아미노산 신경전달물질 '글루탐산' 흥분성 신경독성 탐구!!

[문형철]

J Neural Transm (Vienna). 2014; 121(8): 799–817.

Published online 2014 Mar 1. doi: 10.1007/s00702-014-1180-8

PMCID: PMC4133642

PMID: 24578174

Glutamate as a neurotransmitter in the healthy brain

Y. Zhou and N. C. Danbolt

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Abstract

Glutamate is the most abundant free amino acid in the brain and is at the crossroad between multiple metabolic pathways. Considering this, it was a surprise to discover that glutamate has excitatory effects on nerve cells, and that it can excite cells to their death in a process now referred to as “excitotoxicity”. This effect is due to glutamate receptors present on the surface of brain cells. Powerful uptake systems (glutamate transporters) prevent excessive activation of these receptors by continuously removing glutamate from the extracellular fluid in the brain. Further, the blood–brain barrier shields the brain from glutamate in the blood. The highest concentrations of glutamate are found in synaptic vesicles in nerve terminals from where it can be released by exocytosis. In fact, glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system. It took, however, a long time to realize that. The present review provides a brief historical description, gives a short overview of glutamate as a transmitter in the healthy brain, and comments on the so-called glutamate–glutamine cycle. The glutamate transporters responsible for the glutamate removal are described in some detail.

요약

글루타메이트는 

뇌에서 가장 풍부한 유리 아미노산이며 

여러 대사 경로의 교차로에 존재합니다. 

이러한 점을 고려할 때 

글루타메이트가 신경 세포에 흥분 효과가 있으며, 

현재 '흥분 독성'이라고 불리는 과정에서 

세포를 사멸시킬 수 있다는 사실을 발견한 것은 놀라운 일이었습니다. 

이러한 효과는 

뇌세포 표면에 존재하는 

글루타메이트 수용체 때문입니다. 

강력한 흡수 시스템(글루타메이트 수송체)은 

뇌의 세포 외액에서 

글루타메이트를 지속적으로 제거하여 

이러한 수용체가 과도하게 활성화되는 것을 방지합니다. 

또한 

혈액-뇌 장벽은 

혈액 내 글루타메이트로부터 

뇌를 보호합니다. 

가장 높은 농도의 글루타메이트는 

신경 말단의 시냅스 소포에서 발견되며, 

이곳에서 세포 외 배출에 의해 방출될 수 있습니다. 

실제로 

글루타메이트는 

포유류 중추신경계의 

주요 흥분성 신경전달물질입니다. 

그러나 

이 사실을 깨닫는 데는 오랜 시간이 걸렸습니다. 

이 리뷰에서는 

글루타메이트에 대한 간략한 역사적 설명과 

건강한 뇌의 전달 물질로서의 글루타메이트에 대한 간략한 개요, 

그리고 소위 글루타메이트-글루타민 주기에 대한 설명을 제공합니다. 

글루타메이트 제거를 담당하는 

글루타메이트 수송체에 대해서도 자세히 설명합니다.

Keywords: Glutamate uptake, EAAT2, EAAT1, EAAT3, slc1a2, slc1a1, slc1a3, Glutamate, Glutamate transporter, Immunocytochemistry, Neuropil

Introduction

Outside the community of biomedical scientists, glutamate is probably best known as “monosodium glutamate” or “MSG” which is the sodium salt of glutamic acid and a white crystalline solid used as a flavor or taste enhancer in food (food additive number E620). This, however, is not the reason for the enormous scientific interest in glutamate. The main motivation for the ongoing worldwide research on glutamate is that glutamate is the major excitatory transmitter in the brain.

Like other signaling substances, the signaling effect of glutamate is not dependent on the chemical nature of glutamate, but on how cells are programmed to respond when exposed to it. Because the glutamate receptor proteins are expressed on the surface of the cells in such a way that they can only be activated from the outside, it follows that glutamate exerts its neurotransmitter function from the extracellular fluid. Consequently, control of receptor activation is achieved by releasing glutamate to the extracellular fluid and then removing glutamate from it. Because there are no enzymes extracellularly that can degrade glutamate, low extracellular concentrations require cellular uptake. This uptake is catalyzed by a family of transporter proteins located at the cell surface of both astrocytes and neurons (e.g. Danbolt 2001; Grewer and Rauen 2005; Tzingounis and Wadiche 2007; Vandenberg and Ryan 2013).

Because glutamate is the major mediator of excitatory signals as well as of nervous system plasticity, including cell elimination, it follows that glutamate should be present at the right concentrations in the right places at the right time. It further follows that cells should have the correct sensitivity to glutamate and have energy enough to withstand normal stimulation, and that glutamate should be removed with the appropriate rates from the right locations. Both too much glutamate and too little glutamate are harmful. Excessive activation of glutamate receptors may excite nerve cells to their death in a process now referred to as “excitotoxicity”. This toxicity was initially perceived as a paradox like “Dr. Jekyll and Mr. Hyde”, but it is now clear that glutamate is toxic, not in spite of its importance, but because of it. As outlined before (Danbolt 2001), the intensity of glutamatergic stimulation that a given cell can tolerate, depends on several factors. As long as one variable is not extreme, it will be the combination of several factors that will determine the outcome.

It took a long time to realize that glutamate is a neurotransmitter in part because of its abundance in brain tissue and in part because it is at the crossroad of multiple metabolic pathways (e.g. Erecinska and Silver 1990; Broman et al. 2000; McKenna 2007; Hertz 2013). There is 5–15 mmol glutamate per kg brain tissue, depending on the region, more than that of any other amino acid (Schousboe 1981). So although it was noted early on that glutamate plays a central metabolic role in the brain (Krebs 1935), that brain cells have a very high glutamate uptake activity (Stern et al. 1949) and that glutamate has an excitatory effect (Hayashi 1954; Curtis et al. 1959, 1960), the transmitter role was not realized until the early 1980s (for review see Fonnum 1984).

In fact, glutamate metabolism is complex and compartmentalized (Berl et al. 1961, 1962; Van den Berg and Garfinkel 1971; Balcar and Johnston 1975). The important role of glutamate uptake in the control of the excitatory action of glutamate was recognized (Logan and Snyder 1971, 1972; Wofsey et al. 1971; Balcar and Johnston 1972). This became a hot research topic. A number of different glutamate and aspartate analogues were synthesized, and heterogeneity within glutamate uptake was uncovered suggesting more than one uptake mechanism (Ferkany and Coyle 1986; Robinson et al. 1991, 1993; Fletcher and Johnston 1991; Balcar and Li 1992; Rauen et al. 1992).

Similarly, several families of glutamate receptor proteins were identified with molecular cloning (for review see Niswender and Conn 2010; Traynelis et al. 2010; Nicoletti et al. 2011). The receptors were classified as 

N-methyl-d-aspartate (NMDA) receptors (Gonda 2012; Bonaccorso et al. 2011; Santangelo et al. 2012),

AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) receptors (Rogawski 2013),

kainate receptors (Lerma and Marques 2013) and

metabotropic receptors (Gregory et al. 2013).

Most, if not all, cells in the nervous system express at least one type of glutamate receptor (Steinhauser and Gallo 1996; Vernadakis 1996; Forsythe and Barnes-Davies 1997; Wenthold and Roche 1998; Petralia et al. 1999; Conti et al. 1999; Shelton and McCarthy 1999; Bergles et al. 2000). The locations and functional properties of each type are beyond the scope of this review.

Medicinal chemists continued to synthesize new compounds and it is now possible to differentiate pretty well between the various receptors and transporters. Considering the relatively large number of proteins with ability to bind glutamate, it may seem strange that it is possible to find compounds that can distinguish between them. The reason is the high flexibility of the glutamate molecule which permits several conformations that are only minimally less favorable energetically at body temperature than the lowest energy conformation (Bridges et al. 1991). This implies that glutamate can take many shapes and explains, in part, why the various glutamate binding proteins (transporters, receptors, enzymes) can have quite different binding sites and still be able to bind glutamate. A large number of compounds are now available, and there are a number of excellent reviews on the topic (e.g. Bräuner-Osborne et al. 1997; Jensen and Bräuner-Osborne 2004; Shigeri et al. 2004; Ritzen et al. 2005; Thompson et al. 2005; Bridges and Esslinger 2005; Shimamoto 2008; Bridges et al. 2012a, b; Gregory et al. 2013; Gonda 2012; Bonaccorso et al. 2011).

소개

생의학 과학자 커뮤니티 외부에서 글루타민산염은

글루탐산의 나트륨 염이자

식품의 향료 또는 맛 향상제로 사용되는

흰색 결정성 고체(식품첨가물 번호 E620)인

"글루탐산나트륨" 또는

"MSG"로 가장 잘 알려져 있을 것입니다.

monosodium glutamate” or

“MSG

그러나 이것이

글루타민산염에 대한 과학계의 엄청난 관심의 이유는 아닙니다.

글루타메이트에 대한 전 세계적인 연구가 계속되는 주된 동기는

글루타메이트가

뇌의 주요 흥분성 전달 물질이기 때문입니다.

다른 신호 전달 물질과 마찬가지로

글루타메이트의 신호 효과는

글루타메이트의 화학적 특성에 의존하는 것이 아니라

글루타메이트에 노출되었을 때

세포가 반응하도록 프로그래밍된 방식에 따라 달라집니다.

글루타메이트 수용체 단백질은

외부에서만 활성화될 수 있는 방식으로

세포 표면에 발현되기 때문에

글루타메이트는 세포 외액에서 신경전달물질 기능을 발휘합니다.

따라서

수용체 활성화 제어는

글루타메이트를 세포 외액으로 방출한 다음

세포 외액에서 글루타메이트를 제거함으로써 이루어집니다.

세포 밖에서는

글루타메이트를 분해할 수 있는 효소가 없기 때문에

낮은 세포 외 농도에서는 세포 흡수가 필요합니다.

Because there are no enzymes extracellularly that can degrade glutamate,

low extracellular concentrations require cellular uptake

이러한 흡수는

성상세포와 뉴런의 세포 표면에 위치한

수송체 단백질 계열에 의해 촉매됩니다(예: Danbolt 2001, Grewer와 Rauen 2005, Tzingounis와 Wadiche 2007, Vandenberg와 Ryan 2013).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6406900/

글루타메이트는 중추신경계(CNS)의 흥분성 뉴런이 방출하는 가장 흔한 신경전달물질 중 하나이지만 세포 외 공간에 잔류하는 글루타메이트는 잠재적으로 신경 독성을 일으킬 수 있습니다. 성상교세포의 기본 기능 중 하나는 시냅스에서 방출되는 글루타메이트의 대부분을 흡수하여 신경세포 기능을 최적화하고 글루타메이트 흥분 독성을 방지하는 것이라는 사실은 이제 잘 알려져 있습니다. 중추신경계에서 글루타메이트 제거는 주로 성상교세포에서 발현되는 글루타메이트 흡수 수송체에 의해 매개됩니다. 흥미롭게도 최근 연구에 따르면 세포 외 글루타메이트는 성상교세포의 세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 자극하여 성상교세포에서 인접 뉴런으로 글루타메이트 방출을 유발하며, 이는 대부분 세포 외 기전에 의해 이루어집니다. 이렇게 방출된 글루타메이트는 신경세포의 발화를 조정하고 흥분성 또는 억제성 활동을 매개하는 것으로 여겨집니다. 따라서 성상교세포는 글루타메이트 흡수와 방출이라는 상반된 기능 사이의 균형을 유지함으로써 중추신경계의 글루타메이트 항상성 유지에 기여합니다. 성상교세포의 이러한 이중 기능은 글루타메이트 흥분 독성과 관련된 CNS 질환에 대한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다. 이와 관련하여 글루타메이트 흡수 및 방출의 분자 메커니즘과 그 조절, 그리고 CNS에서 두 과정의 중요성을 요약합니다. 또한 글루타메이트 대사와 글루타메이트 흥분 독성의 주요 특징과 CNS 질환에 미치는 영향에 대해 살펴봅니다.

글루타메이트는

세포 제거를 포함한 신경계 가소성뿐만 아니라

흥분성 신호의 주요 매개체이기 때문에

글루타메이트가

적시에 적정한 장소에 적절한 농도로 존재해야 합니다.

Because glutamate is the major mediator of excitatory signals as well as of nervous system plasticity,

including cell elimination, it follows that glutamate should be present at the

right concentrations in the

right places at the

right time.

또한

세포는

글루타메이트에 대한 정확한 민감도와

정상적인 자극을 견딜 수 있는 충분한 에너지를 가져야 하며,

글루타메이트는

적절한 위치에서

적절한 비율로 제거되어야 합니다.

It further follows that cells should have the correct sensitivity to glutamate and have energy enough to withstand normal stimulation, and that glutamate should be removed with the

appropriate rates from the

right locations.

너무 많은 글루타메이트와

너무 적은 글루타메이트는

모두 해롭습니다.

Both

too much glutamate and

too little glutamate are harmful. 

글루타메이트 수용체가 과도하게 활성화되면

신경 세포가 흥분하여 사멸할 수 있는데,

이를 "흥분 독성"이라고 합니다.

Excessive activation of glutamate receptors

may excite nerve cells to their death in a process now referred to as

“excitotoxicity”.

이러한 독성은 처음에는

"지킬 박사와 하이드 씨"와 같은 역설로 인식되었지만,

이제는 글루타메이트가

그 중요성에도 불구하고 독성이 있다는 것이 아니라

그 때문에 독성이 있다는 것이 분명해졌습니다.

 This toxicity was initially perceived as a paradox like “Dr. Jekyll and Mr. Hyde”, but it is now clear that glutamate is toxic, not in spite of its importance, but because of it. As outlined before (Danbolt 2001), the intensity of glutamatergic stimulation that a given cell can tolerate, depends on several factors

앞서 설명한 바와 같이(댄볼트 2001), 특정 세포가 견딜 수 있는 글루타민산 자극의 강도는 여러 요인에 따라 달라집니다. 한 가지 변수가 극단적이지 않은 한, 여러 요인의 조합이 결과를 결정하게 됩니다.

글루타메이트가

부분적으로는 뇌 조직에 풍부하고

부분적으로는 여러 대사 경로의 교차로에 있기 때문에

신경 전달 물질이라는 사실을 깨닫는 데 오랜 시간이 걸렸습니다

(예: 에레신스카 및 실버 1990; 브로만 외. 2000; 맥케나 2007; 헤르츠 2013).

글루타메이트는

부위에 따라 뇌 조직 1kg당 5-15mmol로

다른 어떤 아미노산보다 더 많이 존재합니다(Schousboe 1981).

따라서

글루타메이트가

뇌에서 중심적인 대사 역할을 하고(Krebs 1935),

뇌세포의 글루타메이트 흡수 활동이 매우 높으며(Stern 외. 1949)

글루타메이트가 흥분 효과가 있다는 사실이 일찍이 알려졌지만(Hayashi 1954; Curtis 외. 1959, 1960),

전달자 역할은 1980년대 초에야 밝혀졌습니다(Fonnum 1984 검토 참조).

사실

글루타메이트 대사는

복잡하고 구획화되어 있습니다

(Berl 외. 1961, 1962; Van den Berg와 Garfinkel 1971; Balcar와 Johnston 1975).

글루타메이트의 흥분성 작용을 조절하는 데 있어

글루타메이트 섭취의 중요한 역할이 인식되었습니다

(Logan and Snyder 1971, 1972; Wofsey 외. 1971; Balcar and Johnston 1972).

이것은

뜨거운 연구 주제가

되었습니다.

여러 가지 글루타메이트와

아스파르트산염 유사체가 합성되었고,

글루타메이트 흡수 내 이질성이 발견되어

하나 이상의 흡수 메커니즘이 있음을 시사했습니다

(Ferkany and Coyle 1986; Robinson 외. 1991, 1993; Fletcher and Johnston 1991; Balcar and Li 1992; Rauen 외. 1992).

마찬가지로,

분자 복제를 통해

여러 종류의 글루타메이트 수용체 단백질이

확인되었습니다

(검토는 Niswender and Conn 2010, Traynelis 외. 2010, Nicoletti 외. 2011 참조).

이 수용체는

N-메틸-d-아스파르트산염(NMDA) 수용체(Gonda 2012; Bonaccorso 외 2011; Santangelo 외 2012),

AMPA(α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이소사졸 프로피온산) 수용체(Rogawski 2013),

kainate receptors  수용체(Lerma and Marques 2013) 및

메타보트로픽 수용체(Gregory 외 2013)로 분류되었습니다.

신경계의

모든 세포는 아니지만

대부분의 세포는 적어도 한 가지 유형의

글루타메이트 수용체를 발현합니다

(Steinhauser and Gallo 1996, Vernadakis 1996, Forsythe와 Barnes-Davies 1997, Wenthold와 Roche 1998, Petralia 외 1999, Conti 외 1999, Shelton과 McCarthy 1999, Bergles 외 2000).

Most, if not all,

cells in the nervous system express at least

one type of glutamate receptor.

(Steinhauser and Gallo 1996; Vernadakis 1996; Forsythe and Barnes-Davies 1997; Wenthold and Roche 1998; Petralia et al. 1999; Conti et al. 1999; Shelton and McCarthy 1999; Bergles et al. 2000). 

각 유형의 위치와 기능적 특성은 이 리뷰의 범위를 벗어납니다.

의약 화학자들은 계속해서 새로운 화합물을 합성했고,

이제는 다양한 수용체와 수송체를 꽤 잘 구분할 수 있게 되었습니다.

글루타메이트와 결합하는 능력이 있는 단백질의 수가

상대적으로 많다는 점을 고려할 때,

이들을 구별할 수 있는 화합물을 찾는 것이 가능하다는 것이 이상하게 보일 수 있습니다.

그 이유는

글루타메이트 분자의 높은 유연성 때문에

체온에서 에너지적으로 가장 낮은 형태보다

에너지적으로 최소로 불리한

여러 가지 형태를 허용하기 때문입니다(Bridges 등. 1991).

The reason is the high flexibility of the glutamate molecule which permits several conformations that are only minimally less favorable energetically at body temperature than the lowest energy conformation

이는

글루타메이트가

다양한 형태를 취할 수 있음을 의미하며,

다양한 글루타메이트 결합 단백질(수송체, 수용체, 효소)이

서로 다른 결합 부위를 가지면서도

글루타메이트와 결합할 수 있는 이유를 부분적으로 설명해 줍니다.

현재 많은 화합물이 이용 가능하며,

이 주제에 대한 훌륭한 리뷰가 많이 있습니다

(예: Bräuner-Osborne 외. 1997, Jensen and Bräuner-Osborne 2004, Shigeri 외. 2004, Ritzen 외. 2005, Thompson 외. 2005, Bridges and Esslinger 2005, Shimamoto 2008, Bridges 외. 2012a, b, Gregory 외. 2013, Gonda 2012, Bonaccorso 외. 2011 등).

Identification of plasma membrane glutamate transporters

A glutamate transporter, now known as EAAT2 (GLT-1; slc1a2; Pines et al. 1992), was purified in an active form from rat brain by employing reconstitution of transport as the assay to monitor the purification process (Danbolt et al. 1990). The purification was based on solubilization of rat brain membranes with a detergent and fractionation by conventional chromatographic techniques. This resulted in a 30-fold increase in specific activity, but due to inactivation, the purification ratio was closer to 100-fold. It was hard to convince ourselves that this moderate enrichment was sufficient to yield a pure preparation, and it was even harder to convince others. The fact that the protein tends to give wide bands in electrophoresis gels did not make the task any easier (see Danbolt 1994). Nevertheless, this was a pure preparation (Levy et al. 1993; Lehre and Danbolt 1998). Antibodies were raised to the purified protein and used to localize it in the brain (Danbolt et al. 1992; Levy et al. 1993) and to screen expression‎ libraries. The sequence of the isolated cDNA predicted correctly a protein of 573 amino acids (Pines et al. 1992). Simultaneously, but independently of each other, three other research teams succeeded in cloning another two glutamate transporters using completely different approaches. Storck et al. (1992) were purifying a galactosyltransferase from rat brain and observed that a 66 kDa hydrophobic glycoprotein copurified with this protein. The purified protein was subjected to limited proteolysis. Partial amino acid sequences were obtained and used for synthesizing degenerate oligonucleotide probes for screening of a rat brain cDNA library. This resulted in the identification of 543 amino acid residues long protein now referred to as EAAT1 (GLAST; slc1a3; Storck et al. 1992). EAAT3 (EAAC1; slc1a1) was isolated from a rabbit jejunum by Xenopus laevis oocyte expression‎ cloning (Kanai and Hediger 1992). The cDNA sequence contains an open reading frame coding for a protein of 524 amino acids. The rat brain equivalent is 89.9 % identical and 523 amino acids long (Kanai et al. 1993; Bjørås et al. 1996). The three human counterparts were quickly identified and named excitatory amino acid transporter (EAAT)1–3 (Arriza et al. 1994). Another two glutamate transporters were found later: EAAT4 (Fairman et al. 1995) and EAAT5 (Arriza et al. 1997). All the EAATs catalyze coupled transport of 1H+, 3Na+, and 1K+ with one substrate molecule (Klöckner et al. 1993; Zerangue and Kavanaugh 1996a; Levy et al. 1998; Owe et al. 2006). l-Glutamate and dl-aspartate are transported with similar affinities while d-glutamate is not. It is important to note that the transporters are performing exchange in addition to net uptake. Exchange is a process whereby the transporters exchange external and internal substrate molecules in a 1:1 relationship (see Fig. 5 in Danbolt 2001). Thus, when transportable uptake inhibitors are added to cell cultures, the inhibitors induce glutamate release from the cells (e.g. Volterra et al. 1996; Danbolt 2001) Table 1.

혈장막 글루타메이트 수송체의 동정

현재 EAAT2로 알려진 글루타메이트 수송체(GLT-1; slc1a2; Pines et al. 1992)는

수송체 재구성을 분석법으로 사용하여

쥐의 뇌에서 활성 형태로 정제되어 정제 과정을 모니터링했습니다(Danbolt et al. 1990).

정제는 세제로 쥐의 뇌막을 가용화하고 기존의 크로마토그래피 기법으로 분별하는 방식으로 이루어졌습니다. 그 결과 특정 활성은 30배 증가했지만 비활성화로 인해 정제 비율은 100배에 가까워졌습니다. 이 정도의 농축으로 순수한 제제를 만들 수 있다고 스스로 확신하기 어려웠고, 다른 사람들을 설득하는 것은 더욱 어려웠습니다. 단백질이 전기영동 젤에서 넓은 밴드를 형성하는 경향이 있다는 사실도 이 작업을 더 쉽게 만들지 못했습니다(댄볼트 1994 참조). 그럼에도 불구하고 이것은 순수한 준비였습니다(Levy et al. 1993; Lehre와 Danbolt 1998). 정제된 단백질에 항체를 올려서 뇌에 국한시키고(Danbolt 외. 1992; Levy 외. 1993) 발현 라이브러리를 선별하는 데 사용했습니다. 분리된 cDNA의 서열은 573개의 아미노산으로 구성된 단백질을 정확하게 예측했습니다(Pines et al. 1992). 동시에, 그러나 서로 독립적으로 세 개의 다른 연구팀이 완전히 다른 접근법을 사용하여 또 다른 두 개의 글루타메이트 수송체를 복제하는 데 성공했습니다. 스토크 등(1992)은 쥐의 뇌에서 갈락토실전달효소를 정제하고 이 단백질과 66kDa 소수성 당단백질이 동화된 것을 관찰했습니다. 정제된 단백질은 제한된 단백질 분해 과정을 거쳤습니다. 부분적인 아미노산 서열을 얻어 쥐의 뇌 cDNA 라이브러리 스크리닝을 위한 퇴화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하는 데 사용했습니다. 그 결과 현재 EAAT1이라고 불리는 543개의 아미노산 잔기가 긴 단백질이 확인되었습니다(GLAST; slc1a3; Storck et al. 1992).

EAAT3(EAAC1; slc1a1)는 제노푸스 라에비스 난모세포 발현 클로닝을 통해 토끼 공장에서 분리되었습니다(Kanai and Hediger 1992). 이 cDNA 서열에는 524개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있습니다. 쥐의 뇌와 89.9% 동일하며 523개의 아미노산으로 이루어져 있습니다(Kanai 외. 1993; Bjørås 외. 1996). 세 개의 인간 대응 물질은 빠르게 확인되어 흥분성 아미노산 수송체(EAAT)1-3으로 명명되었습니다(Arriza 외. 1994). 나중에 또 다른 두 개의 글루타메이트 수송체가 발견되었습니다: EAAT4(Fairman 외. 1995) 및 EAAT5(Arriza 외. 1997). 모든 EAAT는 하나의 기질 분자와 1H+, 3Na+, 1K+의 결합 수송을 촉매합니다(Klöckner 외. 1993; Zerangue and Kavanaugh 1996a; Levy 외. 1998; Owe 외. 2006). l-글루타메이트와 dl-aspartate는 비슷한 친밀도로 수송되는 반면 d-glutamate는 그렇지 않습니다. 수송체는 순 흡수 외에도 교환을 수행한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 교환은 수송체가 외부 기질 분자와 내부 기질 분자를 1:1 관계로 교환하는 과정입니다(댄볼트 2001의 그림 5 참조). 따라서 세포 배양에 수송체 흡수 억제제를 첨가하면 억제제가 세포에서 글루타메이트 방출을 유도합니다(예: Volterra et al. 1996; Danbolt 2001) 표 1.

Table 1

Overview of the nomenclature of plasma membrane glutamate transporters

HUGO nameOther names

Excitatory amino acid transporter 1 (EAAT1; slc1a3)	GLAST (Storck et al. 1992; Tanaka 1993b; Arriza et al. 1994)
Excitatory amino acid transporter 2 (EAAT2; slc1a2)	GLT-1; GLT1 (Pines et al. 1992; Arriza et al. 1994)
Excitatory amino acid transporter 3 (EAAT3; slc1a1)	EAAC1 (Kanai and Hediger 1992; Arriza et al. 1994)
Excitatory amino acid transporter 4 (EAAT4; slc1a6)	(Fairman et al. 1995)
Excitatory amino acid transporter 5 (EAAT5; slc1a7)	(Arriza et al. 1997)

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Glutamate transporters belong to the solute carrier (slc) family 1 (high-affinity glutamate and neutral amino acid transporter family; Hediger et al. 2013). Although there are several proteins with ability to transport glutamate, the term “glutamate transporter” is usually used to describe the five “high-affinity glutamate transporters” also called “excitatory amino acid transporters (EAATs)”. The actual meanings of the acronyms (GLAST glutamate–aspartate transporter, GLT1 glutamate transporter, EAAC excitatory amino acid carrier, EAAT excitatory amino acid transporter) are not important, as they do not reflect functional differences among the transporters. The nomenclature used here is the one adopted by the HUGO Gene Nomenclature Committee (Hediger et al. 2013)

글루타메이트 수송체는

용질 운반체(slc) 계열 1(고친화성 글루타메이트 및 중성 아미노산 수송체 계열; Hediger 외. 2013)에 속합니다.

글루타메이트를 수송하는 능력을 가진 단백질은 여러 가지가 있지만,

"글루타메이트 수송체"라는 용어는 일반적으로

"흥분성 아미노산 수송체(EAAT)"라고도 불리는

5개의 "고친화성 글루타메이트 수송체"를 설명하는 데 사용됩니다.

excitatory amino acid transporters

약어(GLAST 글루타메이트-아스파르트산염 수송체,

GLT1 글루타메이트 수송체, EAAC 흥분성 아미노산 운반체, EAAT 흥분성 아미노산 수송체)의 실제 의미는

수송체 간의 기능적 차이를 반영하지 않기 때문에 중요하지 않습니다.

여기에 사용된 명명법은 HUGO 유전자 명명위원회에서 채택한 명명법입니다(Hediger 외. 2013).

The substrate selectivities are not reviewed here. We will only point out (a) that the commonly used uptake inhibitor dihydrokainate (DHK; CAS 52497-36-6) blocks EAAT2 with high selectivity over the other EAATs (Arriza et al. 1994; Bridges et al. 1999), and (b) that dl-threo-β-benzyloxyaspartate (TBOA; CAS 205309-81-5) and its variants (e.g. PMB-TBOA and TFB-TBOA) block all the five EAATs (Bridges et al. 1999; Shimamoto 2008). These compounds are competitive inhibitors that are not transportable. This implies that they block both uptake and exchange (for a detailed explanation, see sect. 6.5 in Danbolt 2001). For more information, we recommend the outstanding review by Bridges et al. (1999) as an introduction and more recent reviews for the last updates (e.g. Jensen and Bräuner-Osborne 2004; Shigeri et al. 2004; Bridges and Esslinger 2005; Shimamoto and Shigeri 2006; Shimamoto 2008; Sagot et al. 2008).

The EAAT-type of transporters also functions as chloride channels (Fairman et al. 1995; Zerangue and Kavanaugh 1996a; Wadiche et al. 1995a, b; Ryan and Mindell 2007; Takayasu et al. 2009). EAAT4 and EAAT5 have the largest chloride conductance (Mim et al. 2005; Gameiro et al. 2011), and may function more as inhibitory glutamate receptors than as transporters (Dehnes et al. 1998; Veruki et al. 2006; Schneider et al. 2014). Arachidonic acid elicits a substrate-gated proton current associated with the glutamate transporter EAAT4 (Fairman et al. 1998; Tzingounis et al. 1998). In addition, a general feature of sodium coupled transport appears to be transport of water (MacAulay et al. 2001, 2004).

Even though the mammalian transporters have not yet been crystallized, we already know quite a lot about their complex structure (Kanner 2007; Gouaux 2009; Kanner 2013; Vandenberg and Ryan 2013). The EAAT2 and EAAT3 proteins are believed to be homotrimers where the subunits are non-covalently connected (Haugeto et al. 1996). This is in agreement with studies of glutamate transporters from Bacillus Caldotenax and Bacillus stearothermophilus (Yernool et al. 2003) although crosslinking studies of the mammalian transporters indicate that there may be differences between the EAAT subtypes (Dehnes et al. 1998). These proteins are integral membrane proteins and they depend on the lipid environment, and are influenced by fatty acids such as arachidonic acid (Barbour et al. 1989; Trotti et al. 1995; Zerangue et al. 1995) and by oxidation (Trotti et al. 1996; Trotti et al. 1998). The recent determination of the crystall structure of a glutamate transporter homologue (GltPh) from Pyrococcus horikoshii (Yernool et al. 2004) and other transporters (Penmatsa and Gouaux 2013) implies a milestone similar to the cloning of the first transporters in the early 1990s and the generation of knockout mice in the late 1990s. GltPh appear to be a bowl-shaped trimer with a solvent-filled extracellular basin extending halfway across the membrane bilayer. At the bottom of the basin are three independent binding sites (Yernool et al. 2004). This structure is, as uncovered recently, ideal to facilitate rapid transport (Leary et al. 2011).

기질 선택성은 여기서 검토하지 않습니다. 여기서는 (a) 일반적으로 사용되는 흡수 억제제인 디하이드로카이네이트(DHK; CAS 52497-36-6)가 다른 EAAT에 비해 높은 선택성으로 EAAT2를 차단한다는 점만 언급하겠습니다(Arriza et al. 1994; Bridges et al. 1999), (b) dl-threo-β-벤질옥시아스파르테이트(TBOA; CAS 205309-81-5)와 그 변이체(예: PMB-TBOA 및 TFB-TBOA)는 5개의 EAAT를 모두 차단합니다(Bridges et al. 1999; Shimamoto 2008). 이러한 화합물은 수송이 불가능한 경쟁적 억제제입니다. 이는 이들이 흡수와 교환을 모두 차단한다는 것을 의미합니다(자세한 설명은 댄볼트 2001의 6.5절 참조). 자세한 내용은 Bridges 등(1999)의 뛰어난 리뷰(소개)와 최근 업데이트된 리뷰(예: Jensen and Bräuner-Osborne 2004, Shigeri 등 2004, Bridges and Esslinger 2005, Shimamoto and Shigeri 2006, Shimamoto 2008, Sagot 등 2008)를 참고하시기 바랍니다.

EAAT 유형의 수송체는 염화물 채널로도 기능합니다 (Fairman 외. 1995; Zerangue와 Kavanaugh 1996a; Wadiche 외. 1995a, b; Ryan과 Mindell 2007; Takayasu 외. 2009). EAAT4와 EAAT5는 염화물 전도도가 가장 크며(Mim 외. 2005; Gameiro 외. 2011), 수송체보다는 억제성 글루타메이트 수용체로서 더 많이 기능할 수 있습니다(Dehnes 외. 1998; Veruki 외. 2006; Schneider 외. 2014). 아라키돈산은 글루타메이트 수송체 EAAT4와 관련된 기질 게이트 양성자 전류를 유도합니다(Fairman et al. 1998; Tzingounis et al. 1998). 또한 나트륨 결합 수송의 일반적인 특징은 물의 수송인 것으로 보입니다(MacAulay 등. 2001, 2004).
포유류 수송체는 아직 결정화되지는 않았지만, 우리는 이미 그 복잡한 구조에 대해 많은 것을 알고 있습니다(Kanner 2007; Gouaux 2009; Kanner 2013; Vandenberg and Ryan 2013). EAAT2와 EAAT3 단백질은 하위 단위가 비공유로 연결된 호모트리머로 여겨집니다(Haugeto et al. 1996). 이는 포유류 수송체에 대한 가교 연구에 따르면 EAAT 아형 간에 차이가 있을 수 있지만(Dehnes et al. 1998), 바실러스 칼도테낙스와 바실러스 스테아로모필루스의 글루타메이트 수송체에 대한 연구와 일치합니다(Yernool et al. 2003). 이 단백질은 필수 막 단백질이며 지질 환경에 의존하고 아라키돈산과 같은 지방산(Barbour 외. 1989; Trotti 외. 1995; Zerangue 외. 1995)과 산화에 의해 영향을 받습니다(Trotti 외. 1996; Trotti 외. 1998). 최근 파이로코커스 호리코시이(Yernool et al. 2004)와 다른 수송체(Penmatsa and Gouaux 2013)에서 글루타메이트 수송체 동족체(GltPh)의 결정 구조를 결정한 것은 1990년대 초 최초의 수송체 복제 및 1990년대 후반의 녹아웃 마우스 세대와 유사한 이정표를 의미합니다. GltPh는 용매로 채워진 세포 외 분지가 막 이중층의 절반을 가로지르는 그릇 모양의 삼합체처럼 보입니다. 분지의 바닥에는 세 개의 독립적인 결합 부위가 있습니다(Yernool 외. 2004). 이 구조는 최근에 밝혀진 바와 같이 빠른 수송을 촉진하는 데 이상적입니다(Leary 등. 2011).

The glutamate-cystine exchanger

Another transporter that has got quite a lot of attention lately is the so called glutamine-cystine exchanger (xCT; slc7a11). This transporter was first described in human fibroblasts as an electroneutral 1:1 cystine-glutamate exchanger that carries cystine into the cell in exchange for internal glutamate (Bannai 1986). Thus, the physiological role of this transporter is to act as a cystine transporter that uses the transmembrane gradient of glutamate as driving force. It follows from this that extracellular glutamate inhibits uptake of cystine and that uptake of cystine causes glutamate release. The transporter responsible for this uptake has been identified by molecular cloning (Sato et al. 1999). It is a heterooligomer consisting of two different subunits: the 4F2hc surface antigen (slc3a2) the xCT protein (slc7a11). The substrate selectivities are excellently reviewed by Bridges et al. (2012a, b).

There are several reasons why xCT has become a hot topic (Conrad and Sato 2012; Lewerenz et al. 2013; Bridges et al. 2012a, b). The first important observation was that glioma express high levels of xCT and low levels of EAATs suggesting that they release glutamate and that glutamate toxicity may be a mechanism facilitating their invasion of normal tissue (e.g. Ye et al. 1999; Sontheimer 2004; Takeuchi et al. 2013). Another reason for the interest is that cystine is a source of cysteine needed for synthesis of glutathione (Dringen 2000). There are, however, a number of transporters that can transport cysteine. These comprise EAAT3 (Zerangue and Kavanaugh 1996b), the two alanine-serine-cysteine transporters (Arriza et al. 1993; Shafqat et al. 1993; Hofmann et al. 1994), ASCT1 (slc1a4) and ASCT2 (slc1a5) as well as several others (Bröer 2008). So if cystine is reduced to cysteine at the cell surface, then cysteine can be taken up independently of xCT. Nevertheless, xCT-deficient mice display redox imbalance suggesting that xCT does play a role in glutathione production (Sato et al. 2005). A third reason for the interest in xCT is that xCT has been suggested to be a major source of extracellular glutamate (Baker et al. 2002). This has been highly controversial, but a recent paper based on the xCT-deficient mice is supporting the idea (De Bundel et al. 2011). There are, however, a number of unresolved issues. The distribution of xCT in the brain has not yet been definitively determined, and available data suggest low levels (Sato et al. 2002). If the above observations are due to direct actions of xCT, then there must be enough xCT molecules present to perform the proposed functions. Thus, both the expression‎ levels and the speed which xCT operates (translocation cycles per second per xCT molecule) are important to determine. As xCT is highly inducible (Sato et al. 2001, 2004), it is should be kept in mind that expression‎ levels may change in stressful situations. Finally, if xCT exchanges glutamate and cystine in a 1:1 relationship, then a massive glutamate release can only be mediated by xCT if there is a similar transport of cystine (or another substrate) in the other direction. In conclusion, more work is needed before we fully understand the roles that xCT plays.

글루타메이트-시스틴 교환기

최근 많은 관심을 받고 있는 또 다른 수송체는

글루타민-시스틴 교환기(xCT; slc7a11)라고 불리는

수송체입니다.

이 수송체는 인간 섬유아세포에서 내부 글루타메이트와 교환하여 시스틴을 세포 내로 운반하는 전기 중성 1:1 시스틴-글루타메이트 교환기로 처음 설명되었습니다(Bannai 1986). 따라서 이 수송체의 생리적 역할은 글루타메이트의 막 통과 구배를 추진력으로 사용하는 시스틴 수송체 역할을 하는 것입니다.

이로부터

세포 외 글루타메이트가

시스틴의 흡수를 억제하고

시스틴의 흡수가 글루타메이트 방출을 유발한다는 결론이 도출됩니다.

이 흡수를 담당하는 수송체는 분자 복제를 통해 확인되었습니다(사토 등, 1999). 이 수송체는 4F2hc 표면 항원(slc3a2)과 xCT 단백질(slc7a11)의 두 가지 서브유닛으로 구성된 헤테로리고머입니다. 기질 선택성은 Bridges 등(2012a, b)에서 훌륭하게 검토한 바 있습니다.

xCT가 화제가 된 데에는 몇 가지 이유가 있습니다(Conrad and Sato 2012, Lewerenz 외. 2013, Bridges 외. 2012a, b).

첫 번째 중요한 관찰은

신경교종이 높은 수준의 xCT와 낮은 수준의 EAAT를 발현한다는 것으로,

이는 신경교종이 글루타메이트를 방출하고

글루타메이트 독성이 정상 조직 침입을 촉진하는 메커니즘일 수 있음을 시사합니다(예: Ye et al. 1999; Sontheimer 2004; Takeuchi et al. 2013).

시스틴이

글루타치온 합성에 필요한 시스테인의 공급원이라는 점도

관심을 끄는 또 다른 이유입니다(Dringen 2000).

그러나

시스테인을 운반할 수 있는 수송체는

여러 가지가 있습니다.

여기에는 EAAT3(Zerangue and Kavanaugh 1996b),

두 개의 알라닌-세린-시스테인 수송체(Arriza 외. 1993; Shafqat 외. 1993; Hofmann 외. 1994),

ASCT1(slc1a4) 및 ASCT2(slc1a5) 및

기타 여러 가지가 포함됩니다(Bröer 2008).

따라서

세포 표면에서 시스틴이 시스테인으로 환원되면

시스테인은 xCT와 독립적으로 흡수될 수 있습니다.

그럼에도 불구하고 xCT 결핍 마우스는 산화 환원 불균형을 나타내며, 이는 xCT가 글루타치온 생성에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다(사토 외. 2005). xCT에 관심을 갖는 세 번째 이유는 xCT가 세포 외 글루타메이트의 주요 공급원으로 제안되었기 때문입니다(Baker 등. 2002). 이는 논란이 많았으나 최근 xCT 결핍 생쥐를 대상으로 한 논문이 이를 뒷받침하고 있습니다(De Bundel 등. 2011). 그러나 아직 해결되지 않은 여러 가지 문제가 있습니다. 뇌에서 xCT의 분포는 아직 명확하게 밝혀지지 않았으며, 이용 가능한 데이터는 낮은 수준을 시사합니다(사토 외. 2002). 위의 관찰이 xCT의 직접적인 작용에 의한 것이라면, 제안된 기능을 수행하기에 충분한 xCT 분자가 존재해야 합니다. 따라서 발현 수준과 xCT가 작동하는 속도(xCT 분자당 초당 전위 주기)를 모두 결정하는 것이 중요합니다. xCT는 유도성이 높기 때문에(사토 외. 2001, 2004), 스트레스가 많은 상황에서 발현 수준이 변할 수 있다는 점을 염두에 두어야 합니다. 마지막으로, xCT가 글루타메이트와 시스틴을 1:1 관계로 교환한다면, 다른 방향으로 시스틴(또는 다른 기질)의 유사한 수송이 있는 경우에만 대량의 글루타메이트 방출이 xCT에 의해 매개될 수 있습니다. 결론적으로, xCT의 역할을 완전히 이해하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다.

Intracellular glutamate carriers

When glutamate enters the cytoplasm, it may undergo further redistribution to mitochondria or synaptic vesicles (Erecinska and Silver 1990; Nicholls 1993).

(A) Mitochondrial glutamate transport: Several of the enzymes for which glutamate is a substrate are located in mitochondria. In agreement, mitochondria possess mechanisms for glutamate translocation. In fact, there are four different carriers: AGC1 (Slc25a12; aralar1; del Arco and Satrustegui 1998), AGC2 (Slc25a13; citrin; aralar2; Kobayashi et al. 1999; Yasuda et al. 2000), GC1 (Slc25a22; Fiermonte et al. 2002) and GC2 (Slc25a18; Fiermonte et al. 2002). These transporters are very different from the glutamate transporters in the plasma membranes and will not be discussed further here (for review see Palmieri 2013).

(B) Glutamate transporters in synaptic vesicles: In glutamatergic nerve terminals, glutamate is carried into synaptic vesicles by means of the so called vesicular glutamate transporters (VGLUTs). These are also very different from those in the plasma membrane (for review see El Mestikawy et al. 2011; Omote et al. 2011) by being independent of sodium and potassium, and by having lower affinity (km around 1 mM). There are three different isoforms: VGLUT1 (Slc17a7; Ni et al. 1994; Bellocchio et al. 1998, 2000; Takamori et al. 2000), VGLUT2 (Slc17a6; DNPI; Aihara et al. 2000) and VGLUT3 (Slc17a8; Takamori et al. 2002).

세포 내 글루타메이트 운반체

글루타메이트가 세포질에 들어가면

미토콘드리아 또는 시냅스 소포에 재분배될 수 있습니다(Erecinska and Silver 1990; Nicholls 1993).

(A) 미토콘드리아 글루타메이트 수송: 글루타메이트를 기질로 하는 여러 효소가 미토콘드리아에 있습니다. 미토콘드리아는 글루타메이트 전위를 위한 메커니즘을 가지고 있습니다. 실제로 네 가지 운반체가 있습니다: AGC1(Slc25a12; aralar1; del Arco and Satrustegui 1998), AGC2(Slc25a13; citrin; aralar2; Kobayashi 등 1999; Yasuda 등 2000), GC1(Slc25a22; Fiermonte 등 2002) 및 GC2(Slc25a18; Fiermonte 등 2002)가 그것입니다.
이러한 수송체는 혈장막의 글루타메이트 수송체와는 매우 다르므로 여기서는 더 이상 논의하지 않겠습니다(검토는 Palmieri 2013 참조).

글루타메이트는 단백질에 통합되는 아미노산일 뿐만 아니라 포유류 중추신경계에서 가장 풍부한 신경 전달 물질이며 억제성 신경 전달 물질인 γ- 아미노부티르산의 전구체이자 트리카르복실산 순환 중간체 α-케토글루타레이트의 한 대사 단계이기도 합니다. 세포 외 글루타메이트는 Na+ 의존성 수송체 계열에 의해 제거됩니다. 이러한 수송체는 신경계의 모든 세포 유형에 의해 다양하게 발현되지만, 대부분의 제거는 성상교세포에서 이루어집니다. GLT-1과 GLAST(EAAT2 및 EAAT1이라고도 함)는 이 활동을 매개하며 미세 성상세포 과정에서 발현이 풍부한 매우 풍부한 단백질입니다. 이 리뷰에서는 이러한 성상세포 글루타메이트 수송체와 관련된 세 가지 주제에 초점을 맞출 것입니다. 첫째, 이 수송체는 글루타메이트 분자와 함께 3개의 Na+ 이온과 1개의 H+를 공동 수송하고 1개의 K+를 역수송하며, 또한 Cl- 전도도와 결합되어 있습니다. Na+의 이동은 성상세포 탈분극을 일으키기에 충분하며, H+의 이동은 성상세포 산성화와 관련이 있습니다. 또한 Na+의 이동은 Na+ 공동 수송체(예: Na+ - Ca2+ 교환기)의 활성화를 유발할 수 있습니다. 이러한 이온 이동이 뇌 기능 및/또는 신진대사에 대한 신호로 어떻게 연결되는지 설명하겠습니다. 둘째, 이러한 수송체는 미토콘드리아와 공동 구획화되어 잠재적으로 뇌의 연료 공급원으로서 미토콘드리아에 글루타메이트를 공급하는 메커니즘을 제공합니다. 관련된 단백질에 대한 개요를 제공하고 글루타메이트가 산화된다는 증거에 대해 논의한 다음 글루타메이트 산화와 관련된 해결되지 않은 몇 가지 문제를 강조합니다. 마지막으로 허혈성 손상(뇌졸중 또는 산소/포도당 부족)이 이러한 성상세포 미토콘드리아에 변화를 일으킨다는 증거를 검토하고 이러한 변화가 글루타메이트 수송, 글루타메이트 수송 의존 신호 및 글루타메이트 대사 변화와 어떻게 연관되어 있는지에 대해 논의할 것입니다. 마지막으로 아직 해결되지 않은 몇 가지 문제를 간략하게 요약하며 마무리합니다.

(B) 시냅스 소포의 글루타메이트 수송체: 글루타메이트 신경 말단에서 글루타메이트는 소위 소포성 글루타메이트 수송체(VGLUT)를 통해 시냅스 소포 내로 운반됩니다. 이들은 또한 나트륨 및 칼륨과 독립적이고 친화력(약 1mM)이 낮다는 점에서 혈장막의 그것과는 매우 다릅니다(검토는 El Mestikawy 외. 2011, Omote 외. 2011 참조). 세 가지 이소폼이 있습니다: VGLUT1(Slc17a7; Ni 외. 1994; Bellocchio 외. 1998, 2000; Takamori 외. 2000), VGLUT2(Slc17a6; DNPI; Aihara 외. 2000) 및 VGLUT3(Slc17a8; Takamori 외. 2002).

Release of glutamate

Glutamate is continuously being released to the extracellular fluid, and inhibition of glutamate uptake leads to extracellular buildups of glutamate within seconds (Jabaudon et al. 1999). Although most of the focus has been on synaptic release of glutamate from nerve terminals by exocytosis of synaptic vesicles, this is not the only mechanism able to supply the extracellular fluid with glutamate (Danbolt 2001). In fact, there are several different non-vesicular (non-exocytotic) mechanisms that appear to be important. One is through anion channels (Kimelberg et al. 1990; Kimelberg and Mongin 1998; Wang et al. 2013) and another is via reversed operation of the glutamate transporting proteins at the plasma membrane (e.g. Levi and Raiteri 1993; Longuemare and Swanson 1995; Roettger and Lipton 1996; Jensen et al. 2000; Rossi et al. 2000; Jabaudon et al. 2000; Sontheimer 2008). A third is via xCT as explained above. A fourth mechanism that has been vividly debated over the last decade is whether mature brain astrocytes in situ also have the ability to release glutamate by exocytosis (Bezzi et al. 2004). The differences in opinions can to some extent be explained by the use of different model systems. For instance, primary astrocytes in culture differ from mature astrocytes in the brain (Cahoy et al. 2008) so observations from cultures are not necessarily valid for the intact living brain. Nevertheless, it seems likely that also mature astrocytes in situ may release glutamate (Malarkey and Parpura 2008; Nedergaard and Verkhratsky 2012; Wang et al. 2013), but exocytosis of vesicles similar to those in nerve terminals is questionable (Hamilton and Attwell 2010). In fact, a recent paper refutes the notion that astrocytes express vesicular glutamate transporters (Li et al. 2013). Thus, this does not entirely rule out the concept of gliotransmitters because glutamate may be released via other mechanisms as explained above, but it does suggest critical eval‎uation of the literature.

글루타메이트 방출

글루타메이트는 세포 외액으로 지속적으로 방출되며,

글루타메이트 흡수를 억제하면

수 초 내에 글루타메이트가 세포 외로 축적됩니다(Jabaudon 등. 1999).

대부분의 초점은

시냅스 소포의 세포 외 배출에 의한 신경 말단에서

글루타메이트의 시냅스 방출에 맞춰져 있지만,

이것이 세포 외액에 글루타메이트를 공급할 수 있는 유일한 메커니즘은 아닙니다(Danbolt 2001).

실제로 중요한 것으로 보이는 몇 가지 다른 비소포체(비외삽화) 메커니즘이 있습니다.

하나는

음이온 채널을 통한 것이고(Kimelberg 외. 1990; Kimelberg and Mongin 1998; Wang 외. 2013),

다른 하나는

혈장막에서 글루타메이트 수송 단백질의 역작용을 통한 것입니다(예: Levi and Raiteri 1993; Longuemare and Swanson 1995; Roettger and Lipton 1996; Jensen 외. 2000; Rossi 외. 2000; Jabaudon 외. 2000; Sontheimer 2008).

세 번째는 위에서 설명한 대로

xCT를 이용하는 것입니다.

지난 10년 동안 활발하게 논의되어 온

네 번째 메커니즘은

성숙한 뇌 성상교세포도 세포외 이동을 통해

글루타메이트를 방출할 수 있는지 여부입니다(Bezzi 등. 2004).

의견의 차이는 다른 모델 시스템을 사용하여 어느 정도 설명할 수 있습니다. 예를 들어, 배양된 일차 성상교세포는 뇌의 성숙한 성상교세포와 다르므로(Cahoy 등. 2008) 배양에서 관찰한 것이 온전한 살아있는 뇌에 반드시 유효한 것은 아닙니다. 그럼에도 불구하고 현장의 성숙한 성상세포도 글루타메이트를 방출할 수 있는 것으로 보이지만(Malarkey and Parpura 2008; Nedergaard and Verkhratsky 2012; Wang et al. 2013), 신경 말단에서와 유사한 소포의 세포외 유출은 의문입니다(Hamilton and Attwell 2010). 실제로 최근 논문에서는 성상교세포가 소포성 글루타메이트 수송체를 발현한다는 개념을 반박하는 논문이 발표되었습니다(Li et al. 2013). 따라서 위에서 설명한 것처럼 글루타메이트가 다른 메커니즘을 통해 방출될 수 있기 때문에 글루타메이트 전달체의 개념을 완전히 배제하는 것은 아니지만, 문헌에 대한 비판적 평가를 제안합니다.

Regulation of the EAAT-type of transporters

Considering the importance of the glutamate transporters, pharmacological manipulation of transporter function may prove to be highly interesting from a therapeutic point of view (Sheldon and Robinson 2007). Although there are several examples where dysregulation of transporters contributes to the pathogenetic process, there are few examples of transporters being the primary cause (e.g. Danbolt 2001; Sattler and Rothstein 2006; Lauriat and Mcinnes 2007; Bröer and Palacin 2011). For instance, it is clear that complete absence of EAAT2 results in spontaneous epilepsy (Tanaka et al. 1997) and increased extracellular glutamate (Mitani and Tanaka 2003; Takasaki et al. 2008), but studies of humans with epilepsy have not uncovered any direct link to glutamate transporter expression‎ (Tessler et al. 1999; Akbar et al. 1997; Bjørnsen et al. 2007). Nevertheless, studies from knockout mice and from humans with mutated transporters show links to disease (for a recent short update see Zhou and Danbolt 2013). Consequently, uncovering regulatory mechanisms is something that has been a hot topic and has interested a large number of researchers. A full account is beyond the scope of this review. Here we only mention a few points.

The first observation revealing regulation of glial glutamate transporter expression‎ came from lesion experiments (Levy et al. 1995).

Unilateral ablation of the neocortex in young adult rats resulted in ipsilateral down regulation of EAAT1 and EAAT2 in the striatum. The lesions did not penetrate the corpus callosum so striatum was not directly affected. However, the neocortical lesion eliminated the cell bodies that are responsible for the corticostriatal axons resulting in a loss of glutamatergic terminals in the striatum. Because astrocytes reduced their levels of EAAT1 and EAAT2 in response to the removal of these terminals, it was assumed that neuro-glia interactions were important in the regulation of transporter expression‎ (Levy et al. 1995). This was followed up in cell cultures. Astrocytes cultured in the absence of neurons hardly expressed EAAT2 at all, while addition of neuron conditioned medium turned on EAAT2 expression‎ (e.g., Gegelashvili et al. 1996, 1997, 2000, 2001; Plachez et al. 2000). This regulation turned out to be via several different pathways. Further, glutamate transporters are regulated by protein kinase C (Casado et al. 1993; reviewed by: Gonzalez and Robinson 2004; Vandenberg and Ryan 2013), by zinc (Vandenberg et al. 1998; Mitrovic et al. 2001; Vandenberg and Ryan 2013), and by arachidonic acid as mentioned above. In fact, there is regulation on more or less all levels from transcription to posttranslational modification and trafficking (for review see Seal and Amara 1999; Bergles et al. 1999; Hediger 1999; Kullmann 1999; Sims and Robinson 1999; Danbolt 2001; Robinson 2006; Sattler and Rothstein 2006). The most exciting discovery so far from a drug development point of view is the finding that beta-lactam antibiotics, e.g. Ceftriaxone, increase EAAT2 expression‎ (Rothstein et al. 2005; Berry et al. 2013). Another team has also started high-throughput screening in order to identify translational activators of glial glutamate transporter EAAT2 (Colton et al. 2010) and have identified some pyridazine derivatives that may serve as lead compounds for drug development (Xing et al. 2011). Another interesting finding is a spider toxin that enhances EAAT2 transport activity (Fontana et al. 2007), but the compound responsible has not yet been identified.

EAAT 유형의 수송체 조절

글루타메이트 수송체의 중요성을 고려할 때,

수송체 기능의 약리학적인 조작은

치료적 관점에서 매우 흥미로운 것으로 입증될 수 있습니다(Sheldon and Robinson 2007).

수송체의 조절 장애가

병원성 과정에 기여하는 몇 가지 예가 있지만,

수송체가 주요 원인인 예는 거의 없습니다(예: Danbolt 2001, Sattler와 Rothstein 2006, Lauriat와 Mcinnes 2007, Bröer와 Palacin 2011).

예를 들어,

EAAT2가 완전히 결핍되면

자발적 간질이 발생하고(타나카 외 1997)

세포 외 글루타메이트가 증가하지만(미타니와 타나카 2003; 타카사키 외 2008),

간질 환자를 대상으로 한 연구에서는

글루타메이트 수송체 발현과의 직접적인 연관성이 밝혀지지 않았습니다

(테슬러 외 1999; 아크바르 외 1997; 비욘센 외 2007).

그럼에도 불구하고 녹아웃 마우스와 돌연변이 수송체가 있는 인간을 대상으로 한 연구에서 질병과의 연관성이 밝혀졌습니다(최근의 짧은 업데이트는 Zhou와 Danbolt 2013 참조). 따라서 조절 메커니즘을 밝히는 것은 뜨거운 주제이며 많은 연구자들이 관심을 갖고 있습니다. 이에 대한 자세한 설명은 이 리뷰의 범위를 벗어납니다. 여기서는 몇 가지 요점만 언급하겠습니다.
신경교 교세포 글루타메이트 수송체 발현의 조절을 밝힌 첫 번째 관찰은 병변 실험에서 나왔습니다(Levy 등, 1995).

젊은 성인 쥐의 신피질을 일방적으로 제거한 결과 선조체에서 EAAT1과 EAAT2의 동측 하향 조절이 나타났습니다. 병변이 뇌량을 관통하지 않았기 때문에 선조체는 직접적인 영향을 받지 않았습니다. 그러나 신피질 병변은 피질 축삭을 담당하는 세포체를 제거하여 선조체의 글루탐산 말단 손실을 초래했습니다. 성상교세포는 이러한 말단의 제거에 반응하여 EAAT1 및 EAAT2의 수준을 감소시켰기 때문에 신경-신경절 상호 작용이 수송체 발현 조절에 중요하다고 가정했습니다(Levy 등. 1995). 이것은 세포 배양에서 추적되었습니다. 뉴런이 없는 상태에서 배양된 성상교세포는 EAAT2를 거의 발현하지 않았지만, 뉴런 조절 배지를 추가하면 EAAT2 발현이 켜졌습니다(예: 게겔라슈빌리 등 1996, 1997, 2000, 2001; 플라체즈 등 2000). 이 조절은 여러 가지 경로를 통해 이루어지는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 글루타메이트 수송체는 단백질 키나아제 C에 의해 조절됩니다(Casado 등. 1993; 검토: 곤잘레스와 로빈슨 2004; 반덴버그와 라이언 2013), 아연(반덴버그 등 1998; 미트로비치 등 2001; 반덴버그와 라이언 2013), 그리고 위에서 언급한 아라키돈산에 의해 조절됩니다. 실제로 전사부터 번역 후 변형 및 거래에 이르기까지 거의 모든 수준에서 규제가 이루어지고 있습니다(검토는 Seal and Amara 1999, Bergles 외. 1999, Hediger 1999, Kullmann 1999, Sims and Robinson 1999, Danbolt 2001, Robinson 2006, Sattler and Rothstein 2006 참조). 약물 개발 관점에서 지금까지 가장 흥미로운 발견은 세프트리악손과 같은 베타락탐계 항생제가 EAAT2 발현을 증가시킨다는 사실입니다(Rothstein 외. 2005; Berry 외. 2013). 또 다른 연구팀은 신경교 글루타메이트 수송체 EAAT2의 번역 활성화제를 확인하기 위해 고처리량 스크리닝을 시작했으며(Colton 외. 2010), 약물 개발의 선도 화합물로 사용될 수 있는 일부 피리다진 유도체도 확인했습니다(Xing 외. 2011). 또 다른 흥미로운 발견은 EAAT2 수송 활동을 강화하는 거미 독소이지만(Fontana et al. 2007), 아직 그 원인이 되는 화합물은 밝혀지지 않았습니다.

Approaches used to localize glutamate transporters

Early attempt to localize glutamate uptake sites were done using autoradiography in combination with tissue slices or synaptosome preparations (e.g. Minchin and Beart 1975; McLennan 1976; Beart 1976; Storm-Mathisen 1981; Storm-Mathisen and Wold 1981). To obtain higher resolution, thinner sections were needed. By using dry mount autoradiography (Young and Kuhar 1979; Danbolt et al. 1993) in combination with “sodium-dependent binding” of excitatory amino acids the uptake sites (for references see Danbolt 1994), higher resolution seemed to be within reach. However, heteroexchange complicated the interpretations as the amount of retained radioactively labeled ligand was dependent on both the number of transporter molecules and by the amount of endogenous dicarboxylic amino acid trapped within the membranes (Danbolt and Storm-Mathisen 1986a, b; Danbolt 1994).

From the early days of glutamate research, it was believed that glutamate is taken up by glutamatergic nerve terminals (Fonnum 1984), but the finding that glial glutamate transporters are down-regulated after glutamatergic denervation (Levy et al. 1995), weakened the evidence (for a discussion, see sect. 4.2 in Danbolt 2001). By incubating tissue slices in d-aspartate and fixing the slices, it was possible to detect fixed d-aspartate with antibodies. With this technique, uptake in both astrocytes and nerve terminals was demonstrated at the electron microscopic level (Gundersen et al. 1993). d-aspartate is often used instead of l-glutamate as a probe for glutamate uptake because it is slowly metabolized in brain tissue (Davies and Johnston 1976).

After the protein sequences of the transporters were known, synthetic peptides could be used to generate antibodies to the transporters themselves (Danbolt et al. 1998) rather than to the substrates. This led to an explosion in the use of antibodies to transporters, but, unfortunately, not all investigators validated their antibodies and procedures well enough (for detailed discussion see Holmseth et al. 2005, 2006, 2012a). The most difficult part is to obtain good negative controls. Antibodies may react with seemingly unrelated proteins (Holmseth et al. 2005; Zhou et al. 2014). In fact, antibody binding can always be achieved (see for instance Fig. 3 in: Holmseth et al. 2005). This is just a question of adjusting the assay conditions. Without a good negative control (e.g. tissue from knockout mice processed in parallel with tissue from wild-type mice), it is not possible to prove that the binding is to the antigen of interest. Therefore, antibody binding does not in itself prove that a given antigen is present. In this context it should be noted that the so called pre-adsorption test can easily give a false impression of specificity (Holmseth et al. 2012a). Whenever possible, it is a good idea to use additional methods, including in situ hybridization and Western blotting in combination with immunocytochemistry. TaqMan Real Time PCR is an excellent method for getting a first approximation of expression‎ levels (e.g. Lehre et al. 2011; Zhou et al. 2012a).

Another approach is to search available transcriptome and proteome datasets. For instance, proteome data from rat proximal tubules (http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/pttr/) confirm‎s the presence of EAAT3, but does not confirm‎ expression‎ of any of the other EAATs. Similarly, EAAT2 is in liver, but the other EAATs were not detected (http://141.61.102.16/), and neither the EAATs nor the VGLUTs were detected by proteome analysis of mouse pancreas (Zhou et al. 2014). Together, these data cast doubt over a large number of immunocytochemistry reports. The reason is obvious. Labeling with antibodies can always be obtained, and without good negative controls, it is not possible to tell if the labeling represents the antigen of interest or artifacts (see Holmseth et al. 2012a). Further, rapid post mortem proteolysis represents and additional challenge when studying human samples (Beckstrøm et al. 1999; Tessler et al. 1999; Li et al. 2012). Also note that water soluble proteins present in the samples may inhibit binding of transporters to the blotting membranes (Zhou et al. 2012b). Thus, strong upregulation of other proteins should be considered a potential source of error when estimating transporter levels by immunoblotting. Electron microscopy in combination with pre-embedding immunocytochemistry without detergents on unfrozen tissue is ideal for identification of labeled cell types, but is not ideal for subcellular distribution as the peroxidase reaction product diffuses some distance before precipitating. (Depending on the strength of the reaction, the reaction product may diffuse a couple of hundred nanometers.) In contrast, post-embedding immunogold is better for collecting semi-quantitative data and gives better intracellular resolution, but when cell membranes are labeled and cells are close to each other as they typically are in the brain, then immunogold cannot tell which membrane labeling belongs to (for description of these methods, see Danbolt et al. 1998;

Amiry-Moghaddam and Ottersen 2013). Another problem with post-embedding immunogold is that there must be a sufficient number of target molecules in the plane of the section. This is case for EAAT1, EAAT2 and EAAT4. These proteins are present at very high concentrations (Dehnes et al. 1998; Lehre and Danbolt 1998) making them ideal targets for immunogold investigations. This explains, in part, why our early localization studies were so successful (Chaudhry et al. 1995; Dehnes et al. 1998). In contrast, EAAT3 is expressed at lower levels resulting in too few molecules per micrometer plasma membrane length to distinguish real labeling from background noise (Holmseth et al. 2012b). It should be recalled that the tissue sections used for electron microscopy are thin (40–60 nm) and thereby only slightly thicker than the outer diameter of synaptic vesicles (40 nm), and only two/three times thicker than the width of the synaptic cleft (20 nm). The antibodies do not penetrate well into the sections. To maximize labeling, the section may be mounted so that they can be labeled on both sides. Thus, the sensitivity of the post-embedding immunogold technique is limited by the number of proteins in the exact section plane. Another challenge follows from the vulnerability of the sections and thereby also the labeling. These sections are easily damaged during processing. Consequently, there is variability and this leads to another challenge: avoiding sampling error. This challenge comes in addition to those mentioned above (specificity, proteolysis, etc.).

It is also important to consider if any detected proteins are expressed at physiologically relevant levels. The number of molecules needed to accomplish a given task depends on what that task is. This consideration is particularly relevant for neurotransmitter transporters because the transport process is fairly slow. The cycling time of EAAT2 and EAAT3 are in the order of 30 glutamate molecules per second at Vmax (Otis and Jahr 1998; Otis and Kavanaugh 2000; Bergles et al. 2002; Grewer and Rauen 2005) and EAAT5 is even slower (Gameiro et al. 2011). The cycling time of the GABA transporters appear to be comparable to those of the EAATs (Mager et al. 1993; Sacher et al. 2002; Karakossian et al. 2005; Gonzales et al. 2007). This means that the number of transporters must be high. There is a rapid extracellular turnover of glutamate (Jabaudon et al. 1999), and despite this, the resting levels of extracellular glutamate in normal brains are low, possibly as low as 25 nm (Herman and Jahr 2007). Because the km-values are about 1,000 times higher (Danbolt 2001), maintenance of such low extracellular levels implies a vast excess of transporter proteins (Bergles and Jahr 1997; Dehnes et al. 1998; Lehre and Danbolt 1998; Otis and Kavanaugh 2000).

글루타메이트 수송체를 국소화하는 데 사용되는 접근법

글루타메이트 흡수 부위를 국소화하려는 초기 시도는

조직 슬라이스 또는 시냅토솜 제제와 함께

자동 방사선 촬영을 사용하여 수행되었습니다(예: Minchin and Beart 1975; McLennan 1976; Beart 1976; Storm-Mathisen 1981; Storm-Mathisen and Wold 1981).

더 높은 해상도를 얻으려면 더 얇은 단면이 필요했습니다. 흥분성 아미노산의 “나트륨 의존적 결합”과 함께 건식 마운트 자동 방사선 촬영(Young and Kuhar 1979; Danbolt 외. 1993)을 흡수 부위에 사용함으로써(참조: Danbolt 1994), 더 높은 해상도를 얻을 수 있는 것처럼 보였습니다. 그러나 이종 교환은 잔류 방사성 표지 리간드의 양이 수송체 분자의 수와 막 내에 갇힌 내인성 디카르복실 아미노산의 양에 따라 달라지기 때문에 해석을 복잡하게 만들었습니다(Danbolt and Storm-Mathisen 1986a, b; Danbolt 1994).

글루타메이트 연구 초기에는

글루타메이트가 글루타메이트 신경 말단에서 흡수된다고 믿었지만(Fonnum 1984),

글루타메이트 탈신경화 이후 신경교 글루타메이트 수송체가

하향 조절된다는 사실이 밝혀지면서(Levy 등. 1995)

그 근거가 약해졌습니다(논의는 Danbolt 2001의 4.2섹션 참조).

조직 절편을 d- 아스파르트산염에 배양하고 절편을 고정함으로써 항체로 고정 된 d- 아스파르트산염을 검출 할 수있었습니다. 이 기술을 통해 성상세포와 신경 말단에서의 흡수가 전자 현미경 수준에서 입증되었습니다(Gundersen 등 1993). d-아스파르트산염은 뇌 조직에서 천천히 대사되기 때문에 글루타메이트 흡수를 위한 프로브로서 l-글루타메이트 대신 자주 사용됩니다(Davies and Johnston 1976).

수송체의 단백질 서열이 알려진 후에는 합성 펩타이드를 사용하여 기질이 아닌 수송체 자체에 대한 항체를 생성할 수 있었습니다(Danbolt 등. 1998). 이로 인해 수송체에 대한 항체 사용이 폭발적으로 증가했지만, 안타깝게도 모든 연구자가 항체와 절차를 충분히 검증한 것은 아닙니다(자세한 논의는 Holmseth 외. 2005, 2006, 2012a 참조). 가장 어려운 부분은 좋은 음성 대조군을 확보하는 것입니다. 항체는 전혀 관련이 없어 보이는 단백질과 반응할 수 있습니다(Holmseth 외. 2005; Zhou 외. 2014). 사실, 항체 결합은 항상 달성될 수 있습니다(예를 들어 그림 3 참조: Holmseth et al. 2005). 이것은 분석 조건을 조정하는 문제일 뿐입니다. 좋은 음성 대조군(예: 야생형 마우스의 조직과 병행하여 처리한 녹아웃 마우스의 조직)이 없으면 관심 있는 항원에 대한 결합을 증명할 수 없습니다. 따라서 항체 결합이 그 자체로 특정 항원이 존재한다는 것을 증명하는 것은 아닙니다. 이러한 맥락에서 소위 사전 흡착 테스트는 특이성에 대한 잘못된 인상을 쉽게 줄 수 있다는 점에 유의해야 합니다(Holmseth et al. 2012a). 가능하면 면역세포화학과 함께 현장 혼성화 및 웨스턴 블롯팅을 포함한 추가 방법을 사용하는 것이 좋습니다. TaqMan Real Time PCR은 발현 수준의 첫 번째 근사치를 얻는 데 탁월한 방법입니다(예: Lehre et al. 2011; Zhou et al. 2012a).

또 다른 접근법은 사용 가능한 전사체 및 프로테옴 데이터 세트를 검색하는 것입니다. 예를 들어, 쥐 근위 세뇨관의 프로테옴 데이터(http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/pttr/)는 EAAT3의 존재를 확인하지만 다른 EAAT의 발현은 확인하지 못합니다. 마찬가지로, 간에서는 EAAT2가 존재하지만 다른 EAAT는 검출되지 않았고(http://141.61.102.16/), 마우스 췌장의 프로테옴 분석에서는 EAAT나 VGLUT 모두 검출되지 않았습니다(Zhou 등. 2014). 이러한 데이터를 종합하면 수많은 면역세포화학 보고서에 의문이 제기됩니다. 그 이유는 분명합니다. 항체를 사용한 표지는 항상 얻을 수 있으며, 좋은 음성 대조군이 없으면 표지가 관심 항원을 나타내는지 아니면 아티팩트를 나타내는지 알 수 없습니다(Holmseth et al. 2012a 참조). 또한, 사후 빠른 단백질 분해는 인체 샘플을 연구할 때 추가적인 도전 과제입니다(Beckstrøm 외. 1999; Tessler 외. 1999; Li 외. 2012). 또한 시료에 존재하는 수용성 단백질은 수송체가 블롯팅 막에 결합하는 것을 억제할 수 있습니다(Zhou et al. 2012b). 따라서 면역 블 롯팅으로 수송체 수준을 추정할 때 다른 단백질의 강한 상향 조절은 잠재적인 오류의 원인으로 간주되어야 합니다. 동결되지 않은 조직에 세제 없이 사전 임베딩 면역세포화학과 결합한 전자 현미경은 표지된 세포 유형을 식별하는 데 이상적이지만, 퍼옥시다제 반응 생성물이 침전되기 전에 일정 거리 확산되므로 세포 내 분포에는 이상적이지 않습니다. (반응의 강도에 따라 반응 생성물은 수백 나노미터까지 확산될 수 있습니다.) 대조적으로, 후삽입 면역 금은 반정량 데이터를 수집하는 데 더 좋고 세포 내 해상도가 더 좋지만, 세포막에 라벨링이 있고 세포가 일반적으로 뇌에서와 같이 서로 가까이 있는 경우 면역 금은 어떤 막 라벨링이 속한 것인지 알 수 없습니다(이러한 방법에 대한 설명은 댄볼트 외. 1998 참조);

아미리-모그하담과 오터슨 2013 참조). 면역 금 후삽입의 또 다른 문제는 섹션 평면에 충분한 수의 표적 분자가 있어야 한다는 것입니다. EAAT1, EAAT2 및 EAAT4가 이에 해당합니다. 이러한 단백질은 매우 높은 농도로 존재하기 때문에(Dehnes et al. 1998; Lehre and Danbolt 1998) 면역 금 조사에 이상적인 표적이 됩니다. 이는 부분적으로는 초기 국소화 연구가 매우 성공적이었던 이유를 설명해줍니다(Chaudhry 외. 1995; Dehnes 외. 1998). 반면, EAAT3는 낮은 수준에서 발현되어 마이크로미터 혈장막 길이당 분자가 너무 적어 실제 라벨링과 배경 잡음을 구분할 수 없습니다(Holmseth et al. 2012b). 전자 현미경에 사용되는 조직 섹션은 얇기 때문에(40-60nm) 시냅스 소포의 외경(40nm)보다 약간 두껍고 시냅스 틈새(20nm)의 폭보다 2/3배 정도만 두껍다는 점을 상기해야 합니다. 항체가 섹션에 잘 침투하지 않습니다. 라벨링을 극대화하기 위해 섹션을 양면에 라벨링할 수 있도록 장착할 수 있습니다. 따라서 후임베딩 면역금 기법의 감도는 정확한 섹션 평면에 있는 단백질의 수에 의해 제한됩니다. 또 다른 문제는 섹션의 취약성으로 인한 라벨링의 취약성입니다. 이러한 섹션은 처리 과정에서 쉽게 손상됩니다. 결과적으로 가변성이 발생하고 이는 샘플링 오류를 방지하는 또 다른 과제로 이어집니다. 이 과제는 위에서 언급한 과제(특이성, 단백질 분해 등)에 추가적으로 발생합니다.

또한 검출된 단백질이 생리적으로 적절한 수준에서 발현되는지도 고려해야 합니다. 주어진 작업을 수행하는 데 필요한 분자의 수는 해당 작업이 무엇인지에 따라 달라집니다. 이러한 고려 사항은 신경전달물질 수송체의 경우 수송 과정이 상당히 느리기 때문에 특히 중요합니다. EAAT2와 EAAT3의 순환 시간은 Vmax에서 초당 30개의 글루타메이트 분자가 순환하는 정도이며(Otis and Jahr 1998, Otis and Kavanaugh 2000, Bergles 외. 2002, Grewer and Rauen 2005), EAAT5는 더 느립니다(Gameiro et al. 2011). GABA 수송체의 순환 시간은 EAAT와 비슷한 것으로 보입니다 (Mager 외. 1993; Sacher 외. 2002; Karakossian 외. 2005; Gonzales 외. 2007). 이것은 수송체의 수가 많아야 함을 의미합니다. 글루타메이트의 세포 외 회전율이 빠르며(Jabaudon 등 1999), 그럼에도 불구하고 정상 뇌에서 세포 외 글루타메이트의 휴식 수준은 25nm 정도로 낮습니다(Herman and Jahr 2007). km-값이 약 1,000배 더 높기 때문에(Danbolt 2001), 이러한 낮은 세포 외 수치의 유지는 수송체 단백질의 과잉을 의미합니다(Bergles and Jahr 1997; Dehnes et al. 1998; Lehre and Danbolt 1998; Otis and Kavanaugh 2000).

Cellular and subcellular distribution of glutamate transporters in normal mature brain tissue

A large number of papers on transporter distributions have been published, and it is not easy to navigate in the literature as many of the statements are corrected in later publications. Figure 1 is a schematic illustration of the distributions of EAAT1, EAAT2 and EAAT3 in the forebrain.

정상 성숙 뇌 조직에서 글루타메이트 수송체의 세포 및 세포 하부 분포

수송체 분포에 관한 많은 논문이 발표되었으며,

이후 출판물에서 많은 부분이 수정되었기 때문에 문헌을 탐색하기가 쉽지 않습니다.

그림 1은 전뇌에서 EAAT1, EAAT2, EAAT3의 분포를 개략적으로 나타낸 도식화입니다.

Fig. 1

A schematic illustration of glutamate transporter distributions around synapses close to a blood vessel in the hippocampus. Four glutamatergic nerve terminals (T) are shown forming synapses onto dendritic spines (S). Astrocyte branches are indicated (G). Note that astrocytes have very high densities (Lehre et al. 1995; Ginsberg et al. 1995; Lehre and Danbolt 1998) of both EAAT2 (red dots) and EAAT1 (blue dots). The highest densities of EAAT1 and EAAT2 are in the astrocyte membranes facing neuropil, while the membranes facing the endothelium have low levels. Also note that glutamate transporters have not been detected in the endothelium. EAAT1 is selective for astrocytes (Lehre et al. 1995; Ginsberg et al. 1995), while EAAT2 is predominantly expressed in astrocytes (Danbolt et al. 1992), but there is also some (about 10 %) in hippocampal nerve terminals (Furness et al. 2008). EAAT3 (green dots) is selective for neurons, but is expressed at levels two orders of magnitude lower than EAAT2 and is targeted to dendrites and cell bodies (Holmseth et al. 2012b). Also note that the endfeet may actually overlap with no gaps in between them (Mathiisen et al. 2010) (Copyright: Neurotransporter AS; Reproduced with permission)

EAAT1 (GLAST; slc1a3) is selectively expressed in astrocytes throughout the CNS (Lehre et al. 1995). This conclusion is supported both by in situ hybridization and immunocytochemistry (e.g. Ginsberg et al. 1995; Rothstein et al. 1995 Schmitt et al. 1997; Berger and Hediger 1998, 2000) and appears to be valid for all parts of the central nervous system including the regions where EAAT1 is the predominant transporter (Lehre et al. 1995; Lehre and Danbolt 1998; Takatsuru et al. 2007; Takayasu et al. 2009): the retina (Rauen et al. 1996; Lehre et al. 1997; Rauen et al. 1998; Rauen 2000; Rauen and Wiessner 2000), the inner ear (Furness and Lehre 1997; Takumi et al. 1997), and the circumventricular organs (Berger and Hediger 2000). Thus, there is no disagreement here. Other statements can be found in the literature, but these have been corrected by the authors themselves.

After having determined the cell types expressing EAAT1 (Lehre et al. 1995), immunogold was performed to obtain additional information (Chaudhry et al. 1995). This revealed that EAAT1 is preferentially targeted to the plasma membranes, and that plasma membranes facing neuropil have higher densities than those facing cell bodies, pia mater and endothelium (Fig. 1).

Mice lacking EAAT1 (Watase et al. 1998) develop normally, but show symptoms of insufficient glutamate uptake in regions where EAAT1 is the major glutamate transporter (Watase et al. 1998; Hakuba et al. 2000; Harada et al. 1998). The EAAT1 knockout mice also display poor nesting behavior; abnormal sociability, reduced alcohol intake and reward (Watase et al. 1998; Stoffel et al. 2004; Karlsson et al. 2009, 2012). Lack of GLAST does not lead to spontaneous seizures like those seen in connection with EAAT2-deficiency (Tanaka et al. 1997), but GLAST deficiency increases seizure duration and severity (Watanabe et al. 1999). EAAT1 mutations in humans are linked to episodic ataxia (Bröer and Palacin 2011; Jen et al. 2005; de Vries et al. 2009).

EAAT2 (GLT-1; slc1a2) was the first glutamate transporter to be localized immunocytochemically. In the mature and normal brain it is predominantly expressed in astrocytes (Danbolt et al. 1992; Levy et al. 1993; Rothstein et al. 1994; Lehre et al. 1995). There is no disagreement here either, and this conclusion is supported both by later immunocytochemistry (e.g. Schmitt et al. 1996; Kugler and Schmitt 2003; Berger et al. 2005; Holmseth et al. 2009) and in situ hybridization (Torp et al. 1994, 1997; Berger and Hediger 2000, 2001) as well as by data obtained with EAAT2 eGFP BAC reporter mice (de Vivo et al. 2010a).

EAAT2 is the only one of the EAAT-type of glutamate transporters that is required for survival under non-challenging conditions (Tanaka et al. 1997; Danbolt 2001). This is in agreement with biochemical data showing that the EAAT2 protein represents about 1 % of the total forebrain protein and that it is about four times more abundant than EAAT1 in the hippocampus and six times less abundant than EAAT1 in the cerebellum (Lehre and Danbolt 1998). Based on immunoadsorption of transport activity EAAT2 was shown to account for 95 % of the total glutamate uptake activity in young adult forebrain tissue (Danbolt et al. 1992; Haugeto et al. 1996). This conclusion was confirmed by deletion of the EAAT2 gene in mice (Tanaka et al. 1997; Voutsinos-Porche et al. 2003; Matsugami et al. 2006; Kiryk et al. 2008; Holmseth et al. 2012b) as well as by electrophysiological recordings of glutamate transporter currents (Otis and Kavanaugh 2000).

The discussion about EAAT2 distribution concerns expression‎ in neurons. Having said that, there is consensus that EAAT2 is expressed in cultured neurons from hippocampus and neocortex; in particular if these are cultured in the absence of astrocytes (Mennerick et al. 1998; Wang et al. 1998; Plachez et al. 2000) in agreement with observations that EAAT2 is transiently localized on growing axons of the mouse spinal cord before establishing astrocytic expression‎ (Yamada et al. 1998). There is also consensus that EAAT2 is present in neurons in the normal and mature mammalian retina (Rauen et al. 1996, 1999; Rauen and Kanner 1994; Euler and Wassle 1995; Rauen 2000).

The controversy is related to expression‎ of EAAT2 in neurons in the normal and mature brain (cerebrum and cerebellum). All studies, however, agree that there is EAAT2 mRNA in CA3 hippocampal neurons (Torp et al. 1994, 1997; Berger and Hediger 2000, 2001; de Vivo et al. 2010a) and that their axon-terminals express the protein, at least in the CA1 (Chen et al. 2004; Furness et al. 2008; Melone et al. 2009, 2011). Further, all of the glutamate uptake activity in glutamatergic terminals in CA1 is due to EAAT2 (Furness et al. 2008).

The remaining controversy concerns (a) the expression‎ of EAAT2 in axon-terminals in other parts of the brain, and (b) the physiological importance of the uptake into terminals. Why was about half of all d-aspartate taken up by hippocampus slices found in axon-terminals when terminals only contain around 10 % of the EAAT2 protein (Furness et al. 2008)? This disproportionally large uptake cannot simply be disregarded as an in vitro artifact due to a higher rate of heteroexchange than net uptake (Zhou et al. 2013), but it might still be an artifact because the possibility has not been ruled out that astrocytes release glutamate via anion channels or similar. Preliminary data from selective deletion of EAAT2 in axon-terminals indicate disturbances in synaptic transmission (Sun et al. 2012), and thereby may suggest that EAAT2 in terminals is functionally relevant. However, further studies are required before definite conclusions can be made.

In contrast to EAAT1, there is very little EAAT2 in mice and rats at birth and in the first postnatal week (Ullensvang et al. 1997; Furuta et al. 1997). This explains why EAAT2-knockout mice are inconspicuous at birth. But at 3 weeks, when the EAAT2-levels in wild-type mice have increased to 50 % of adult levels, the EAAT2-deficient mice can readily be identified because they are hyperactive, epileptic and smaller than their wild-type littermates. They have increased extracellular glutamate levels (Mitani and Tanaka 2003; Takasaki et al. 2008), and about half of them die from spontaneous seizures before they reach 4 weeks of age (Tanaka et al. 1997). The heterozygote EAAT2 knockout mice (±) have only half the EAAT2-concentrations as wild-type mice, but do not show any apparent morphological brain abnormalities (Kiryk et al. 2008), but are more vulnerable to traumatic spinal cord injury (Lepore et al. 2011).

EAAT3 (EAAC1; slc1a1) has been particular hard to localize. Nevertheless, the first studies were basically correct (Kanai and Hediger 1992; Rothstein et al. 1994). EAAT3 is a neuronal transporter, and is not expressed in glial cells (Holmseth et al. 2012b; Shashidharan et al. 1997). It appears to be expressed in the majority if not all neurons throughout the CNS, but has a unique sorting motif (Cheng et al. 2002) selectively targeting it to somata and dendrites avoiding axon terminals (Holmseth et al. 2012b; Shashidharan et al. 1997).

The highest levels of EAAT3 in the brain are found in the hippocampus and neocortex, but the total tissue content in young adult rat brains is about 100 times lower than that of EAAT2 (Holmseth et al. 2012b). It is also expressed in the kidney and in the ileum. In agreement, mice lacking EAAT3 (Peghini et al. 1997) develop dicarboxylic aminoaciduria, but do not show signs of neurodegeneration at young age and do not have epilepsy (Peghini et al. 1997; Aoyama et al. 2006; Berman et al. 2011). Humans lacking EAAT3 develop dicarboxylic aminoaciduria (Bailey et al. 2011) and EAAT3 polymorphisms are associated with obsessive–compulsive disorders (Brandl et al. 2012; Walitza et al. 2010).

EAAT4 (slc1a6) is predominantly found in the cerebellar Purkinje cells (Fairman et al. 1995; Dehnes et al. 1998) where it is targeted to the dendrites, the spines in particular (Dehnes et al. 1998), but there is also some EAAT4 in a subset of forebrain neurons (Dehnes et al. 1998; Massie et al. 2008; de Vivo et al. 2010b) and in vestibular hair cells and calyx endings (Dalet et al. 2012). EAAT4 knockout mice are viable and appear normal (Huang et al. 2004) albeit with some alteration of receptor activation (Nikkuni et al. 2007).

EAAT5 (slc1a7) is preferentially expressed in the retina, while the levels in the brain are low (Arriza et al. 1997; Eliasof et al. 1998). EAAT5 is also expressed in vestibular hair cells and calyx endings (Dalet et al. 2012). There is more than one isoform in the retina due to variable splicing (Eliasof et al. 1998). As explained above, EAAT4 and EAAT5 are not very efficient as transporters, but are efficient chloride channels suggesting that they may be more important as inhibitory glutamate receptors than as transporters. Some investigators have tried to determine the exact cellular and subcellular localization of EAAT5, but the validity of these studies is hard to judge at present because nobody has as yet made an EAAT5 knockout mouse that could serve as negative control for validation of the immunolabeling. We have previously shown how important this control is and also how inadequate the so called pre-adsorption test is (Holmseth et al. 2012a). So, validated information on EAAT5 distribution remains to be provided.

Comments on the glutamine-glutamate cycle

Glutamate taken up by astroglial cells can be metabolized via the tricarboxylic acid cycle and be used in protein synthesis or converted to glutamine. Glutamine can be released to the extracellular fluid by a sodium neutral amino transporter in the astrocytic membrane by SNAT3 (Boulland et al. 2002, 2003; Mackenzie and Erickson 2004; Nissen-Meyer et al. 2011) and SNAT5 (SN2; slc38a5) (Hamdani et al. 2012) because it is inactive in the sense that it cannot activate glutamate receptors (for review: Erecinska and Silver 1990; Danbolt 2001; Hertz 2013). The conversion of glutamate to glutamine is catalyzed by the enzyme glutamine synthetase (GLUL) in an ATP-dependent manner (Erecinska and Silver 1990; Marcaggi and Coles 2001). Glutamine synthetase plays important roles in the brain and in other organs from implantation to high age. This is evident from studies of glutamine deficiency in man and mice (He et al. 2007, 2010a, b; Haberle et al. 2011, 2012). Further, reduced glutamine synthetase levels are associated with some forms of epilepsy (Eid et al. 2004).

The prevailing view has been that glutamine from astrocytes is the predominant source of glutamate in glutamatergic terminals (Sibson et al. 2001; Hertz 2013), but this hypothesis implies that the supply of glutamine to terminals keeps up with glutamate release. And although there are many observations in cultured cells suggesting the existence of glutamine transporters in glutamatergic terminals, it is important to keep in mind that cultured astrocytes are different from mature astrocytes (e.g. Plachez et al. 2000; Cahoy et al. 2008). Further, it is important to note that glutamine transporters have so far not been positively identified in terminals in brain tissue (Mackenzie and Erickson 2004; Chaudhry et al. 2002; Conti and Melone 2006). The only positive identifications of SNAT2 (SAT2; slc38a2) and SNAT1 (SAT1; GlnT; slc38a1) are in dendrites and cell bodies of neurons (e.g. Jenstad et al. 2009; Solbu et al. 2010; Conti and Melone 2006). One possibility is that they have evaded detection in glutamatergic terminals due to methodological challenges. Another possibility is that they have not been detected simply because they are not there. This would be in line with studies suggesting that SNAT1 and SNAT2 play no role in delivering glutamine for glutamatergic transmission (Grewal et al. 2009). There could be other glutamine transporters, however. For instance, ASCT2 (slc1a5) has ability to transport glutamine (Bröer et al. 1999), but is expressed at low levels in the mature brain (Utsunomiya-Tate et al. 1996; Bröer and Brookes 2001). There are also other potential candidates within the slc38-family. On the other hand, lack of significant glutamine uptake activities in terminals would be is in line with some old reports (e.g. Hertz et al. 1980; Yu and Hertz 1982; McMahon and Nicholls 1990). Another possibility is whether glutamate may be formed in a glutamine-independent manner (Hassel and Bråthe 2000; McKenna et al. 2000), but this is also debated. A third source is direct uptake by glutamate transporters in terminals themselves (Gundersen et al. 1993). As explained above, there is EAAT2 in terminals and this uptake is highly active (Furness et al. 2008). Another complicating factor is that nerve terminals in different brain regions may differ. While terminals in several forebrain regions (e.g. neocortex, hippocampus and striatum) have been shown to posses glutamate uptake activity (e.g. Gundersen et al. 1993), this is more uncertain in the cerebellar cortex (e.g. Wilkin et al. 1982). In conclusion, the glutamine-glutamate cycle has been studied and debated for about 50 years and we still do not have the final answer!

글루타민-글루타메이트 주기에 대한 코멘트

성상교세포에서

흡수된 글루타메이트는

트리카르복실산 순환을 통해 대사되어 단백질 합성에 사용되거나

글루타민으로 전환될 수 있습니다.

글루타민은

성상교세포막의 나트륨 중성 아미노 수송체에 의해 세포 외액으로 방출될 수 있는데,

이는 글루타메이트 수용체를 활성화할 수 없다는 의미에서

비활성이기 때문입니다(검토: Erecinska and Silver 1990; Danbolt 2001; Hertz 2013).

글루타메이트가 글루타민으로 전환되는 것은

효소 글루타민 합성효소(GLUL)에 의해

ATP 의존적인 방식으로 촉매됩니다(Erecinska and Silver 1990; Marcaggi and Coles 2001).

글루타민 합성효소는 착상부터 노년기까지 뇌와 다른 기관에서 중요한 역할을 합니다. 이는 인간과 생쥐의 글루타민 결핍에 대한 연구에서 분명하게 드러납니다(He 외. 2007, 2010a, b; Haberle 외. 2011, 2012). 또한 글루타민 합성효소 수치의 감소는 일부 형태의 간질과 관련이 있습니다(Eid 외. 2004).

성상교세포의 글루타민이 글루타메이트 말단에서 글루타메이트의 주요 공급원이라는 견해가 지배적이지만(Sibson 외. 2001; Hertz 2013), 이 가설은 말단으로의 글루타민 공급이 글루타메이트 방출을 따라간다는 것을 암시합니다. 그리고 배양 세포에서 글루타메이트 말단에 글루타민 수송체가 존재한다는 것을 시사하는 많은 관찰 결과가 있지만, 배양 성상교세포는 성숙한 성상교세포와 다르다는 점을 명심하는 것이 중요합니다(예: Plachez 외. 2000; Cahoy 외. 2008). 또한, 글루타민 수송체는 지금까지 뇌 조직의 말단에서 긍정적으로 확인되지 않았다는 점에 유의하는 것이 중요합니다(Mackenzie and Erickson 2004; Chaudhry 등 2002; Conti and Melone 2006). SNAT2(SAT2; slc38a2)와 SNAT1(SAT1; GlnT; slc38a1)의 유일한 양성 확인은 뉴런의 수상 돌기와 세포체입니다(예: Jenstad 외. 2009; Solbu 외. 2010; Conti and Melone 2006).

한 가지 가능성은 방법론적 문제로 인해 글루탐산 말단에서 검출을 회피했을 가능성이 있습니다. 또 다른 가능성은 단순히 존재하지 않기 때문에 검출되지 않았을 가능성입니다. 이는 SNAT1과 SNAT2가 글루타민 전달을 위한 글루타민 전달에 아무런 역할을 하지 않는다는 연구 결과와 일치합니다(Grewal 외. 2009). 그러나 다른 글루타민 수송체도 있을 수 있습니다. 예를 들어, ASCT2(slc1a5)는 글루타민을 운반하는 능력이 있지만(Bröer 외. 1999), 성숙한 뇌에서는 낮은 수준으로 발현됩니다(Utsunomiya-Tate 외. 1996; Bröer and Brookes 2001). slc38 계열에는 다른 잠재적 후보도 있습니다. 반면에 말단에서 글루타민 흡수 활동이 현저히 부족하다는 것은 일부 오래된 보고와 일치합니다(예: Hertz 외. 1980; Yu와 Hertz 1982; McMahon과 Nicholls 1990). 또 다른 가능성은 글루타민과 독립적인 방식으로 글루타메이트가 형성될 수 있는지 여부이지만(Hassel and Bråthe 2000; McKenna 외. 2000), 이 역시 논쟁의 여지가 있습니다. 세 번째 공급원은 터미널 자체의 글루타메이트 수송체에 의한 직접 흡수입니다(Gundersen 등. 1993). 위에서 설명한 바와 같이, 말단에는 EAAT2가 존재하며 이 흡수는 매우 활발합니다(Furness et al. 2008). 또 다른 복잡한 요인은 뇌 영역에 따라 신경 말단이 다를 수 있다는 것입니다. 여러 전뇌 영역(예: 신피질, 해마, 선조체)의 단자는 글루타메이트 흡수 활동을 하는 것으로 나타났지만(예: Gundersen 등. 1993), 소뇌 피질에서는 이러한 활동이 더 불확실합니다(예: Wilkin 등. 1982). 결론적으로 글루타민-글루타메이트 주기는 약 50년 동안 연구되고 논의되어 왔지만 아직 최종적인 해답을 찾지 못했습니다!

Glutamate transporters at the blood brain barrier

The nervous system isolates itself from blood by means of barriers (e.g. Abbott 2005; Alvarez et al. 2013). This is important for a number of reasons. One of them is the fact that serum glutamate is typically in the range 50–200 μm (Zlotnik et al. 2011a, b, c) which is orders of magnitude higher than the concentrations that are toxic to neurons (Danbolt 2001).

The blood–brain barrier is between blood and the interstitial fluid of the brain. It is in mammals formed by the endothelial cells after influence from brain cells. Another barrier is in the choroid plexus epithelium which secretes cerebrospinal fluid (CSF). These barriers are important both from a physiological point of view because they are essential for brain homeostasis, and from a pharmacological point of view because they prevent drugs from entering brain tissue (Deboer and Gaillard 2007; Teichberg 2007).

The literature is extensive and full of conflicting reports. A full account is beyond the scope of this review. Here we only want to point out (Fig. 1) that brain barrier endothelial cells do not express significant levels of EAAT1-3 (Lehre et al. 1995; Berger and Hediger 2000; Holmseth et al. 2009, 2012b). There are, however, huge amounts of glutamate transporters in the astrocytic endfeet surrounding the blood vessels (Fig. 1). When isolating brain microvessels, the preparations are likely to be contaminated by endfeet and this may explain some of the data. Thus, it seems that no significant transport of glutamate can occur through a normal and intact blood–brain barrier. In agreement, injection of radiolabeled glutamate and aspartate does not result in accumulation of radioactivity in the brain (Klin et al. 2010). On the other hand, there is an efflux mechanism for glutamate as blood-mediated scavenging is reported to reduce glutamate in the cerebrospinal fluid (Gottlieb et al. 2003). There is some evidence that this may offer some protection (Zlotnik et al. 2008; Teichberg et al. 2009; Zlotnik et al. 2010; Nagy et al. 2010). The mechanism, however, of release from the brain remains to be identified. This illustrates that brain water homeostasis and transport mechanisms between the blood and the extracellular fluid in brain are incompletely understood. Recent work from Nedergaard and co-workers may represent a leap in our understanding. They introduce the term “glymphatics” (Iliff et al. 2012; Nedergaard 2013) to describe flow of fluid from the arachnoid space along blood vessels into brain tissue. This may reconcile a number of apparently conflicting reports. Perhaps this also will explain why the betaine-GABA transporter (BGT1; slc6a12; Zhou et al. 2012b) and the taurine transporting GABA transporter 2 (GAT2; slc6a13; Zhou et al. 2012a) are expressed in the leptomeninges.

혈액 뇌 장벽의 글루타메이트 수송체

신경계는

장벽을 통해 혈액으로부터

자신을 격리합니다(예: Abbott 2005; Alvarez 외. 2013).

이는 여러 가지 이유로 중요합니다.

그 중 하나는

혈청 글루타메이트가

일반적으로 신경세포에 독성이 있는 농도보다 훨씬 높은

50-200 μm 범위(Zlotnik et al. 2011a, b, c)에 있다는 사실입니다(Danbolt 2001).

혈액-뇌 장벽은

혈액과 뇌의 간질액 사이에 있습니다.

포유류에서는

뇌세포의 영향을 받아

내피 세포에 의해 형성됩니다.

또 다른 장벽은

뇌척수액(CSF)을 분비하는

맥락막 신경총 상피에 있습니다.

이러한 장벽은

뇌 항상성에 필수적이라는 생리적 관점과

약물이 뇌 조직으로 들어가는 것을 막는다는

약리학적인 관점 모두에서 중요합니다(Deboer and Gaillard 2007; Teichberg 2007).

관련 문헌은 방대하고 상반된 보고로 가득합니다. 이에 대한 자세한 설명은 이 리뷰의 범위를 벗어납니다.

여기서는

뇌 장벽 내피 세포가

상당한 수준의 EAAT1-3을 발현하지 않는다는 점(그림 1)만

지적하고자 합니다(Lehre 외. 1995; Berger and Hediger 2000; Holmseth 외. 2009, 2012b).

그러나

혈관을 둘러싸고 있는 성상세포 말단에는

엄청난 양의 글루타메이트 수송체가 존재합니다(그림 1).

뇌 미세혈관을 분리할 때

시약이 말단에 의해 오염될 가능성이 있으며,

이것이 데이터의 일부를 설명할 수 있습니다.

따라서 정상적이고 온전한 혈액-뇌 장벽을 통해서는 글루타메이트의 중요한 수송이 일어나지 않는 것으로 보입니다. 이에 동의하여 방사성 표지 글루타메이트와 아스파르테이트의 주사는 뇌에 방사능 축적을 초래하지 않습니다(Klin 외. 2010).

반면에

혈액 매개 청소가

뇌척수액에서 글루타메이트를 감소시키는 것으로 보고됨에 따라

글루타메이트의 유출 메커니즘이 있습니다(Gottlieb 등. 2003).

이것이 어느 정도 보호 효과를 제공할 수 있다는 증거도 있습니다(Zlotnik 외. 2008; Teichberg 외. 2009; Zlotnik 외. 2010; Nagy 외. 2010). 그러나 뇌에서 방출되는 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다.

이는

뇌의 수분 항상성과 혈액과 뇌의 세포 외액 사이의

수송 메커니즘이 불완전하게 이해되고 있음을 보여줍니다.

네더가드와 동료들의 최근 연구는 우리의 이해에 비약적인 발전을 가져올 수 있습니다. 이들은 혈관을 따라 거미막 공간에서 뇌 조직으로의 체액 흐름을 설명하기 위해 “글림파틱스”(Iliff et al. 2012, Nedergaard 2013)라는 용어를 도입했습니다. 이는 겉보기에 상충되는 여러 보고를 조정할 수 있습니다.

아마도 이것은 또한

베타인-GABA 수송체(BGT1; slc6a12; Zhou 등 2012b)와

타우린 수송 GABA 수송체 2(GAT2; slc6a13; Zhou 등 2012a)가

연수체에서 발현되는 이유를 설명할 수 있을 것입니다.

https://www.frontiersin.org/journals/molecular-neuroscience/articles/10.3389/fnmol.2022.937789/full

Concluding remarks

As outlined above, substantial progress has been made over the last decades. But there are major gaps in our understanding of key processes. One example is transport of metabolites across the blood brain barrier. Another unknown is the uptake in glutamatergic nerve endings and the relevance of the glutamate-glutamine cycle for transmitter glutamate. A third topic is why the body needs several different glutamate transporters, and how they can be pharmacologically modulated.

결론

위에서 설명한 바와 같이 지난 수십 년 동안 상당한 진전이 있었습니다. 그러나 주요 과정에 대한 이해에는 큰 격차가 있습니다. 한 가지 예로 혈액 뇌 장벽을 통한 대사물질의 수송을 들 수 있습니다. 또 다른 미지의 영역은 글루타메이트 신경 종말에서의 흡수와 글루타메이트-글루타민 주기와 전달물질 글루타메이트의 관련성입니다. 세 번째 주제는 신체에 여러 가지 글루타메이트 수송체가 필요한 이유와 약리학적으로 어떻게 조절될 수 있는지에 관한 것입니다.

Acknowledgments

The authors thank Gunnar Lothe for help with Fig. 1. This work was supported by stimulation funds from the University of Oslo, by the Norwegian Research Council (FUGE II-183727-S10) and by private funds.

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Abbreviations

AMPA	α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid
l-AP4	l-2-Amino-4-phosphonobutanoate
ATP	Adenosine triphosphate
CNS	Central nervous system
EAAC1	Glutamate transporter number 3 (EAAT3; slc1a1; Kanai and Hediger 1992)
EAAT	Excitatory amino acid transporter (synonymous to glutamate transporter)
GABA	γ-Aminobutyric acid
GLAST	Glutamate transporter number 1 (EAAT1; slc1a3; Storck et al. 1992; Tanaka 1993a)
GLT-1	Glutamate transporter number 2 (EAAT2; slc1a2; Pines et al. 1992)
GLUL	Glutamine synthetase
NMDA	N-Methyl-d-aspartate
TBOA	dl-threo-β-benzyloxyaspartate

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References

• Abbott NJ. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell Mol Neurobiol. 2005;25:5–23. [PubMed] [Google Scholar]