 시료의 평균 ± 표준 편차입니다. 같은 열 내의 다른 글자(a–d)는 유의미한 차이를 나타냅니다(p < 0.05).

Figure 2. The effects of various treatments on (A) total antioxidant capacity, (B) total antioxidant capacity, (C) superoxide anion scavenging capacity, and (D) hydroxyl radical scavenging ability in enzyme-treated highland barley beverages. Highland barley (HB), germinated barley (GB), barley with TB13 (BT), germinated barley with TB13 (GBT), and germinated barley with TB13 added then fermented (GBTF). The results are the mean of three samples ± standard deviation. Different letters in the same column (a–d) represent significant differences (p < 0.05).

4.3. Effect of Pretreatment on Sensory Quality of Highland Barley Beverages

Sensory eval‎uation has been accomplished through visual observation, the use of taste buds in the mouth, and the olfactory sense of the nose. However, physiological differences and variations in olfactory abilities among individuals can lead to inaccurate and non-reproducible results. Furthermore, extended periods of tasting can result in sensory fatigue or desensitization of the human sensory organs. The electronic tongue and electronic nose boast several merits, including robust repeatability, swift measurements, and user-friendly operation [36].

The taste and aroma profiles of the HB, GB, BT, and GBT samples overlap, with similar taste characteristics and aromas, as depicted in Figure 3A,B. The HB, GB, BT, and GBT samples exhibit higher levels of freshness, saltiness, and richness compared to the GBTF samples, which notably lack acidity. In contrast, the enzymatically treated barley beverage GBTF, obtained through fermentation, shows an increase in acidity and a decrease in bitterness. It is possible that Lactobacillus plantarum utilized certain bitter amino acids to produce a variety of organic acids [37]. The olfactory profile of the GBTF samples significantly expanded, with sensory sensors W1S, W2S, and W5S exhibiting a marked increase in response. Similarly, sensors W1W and W2W also showed a significant rise in response. GBTF was metabolized by microorganisms to alter and produce more aromatic compounds, volatile sulfides, and nitrogen oxides [38]. This indicates that fermentation not only effectively changes the mouthfeel of barley enzyme-treated beverages but also generates more volatile compounds, thereby improving the overall flavor of the barley enzyme-treated beverages.

4.3. 전처리 방법이 고지대 보리 음료의 감각 품질에 미치는 영향

감각 평가는 시각적 관찰, 입안의 미각 세포 사용, 코의 후각을 통해 수행되었습니다. 그러나 개인 간의 생리적 차이 및 후각 능력의 변동은 부정확하고 재현 불가능한 결과를 초래할 수 있습니다. 또한, 장시간의 시음은 인간의 감각 기관의 감각 피로나 둔화를 초래할 수 있습니다. 전자 혀와 전자 코는 강력한 재현성, 빠른 측정 속도, 사용자 친화적인 조작 등 여러 장점을 갖추고 있습니다 [36].

HB, GB, BT, 및 GBT 시료의 맛과 향 프로파일은 Figure 3A,B에 표시된 대로 유사한 맛 특성과 향을 보입니다. HB, GB, BT, 및 GBT 샘플은 GBTF 샘플에 비해 신선함, 짠맛, 및 풍미가 더 높으며, GBTF 샘플은 산도가 현저히 부족합니다. 반면, 발효를 통해 얻어진 효소 처리된 보리 음료 GBTF는 산도가 증가하고 쓴맛이 감소했습니다. Lactobacillus plantarum이 특정 쓴 아미노산을 활용해 다양한 유기산을 생성했을 가능성이 있습니다 [37]. GBTF 샘플의 후각 프로파일은 크게 확장되었으며, 감각 센서 W1S, W2S, 및 W5S는 반응이 현저히 증가했습니다. 마찬가지로 센서 W1W와 W2W도 반응이 유의미하게 증가했습니다. GBTF는 미생물에 의해 대사되어 향기로운 화합물, 휘발성 황화물, 및 질소 산화물을 생성하고 변환시켰습니다 [38]. 이는 발효가 보리 효소 처리 음료의 입안 느낌을 효과적으로 변화시킬 뿐만 아니라 더 많은 휘발성 화합물을 생성하여 보리 효소 처리 음료의 전체적인 풍미를 향상시킨다는 것을 나타냅니다.

그림 3. 전자 혀를 사용하여 다양한 방법으로 처리된 보리 효소 처리 음료의 레이더 차트 (A) 및 클러스터 히트맵 (C). 또한 동일한 시료를 전자 코로 분석한 레이더 차트 (B) 및 클러스터 히트맵 (D)을 제시합니다. 결과는 3개 샘플의 평균 ± 표준 편차입니다. 고지대 보리(HB), 발아 보리(GB), TB13 처리 보리(BT), TB13 처리 발아 보리(GBT), TB13 처리 후 발효된 발아 보리(GBTF).

Figure 3. The radar chart (A) and cluster heatmap (C) for barley enzyme-treated beverages treated with different methods using an electronic tongue. Additionally, it presents the radar chart (B) and cluster heatmap (D) for the same samples analyzed with an electronic nose. The results are the mean of three samples ± standard deviation. Highland barley (HB), germinated barley (GB), barley with TB13 (BT), germinated barley with TB13 (GBT), and germinated barley with TB13 added then fermented (GBTF).

As illustrated in Figure 3C,D, taste sensors classify acidity, sweetness, astringency, and astringency aftertastes into a single category. The HB, GB, BT, and GBT samples exhibit similar and generally lower response values compared to the GBTF samples. Conversely, bitterness, freshness, richness, saltiness, and bitterness aftertastes are grouped together, with the HB, GB, BT, and GBT samples showing similar and generally higher response values than the GBTF samples. Olfactory sensors cluster W5C, W3C, and W1C, all responsive to aromatic compounds, into one category. The HB, GB, BT, and GBT samples show similar and overall higher response values compared to the GBTF samples. The W5S, W1W, W1S, W2S, W2W, W3S, and W6S sensors are grouped together, indicating that the HB, GB, BT, and GBT samples have similar and overall lower response values compared to the GBTF samples. Horizontal clustering reveals that, whether in taste or aroma features, the HB, GB, BT, and GBT samples are more closely grouped, while the GBTF samples exhibit clear distinctions from other samples. Further analysis reveals that germination significantly altered the taste of HB and GB beverages without the addition of TB13. In contrast, for the BT and GBT samples with TB13, germination had little impact on taste. Notably, the effects of germination and the addition of active barley powder on the taste and aroma characteristics of the beverages vary. Germination had a minor influence on aroma, whereas the addition of TB13 caused substantial changes, leading to the grouping of HB and GB into one cluster and BT and GBT into another. The addition of TB13 likely contributed significantly to the taste and aroma, making it well expressed in the beverages.

그림 3C, D에서 보여지듯이, 맛 센서는 산도, 단맛, 떫은맛, 떫은맛 여운을 단일 카테고리로 분류합니다. HB, GB, BT, GBT 샘플은 GBTF 샘플에 비해 유사하고 일반적으로 낮은 반응 값을 보입니다. 반면, 쓴맛, 신선함, 풍부함, 짠맛, 그리고 쓴맛의 여운은 함께 그룹화되며, HB, GB, BT, 및 GBT 샘플은 GBTF 샘플에 비해 유사하고 일반적으로 더 높은 반응 값을 보입니다. 후각 센서는 향기 성분에 반응하는 W5C, W3C, 및 W1C를 단일 카테고리로 분류합니다. HB, GB, BT 및 GBT 샘플은 GBTF 샘플에 비해 유사하고 전반적으로 더 높은 반응 값을 보입니다. W5S, W1W, W1S, W2S, W2W, W3S 및 W6S 센서는 함께 그룹화되어, HB, GB, BT 및 GBT 샘플이 GBTF 샘플에 비해 유사하고 전반적으로 더 낮은 반응 값을 보임을 나타냅니다. 수평 클러스터링 결과, 맛이나 향기 특성 모두에서 HB, GB, BT, GBT 샘플은 더 밀접하게 그룹화되었으며, GBTF 샘플은 다른 샘플과 명확한 차이를 보였습니다. 추가 분석 결과, TB13을 추가하지 않은 HB 및 GB 음료의 맛은 발아에 의해 크게 변화했습니다. 반면, TB13을 추가한 BT 및 GBT 샘플에서는 발아가 맛에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 특히, 발아와 활성 보리 분말 추가가 음료의 맛과 향기 특성에 미치는 영향은 다릅니다. 발아는 향기에 미미한 영향을 미쳤지만, TB13 추가로 인해 HB와 GB가 한 클러스터로, BT와 GBT가 다른 클러스터로 그룹화되는 등 향기에 큰 변화를 초래했습니다. TB13 추가가 맛과 향기에 크게 기여해 음료에서 잘 표현되었습니다.

4.4. Impact of Pretreatment on Volatile Flavor Compounds in Highland Barley Beverages

As shown in Figure 4, GC-MS analysis successfully identified 69 compounds in the five sample groups, including 14 esters, 20 alcohols, 7 acids, 10 aldehydes, 7 ketones, 5 phenols, and 6 other compounds. The vertical clustering in Figure 4 aligns with the results of the electronic nose and electronic tongue analyses, highlighting the significant differentiation of GBTF samples in terms of their volatile flavor compounds compared to the other four groups. Combining the analysis of substance composition in Figure 5A,C, the five sample groups contain 37, 32, 42, 47, and 43 volatile compounds, respectively, with alcohols, esters, and aldehydes being the predominant categories.

Figure 4. The cluster heatmap of volatile compounds in barley enzyme-treated beverages treated with different methods. Highland barley (HB), germinated barley (GB), barley with TB13 (BT), germinated barley with TB13 (GBT), and germinated barley with TB13 added then fermented (GBTF).

Figure 5. The types (A), concentrations (B), and a Venn diagram (C) of volatile components in barley enzyme-treated beverages treated with different methods. Highland barley (HB), germinated barley (GB), barley with TB13 (BT), germinated barley with TB13 (GBT), and germinated barley with TB13 added then fermented (GBTF).

The common compounds across all five sample groups include acetone, 1-pentanol, 1-octen-3-ol, 1-heptanol, 2-ethylhexanol, 2,4-di-tert-butylphenol, pentanal, hexanal, heptenal, nonanal, benzaldehyde, benzeneacetaldehyde, acetophenone, oxime-methoxy-phenyl-, hexyl formate, spironolactone, benzyl acetate, and 2,2,4-trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate. Alcohols such as 1-pentanol, 1-heptanol, and 2-ethylhexanol contribute to the pleasant, mellow, and fruity flavor characteristics of barley grains. 1-octen-3-ol imparts a mushroom-like aroma, while aldehydes like pentanal, hexanal, heptenal, nonanal, benzaldehyde, and benzeneacetaldehyde provide malt, grass, fatty, and rose aromas [39].

The GB, BT, and GBT samples obtained one, one, and four additional compounds, respectively, through germination and the addition of active barley powder. These include 1-dodecanol, isobutyl acetate, 4-ethylcyclohexanol, octyl formate, 2-butylcyclohexan-1-one, and 2-ethylhexanoyl 2-ethylhexanoate. However, the GBTF samples exhibited an increase in 10 new substances, with acids being the most preval‎ent category. These acids include acetic acid, octanoic acid, and guanidinopropionic acid, contributing acidity and forming esters through reactions with ethanol, enhancing the overall flavor of the beverage [40]. The addition of furfural, originating from the thermal decomposition of polypentose in cereal husks, provides an almond-like aroma and sweetness, significantly enhancing the rich caramel flavor of barley enzyme-treated beverages [41]. 2-Methoxy-4-vinylphenol imparts a vanilla flavor to the barley enzyme-treated beverages. Enzymatic hydrolysis, fermentation, and other treatments break down proteins in barley into amino acids, which are crucial precursor substances for the formation of flavor compounds [38].

As shown in Figure 4, the vertical clustering of barley enzymatic beverages treated in different ways reveals consistent results when comparing volatile flavor compounds measured by GC-MS and aroma characteristics assessed by the electronic nose during sample clustering. The GBTF sample was distinguished from the others, while the HB and GB samples and the BT and GBT samples were further separated. This clearly demonstrates that fermentation significantly altered the flavor of the barley enzymatic beverages, while the addition of TB13 active barley powder also contributed to flavor changes, though its effect was weaker than that of fermentation. Germination, on the other hand, had minimal impact on the flavor of the beverages. From the horizontal clustering, the volatile flavor compounds in the beverages were mainly grouped into three categories. The first category contained 16 compounds, with their concentrations being higher in the GBTF sample compared to the others. Notably, 2,4-di-tert-butylphenol and hexyl formate exhibited significant differences in concentration due to varying treatments, such as germination, TB13 addition, and fermentation. Hexanoic acid and acetic acid were fermentation products, and in the fermented GBTF sample, the relative content of acetic acid and hexanoic acid reached 5.1% and 5.8%, respectively. The second category comprised 26 compounds, characterized by significant variability in concentration depending on the treatment method. The third category included 27 compounds, where 1-pentanol, t-butylhydroquinone, benzaldehyde, ethyl acetate, octyl formate, diisobutyl phthalate, and monobutyl phthalate were found in higher concentrations in the BT or GBT samples, which was potentially related to the addition of highly active TB13 barley powder.

As shown in Figure 5A,B, the number of volatile compounds in the different samples ranged from 32 to 47, consisting of esters, aldehydes, phenols, and other similar substances, with a relatively similar composition structure. In contrast, the total content of volatile flavor compounds such as phenols and esters in the germinated GB sample was close to that in HB. However, in the BT, GBT, and GBTF samples with added active barley powder, there were significant changes in the composition of volatile flavor compounds, including an increase in phenols and a decrease in esters, aldehydes, and other substances. Fermentation notably increased the content of acids while reducing the content of aldehydes and ketones.

4.4. 전처리 방법의 고지대 보리 음료 내 휘발성 향미 성분への 영향

그림 4에 표시된 대로, GC-MS 분석을 통해 5개 샘플 그룹에서 14개의 에스터, 20개의 알코올, 7개의 산, 10개의 알데히드, 7개의 케톤, 5개의 페놀, 및 6개의 기타 화합물을 포함한 총 69개의 화합물이 성공적으로 식별되었습니다. 그림 4의 수직 클러스터링은 전자 코와 전자 혀 분석 결과와 일치하며, GBTF 샘플이 다른 4개 그룹과 비교해 휘발성 향미 성분 측면에서 유의미한 차이를 보임을 강조합니다. 그림 5A, C의 물질 구성 분석 결과를 결합하면, 5개 샘플 그룹은 각각 37, 32, 42, 47, 43개의 휘발성 화합물을 포함하며, 알코올, 에스터, 알데히드가 주요 카테고리를 차지합니다.

그림 4. 다양한 방법으로 처리된 보리 효소 처리 음료의 휘발성 성분 클러스터 히트맵. 고지대 보리 (HB), 발아 보리 (GB), TB13 처리 보리 (BT), TB13 처리 발아 보리 (GBT), TB13 처리 후 발효된 발아 보리 (GBTF).

그림 5. 다양한 방법으로 처리된 보리 효소 처리 음료의 휘발성 성분의 유형(A), 농도(B), 및 벤 다이어그램(C). 고지대 보리(HB), 발아 보리(GB), TB13 처리 보리(BT), TB13 처리 발아 보리(GBT), 및 TB13을 추가한 후 발효된 발아 보리(GBTF).

모든 5개 샘플 그룹에 공통으로 존재하는 화합물에는 아세톤, 1-펜탄올, 1-옥텐-3-올, 1-헥탄올, 2-에틸헥산올, 2,4-디-테르트-부틸페놀, 펜탈, 헥살, 헤프탈, 노나날, 벤즈알데히드, 벤젠아세탈데히드, 아세토페논, 옥시메토キシ페닐-, 헥실 포르메이트, 스피로노락톤, 벤질 아세테이트, 및 2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄디올 디이소부티레이트입니다. 1-펜탄올, 1-헥탄올, 및 2-에틸헥산올은 보리 곡물의 향긋하고 부드럽고 과일 향을 기여합니다. 1-옥텐-3-올은 버섯 향을 부여하며, 펜탈, 헥살, 헥사날, 헥사날, 벤잘데히드, 및 벤젠아세탈데히드와 같은 알데히드는 맥아, 풀, 지방, 및 장미 향을 제공합니다 [39].

GB, BT, 및 GBT 시료는 발아 및 활성 보리 가루 추가를 통해 각각 1개, 1개, 4개의 추가 화합물을 얻었습니다. 이에는 1-도데카놀, 이소부틸 아세테이트, 4-에틸사이클로헥산올, 옥틸 포르메이트, 2-부틸사이클로헥산-1-온, 및 2-에틸헥사노일 2-에틸헥사노에이트가 포함됩니다. 그러나 GBTF 샘플은 10개의 새로운 물질이 증가했으며, 이 중 산류가 가장 많은 카테고리를 차지했습니다. 이 산류에는 아세트산, 옥타노산, 구아니디노프로피온산이 포함되며, 에탄올과의 반응을 통해 에스터를 형성하여 음료의 전체적인 풍미를 향상시킵니다 [40]. 폴리펜토스의 열분해로 생성되는 푸르푸랄은 곡물 껍질에서 유래하며, 아몬드 향과 단맛을 부여해 보리 효소 처리 음료의 풍부한 캐러멜 향을 크게 향상시킵니다 [41]. 2-메톡시-4-비닐페놀은 보리 효소 처리 음료에 바닐라 향을 부여합니다. 효소 분해, 발효 및 기타 처리는 보리의 단백질을 아미노산으로 분해하며, 이는 향미 화합물 형성의 중요한 전구체 물질입니다 [38].

그림 4에서 보듯이, 다양한 방법으로 처리된 보리 효소 음료의 수직 클러스터링은 GC-MS로 측정된 휘발성 향미 화합물과 전자 코로 평가된 향미 특성을 비교할 때 일관된 결과를 보여줍니다. GBTF 샘플은 다른 샘플과 구분되었으며, HB와 GB 샘플 및 BT와 GBT 샘플은 추가로 분리되었습니다. 이는 발효가 보리 효소 음료의 향에 크게 영향을 미쳤음을 명확히 보여주며, TB13 활성 보리 분말의 추가도 향 변화에 기여했지만 그 효과는 발효보다 약했습니다. 반면 발아는 음료의 향에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 수평 클러스터링 결과, 음료의 휘발성 향미 성분은 주로 세 가지 범주로 분류되었습니다. 첫 번째 범주는 16개의 화합물로 구성되었으며, GBTF 샘플에서 다른 샘플보다 농도가 높았습니다. 특히 2,4-디-테르트-부틸페놀과 헤xyl 포르메이트는 발아, TB13 추가, 발효와 같은 처리 조건에 따라 농도 차이가 유의미했습니다. 헥산산과 아세트산은 발효 생성물로, 발효된 GBTF 샘플에서 아세트산과 헥산산의 상대적 함량은 각각 5.1%와 5.8%에 달했습니다. 두 번째 카테고리는 26개의 화합물로 구성되었으며, 처리 방법에 따라 농도가 크게 변동되었습니다. 세 번째 카테고리에는 27개의 화합물이 포함되었으며, 1-펜탄올, t-부틸히드록시퀴논, 벤잘데히드, 에틸 아세테이트, 옥틸 포르메이트, 디이소부틸 프탈레이트, 모노부틸 프탈레이트는 BT 또는 GBT 시료에서 높은 농도로 검출되었으며, 이는 활성도가 높은 TB13 보리 분말의 추가와 관련이 있을 수 있습니다.

그림 5A,B에 표시된 바와 같이, 다양한 시료의 휘발성 화합물 수는 32에서 47까지 다양했으며, 에스터, 알데히드, 페놀 및 유사한 물질로 구성되어 상대적으로 유사한 구성 구조를 보였습니다. 반면, 발아된 GB 시료의 페놀과 에스터와 같은 휘발성 향미 화합물의 총 함량은 HB와 유사했습니다.

그러나 활성 보리 가루를 추가한 BT, GBT, GBTF 시료에서는 휘발성 향료 화합물의 구성에 유의미한 변화가 관찰되었으며, 페놀 함량은 증가하고 에스터, 알데히드 및 기타 물질의 함량은 감소했습니다. 발효는 산 함량을 증가시키며 알데히드와 케톤의 함량을 감소시켰습니다.

5. Conclusions

This study, through germination, enzymatic hydrolysis, the addition of active highland barley powder, and fermentation treatments, not only increased the content of GABA, amino acids, and phenolic compounds in highland barley beverages but also enhanced their antioxidant capacity. Additionally, it improved the flavor of highland barley beverages. Among the samples used, the GBT sample stood out for having the highest content of GABA, free amino acids, and total flavonoids. In contrast, the fermented GBTF sample exhibited a significant increase in total phenolic content and overall antioxidant capacity, reaching 1.6 times and 2 times that of the control sample, HB, respectively. The GB, BT, and GBT samples had a minimal impact on the taste and aroma of the enzymatically hydrolyzed highland barley beverages. However, the levels of compounds such as 2,4-Di-tert-butylphenol, hexyl formate, hexanal, acetone, spironolactone, 2,2,4-trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate, and pyridine varied significantly between the treatments. Notably, the fermented GBTF sample drastically altered the flavor profile of the enzymatically hydrolyzed highland barley beverage, reducing its bitterness and increasing its acidity. This was accompanied by a significant rise in compounds such as hexanoic acid, acetic acid, octanoic acid, 2,4-di-tert-butylphenol, hexyl formate, and 1-heptanol. The findings of this research will contribute to the development of innovative barley-based functional beverages that combine enhanced nutritional benefits with improved sensory qualities, ultimately offering a valuable addition to the functional food market.

5. 결론

이 연구는 발아, 효소 분해, 활성 고지대 보리 가루 첨가, 발효 처리를 통해 고지대 보리 음료의 GABA, 아미노산, 페놀성 화합물 함량을 증가시키고 항산화 능력을 향상시켰습니다. 또한 고지대 보리 음료의 풍미를 개선했습니다. 사용된 시료 중 GBT 시료는 GABA, 자유 아미노산, 총 플라보노이드 함량이 가장 높았습니다.

반면 발효된 GBTF 샘플은

총 페놀 함량과 전체 항산화 능력이 대조군 샘플 HB에 비해

각각 1.6배와 2배로 유의미하게 증가했습니다.

GB, BT, GBT 샘플은 효소 분해된 고지대 보리 음료의 맛과 향에 미미한 영향을 미쳤습니다. 그러나 2,4-디-테르트-부틸페놀, 헥실 포르메이트, 헥사날, 아세톤, 스피로노락톤, 2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄디올 디이소부티레이트, 피리딘 등의 화합물 수준은 처리 조건에 따라 크게 차이가났습니다.

특히, 발효된 GBTF 샘플은

효소적 가수분해 고지대 보리 음료의 풍미 프로파일을 극적으로 변화시켜

쓴맛을 감소시키고 산도를 증가시켰습니다.

이는 헥사노산, 아세트산, 옥타노산, 2,4-디-테르트-부틸페놀, 헥실 포르메이트, 및 1-헥산올과 같은 화합물의 유의미한 증가와 동반되었습니다. 이 연구의 결과는 향상된 영양적 이점과 개선된 감각적 특성을 결합한 혁신적인 보리 기반 기능성 음료 개발에 기여할 것이며, 궁극적으로 기능성 식품 시장에 가치 있는 기여를 할 것입니다.

Author Contributions

Conceptualization, data curation, and writing—original draft, X.Y.; writing—review and editing, supervision, S.W.; writing—review and editing, Z.W.; data curation, resources, H.W.; methodology, T.B.; writing—review and editing, funding acquisition, Y.Z. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

Funding

This study was financially supported by funds from the Tibet Autonomous Region Major Science and Technology Project, grant number XZ202201ZD0001N, and the National Key Research and Development Program of China, grant number 2021YFD1000305.

Data Availability Statement

The original contributions presented in the study are included in the article, further inquiries can be directed to the corresponding author.

Conflicts of Interest

The authors declare no conflicts of interest.

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