효소활성 측정

[김희중]

 

효소활성 측정법

① 효소란?

대부분이 구형 단백질 분자로써, 화학적 촉매와 같이 반응물질의 활성화에너지를 낮추어 반응속도를 촉진시킬 뿐, 자신은 화학반응에 관여하지 않는다.

② 효소활성측정이란?

일정한 온도와 일정한 pH하에서 일정량의 기질과 효소를 반응시켜, 감소된 반응물질의 양 또는 생성된 생산물질의 양을 일정시간 간격으로 측정하는 것으로 효소의 농도를 일정하게 하고 기질의 농도를 변화시켜가면서 반응속도 측정

③ 효소농도에 따른 효소의 반응속도

                 

                 Vmax

              1/2Vmax

                           Km                       [S]

▷기질의 농도[S]가 낮을 때 효소반응속도는 [S]에 비례하므로 대단히 빠르나, 기질의 농도가 충분히 커지면 반응속도의 증가가 없는 포화상태가 되어 최대 속도(V_max)에 도달한다.

▷효소에 의해서 촉매 되는 반응들의 초기속도(V₀)는 기질의 농도가 증가함에 따라서 증가하다가 기질의 농도가 더 증가하여도 초기속도가 더 이상 증가하지 않는다. 이와 같은 현상과 기질포화에 도달하였을 때의 최대초기속도 (V_max)는 다음그림과 같이 나타낼 수가 있으며 이 반응은 중간물질인 효소기질복합체가 형성되어야만 일어나고 모든 효소분자가 복합체를 이루고 있을 경우에 관찰되는 속도가 최대속도이다.

④ 효소의 작용

효소(E) 기질(S)이 결합하여 효소-기질복합체(ES)를 형성하며, 이 복합체는 대단히 안정하고 활성화에너지가 작으므로, 곧 내부 분자구조가 변형되어 반응 생성물과 효소로 분리된다.

⑤ 효소의 단위

효소 활성은 지정된 조건 하에서 1분동안 1μmol의 기질의 변화를 촉매하는 효소량과 같다(일반적으로 사용되는 단위 : 효소마다 기질이 다르기 때문에 약간의 차이가 있다.).

※ 효소활성에 영향을 미치는 요인

① 온도

  ㄱ. 45℃ 까지는 온도의 상승에 따라 반응속도가 증가한다.

  ㄴ. 45℃ 이후에는 열변성이 시작된다.(단백질로 구성되어있기 때문)

  ㄷ. 55℃ 이상이면 변성을 일으켜서 촉매를 잃게 된다.

  ㄹ. 효소 최대 반응속도 온도는 35℃ 에서 45℃ 이다.(최적 온도)

② pH

대부분의 효소들의 활동성은 매질의 pH에 따라서 크게 달라진다. 따라서 효소분석은 완충용액에서 실행하여야 한다. 효소반응의 pH 의존성은 효소 또는 기질의 작용기들의 이온화도의 변화의 결과에서 온다.

③ 보조인자

많은 효소들은 그들의 작용에 의해서 느슨하게 결합된 유기보조인자들 또는 금속이온을 필요로한다. 효소를 정제하는 과정에서 이러한 보조인자들을 첨가하는 것을 잊지 말아야 한다. 왜냐하면 효소정제의 각 단계에서의 효소분석에 있어서 효소의 활동성을 가지려면 보조인자들이 있어야 하기 때문이다.

④ 기질농도의 영향

  ㄱ. 기질 농도가 낮은 초기 반응속도는 기질 농도에 비례하여 반응속도가 증가한다.

  ㄴ. 일정한 기질농도가 지나면 반응속도 증가가 점차 감소한다.

  ㄷ. 어느 수준의 기질량 이상에서는 더 이상 반응속도의 증가는 보이지 않는다.

참고자료

1) 효소의 특징

① 생 세포에서 만들어진다.

② 생체촉매제 작용을 한다.(반응이 매우 빠르다)

③ 기질특이성이 있다.(절대적 특이성, 상대적 특이성)

④ 대부분 단백질로 구성되어 있다.(RNA인 것도 있다. RNA enzyme)

⑤ 산이나 PH에 의해 영향을 받는다.

2) 효소의 성질

① 단백질의 모든 특성을 나타낸다.

② 열, 강산, 강염기, 단백질 변성제에 의해 구조가 변하며, 촉매활성을 잃어버리게 된다.

③ 저분자화합물이나 금속이온과 같은 보조인자를 가진다.

④ 단백질에 보조인자가 결합해 완전한 촉매활성을 나타내는 효소를 완전 효소라 한다.

⑤ 효소는 기질에 대해 특이적인 선택성을 가진다.

⑥ 효소합성은 호르몬에 의해 조절

⑦ 어떤 효소는 precursor 형태로 합성된후 proteolysis에 의해서 활성이 active한 enzyme으로 변화.

⑧ Allosteric enzyme, Covalent modification

※ 효소의 특이성

① 작용특이성

하나의 효소는 하나의 화학반응에 촉매를 나타내며 부 반응이나 부산물을 만들지 않는다.

② 기질 특이성

  - 효소의 반응부위와 기질은 상보적으로 결합한다.

  - 효소단백질의 입체구조와 기질분자의 입체배치에 의해 특이성이 나타난다.

③ 입체특이성

효소는 입체 이성질체 기질의 어느 한쪽만의 반응을 촉매 한다.

④ 군 특이성

일군의 화합물을 기질로 하는 효소가 가지는 특이성을 말한다.

3) 효소의 단위

① 효소의 국제 단위는 (unit)이다.

② 효소가 최적 온도(30℃)에서 1분당 1mm 의 기질을 생성물로 변환시키는데 필요한 효소의 양을 1 단위(I.U)라 한다.

③ turmover number : 한 분자의 효소에 의해 단위시간(초)동안 전환되는 substrate molecular수

4) 효소의 반응 특이성

  ① 촉매로서의 작용

  A. 효소는 활성화에너지를 낮추어 반응속도를 촉진시키는 역할을 한다.

   a. 절대적 특이성 : 유사한 기질 중 한 기질만을 선택적으로 촉매 하는 효소특이성

   b. 절대군 특이성 : 일정한 기를 가진 집단의 기질만을 선택적으로 촉매 하는 효소특이성

   c. 상대적 특이성 : 어떤 류의 기질과 우선 반응한 후 다른 류의 기질과도 반응을 나타내는 효소특이성

   d. 광학적 특이성 : 광학 이성질체 중 특정한 타입에만 반응하는 효소 특이성

5) 효소 반응식

  ① km(michaelis 상수) : 효소-기질 복합체가 해리하는 정도를 나타내는 상수

  ② 효소에 대한 기질의 상대적인 친화도를 나타내는 값을 의미한다.

  ③ km이 낮을 때 : 효소와 기질 친화도가 높은 것을 의미한다.

6) 단순효소촉매의 반응속도론

  ① E +S --K₁--a ES -K₂---a E + P aK-1--- a- K-2: (p의 양이 거의 없으므로 무시)

  ② 정상 상태에서는 ES 생성 속도와 ES분해속도가 같다.

  ③ (효소 반응속도: 기질소모속도, 생성물 생성속도) V=K₂[ES]

  ④ Vm= 최대 반응속도, 효소량에 의해 변화하나 기질과는 무관하다. V₀=초기속도

  ⑤ Km=k-1 + k₂/k₁ = Vm의 1/2 (michaelis menten 상수, 효소와 기질 친화도

    (값이 적을수록 친화도가 높다)

  ⑥ [ES]=[E₀][S]/[S] + Km

  ⑦ [ES]=[E₀] 일 때 최대 속도가 얻어진다.

  ⑧ V₀= K₂ [ES]

  ⑨ V_max= k₂ [E0]

  ⑩ V₀= K2 [E0][S]/[S] + Km ------------briggs- haldane식

     V₀= V_max[s]/[s] + Km--------------michaelis-menten식

  ⑪ 1/v= 1/Vm + km/Vm(1/[s])---------Lineweaver-Burk plotting

     (Vm 정확하나, km은 부정확하다.)

  ⑫ V= Vm - km(V/[S]) --------------Eadie-Hopstee plotting

     (낮은 값의[s]에 대해 작은 오차 값을 나타낸다.)

7) Km

  ① [s]가 아주 클 때는 의미가 없다.

  ② 속도 재한 단계를 예측하는데 사용할 수 있다.

   A. Km 값에 변화를 주는 요인들

     a. pH

     b. 온도

     c. 이온의 세기

  ③ 효소의 기질 선호도 기준이 된다.(substrate preference)

8) 효소활성의 저해

  ① 비가역적 저해

   ㄱ. 저해재가 효소의 활성부위 근처의 아미노산 잔기에 비가역적으로 공유결합 한다.

   ㄴ. 효소와 기질의 결합이 생성되지 못하게 한다.

  ② 가역적 저해

   ㄱ. 효소의 결합부위에 저해제가 가역적으로 결합한다.

   ㄴ. 효소의 작용을 억제한다.

  ③ 경쟁적 저해(Competitive inhibition)

   ㄱ. 기질과 저해제의 화학구조가 유사한 경우를 말한다.

       (S의 농도를 높이면 inhibition이 일어나지 않는다)

   ㄴ. 효소 활성부위에 기질과 저해제가 경쟁적으로 결합하게 되는 것이다.

   ㄷ. Vmax는 일정, Km은 증가

  ④ 비경쟁적 저해(noncompetitive inhibition)

   ㄱ. 저해제가 효소와 기질의 결합부위가 아닌 다른 부위에 결합한다.

   ㄴ. 그런 후 다시 기질과 결합하기도 한다.

   ㄷ. 이러한 복합체들에 저해제가 결합해 반응을 저해하게 되는 것이다.

   ㄹ. Km은 일정, Vmax은 감소

  ⑤ 무경쟁적 저해(Uncompetitive inhibition)

   ㄱ. 저해제가 효소-기질복합체와만 결합한다.

   ㄴ. 촉매반응을 저해 시키는 것이다.

   ㄷ. Km․Vmax 감소

9) 명명 법

  ① 말단에 - ase 를 붙여 명명한다. (효소 반응형식, 효소 반응 시 사용되는 기질의 종류에 따라)

  ② pepsin, trypsin, papain : 관용 명으로 존재하는 효소들이다.

  ③ 화학반응에서의 역할에 따라 이름을 붙인다.

   ㄱ. Transferase (전이 효소)

   ㄴ. Hydrolase (가수분해효소)

   ㄷ. Lyase (기질 분해효소)

   ㄹ. Isomerase (이성질체 효소)

   ㅁ. Ligase (결합효소)

   ㅂ. Oxidoreductase (산화 환원효소)

※ (EC. W. X. Y. Z) Enzyme commission number

  - W : Type of reaction catalyzed

  - X : Nature of groups donated

  - Y : Type of receptor

  - Z : Nature od substrate

▶ 시약 및 기기

① Reagents

효소원, 표준완충용액(pH3 sodium acetate buffer, pH6 sodium phosphate buffer, pH8 Tris-HCl buffer), guaiacol (150mM), H₂O₂ (100mM), DDW

② Instruments

cuvette, 마이크로피펫, tip, para film, UV/VIS spectrophotometer(분광광도계)

▶ 방법(Method)

1) Peroxidase는 붉은색으로 발색하므로 흡광도 파장수치를 470 nm로 맞추어야한다.

2) assay

  ① 1.5ml cuvett에 효소를 50㎕, buffer 800㎕, guaiacol 100㎕, H₂O₂ 50㎕를 넣고(최종부피 1ml이 되도록) 2-3회 shake한 후 spectrophotometer를 통해 효소활성을 확인한다.

  ② buffer pH를 바꾸어 가면서 활성을 측정한다.

실험결과