Re: 대장균 효모 발효 --＞ 커큐민, 사포닌(테르페노이드 ) 생산 2018!!

[문형철]

Front Microbiol

. 2018 Oct 12;9:2460. doi: 10.3389/fmicb.2018.02460

Microbial Platform for Terpenoid Production: Escherichia coli and Yeast

Chonglong Wang 1,*, Mudanguli Liwei 1, Ji-Bin Park 2, Seong-Hee Jeong 2, Gongyuan Wei 1, Yujun Wang 3, Seon-Won Kim 2,*

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PMCID: PMC6194902  PMID: 30369922

Abstract

Terpenoids, also called isoprenoids, are a large and highly diverse family of natural products with important medical and industrial properties. However, a limited production of terpenoids from natural resources constrains their use of either bulk commodity products or high valuable products. Microbial production of terpenoids from Escherichia coli and yeasts provides a promising alternative owing to available genetic tools in pathway engineering and genome editing, and a comprehensive understanding of their metabolisms. This review summarizes recent progresses in engineering of industrial model strains, E. coli and yeasts, for terpenoids production. With advances of synthetic biology and systems biology, both strains are expected to present the great potential as a platform of terpenoid synthesis.

초록

테르페노이드(이소프렌오이드라고도 함)는

의학적 및 산업적 특성이 중요한 대규모의 매우 다양한 천연물 계열이다.

그러나

천연 자원에서 테르페노이드의 생산량이 제한적이어서

대량 상품이나 고부가가치 제품으로의 활용이 제약된다.

대장균(Escherichia coli)과 효모를 이용한

미생물학적 테르페노이드 생산은

대사 경로 공학 및 게놈 편집에 활용 가능한 유전학적 도구와

이들의 대사 과정에 대한 포괄적인 이해 덕분에 유망한 대안을 제공한다.

본 리뷰는 테르페노이드 생산을 위한 산업용 모델 균주인

대장균(E. coli)과 효모의 공학적 개량에 관한 최근 진전을 요약한다.

합성생물학과 시스템생물학의 발전으로

두 균주 모두 테르페노이드 합성 플랫폼으로서

큰 잠재력을 보일 것으로 기대된다.

Keywords: terpenoid, Escherichia coli, yeast, synthetic biology, MEP pathway, MVA pathway, strain engineering

Introduction

Terpenoids comprise a vast family of the most abundant (>55, 000 known members) natural products with diverse biological functions including cell integrity, hormones, electron transport, and photosynthetic machinery. The extracted products from some herbs or animal liver are realized as flavors, fragrances, colorants, commodity chemicals, vitamins, and pharmaceuticals from ancient time. Nevertheless, their low yields from natural sources limit mass production of terpenoid for industrial application. For instance, Artemisia annua (Qinghao) just yields artemisinin of <0.8% by dry biomass weight (Zyad et al., 2018), which severely restricts commercialization of this antimalarial drug. Humans have employed microbes to produce beverages (e.g., Saccharomyces cerevisiae) before civilization, and antibiotics (e.g., Penicillium chrysogenum) at an industrial scale since the Second World War (Nielsen and Keasling, 2016). Nowadays, advances in metabolic engineering enable us to build microbial cell factories to generate many interesting products, of which Escherichia coli and yeast are the well-characterized hosts for efficient and large-scale production. Since Amyris Inc., announced a record low manufacturing cost of $1.75 per liter for farnesene from yeast in 2015, microbial farnesene has attracted a lot of interests from industry1. This review describes progress in biosynthesis of the diverse terpenoids in E. coli and yeast, where fantastic technologies are harnessed for development of microbial cell factories. It illuminated the great potential of E. coli and yeast on tackling a complexity of biosynthesis of the diverse terpenoids.

서론

테르페노이드는

세포 구조 유지, 호르몬, 전자 전달, 광합성 기구 등

다양한 생물학적 기능을 가진 가장 풍부한(55,000종 이상 확인) 천연물 대가족을 구성한다.

일부 약초나 동물 간에서 추출된 제품은

고대부터 향료, 향수, 착색제, 일반 화학물질, 비타민, 의약품으로 활용되어 왔다.

그러나

천연 원료에서의 낮은 수율로 인해 산업적 응용을 위한

테르페노이드의 대량 생산이 제한된다.

예를 들어,

Artemisia annua (청호)는

건조 생물량 기준 아르테미시닌 수율이 0.8% 미만(Zyad et al., 2018)에 불과하여

이 항말라리아 약물의 상업화를 심각하게 제약한다.

인류는 문명 이전부터 미생물을 이용해 음료(예: Saccharomyces cerevisiae)를 생산해 왔으며,

제2차 세계대전 이후에는 항생제(예: Penicillium chrysogenum)를

산업 규모로 생산해 왔다(Nielsen and Keasling, 2016).

오늘날 대사 공학의 발전으로 우리는

많은 흥미로운 제품을 생산하기 위한 미생물 세포 공장을 구축할 수 있게 되었으며,

그중 Escherichia coli와 효모는

효율적이고 대규모 생산을 위한 잘 알려진 숙주입니다.

2015년 에이미리스(Amyris Inc.)가 효모를 이용한 파네센(farnesene) 제조 비용을

리터당 1.75달러라는 사상 최저 수준으로 발표하면서,

미생물 파네센은 산업계의 큰 관심을 끌었다1.

본 리뷰는

대장균(E. coli)과 효모에서 다양한 테르페노이드(terpenoids)의 생합성 진전을 설명하며,

미생물 세포 공장 개발을 위해 활용되는 놀라운 기술들을 조명한다.

이는 다양한 테르페노이드의 복잡한 생합성 문제를 해결하는 데 있어

대장균과 효모의 큰 잠재력을 밝혀주었다.

Biosynthesis Pathways of Diverse Terpenoids

Albeit structurally diverse, skeletons of terpenoids are composed of C5 isoprene units which are successively assembled by biogenic isoprene rule. Precursors of the C5 isoprene units are isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP), which are synthesized by either meval‎onate (MVA) pathway in eukaryotes, archaea and a few bacteria or 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway in prokaryotes and plant plastids (Liao et al., 2016; Frank and Groll, 2017). MEP pathway starts from condensation of two glycolytic intermediates, pyruvate and glyceraldehyde-3-phosphate, and MVA pathway from condensation of acetyl-CoAs (Figure 1A). Both pathways require energies (ATP) and reductive powers [NAD(P)H] to proceed multi-enzymatic reactions to produce IPP and DMAPP. Given no consideration of energy balance, MEP pathway consumes 1 molecule of glucose per IPP with a carbon molar yield of 0.83, while the MVA pathway consumes 1.5 molecules of glucose per IPP with the lower yield of 0.56 (Eqs. 1, 2) (Schempp et al., 2018). In this scenario, MEP pathway requires 2 ATP and 2 NAD(P)H, while MVA pathway accompanies generation of 3 NAD(P)H. Thus, microorganisms need engineering to use both pathways to attain the carbon and energy balances, which results in a synergy between both pathways for production of terpenoids (Yang et al., 2016).

다양한 테르페노이드의 생합성 경로

구조적으로 다양함에도 불구하고,

테르페노이드의 골격은

생합성 이소프렌 규칙에 의해 연속적으로 조립되는 C5 이소프렌 단위로 구성된다.

C5 이소프렌 단위의 전구체는

이소펜틸 디포스페이트(IPP)와 디메틸알릴 디포스페이트(DMAPP)로,

진핵생물, 고세균 및 일부 박테리아에서는

메발론산(MVA) 경로로,

원핵생물과 식물 플라스티드에서는 2-C-메틸-D-에리스리톨 4-포스페이트(MEP) 경로로 합성됩니다 (Liao et al., 2016; Frank and Groll, 2017).

MEP 경로는

두 가지 당분해 중간체인 피루브산과 글리세랄데히드-3-인산(GAPH3P)의 축합 반응으로 시작되며,

MVA 경로는 아세틸-CoA의 축합 반응으로 시작됩니다(그림 1A).

두 경로 모두 IPP와 DMAPP를 생성하기 위한

다중 효소 반응을 진행하기 위해 에너지(ATP)와 환원력[NAD(P)H]이 필요합니다.

에너지 균형을 고려하지 않을 경우, MEP 경로는 IPP 당 포도당 1분자를 소비하며 탄소 몰수율은 0.83이다. 반면 MVA 경로는 IPP 당 포도당 1.5분자를 소비하며 수율이 낮은 0.56이다(식 1, 2) (Schempp et al., 2018). 이 시나리오에서 MEP 경로는 2개의 ATP와 2개의 NAD(P)H를 필요로 하는 반면, MVA 경로는 3개의 NAD(P)H 생성을 동반한다. 따라서 미생물은 탄소 및 에너지 균형을 달성하기 위해 두 경로를 모두 활용하도록 공학적으로 설계되어야 하며, 이는 테르페노이드 생산을 위한 두 경로 간의 시너지 효과를 초래한다(Yang et al., 2016).

FIGURE 1.

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Overview of terpenoids biosynthesis pathway (A), and pathway engineering strategies (B,C). Terpenoids biosynthesis is comprised of carbon assimilation, isoprene unit synthesis, terpenoids backbone synthesis, and terpenoids decoration. C6 or C5 sugar enters the central pathway of glycolysis. MEP and MVA pathways use central metabolites to initiate synthesis of IPP and DMAPP, the building blocks of terpenoids. Terpenoid synthesis pathways could be assembled and engineered in a tractable host (e.g., E. coli or yeasts) to create cell factories for their mass production. Two fashions of static and dynamic engineering have been used to optimize the synthesis pathways and coordinate them with host metabolic network. Static engineering approach generally constructs a matrix of genes, promoters, and regulatory elements (e.g., UTRs) to screen the best orchestra, while dynamic engineering approach relies on biosensors (metabolite response or transcription factor-based) to dynamically control the synthesis pathway. The red dots present the key intermediates of terpenoid biosynthesis, and the yellow and cyan dots present primary terpenenoids and decorated terpenoids, respectively (A,B). TF presents transcription factor (C).

테르페노이드 생합성 경로 개요 (A) 및 경로 공학 전략 (B,C).

테르페노이드 생합성은

탄소 동화, 이소프렌 단위체 합성, 테르페노이드 골격 합성, 테르페노이드 장식 단계로 구성된다.

C6 또는 C5 당은

글리코리시스 중심 경로로 진입한다.

MEP 및 MVA 경로는

중심 대사 산물을 이용해 테르페노이드의 구성 요소인 IPP와 DMAPP의 합성을 시작한다.

테르페노이드 합성 경로는

다루기 쉬운 숙주(예: E. coli 또는 효모)에 조립 및 설계되어

대량 생산을 위한 세포 공장을 만들 수 있다.

합성 경로를 최적화하고 숙주 대사 네트워크와의 협응력을 확보하기 위해 정적 및 동적 공학 두 가지 방식이 활용되었다. 정적 공학 접근법은 일반적으로 유전자, 프로모터, 조절 요소(예: UTR)의 매트릭스를 구축하여 최적의 조합을 선별하는 반면, 동적 공학 접근법은 생체 센서(대사체 반응 또는 전사 인자 기반)에 의존하여 합성 경로를 동적으로 제어한다. 빨간 점은 테르페노이드 생합성의 핵심 중간체를 나타내며, 노란색과 청록색 점은 각각 1차 테르페노이드와 장식된 테르페노이드를 나타냅니다 (A,B). TF는 전사 인자를 나타냅니다 (C).

𝐌𝐄𝐏: 1 Glucose+2⁢ATP+2 NAD(P)H→1 IPP+CO2 (𝑌IPP/Glucose=0.83 C-mol/C-mol)

(1)

𝐌𝐕𝐀: 1.5 Glucose→1 IPP+4 CO2+3⁢NAD(P)H (𝑌IPP/Glucose=0.56 C-mol/C-mol)

(2)

Next, prenyltransferases catalyze chain elongation of isoprenyl diphosphates including geranyl diphosphate (GPP, C10), farnesyl diphosphate (FPP, C15), geranylgeranyl diphosphate (GGPP, C20), and even longer chain isoprenyl diphosphates (LoPP, >C45), which determine the primary diversity of terpenoids in the chain lengths. Thus, terpenoids are classified to hemiterpenoids (C5), monoterpenoids (C10), sesquiterpenoids (C15), diterpenoids (C20), triterpenoids (C30), tetraterpenoids (C40), and long chain isoprenyl products (Figure 1A).

Terpene synthases convert isoprenyl diphosphates to numerous terpenes via carbocationic reaction cascades and/or hybridization of carbon atoms, which generate a myriad of carbon skeletons containing several stereocenters and present their diversity in the structure (Christianson, 2017). The skeletons are further regio- and stereo-selectively decorated by many tailoring enzymes such as cytochrome P450s (P450s), acyltransferase, and glycosyltransferase, which may act in a combinatory manner and finally render various functions to isoprenoids (e.g., artemisinin, taxol and ginkgolide) (King et al., 2016). Therefore, the microbes, for which a good genetic engineering toolbox is available, can be engineered to synthesize valuable terpenoids by assembling of the precursor synthesis, isoprenyl chain elongation, structural rearrangement and tailoring reactions.

다음으로, 프레닐전달효소는 게라닐 디포스페이트(GPP, C10), 파르네실 디포스페이트(FPP, C15), 게라닐게라닐 디포스페이트(GGPP, C20), 그리고 더 긴 사슬의 이소프렌릴 디포스페이트(LoPP, >C45)를 포함하여 사슬 연장을 촉매합니다. 이는 사슬 길이에 따른 테르페노이드의 주요 다양성을 결정합니다. 따라서 테르페노이드는 헤미테르페노이드(C5), 모노테르페노이드(C10), 세스퀴테르페노이드(C15), 디테르페노이드(C20), 트리테르페노이드(C30), 테트라테르페노이드(C40), 그리고 장쇄 이소프렌일 생성물(그림 1A)로 분류됩니다.

테르펜 합성효소는

이소프렌일 디포스페이트를 카르보카티온 반응 계단 및/또는

탄소 원자 하이브리드화를 통해 수많은 테르펜으로 전환하며,

이는 여러 입체중심(stereocenter)을 포함하는 무수한 탄소 골격을 생성하고

구조적 다양성을 나타낸다(Christianson, 2017).

이러한 골격은 시토크롬 P450(P450), 아실트랜스퍼라제, 글리코실트랜스퍼라제 등 다양한 가공 효소에 의해 지역 및 입체 선택적으로 장식되며, 이러한 효소들은 조합적으로 작용하여 최종적으로 이소프렌오이드(예: 아르테미시닌, 탁솔, 은행나무산)에 다양한 기능을 부여합니다(King et al., 2016).따라서 유전자 공학 도구 상자가 잘 갖춰진 미생물은 전구체 합성, 이소프렌일 사슬 연장, 구조 재배열 및 테일러링 반응을 조합하여 가치 있는 테르페노이드를 합성하도록 설계될 수 있습니다.

Microbial Hosts for Terpenoid Production

As most terpenoids have been discovered in plants, an extraction from plants is a major source of commercialized terpenoids. However, the plant extraction is compromised by its low productivity due to a slow growth of plants, a low product content in plants, and a limitation in cultivating some species. Even though there is a biotechnological progress in transgenic plants, it still remains difficult to engineer plants for improved isoprenoids contents. Microbes grow fast and do not heavily rely on land/water resources. Thus, they possess a great potential for sustainable mass production of terpenoids over plants. Microbial hosts in industry are required to meet the criteria: (i) a large metabolic potential supporting efficient synthesis of products of interest with robust and fast cell growth, (ii) a well-understood metabolism and well-developed genetic tools (e.g., expression‎ vectors), and (iii) a great capacity to grow on cheap carbon sources. Terpenoids synthesis relies on MEP or MVA pathway for the generation of building units, IPP and DMAPP. Therefore, two representative microbial hosts E. coli and S. cerevisiae, which are based on MEP and MVA pathways, respectively, have been used for production of diverse terpenoids.

The terpenoids natively produced in E. coli are limited to small amounts (e.g., quinones). The native MEP pathway could be less efficient in IPP and DMAPP supply for terpenoid production. E. coli has been engineered to improve IPP and DMAPP synthesis by augmenting bottleneck enzymes of MEP pathway or introducing heterologous MVA pathway. S. cerevisiae accumulates a large amount of ergosterol, which presents a potential of its MVA pathway for terpenoid production. S. cerevisiae has redox systems that allow cytochrome P450 to modify terpenoids skeleton, whereas E. coli has none. S. cerevisiae is superior to E. coli in synthesis of value-added terpenoids with complicated structures. Yarrowia lipolytica is another good yeast for production of terpenoids based on MVA pathway because of its abundant acetyl-CoA, the initial substrate of MVA pathway (Zhu and Jackson, 2015). Besides, carotenogenic Rhodosporidium toruloides is developed to produce terpenoids from lignocellulosic hydrolysates in that it exerts ability to utilize multiple carbons and tolerates high osmotic stress (Yaegashi et al., 2017; Sundstrom et al., 2018). As many terpenoids have been isolated from Streptomyces species (Koksal et al., 2012; Rinkel et al., 2017), the bacteria could also be a potential host for terpenoids production in the future (Phelan et al., 2015; Khalid et al., 2017).

테르페노이드 생산을 위한 미생물 숙주

대부분의 테르페노이드는

식물에서 발견되었기 때문에,

식물 추출물은 상업화된 테르페노이드의 주요 공급원이다.

그러나 식물 추출은

식물의 느린 성장, 식물 내 낮은 제품 함량, 일부 종의 재배 제한으로 인한

낮은 생산성으로 인해 제약이 있다.

유전자 변형 식물 분야의 생명공학적 진전이 있음에도 불구하고, 이소프렌류 함량을 개선하기 위한 식물 공학은 여전히 어려운 과제이다. 미생물은 성장 속도가 빠르고 토지/수자원에 크게 의존하지 않는다. 따라서 식물보다 테르페노이드의 지속 가능한 대량 생산에 큰 잠재력을 지닌다. 산업용 미생물 숙주는 다음 기준을 충족해야 합니다: (i) 관심 제품의 효율적 합성을 지원하는 큰 대사 잠재력과 강력하고 빠른 세포 성장, (ii) 잘 이해된 대사 과정과 잘 개발된 유전학적 도구(예: 발현 벡터), (iii) 저렴한 탄소원을 이용한 높은 성장 능력. 테르페노이드 합성은 기본 구성 단위인 IPP와 DMAPP 생성을 위해 MEP 또는 MVA 경로에 의존한다. 따라서 각각 MEP 경로와 MVA 경로를 기반으로 하는 두 가지 대표적인 미생물 숙주인 E. coli와 S. cerevisiae가 다양한 테르페노이드 생산에 활용되어 왔다.

E. coli에서 자연적으로 생성되는 테르페노이드는 소량(예: 퀴논류)으로 제한된다. 테르페노이드 생산을 위한 IPP 및 DMAPP 공급 측면에서 내재적 MEP 경로는 효율성이 낮을 수 있다. 대장균은 MEP 경로의 병목 효소를 증강하거나 이종 MVA 경로를 도입하여 IPP 및 DMAPP 합성을 개선하도록 공학적으로 개량되었다. 효모는 대량의 에르고스테롤을 축적하며, 이는 테르페노이드 생산을 위한 MVA 경로의 잠재력을 시사한다. S. cerevisiae는 사이토크롬 P450이 테르페노이드 골격을 변형할 수 있는 산화환원 시스템을 보유한 반면, E. coli는 이를 갖추지 못한다. S. cerevisiae는 복잡한 구조를 가진 고부가가치 테르페노이드 합성에서 E. coli보다 우월하다. Yarrowia lipolytica는 MVA 경로의 초기 기질인 아세틸-CoA가 풍부하여 MVA 경로 기반 테르페노이드 생산에 적합한 또 다른 효모이다 (Zhu and Jackson, 2015). 또한 카로티노이드 생성 균주인 Rhodosporidium toruloides는 다중 탄소 이용 능력과 높은 삼투압 스트레스 내성을 발휘하여 리그노셀룰로오스 가수분해물로부터 테르페노이드를 생산하도록 개발되었다(Yaegashi et al., 2017; Sundstrom et al., 2018). 많은 테르페노이드가 Streptomyces 종에서 분리되었기 때문에(Koksal et al., 2012; Rinkel et al., 2017), 이 박테리아 역시 향후 테르페노이드 생산을 위한 잠재적 숙주가 될 수 있다(Phelan et al., 2015; Khalid et al., 2017).

Metabolic Engineering of E. coli and Yeasts for Terpenoid Production

Microbial production of terpenoids can be addressed by introduction of relevant genes for their synthesis into host strains (Figure 1B). Owing to a versatility of E. coli and S. cerevisiae, many strategies of metabolic engineering have been developed and examined to increase terpenoid production in the both model hosts. The engineering strategies can be classified to “static” and “dynamic” according to a regulatory means of synthetic pathway. Both approaches have been applied to terpenoid synthetic pathways for an enhancement of IPP/DMAPP flux, a minimization of byproducts formation, a toxicity reduction of pathway intermediates, etc., Static engineering employs variation of vectors, promoters, ribosome binding sites (RBSs), and genes of interest, which are assembled in a plethora of biological systems, to optimize a synthesis of target products (Ren et al., 2017; Figure 1C). Brewer’s yeast has been engineered by combinatory regulation of pathway genes to biosynthesize aromatic monoterpenes that impart hoppy flavor to beer (Denby et al., 2018). Farnesol is a desirable biofuel molecule derived from FPP by phosphatases. By variation of phosphatases, 526 mg/L of farnesol was produced in an engineered E. coli overexpressing a membrane integral phosphatase, PgpB (Wang C. et al., 2016). Further phosphatase mining retrieved a cytosolic phosphatase NudB, whose overexpression‎ led to farnesol of 1.42 g/L along with hemiterpenoids isopentenol (Zada et al., 2018). Optimization of plasmids carrying synthesis pathway of terpenoids brought an enhanced production of monoterpenes, 653 mg/L of 1,8-cineole of and 505 mg/L of linalool, from E. coli (Mendez-Perez et al., 2017). Oleaginous Y. lipolytica is able to synthesize a massive amount of acetyl-CoA, and lipid droplet is supposed to store lipophilic terpenoids. Tuning of promoter strength by promoters shuffling resulted in β-carotene production of 111.8 mg/L in Y. lipolytica (Larroude et al., 2018).

However, the static engineering is too laborious to gain a desired performance from an engineered strain due to intermediates toxicity or metabolic burdens often occurring from a mass production of terpenoids, whereas the dynamic engineering can address such adverse circumstances. Thus, there is also a great interest to develop tunable or inducible promoters and small regulatory RNAs (Ghodasara and Voigt, 2017; Marschall et al., 2017; Portela et al., 2017; Trassaert et al., 2017), which could benefit to a dynamic control of synthetic pathways of terpenoids. Biosensors have been developed to sense small molecules (metabolites), which are applied to a transcription control of the committed pathway in response to metabolite abundance (Dekker and Polizzi, 2017). They are built to a simple metabolite responsive promoter or a transcription factor (TF)-based binary system (Figure 1C), which are incorporated as a metabolic controller for dynamic flux control (Mannan et al., 2017). For example, FPP repressive promoters were developed to down-regulate FPP biosynthesis and FPP activated promoters could be used to up-regulate expression‎ of amorphadiene synthase converting FPP to amorphadiene. These two promoters were combined in E. coli to implement the negative and positive feedback loops of the synthesis and conversion of FPP, which is a critical metabolic node in amorphadiene synthesis. Amorphadiene production of 1.2 g/L was obtained from the engineered E. coli, which was a two-fold increase in the production through the dynamic control (Dahl et al., 2013). In S. cerevisiae, a large amount of FPP is mainly used for synthesis of ergosterol via squalene. Thus, squalene synthase (Erg9) condensing two FPPs to a squalene could be a critical regulation point to divert FPP flux to synthesis of terpenoids of interests. A dynamic control of Erg9 expression‎ using ergosterol-responsive promoter could alter FPP flux to amorphadiene synthesis (Yuan and Ching, 2015). Biosensors have been developed to provide an additional exquisite regulatory means for tuning of synthetic pathway, and improved in both their dynamic responsive range and substrates spectrum (Rogers et al., 2016; Liu et al., 2017). Natural TFs (AraC and Gal4) were evolved to respond to IPP accumulation (Chou and Keasling, 2013). Their application in controlling zeaxanthin biosynthesis pathway resulted in a successful production of the carotenoid (C40) at a titer of 722.5 mg/L (Shen et al., 2016). Synthetic biologists have also designed promoters responding to environmental signals such as pH and quorum sensing (QS) molecules (Tsao et al., 2010; Zargar et al., 2015; Rajkumar et al., 2016). It is capable control terpenoid biosynthesis with the environmental signals, not using expensive inducer molecules. A QS-based promoter system was successfully applied for an inducer free production of bisabolene from E. coli, where titer of bisabolene was increased to 1.1 g/L through optimization of LuxR and LuxI expressions (Kim et al., 2017).

테르페노이드 생산을 위한 E. coli 및 효모의 대사 공학

테르페노이드의 미생물 생산은 합성에 필요한 관련 유전자를 숙주 균주에 도입함으로써 해결할 수 있다(그림 1B). E. coli와 S. cerevisiae의 다용도성 덕분에, 두 모델 숙주에서 테르페노이드 생산량을 증가시키기 위한 다양한 대사 공학 전략이 개발되고 검토되어 왔다. 이러한 공학적 전략은 합성 경로의 조절 방식에 따라 “정적”과 “동적”으로 분류될 수 있다. 두 접근법 모두 IPP/DMAPP 유동성 향상, 부산물 생성 최소화, 경로 중간체의 독성 감소 등을 위해 테르페노이드 합성 경로에 적용되어 왔다. 정적 공정은 벡터, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 관심 유전자의 변이를 활용하며, 이는 다양한 생물학적 시스템에 조립되어 표적 제품의 합성을 최적화한다(Ren et al., 2017; 그림 1C). 맥주 효모는 경로 유전자의 조합적 조절을 통해 맥주에 홉 풍미를 부여하는 방향성 모노테르펜을 생합성하도록 공학적으로 개량되었다(Denby et al., 2018). 파네솔은 인산분해효소에 의해 FPP로부터 유래되는 바람직한 바이오연료 분자이다. 인산 가수분해 효소의 변이를 통해, 막 통합 인산 가수분해 효소 PgpB를 과발현하는 공학적으로 개량된 E. coli에서 526 mg/L의 파네솔이 생산되었다(Wang C. et al., 2016). 추가적인 포스파타제 탐사를 통해 세포질 포스파타제 NudB를 발견했으며, 이를 과발현한 결과 1.42 g/L의 파네솔과 함께 헤미테르페노이드 이소펜테놀(Zada et al., 2018)이 생성되었습니다. 테르페노이드 합성 경로를 가진 플라스미드의 최적화를 통해 대장균에서 모노테르펜 생산량이 향상되어 1,8-시네올 653 mg/L 및 리날룰 505 mg/L이 생산되었습니다 (Mendez-Perez et al., 2017). 유지성 Y. lipolytica는 대량의 아세틸-CoA를 합성할 수 있으며, 지질 방울은 친유성 테르페노이드를 저장하는 것으로 추정됩니다. 프로모터 셔플링을 통한 프로모터 강도 조정은 Y. lipolytica에서 111.8 mg/L의 β-카로틴 생산을 가져왔습니다 (Larroude et al., 2018).

그러나 정적 공정은 중간체 독성이나 대량 생산 시 발생하는 대사 부담으로 인해 원하는 성능을 얻기에는 너무 번거롭습니다. 반면 동적 공정은 이러한 불리한 상황을 해결할 수 있습니다. 따라서 테르페노이드 합성 경로의 동적 제어에 유용할 수 있는 조절 가능하거나 유도 가능한 프로모터 및 소형 조절 RNA(Ghodasara and Voigt, 2017; Marschall et al., 2017; Portela et al., 2017; Trassaert et al., 2017) 개발에도 큰 관심이 있습니다. 소분자(대사산물)를 감지하기 위한 바이오센서가 개발되어, 대사산물의 풍부함에 반응하여 확립된 경로의 전사 조절에 적용되고 있다(Dekker and Polizzi, 2017).. 이들은 단순한 대사산물 반응성 프로모터 또는 전사인자(TF) 기반 이진 시스템(그림 1C)으로 구축되어 동적 유동 제어용 대사 조절기로 통합됩니다(Mannan et al., 2017). 예를 들어, FPP 생합성을 하향 조절하기 위해 FPP 억제성 프로모터가 개발되었으며, FPP 활성화 프로모터는 FPP를 아모르파디엔으로 전환하는 아모르파디엔 합성효소 발현을 상향 조절하는 데 사용될 수 있습니다. 이 두 프로모터는 E. coli에서 결합되어 아모르파디엔 합성의 핵심 대사 노드인 FPP의 합성과 전환에 대한 음성 및 양성 피드백 루프를 구현했습니다. 공학적으로 개량된 E. coli로부터 1.2 g/L의 아모르파디엔 생산량을 얻었으며, 이는 동적 제어를 통한 생산량의 2배 증가였습니다(Dahl et al., 2013). S. cerevisiae에서는 다량의 FPP가 주로 스쿠알렌을 경유한 에르고스테롤 합성에 사용된다. 따라서 두 개의 FPP를 스쿠알렌으로 축합하는 스쿠알렌 합성효소(Erg9)는 FPP 유동을 관심 있는 테르페노이드 합성으로 전환시키는 핵심 조절점이 될 수 있다. 에르고스테롤 반응성 프로모터를 이용한 Erg9 발현의 동적 제어는 FPP 유동을 아모르파디엔 합성으로 전환시킬 수 있다(Yuan and Ching, 2015). 합성 경로 조정을 위한 정교한 추가적 조절 수단으로 바이오센서가 개발되었으며, 동적 반응 범위와 기질 스펙트럼 모두에서 개선되었다(Rogers et al., 2016; Liu et al., 2017). 자연계 전사인자(AraC 및 Gal4)를 IPP 축적에 반응하도록 진화시켰다(Chou and Keasling, 2013). 이를 이용해 제아잔틴 생합성 경로를 제어한 결과, 카로티노이드(C40)를 722.5 mg/L 농도로 성공적으로 생산하였다(Shen et al., 2016). 합성 생물학자들은 또한 pH 및 쿼럼 센싱(QS) 분자와 같은 환경 신호에 반응하는 프로모터를 설계했습니다(Tsao et al., 2010; Zargar et al., 2015; Rajkumar et al., 2016). 이는 값비싼 유도체 분자를 사용하지 않고 환경 신호로 테르페노이드 생합성을 제어할 수 있게 합니다. QS 기반 프로모터 시스템은 E. coli에서 비사볼렌의 유도체 없는 생산에 성공적으로 적용되었으며, LuxR 및 LuxI 발현 최적화를 통해 비사볼렌의 생산량을 1.1 g/L까지 증가시켰습니다(Kim et al., 2017).

Genome-Level Engineering of Terpenoids Production

Rewiring of metabolic network of host strain is required for a full performance of an engineered pathway for product synthesis, when potential of the engineered production pathway is restricted due to a metabolic characteristics of the host. Many genetic tools are available for genome engineering in E. coli and yeasts. Homologous recombination is the most popular method for deletion and replacement of genetic parts. The glyceraldehyde 3-phosphate and pyruvate supply was rebalanced by tuning-down of glyceraldehyde 3-phosphate synthase, which led to a two-fold increase in lycopene production via the MEP pathway in E. coli (Jung et al., 2016). The central pathway was rewired in S. cerevisiae to synthesize acetyl-CoA with reduced losses of carbon and ATP. As acetyl-CoA was the substrate of the MVA pathway, rewiring of the central carbon metabolism in S. cerevisiae resulted in an increase in farnesene production by 25% along with a reduced requirement of oxygen by 75% (Meadows et al., 2016). Genome engineering tools have been developed to simultaneously target multiple genomic loci like as multiplex automated genome engineering (MAGE), and to precisely edit a specific genomic locus without a scar based on the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system (Figure 2A). MAGE was applied to optimizing MEP pathway in E. coli for lycopene production (Wang et al., 2009). A modified method of MAGE was also successfully applied for β-carotene production in S. cerevisiae (Barbieri et al., 2017). As MAGE generates a vast of combinatorial variants in genome, it could be an effective genome engineering tool only when it is combined with a high-throughput screening (colorimetric or fluorescent) system enabling a selection of variants with desired traits. It is also difficult to incorporate large genetic parts (>1 kb) into genome by MAGE. CRISPR/Cas9 is currently powerful and popular genetic tool for precise genome editing (Jiang et al., 2013; Jessop-Fabre et al., 2016). The endonuclease Cas9 combined with guide RNA (gRNA) specifically recognizes a target site in genome, and facilitates site-specific nucleotide base-pair mutations, gene deletions, or large DNA fragment (around 8 kb at least) insertions (Figure 2A). β-Carotene synthesis pathway was integrated into E. coli genome by CRISPR/Cas9-based method. Both MEP pathway and central metabolic pathways were optimized in the engineered strain, and the final strain was cultured in fed-batch, yielding 2.0 g/L of β-carotene (Li et al., 2015). A set of genomic loci of Y. lipolytica have been identified for targeted marker-less integration using CRISPR/Cas9 (Schwartz et al., 2017). An automated platform for multiplex genome-scale engineering in S. cerevisiae has been also developed based on CRISPR/Cas9 (Si et al., 2017). Plasmid-based expression‎ of production pathway has a problem of segregational or structural instability of plasmids, which becomes worse in case of inhibitory products to host cells. Moreover, expensive antibiotics is required to exert a selection pressure on host cells for prevention of plasmid loss, which increases a production cost. However, genome-based expression‎ of production pathway could deliver stable and reproducible production with no use of antibiotics, which is important for mass scale production of industry. The top portion of MVA pathway was integrated into genomic loci of adhE and ldhA in E. coli, and atpFH genes were deleted to increase glycolytic rate. The genome-engineered strain exhibited both high productivity (∼1.01 g/liter/h) and yield (86.1% of theoretical yield) after 48 h of shaking flask culture (Wang J. et al., 2016). However, engineering of genome integrated production pathway is a cumbersome task compared to plasmid-based engineering. Plasmid is more easy and convenient to modulate genes dosage and to construct various genetic expression‎ cassettes. The genome level engineering for optimization of production pathway was facilitated by CRISPR/Cas9-based convenient chromosomal promoters change, which is successfully applied for bisabolene synthesis in E. coli (Alonso-Gutierrez et al., 2018). A heterologous MEP pathway was integrated into genome of S. cerevisiae with endogenous MVA pathway. As the MEP pathway does not produce extra NADH which need oxidizing to maintain redox status, the engineered yeast enabled to rely solely on the MEP pathway instead of the MVA pathway for terpenoids biosynthesis under low aeration conditions (Kirby et al., 2016). MVA pathway genes attached with mitochondrial-targeting signal sequences were integrated into genome of S. cerevisiae to enable utilization of both cytosolic and mitochondrial acetyl-CoAs via the native cytosolic and the engineered exogenous mitochondrial MVA pathways. The engineered yeast produced 2.5 g/L of isoprene, an increase of 1.6-fold by the mitochondrial MVA pathway (Lv et al., 2016). A comprehensive understanding of whole metabolic networks is a prerequisite to rational editing of genomes or design of biosynthesis pathways (Campbell et al., 2017). Metabolic engineers paid efforts to interpret cellular phenomena at a systems level by measuring various cellular components including RNAs, proteins, and metabolites (Figure 2B). There are successful examples of terpenoid production driven by systems biology to debottleneck synthesis pathway (Alonso-Gutierrez et al., 2015; Li et al., 2017; Wada et al., 2017). An integrated approach of multi-level Omics data has been pursued to obtain a desirable phenotype of host strain for production, because a genetic manipulation may have positive impact at one metabolic layer but a negative or neutral impact at another (Goh and Wong, 2016; Lechner et al., 2016). IPP toxicity always challenges the engineered microbial systems for terpenoid production. By multi-level Omics-integrated analysis, formation of isoprenyl-ATP analog is recognized as a cause of the IPP toxicity, which suggests potential engineering strategies for terpenoids production from E. coli (George et al., 2018).

테르페노이드 생산을 위한 게놈 수준 공학

호스트 균주의 대사 네트워크 재구성은, 호스트의 대사 특성으로 인해 설계된 생산 경로의 잠재력이 제한될 때 제품 합성을 위한 설계 경로의 완전한 성능 발휘를 위해 필요하다. 대장균과 효모에서 게놈 공학을 위한 다양한 유전적 도구가 이용 가능하다. 유전자 부분의 삭제 및 교체를 위한 가장 널리 사용되는 방법은 동종 재조합이다. 글리세랄데히드-3-인산 합성효소(GAPAS) 발현을 억제하여 글리세랄데히드-3-인산과 피루브산 공급을 재조정함으로써, E. coli에서 MEP 경로를 통한 라이코펜 생산량을 2배 증가시켰다(Jung et al., 2016). S. cerevisiae에서 중심 경로를 재구성하여 탄소 및 ATP 손실을 줄인 아세틸-CoA 합성을 가능하게 했다. 아세틸-CoA가 MVA 경로의 기질이었기에, S. cerevisiae의 중심 탄소 대사 재구성은 파네센 생산량을 25% 증가시키고 산소 요구량을 75% 감소시키는 결과를 가져왔다(Meadows et al., 2016). 다중 자동화 게놈 공학(MAGE)과 같이 여러 게놈 위치를 동시에 표적화하거나, 군집화 규칙 간격 단일 회문 반복(CRISPR)/Cas9 시스템을 기반으로 흉터 없이 특정 게놈 위치를 정밀하게 편집하는 게놈 공학 도구가 개발되었다(그림 2A). MAGE는 E. coli에서 라이코펜 생산을 위한 MEP 경로 최적화에 적용되었다(Wang et al., 2009). 수정된 MAGE 방법은 S. cerevisiae에서 β-카로틴 생산에도 성공적으로 적용되었다(Barbieri et al., 2017). MAGE는 게놈 내에서 방대한 조합적 변이체를 생성하므로, 원하는 형질을 가진 변이체를 선별할 수 있는 고효율 스크리닝(색도계 또는 형광) 시스템과 결합될 때만 효과적인 게놈 공학 도구가 될 수 있다. 또한 MAGE를 통해 큰 유전적 부분(>1 kb)을 게놈에 통합하는 것은 어렵습니다. CRISPR/Cas9는 현재 정밀한 게놈 편집을 위한 강력하고 널리 사용되는 유전적 도구입니다(Jiang et al., 2013; Jessop-Fabre et al., 2016). 가이던스 RNA(gRNA)와 결합된 엔도뉴클레이스 Cas9는 게놈 내 표적 부위를 특이적으로 인식하여, 위치 특이적 뉴클레오티드 염기쌍 돌연변이, 유전자 삭제 또는 대규모 DNA 단편(최소 약 8kb) 삽입을 촉진한다(그림 2A). β-카로틴 합성 경로는 CRISPR/Cas9 기반 방법으로 E. coli 게놈에 통합되었다. 공학적으로 개량된 균주에서 MEP 경로와 중심 대사 경로가 모두 최적화되었으며, 최종 균주는 공급배양(fed-batch) 방식으로 배양되어 2.0 g/L의 β-카로틴을 생산하였다(Li et al., 2015). CRISPR/Cas9를 이용한 표적 마커리스 통합을 위해 Y. lipolytica의 일련의 게놈 위치를 확인하였다(Schwartz et al., 2017). CRISPR/Cas9 기반의 S. cerevisiae에서 다중 게놈 규모 공학을 위한 자동화 플랫폼도 개발되었다(Si et al., 2017). 플라스미드 기반 생산 경로 발현은 플라스미드의 분리적 또는 구조적 불안정성 문제를 지니며, 이는 숙주 세포에 대한 억제성 생성물이 존재할 경우 더욱 악화된다. 게다가 플라스미드 손실 방지를 위해 숙주 세포에 선택 압력을 가하기 위해 고가의 항생제가 필요하며, 이는 생산 비용을 증가시킵니다. 그러나 생산 경로의 게놈 기반 발현은 항생제 사용 없이 안정적이고 재현 가능한 생산을 가능하게 하여 산업적 대규모 생산에 중요합니다. MVA 경로의 상부 구간은 E. coli의 adhE 및 ldhA 유전자 위치에 통합되었으며, 당분해 속도 증대를 위해 atpFH 유전자가 삭제되었습니다. 유전체 공학적으로 개량된 균주는 48시간의 쉐이킹 플라스크 배양 후 높은 생산성(∼1.01 g/L/h)과 수율(이론 수율의 86.1%)을 모두 나타냈다(Wang J. et al., 2016). 그러나 유전체 통합 생산 경로의 공학화는 플라스미드 기반 공학에 비해 번거로운 작업이다. 플라스미드는 유전자 용량을 조절하고 다양한 유전자 발현 카세트를 구축하는 데 더 쉽고 편리합니다. 생산 경로 최적화를 위한 게놈 수준 공정은 CRISPR/Cas9 기반의 편리한 염색체 프로모터 변경으로 용이해졌으며, 이는 E. coli에서 비사볼렌 합성에 성공적으로 적용되었다(Alonso-Gutierrez et al., 2018). 이종 MEP 경로가 내인성 MVA 경로와 함께 S. cerevisiae 게놈에 통합되었다. MEP 경로는 산화 환원 상태를 유지하기 위해 산화해야 하는 추가 NADH를 생성하지 않으므로, 이 공학화된 효모는 저산소 조건에서 테르페노이드 생합성을 위해 MVA 경로 대신 MEP 경로에만 의존할 수 있게 되었습니다(Kirby et al., 2016). 미토콘드리아 표적 신호 서열이 부착된 MVA 경로 유전자를 S. cerevisiae 게놈에 통합하여, 세포질 내재적 MVA 경로와 공학적으로 설계된 외인성 미토콘드리아 MVA 경로를 통해 세포질 및 미토콘드리아 아세틸-CoA를 모두 활용할 수 있게 하였다. 개량된 효모는 미토콘드리아 MVA 경로를 통해 이소프렌을 2.5 g/L 생산하여 1.6배 증가시켰다(Lv et al., 2016). 전체 대사 네트워크에 대한 포괄적 이해는 게놈의 합리적 편집이나 생합성 경로 설계의 전제조건이다(Campbell et al., 2017). 대사공학자들은 RNA, 단백질, 대사산물 등 다양한 세포 구성 요소를 측정하여 시스템 수준에서 세포 현상을 해석하기 위해 노력해왔다(그림 2B). 합성 경로의 병목 현상을 해소하기 위해 시스템 생물학을 활용한 테르페노이드 생산의 성공 사례가 존재한다(Alonso-Gutierrez et al., 2015; Li et al., 2017; Wada et al., 2017). 생산에 적합한 숙주 균주의 바람직한 표현형을 얻기 위해 다중 수준의 오믹스 데이터를 통합하는 접근법이 추구되어 왔다. 유전자 조작은 한 대사 계층에서는 긍정적 영향을 미칠 수 있지만 다른 계층에서는 부정적이거나 중립적인 영향을 미칠 수 있기 때문이다(Goh and Wong, 2016; Lechner et al., 2016). 테르페노이드 생산을 위한 공학화된 미생물 시스템은 항상 IPP 독성에 직면한다. 다단계 오믹스 통합 분석을 통해 이소프렌릴-ATP 유사체 형성이 IPP 독성의 원인으로 확인되었으며, 이는 E. coli를 이용한 테르페노이드 생산을 위한 잠재적 공학적 전략을 제시한다(George et al., 2018).

FIGURE 2.

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Strain manipulation by genome editing (A), integrated-omics (B), and consortia process (C). Host genome can be evolved by either random (e.g., MAGE) or rational engineering (e.g., Cas9-CRISPR). The integrated-omics approaches can comprehensively elucidate host metabolism, which benefit strain manipulation. The microbial consortia process divides a long complicated pathway into a few short simple pathways, dispersed among microbes in the consortia. It can be built in the same species (homo-consortia) or the different species (hetero-consortia).

Consortia Process for Production of Terpenoids

Complicated structures of terpenoids are often a hurdle of the production using a single microbe. As E. coli is generally not a tractable host for P450 chemistry, it is difficult to produce terpenoids decorated by P450 from E. coli. Although an oxygenated taxanes is produced in E. coli with optimization of P450 expression‎ and its reductase partner interaction (Biggs et al., 2016), it requires lots of elaborate endeavors and cannot be copied into an engineering of other P450s. It would be beneficial to engineer multiple organisms to carry out a complicated task together rather than an engineering of a single organism alone (Hays et al., 2015). With greater understanding of microbial traits, coordinated microbial consortia can be designed and built to address complex tasks. Expansion of metabolic capacities and improvement of production yields could be attained in the synthetic microbial communities along with simplification of engineering of a complicated long pathway to a few simple shorter pathways distributed in the community microbes. The synthetic microbial consortia can be classified an intraspecies homo-consortia and an interspecies hetero-consortia, of which each strain is assigned an individual role toward product synthesis (Figure 2C). A key issue of synthetic microbial consortia engineering is to balance each microbial population for a successful collaboration to attain the goal (Johns et al., 2016). In order to produce acetylated taxanes, the entire pathway was divided into taxadiene synthesis expressed in E. coli and P450 modification in S. cerevisiae (Zhou et al., 2015). E. coli was engineered to use xylose, but produce a wasteful acetate, while auxotrophic S. cerevisiae assimilated solely acetate for cell growth in presence of xylose as a sole carbon source. The mutualistic consortium could maintain a population balance of the co-cultured strains and doubled the production in comparison with a co-culture using glucose. Deeper understanding of autotrophy, interspecies cross-feed, and QS machinery would provide more exquisite approaches for production of complicated terpenoids using synthetic microbial consortia.

테르페노이드 생산을 위한 군집 공정

테르페노이드의 복잡한 구조는 단일 미생물을 이용한 생산의 장애물이 되는 경우가 많다. 대장균(E. coli)은 일반적으로 P450 화학 반응에 적합한 숙주가 아니므로, 대장균에서 P450에 의해 수식된 테르페노이드를 생산하기는 어렵다. 비록 산소화 택산이 P450 발현과 그 환원효소 파트너 상호작용의 최적화를 통해 대장균에서 생산되기는 하지만(Biggs et al., 2016), 이는 많은 정교한 노력이 필요하며 다른 P450의 공학화에 복제될 수 없다. 단일 미생물만을 공학화하기보다는 여러 유기체를 공학화하여 복잡한 작업을 함께 수행하도록 하는 것이 유리할 것이다(Hays et al., 2015). 미생물 특성에 대한 이해가 깊어짐에 따라, 복잡한 작업을 해결하기 위해 협응력 있는 미생물 군집을 설계하고 구축할 수 있다. 합성 미생물 군집에서는 대사 능력 확장 및 생산 수율 향상을 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 복잡한 긴 경로를 군집 내 미생물들에 분산된 몇 개의 단순한 짧은 경로로 단순화하는 공학적 설계가 가능해진다. 합성 미생물 군집은 동종 군집(종 내 동종 군집)과 이종 군집(종 간 이종 군집)으로 분류될 수 있으며, 각 균주는 제품 합성을 위한 개별 역할을 부여받는다(그림 2C).합성 미생물 군집 공학의 핵심 과제는 목표 달성을 위한 성공적인 협력을 위해 각 미생물 군집 간의 균형을 맞추는 것이다(Johns et al., 2016). 아세틸화 택산 생산을 위해 전체 경로는 E. coli에서 발현되는 택사디엔 합성과 S. cerevisiae에서의 P450 변형으로 분할되었다(Zhou et al., 2015). E. coli는 자일로스(xylose)를 이용하도록 설계되었으나, 비효율적인 아세테이트(acetate)를 생산하는 반면, 영양소 결핍성(auxotrophic) S. cerevisiae는 자일로스를 유일한 탄소원으로 존재하는 환경에서 세포 성장에 아세테이트만을 동화시켰다. 상호공생 컨소시엄은 공배양 균주의 개체군 균형을 유지할 수 있었으며, 포도당을 이용한 공배양 대비 생산량을 두 배로 증가시켰다. 자영영양, 종간 교차 공급, 퀀텀 시그널링(QS) 기전에 대한 심층적 이해는 합성 미생물 컨소시엄을 활용한 복잡한 테르페노이드 생산을 위한 정교한 접근법을 제공할 것이다.

Conclusion

Currently, many enabling technologies of synthetic biology allow us to tailor microbes for terpenoids production. Among the microbial species, E. coli, and yeasts have proved as the most attractive microbial platform, which can be conveniently developed to generate either bulk or value-added terpenoids owing to versatile enabling technologies for the microbes. A great potential of E. coli and yeasts as platform strains has been demonstrated with many successes of synthetic pathway rewiring, genome editing, and microbial consortia building for improvement of production. With deeper understanding of their metabolism, more promising approaches are expected to boost production of terpenoids in E. coli and yeasts.

결론

현재 합성생물학의 다양한 기반 기술들은 테르페노이드 생산을 위해 미생물을 맞춤 설계할 수 있게 한다. 미생물 종 중 E. coli와 효모는 다용도 기반 기술을 통해 대량 또는 고부가가치 테르페노이드 생산을 편리하게 개발할 수 있는 가장 매력적인 미생물 플랫폼으로 입증되었다. 생산성 향상을 위한 합성 경로 재구성, 게놈 편집, 미생물 군집 구축 등 수많은 성공 사례를 통해 E. coli와 효모의 플랫폼 균주로서의 큰 잠재력이 입증되었다. 이들의 대사에 대한 이해가 깊어질수록 E. coli와 효모에서의 테르페노이드 생산을 촉진할 더 유망한 접근법이 기대된다.

Author Contributions

CW and S-WK developed the ideas and drafted the manuscript. ML, J-BP, and S-HJ collected the literatures and drew the figures. GW, YW, and S-WK professionally edited the manuscript.

Conflict of Interest Statement

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Acknowledgments

CW would like to thank the support of the China Postdoctoral Science Foundation (2017M610350). CW and GW also thanked a project funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Funding. This work was supported by C1 Gas Refinery Program through the NRF funded by the MSIP (NRF-2016M3D3A1A01913246) and a grant from the Next-Generation BioGreen 21 Program (SSAC, grant#: PJ01326501), RDA, Korea. J-BP and S-HJ were supported by scholarships from the BK21 Plus Program, MEST, Korea.

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http://investors.amyris.com/press-releases

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