Re: B. subtilis 명확한 유전적 배경, 다양한 유전자 조작 시스템을 갖춘 박테리아

[문형철]

• Review
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• Published: 03 September 2020

Bacillus subtilis: a universal cell factory for industry, agriculture, biomaterials and medicine

• Yuan Su, 
• Chuan Liu, 
• Huan Fang & 
• Dawei Zhang 

Microbial Cell Factories volume 19, Article number: 173 (2020) Cite this article

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Abstract

Due to its clear inherited backgrounds as well as simple and diverse genetic manipulation systems, Bacillus subtilis is the key Gram-positive model bacterium for studies on physiology and metabolism. Furthermore, due to its highly efficient protein secretion system and adaptable metabolism, it has been widely used as a cell factory for microbial production of chemicals, enzymes, and antimicrobial materials for industry, agriculture, and medicine. In this mini-review, we first summarize the basic genetic manipulation tools and expression‎ systems for this bacterium, including traditional methods and novel engineering systems. Secondly, we briefly introduce its applications in the production of chemicals and enzymes, and summarize its advantages, mainly focusing on some noteworthy products and recent progress in the engineering of B. subtilis. Finally, this review also covers applications such as microbial additives and antimicrobials, as well as biofilm systems and spore formation. We hope to provide an overview for novice researchers in this area, offering them a better understanding of B. subtilis and its applications.

초록

명확한 유전적 배경과 단순하면서도 다양한 유전자 조작 시스템을 갖춘

Bacillus subtilis는

생리학 및 대사 연구를 위한 핵심 그람 양성 모델 미생물입니다.

clear inherited backgrounds as well as simple and diverse genetic manipulation systems, 

Bacillus subtilis is the key

Gram-positive model bacterium for studies on physiology and metabolism

또한 고효율 단백질 분비 시스템과 적응성 높은 대사 특성 덕분에

산업, 농업, 의학 분야의 화학물질, 효소, 항균 물질 생산을 위한

미생물 공장으로서 널리 활용되고 있습니다.

본 미니 리뷰에서는

먼저 전통적 방법과 새로운 공학 시스템을 포함한

이 균주의 기본 유전자 조작 도구 및 발현 시스템을 요약한다.

둘째,

화학물질 및 효소 생산에서의 응용을 간략히 소개하고,

주목할 만한 제품과 B. subtilis 공학 분야의 최근 진전을 중심으로 그 장점을 종합한다.

마지막으로

미생물 첨가제 및 항균제, 생물막 시스템, 포자 형성 등의 응용 분야도 다룬다.

본 분야 초보 연구자들에게 개요를 제공하여

B. subtilis와 그 응용에 대한 이해를 높이는 데 기여하고자 한다.

Introduction

Bacillus subtilis is an aerobic, Gram-positive soil bacterium, which has been widely used for the production of heterologous proteins [1]. It secretes numerous enzymes to degrade a variety of substrates, enabling the bacterium to survive in a continuously changing environment. This species and some of its close relatives have excellent protein secretion ability, making them important hosts for the production of medicinal proteins and industrial enzymes. For these reasons, it has been widely used to produce heterologous proteins. Moreover, it has excellent physiological characteristics and highly adaptable metabolism, which makes it easy to cultivate on cheap substrates. Accordingly, B. subtilis grows fast and the fermentation cycle is shorter, usually, around 48 h, while the fermentation cycle of Saccharomyces cerevisiae is around 180 h [2, 3]. Furthermore, excellent expression‎ systems with good genetic stability are available for this organism, and it has no strong codon preference. Different from Escherichia coli, B. subtilis has a single cell membrane, which facilitates protein secretion, simplifies downstream processing, and reduces the process costs. Finally, this species is generally recognized as safe (GRAS) [4, 5].

서론

Bacillus subtilis는

호기성 그람 양성 토양 세균으로,

이종 단백질 생산에 널리 활용되어 왔다[1].

이 균주는 다양한 기질을 분해하기 위해

다수의 효소를 분비하여 지속적으로 변화하는 환경에서 생존할 수 있다.

이 종과 그 근연종들은 우수한 단백질 분비 능력을 지녀

의약 단백질 및 산업용 효소 생산의 중요한 숙주 역할을 한다.

이러한 이유로 이 균주는

이종 단백질 생산에 널리 활용되어 왔다.

또한 우수한 생리적 특성과 높은 적응성을 지닌 대사 체계로 인해

저렴한 기질에서도 쉽게 배양할 수 있다.

이에 따라 B. subtilis는

빠르게 성장하며 발효 주기가 짧아 보통 약 48시간이 소요되는 반면, 

Saccharomyces cerevisiae의 발효 주기는 약 180시간이다[2, 3].

또한 이 미생물은

우수한 유전자 안정성을 지닌 발현 시스템을 활용할 수 있으며,

강한 코돈 선호도가 없습니다. 

Escherichia coli와 달리 B. subtilis는

단일 세포막을 지녀 단백질 분비를 용이하게 하고,

다운스트림 가공을 단순화하며 공정 비용을 절감합니다.

마지막으로,

이 종은 일반적으로 안전하다고 인정되는 물질(GRAS)로 분류됩니다[4, 5].

Over the decades of research, many different tools for genetic modification of B. subtilis have been developed, including the classical counter-selection marker strategies and recently developed clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9/Cpf1 based tool box. Its diverse protein secretion systems, as well as the recently developed artificial promoter and ribosome binding site (RBS) libraries are also helpful in the production of extracellular enzymes. The newly discovered expression‎ cassette integration (MEXI) method based on the mariner transposon can produce knock-in mutants with higher levels of intracellular GFP and extracellular AprE expression‎ than the commonly used amyE integration method [6], thus improving the production of heterologous proteins. In addition to being an excellent host in bioreactors, B. subtilis is an ideal multifunctional probiotic, with great potential for preventing the growth of pathogenic bacteria and enhancing nutrient assimilation [7]. B. subtilis is also commonly used as an industrial cell factory, for the production of vitamins, inositol, acetoin, hyaluronan, and other chemicals. Its clear inherited backgrounds and well-developed gene manipulation tools enabled the reconstruction of its cellular metabolism, and the availability of public knockout collections makes them attractive as metabolic engineering hosts [8]. Yang Gu et al. redesigned the central carbon and redox metabolism of B. subtilis with a new “push-pull promote” approach, through which they manipulated the central carbon metabolism, eliminated the metabolic overflows, and achieved high production of N-acetylglucosamine (GlcNAc) [9]. In agriculture, studies have shown that adding an appropriate amount of B. subtilis can significantly improve the humus and carbon content of compost, thus improving soil quality and promoting crop growth [10]. B. subtilis can also form complex biofilms, which can be used as living biological materials for the production of many functional biomaterials, such as surface growth factors, antibiotics, lysozyme, and antimicrobial peptides for medical materials.

In this paper, we reviewed recent progress in the metabolic engineering and protein expression‎ systems, as well as industrial, agricultural, and biomaterial applications of B. subtilis. Finally, we analyzed the factors that hinder the further application of this strain and discussed the reasons. This review provides a reference for researchers who want to gain a general understanding of B. subtilis and its various applications (Fig. 1).

수십 년간의 연구를 통해

B. subtilis의 유전자 변형을 위한 다양한 도구들이 개발되었으며,

여기에는 고전적인 역선택 마커 전략과

최근 개발된 군집적 규칙적 간격 단편 회문 반복(CRISPR)-Cas9/Cpf1 기반 도구 상자가 포함됩니다.

또한 다양한 단백질 분비 시스템과

최근 개발된 인공 프로모터 및 리보솜 결합 부위 라이브러리 역시

세포외 효소 생산에 유용합니다.

마리너 트랜스포존 기반의 새로 발견된 발현 카세트 통합(MEXI) 방법은

일반적으로 사용되는 amyE 통합 방법[6]보다

높은 수준의 세포내 GFP 및 세포외 AprE 발현을 가진 녹인 돌연변이를 생성할 수 있어

이종 단백질 생산을 향상시킵니다.

생물반응기에서 우수한 숙주일 뿐만 아니라,

B. subtilis는 병원성 세균의 성장을 억제하고

영양소 동화 및 흡수 능력을 향상시키는 데 큰 잠재력을 지닌

이상적인 다기능 프로바이오틱스입니다 [7].

B. subtilis는 또한

비타민, 이노시톨, 아세토인, 히알루론산 및 기타 화학 물질 생산을 위한

산업용 세포 공장으로 흔히 사용됩니다.

명확한 유전적 배경과 잘 발달된 유전자 조작 도구를 통해

세포 대사를 재구성할 수 있으며,

공개된 녹아웃 컬렉션의 가용성으로 인해 대사 공학 호스트로서 매력적입니다 [8].

양구(Yang Gu) 등은 새로운 “푸시-풀 촉진(push-pull promote)” 접근법을 통해 B. subtilis의 중심 탄소 및 산화환원 대사를 재설계하였습니다. 이를 통해 중심 탄소 대사를 조작하고 대사 유출을 제거하며 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 고생산성을 달성하였습니다 [9]. 농업 분야에서는 적절한 양의 B. subtilis를 첨가하면 퇴비의 부식질 및 탄소 함량을 크게 향상시켜 토양 품질을 개선하고 작물 생장을 촉진할 수 있다는 연구 결과가 있다[10].

B. subtilis는 또한 복잡한 생물막을 형성할 수 있으며,

이는 표면 성장 인자, 항생제, 리소자임, 의료용 항균 펩타이드 등

다양한 기능성 생체 재료 생산을 위한 생체 재료로 활용될 수 있다.

본 논문에서는

B. subtilis의 대사 공학 및 단백질 발현 시스템,

산업·농업·생체재료 응용 분야의 최근 진전을 검토하였다.

마지막으로 이 균주의 추가적 응용을 저해하는 요인을 분석하고

그 원인을 논의하였다.

본 리뷰는 B. subtilis와 그 다양한 응용 분야에 대한 전반적 이해를 원하는

연구자들에게 참고자료를 제공한다(그림 1).

Fig. 1

유전자 공학, 산업용 화학물질 또는 효소 생산, 농업, 의학 및 생체재료 분야에서의 B. subtilis 응용.

Application of B. subtilis for genetic engineering, production of industrial chemicals or enzymes, agriculture, medicine and biomaterials. The CRISPR/cas9 tool has been widely used in the genetic engineering of B. subtilis. The bacterium can be used to produce various industrial enzymes, such as α-amylase, xylanase, lichenase, lipase, cellulase, or pectinase. It can also be used to produce various chemicals, such as riboflavin, menaquinone-7, inositol, or N-acetylglucosamine. In agriculture, it can be used as a feed additive. Biofilms of B. subtilis can be used as a biomaterial in 3D printing. In medicine, B. subtilis can be used to produce vaccines

유전자 공학, 산업용 화학물질 또는 효소 생산, 농업, 의학 및 생체재료 분야에서의 B. subtilis 응용.

CRISPR/cas9 도구는

B. subtilis의 유전자 공학에 널리 사용되어 왔다.

이 균주는

α-아밀라아제, 자일라나아제, 리케나아제, 리파아제, 셀룰라아제, 펙티나아제 등

다양한 산업용 효소 생산에 활용될 수 있다.

또한 리보플라빈, 메나퀴논-7, 이노시톨, N-아세틸글루코사민 등

다양한 화학물질 생산에도 사용 가능하다.

농업 분야에서는 사료 첨가제로 활용될 수 있다.

B. subtilis의 생체막은 3D 프린팅용 생체재료로 사용될 수 있다.

의학 분야에서는 B. subtilis를 이용한 백신 생산이 가능하다.

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Genetic manipulation of Bacillus subtilis

As B. subtilis was selected as a model bacterium, simple and efficient genetic tools have been developed in the past decades. Classical genome modification relies on the insertion of a selectable marker, usually an antibiotic resistance gene, into the chromosome of the target strain [11]. The most commonly used scarless genetic manipulations systems for B. subtilis rely on counter-selectable markers (CSM) [12], while other methods include site-specific recombination systems (SSR) [13], and the recently developed CRISPR-Cas9 system [14].

CSM are often used for the markerless construction of engineered strains and have been used to construct Bacillus cell factories for various industrial applications. Selectable markers can generally be divided into positive and negative selection markers, whereby the former are most commonly antibiotic-resistance markers. In this classical approach, antibiotic-resistant strains are selected on appropriate agar plates (Fig. 2). In addition to the genomically integrated markers, Jeong et al. constructed a synthetic gene circuit consisting of a plasmid-based selection system, in which the Pxyl-lacI and neomycin resistant gene (neo) are integrated into the genome, while a Pspac-chloramphenicol (cat) resistant cassette and xylR gene are on the plasmid. In the first recombination, Pxyl-lacI and neo are integrated into the genome as a selectable marker. When xylose is added to the medium, the lacI gene is expressed then the chloramphenicol resistant gene is repressed. Consequently, the cell will survive only when the Pxyl-lacI and neo are deleted through a second round of recombination. Finally, the plasmid can be removed after several rounds of culture without chloramphenicol [15]. This is a highly efficient method for genome engineering in B. subtilis, and it avoids the introduction of a selectable marker into the genome or the tightly controlled expression‎ of a toxic gene. Other counter-selectable markers commonly used in B. subtilis include upp, blaI, araR, and hewI [11]. Fabret et al. used the upp gene, which encodes uracil phosphoribosyltransferase as a counter-selection marker to achieve the transmission of unlabeled point mutations, in-frame deletions and large numbers of deletions on the chromosome [16]. Brans et al. developed another method to knock out a single gene and introduce a new gene by combining the use of blaI, an antibiotic resistance gene, which encodes a repressor of the Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase, with a conditional lysine-auxotrophic B. subtilis strain [17]. However, CSM-based strategies require host pre-modification and have a low success rate due to the leaky expression‎ of the CSM.

Bacillus subtilis의 유전자 조작

B. subtilis가

모델 미생물로 선정되면서

지난 수십 년간 단순하고 효율적인 유전자 조작 도구가 개발되었다.

전통적인 게놈 변형은

표적 균주의 염색체에 선택적 마커(일반적으로 항생제 내성 유전자)를 삽입하는 방식에 의존합니다[11].

B. subtilis에 가장 널리 사용되는 무흉터 유전자 조작 시스템은

역선택 마커(CSM)에 기반합니다[12].

다른 방법으로는

위치 특이적 재조합 시스템(SSR)[13]과 최근 개발된 CRISPR-Cas9 시스템[14]이 있습니다.

CSM은 흔히 마커 없는 공학 균주 구축에 사용되며,

다양한 산업적 응용을 위한 Bacillus 세포 공장 구축에 활용되어 왔다.

선택 마커는 일반적으로 양성 선택 마커와 음성 선택 마커로 구분되며,

전자는 대부분 항생제 내성 마커이다.

이 고전적 접근법에서는

항생제 내성 균주가 적절한 한천 배지에서 선별된다(그림 2).

게놈에 통합된 마커 외에도,

정 등은 플라스미드 기반 선택 시스템으로 구성된 합성 유전자 회로를 구축했는데,

여기서는 Pxyl-lacI 및 네오마이신 내성 유전자(neo)가 게놈에 통합되고,

Pspac-클로람페니콜(cat) 내성 카세트와 xylR 유전자는 플라스미드에 위치한다.

첫 번째 재조합에서 Pxyl-lacI 및 neo는 선택 마커로 게놈에 통합된다. 배지에 자일룰을 첨가하면 lacI 유전자가 발현되어 클로람페니콜 내성 유전자가 억제된다. 결과적으로, 두 번째 재조합을 통해 Pxyl-lacI와 neo가 삭제될 때만 세포가 생존한다. 결국 클로람페니콜 없이 여러 번 배양한 후 플라스미드를 제거할 수 있다[15]. 이는 B. subtilis의 게놈 공학에 매우 효율적인 방법으로, 게놈에 선택 마커를 도입하거나 독성 유전자의 발현을 엄격히 제어할 필요가 없다. B. subtilis에서 흔히 사용되는 다른 역선택 마커로는 upp, blaI, araR, hewI 등이 있다 [11]. Fabret 등은 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제를 암호화하는 upp 유전자를 역선택 마커로 사용하여 표지되지 않은 점 돌연변이의 전이, [16]. Brans 등은 Bacillus licheniformis BlaP β-락타마제의 억제제를 암호화하는 항생제 내성 유전자 blaI와 조건부 라이신 자생불능성 B. subtilis 균주를 결합하여 단일 유전자 녹아웃 및 신규 유전자 도입을 위한 또 다른 방법을 개발하였다 [17]. 그러나 CSM 기반 전략은 숙주 사전 변형이 필요하며, CSM의 누출 발현으로 인해 성공률이 낮다.

Fig. 2

Schematic overview of genome editing methods based on counter-selectable markers. Left: genome editing (gene knockout as an example) with two integration steps. Step 1, an exogenous artificial DNA (plasmid or fragment) with up- and downstream homologous sequences is integrated into the genome, replacing the target gene. The recombinant clone can be selected under condition A. Step 2, under the selection condition B, the clone obtained in step 1 deleted the selectable marker and repressor/toxin gene through a self-recombination with the DR (direct repeats). Right: Composition of the selectable elements, the selectable marker A, toxin gene/repressor, and up- and downstream homologous sequences of the target gene can be constructed as fragments or on a plasmid. Examples of selectable markers A include: cat (chloramphenicol), phleo (phleomycin), or spe (spectinomycin). Examples of toxic genes include: upp, pyrF, or mazF. Examples of repressor genes include: xylR, blaI, araR, or lacI. The repressor can inhibit the expression‎ of the selectable marker B, which can be integrated into the genome or a plasmid

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Site-specific recombination (SSR) systems are powerful tools for precise excision of DNA fragments. These systems, such as FLP/FRT [18] and Cre/loxP [13], have much higher recombination efficiency than the endogenous recombination systems, making them an ideal tool for many genetic manipulations. By combining a mutated Cre/lox system with the long segment fusion PCR method [19], Yan et al. developed a rapid and accurate B. subtilis genome engineering tool that allows operations such as targeted gene inactivation, long-fragment deletion, and in-frame deletion of target genes [13].

In recent years, the application of the CRISPR-related (Cas) system in B. subtilis has further enriched the gene editing toolbox. The CRISPR locus is first transcribed into a precursor CRISPR ribonucleic acid (pre-crRNA), which is then cut into small RNA units under the action of Cas protein or endonuclease. These small RNA units are mature crRNAs that contain spacer sequences and partial repeat sequences. Maturation of the crRNAs of type II CRISPR/Cas systems requires not only the participation of Cas9 and RNase, but also the guidance of a tracrRNA [20]. Mature crRNAs and tracrRNA form double-stranded RNA structures through complementary base pairing. The resulting duplexes bind Cas9 protein to form a targeted cutting complex, specifically cutting foreign sequences to achieve the goal of identifying and eliminating invading foreign genes such as plasmids and viruses [21,22,23]. At present, there are three kinds of CRISPR/Cas9-based genome editing strategies widely used in B. subtilis. (1) The single-plasmid based system, in which Cas9, a single guide RNA (gRNA), donor DNA, and other elements are assembled into the same carrier skeleton, wherein Cas9 protein and gRNA are respectively expressed from inducible or strong constitutive promoters; (2) The two-plasmid-based system is more flexible than the single plasmid system. In this system, Cas9, gRNA, and donor DNA are assembled on two different plasmids, which are respectively used to produce Cas9 protein and deliver the gRNA transcription module and donor DNA template; (3) The chromosomally integrated system is more stable and effective than the first two systems, but it requires the use of engineered strains. The Cas9 was integrated into the genome, and then araE/R initiation subsystem was used to construct a multi-gRNA delivery vector [22]. Furthermore, this CRISPR-Cas9 toolkit was extended to CRISPR interference (CRISPRi) for transcriptional-level regulation [21]. The CRISPRi system is composed of a deactivated Cas9 (dCas9) protein and gRNA, enabling the targeting of dCsa9 to any target gene on the genome under the guidance of gRNA to inhibit its transcription without inducing a double-strand break, which can be applied to gene repression in metabolic engineering [24]. So et al. developed a CRISPR-derived genome engineering technique to efficiently generate large genomic deletions in B. subtilis without the introduction of counter-selectable markers such as antibiotic-resistance genes, which had previously limited the application of B. subtilis in food engineering [25]. This method has wide applicability for various types of site-directed mutagenesis in B. subtilis [24, 26, 27]. However, CRISPR/Cas9 has low efficiency in multi-gene editing. Liu et al. recently developed a CRISPR/Cas9n-mediated genome editing system, using Cas9n to exchange the natural Cas9 of existing constructs for B. subtilis and for iterative editing of the genome [28]. This system is more effective than CRISPR/Cas9 in various types of gene modification and shows higher efficiency for large genomic deletions or multiplex gene editing. In terms of multi-gene editing and regulation, the newly developed CRISPR/Cpf1 system is the most powerful tool in B. subtilis. Compared with CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1 has higher targeting specificity and can be used for gene editing in human cells, plant cells and many bacteria, while also offering a higher efficiency of multiplex gene editing [29]. In fact, the system provides up to 100% efficiency of double in-frame knockouts, enables the introduction of multiple point mutations (up to six) with 100% efficiency, and can be used to simultaneously activate and/or inhibit multiple genes [27].

특이적 재조합(SSR) 시스템은

DNA 단편을 정밀하게 절제하는 강력한 도구입니다.

FLP/FRT [18] 및 Cre/loxP [13]과 같은 이러한 시스템은 내인성 재조합 시스템보다 훨씬 높은 재조합 효율을 가지므로 많은 유전자 조작에 이상적인 도구입니다. 변이된 Cre/lox 시스템과 긴 단편 융합 PCR 방법[19]을 결합하여, Yan 등은 표적 유전자 불활성화, 긴 단편 삭제, 표적 유전자의 인프레임 삭제 등의 작업을 가능하게 하는 신속하고 정확한 B. subtilis 게놈 공학 도구를 개발했습니다[13].

최근 몇 년간

B. subtilis에서 CRISPR 관련(Cas) 시스템의 적용은

유전자 편집 도구 상자를 더욱 풍부하게 만들었다.

CRISPR 유전자좌는

먼저 전구체 CRISPR 리보핵산(pre-crRNA)으로 전사된 후,

Cas 단백질 또는 엔도뉴클레이제의 작용 하에 작은 RNA 단위로 절단된다.

이러한 작은 RNA 단위는

스페이서 서열과 부분 반복 서열을 포함하는 성숙 crRNA이다.

II형 CRISPR/Cas 시스템의 crRNA 성숙에는

Cas9 및 RNase의 참여뿐만 아니라

tracrRNA의 안내도 필요하다[20].

성숙된 crRNA와 tracrRNA는 상보적 염기 배열을 통해

이중가닥 RNA 구조를 형성한다.

생성된 이중나선은

Cas9 단백질과 결합하여 표적 절단 복합체를 형성하며,

외래 서열을 특이적으로 절단하여

플라스미드나 바이러스와 같은 침입 외래 유전자를 식별하고 제거하는 목표를 달성합니다[21,22,23].

현재 B. subtilis에서 널리 사용되는

CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 전략은

세 가지입니다.

(1) 단일 플라스미드 기반 시스템: Cas9, 단일 가이드 RNA(gRNA), 기증자 DNA 및 기타 요소가 동일한 운반체 골격에 조립되며, 여기서 Cas9 단백질과 gRNA는 각각 유도 가능 또는 강력한 구성적 프로모터로부터 발현됩니다;

(2) 이중 플라스미드 기반 시스템은 단일 플라스미드 시스템보다 더 유연합니다. 이 시스템에서는 Cas9, gRNA 및 기증자 DNA가 서로 다른 두 플라스미드에 조립되며, 각각 Cas9 단백질 생산과 gRNA 전사 모듈 및 기증자 DNA 템플릿 전달에 사용됩니다;

(3) 염색체 통합 시스템은 앞의 두 시스템보다 안정적이고 효과적이지만, 공학적으로 개량된 균주 사용이 필요하다. Cas9를 게놈에 통합한 후 araE/R 개시 하위 시스템을 활용하여 다중 gRNA 전달 벡터를 구축하였다[22]. 또한 이 CRISPR-Cas9 툴킷은 전사 수준 조절을 위한 CRISPR 간섭(CRISPRi)으로 확장되었다 [21]. CRISPRi 시스템은 비활성화된 Cas9(dCas9) 단백질과 gRNA로 구성되어 gRNA의 유도 하에 dCas9를 게놈상의 모든 표적 유전자에 결합시켜 이중 가닥 절단 없이 전사를 억제할 수 있으며, 이는 대사 공학에서의 유전자 억제에 적용될 수 있다[24].

So 등은 항생제 내성 유전자와 같은 역선택 마커를 도입하지 않고도 B. subtilis에서 대규모 게놈 결실을 효율적으로 생성하는 CRISPR 유래 게놈 공학 기술을 개발했습니다. 이는 이전까지 B. subtilis의 식품 공학 적용을 제한했던 요소였습니다[25]. 이 방법은 B. subtilis에서 다양한 유형의 위치 특이적 돌연변이 유발에 광범위하게 적용 가능합니다[24, 26, 27]. 그러나 CRISPR/Cas9는 다중 유전자 편집 효율이 낮다. Liu 등은 최근 Cas9n을 활용하여 기존 B. subtilis 구축체의 자연 Cas9를 대체하고 게놈 반복 편집을 수행하는 CRISPR/Cas9n 매개 게놈 편집 시스템을 개발하였다 [28].. 이 시스템은 다양한 유형의 유전자 변형에서 CRISPR/Cas9보다 효과적이며, 대규모 게놈 삭제나 다중 유전자 편집에서 더 높은 효율을 보인다.

다중 유전자 편집 및 조절 측면에서 새로 개발된 CRISPR/Cpf1 시스템은

B. subtilis에서 가장 강력한 도구이다.

CRISPR/Cas9에 비해 CRISPR/Cpf1은 표적 특이성이 더 높으며,

인간 세포, 식물 세포 및 많은 박테리아에서 유전자 편집에 사용할 수 있을 뿐만 아니라

다중 유전자 편집 효율도 더 높습니다 [29].

사실, 이 시스템은 최대 100%의 이중 인프레임 녹아웃 효율을 제공하고, 100%의 효율로 여러 점 돌연변이(최대 6개)를 도입할 수 있으며, 여러 유전자를 동시에 활성화 및/또는 억제하는 데 사용할 수 있습니다 [27].

Gene expression‎ in Bacillus subtilis

To enhance and appropriately adjust gene expression‎ levels in B. subtilis, it is essential to study the promoters that regulate transcription levels [30]. Inducible and constitutive promoters are usually applied for the expression‎ of heterologous genes in B. subtilis [31]. In addition to the promoters, the protein expression‎ level is also influenced by the strength of the ribosome binding site, while plasmids with different copy numbers also provide choices for adjusting the level of gene expression‎ [31]. Different genes have specific expression‎ features, and their expression‎ must be adjusted to a level appropriate for a specific metabolic pathway, which necessitates the use of promoters with different strengths for engineering purposes [32]. Researchers have broadened the scope of target gene transcription levels by constructing promoter libraries. In a recent study, Liu et al. constructed a synthetic promoter library with an intensity gradient by analyzing microarray transcriptome data of B. subtilis 168, which can be used for extensive fine-tuning of genetic pathways in B. subtilis, facilitating strain engineering and synthetic biology [33]. To enable the efficient and accurate co-expression‎ of multiple genes in metabolic networks, a recent review discussed the construction promoter libraries by site-directed mutagenesis [34], such as error-prone PCR, saturation mutagenesis and directional design. RBS sequences can be used to fine-tune gene expression‎ at the translational level. When inducible promoters are used, different ribosomal binding sites can be used to fine-tune the dynamic range of gene expression‎. In addition, a proteolysis tag can be used to control the degradation rate of a protein at the post-translational level [35]. A synthetic gene expression‎ toolbox consisting of promoter libraries, RBS libraries, and different proteolytic tags can realize gene regulation with a dynamic range of 5 orders of magnitude [36]. Other elements other than the promoter and RBS are also used to adjust gene expression‎ in B. subtilis. Tian et al. conducted and statistical analyzed 96 rationally selected N-terminal coding sequences (NCSs) from B. subtilis, which influenced gene expression‎ at the translation level. They found that NCS substitution is more efficient and convenient than promoter substitution for gene expression‎ improvement [37]. Naseri et al. discussed the construction of complex libraries and combinatorial optimization strategies. However, the examples shown in their review indicate that E.coli and S. cerevisiae are used as host more often than B. subtilis [38]. Therefore, future studies should focus on developing new tools for this important Gram-positive model bacterium.

Bacillus subtilis에서의 유전자 발현

B. subtilis에서

유전자 발현 수준을 향상시키고 적절히 조절하기 위해서는

전사 수준을 조절하는 프로모터 연구가 필수적이다[30].

B. subtilis에서 이종 유전자 발현에는

유도형 및 상시형 프로모터가 일반적으로 적용된다[31].

프로모터 외에도 리보솜 결합 부위의 강도가 단백질 발현 수준에 영향을 미치며,

서로 다른 복제 수를 가진 플라스미드 역시 유전자 발현 수준 조절을 위한 선택지를 제공한다[31].

서로 다른 유전자들은 리보솜 결합 부위의 강도에 의해 영향을 받으며, 서로 다른 복 [31]. 프로모터 외에도 단백질 발현 수준은 리보솜 결합 부위의 강도에 영향을 받으며, 복제수가 다른 플라스미드 역시 유전자 발현 수준 조절을 위한 선택지를 제공한다 [31]. 서로 다른 유전자들은 특정한 발현 특성을 가지며, 특정 대사 경로에 적합한 수준으로 발현을 조절해야 하므로, 공학적 목적으로 서로 다른 강도의 프로모터를 사용해야 한다 [32]. 연구자들은 프로모터 라이브러리 구축을 통해 표적 유전자 전사 수준 범위를 확장해 왔다. 최근 연구에서 Liu 등은 B. subtilis 168의 마이크로어레이 전사체 데이터를 분석하여 강도 그라데이션을 가진 합성 프로모터 라이브러리를 구축했으며, 이는 B. subtilis 내 유전자 경로의 광범위한 미세 조정에 활용되어 균주 공학 및 합성 생물학을 용이하게 한다 [33]. 대사 네트워크에서 다중 유전자의 효율적이고 정확한 공동 발현을 가능하게 하기 위해, 최근 리뷰에서는 오류 발생 가능성이 높은 PCR, 포화 돌연변이 및 방향성 설계와 같은 위치 특이적 돌연변이 유발을 통한 프로모터 라이브러리 구축을 논의하였다[34]. RBS 서열은 번역 수준에서 유전자 발현을 미세 조정하는 데 사용될 수 있다. 유도성 프로모터를 사용할 경우, 서로 다른 리보솜 결합 부위를 활용하여 유전자 발현의 동적 범위를 미세 조정할 수 있다. 또한, 단백질 분해 태그를 사용하여 번역 후 수준에서 단백질의 분해 속도를 제어할 수 있다[35]. 프로모터 라이브러리, RBS 라이브러리 및 다양한 단백질 분해 태그로 구성된 합성 유전자 발현 툴박스는 5차원의 동적 범위를 가진 유전자 조절을 실현할 수 있다[36]. 프로모터와 RBS 외의 다른 요소들도 B. subtilis에서 유전자 발현을 조절하는 데 사용됩니다.

Tian 등은

B. subtilis에서 합리적으로 선별한 96개의 N-말단 코딩 서열(NCS)을 실험 및 통계 분석하여

번역 수준에서 유전자 발현에 영향을 미쳤습니다.

그들은 유전자 발현 개선을 위해

NCS 치환이 프로모터 치환보다 더 효율적이고 편리하다는 것을

발견했습니다[37].

Naseri 등은

복합 라이브러리 구축 및 조합 최적화 전략을 논의하였다.

그러나 그들의 리뷰에 제시된 사례들은 E.coli와 S. cerevisiae가

B. subtilis보다 더 자주 숙주로 사용됨을 시사한다[38].

따라서

향후 연구는 이 중요한 그람 양성 모델 세균을 위한

새로운 도구 개발에 집중해야 한다.

Protein secretion systems of Bacillus subtilis

Bacillus subtilis has a strong capacity for protein expression‎ and secretion, which has led to its wide use in the production of industrial enzyme preparations. In addition to the abundant promoters and plasmid expression‎ systems described above, B. subtilis also has an efficient protein secretion system to meet the needs of the secretion of various proteins. There are three classical protein secretion pathways in B. subtilis, the general protein secretion pathway (Sec), the twin-arginine translocation pathway (Tat), and the ATP-binding cassette (ABC) transporters [39] (Fig. 3). The Sec pathway is the main transport channel, which can transport a large number of exported proteins. The essential elements of the Sec pathway are the signal recognition particle (SRP), Sec translocase, type I signal peptidase, and chaperones. After the synthesis of the precursor protein, there are two routes through the Sec pathway. In the first one, the signal peptide is recognized by the signal recognition particle (SRP) with the help of a cytoplasmic chaperone, and then transferred to the membrane to bind with FstY, the receptor protein of the SRP, and transported to the channel of the Sec translocase complex (translocation channel). The second route maintains the precursor protein’s translocation ability by preventing its complete folding using intracellular chaperones, and the it is then transfer to the Sec translocase complex. Next, the N-terminal signal peptide sequence is cut off by signal peptidases. Finally, the translocating protein is folded in the extracellular space with the aid of extracellular chaperones [30, 40]. In contrast to the Sec pathway, which relies on unfolded substrates, the Tat pathway transports tightly folded proteins that contain a conserved twin-arginine motif in the signal peptide sequences. Before translocation, the precursors fold in the cytoplasm with the help of cofactors, and are then excreted through the Tat protein complex (Tat translocase) utilizing energy from the pH gradient across the cytoplasmic membrane. After translocation, the type I signal peptidase processes the signal peptide, and finally, the folded mature proteins are secreted out of the cell. ATP-binding cassette (ABC) transporters contain two transmembrane domains (TMD) that define substrate binding sites, and two soluble nucleotide binding domains (NBD) that act as motor domains [30, 39]. They are relatively specific for their substrates and can export or import various molecules (ions, amino acids, peptides, antibiotics, polysaccharides, proteins, etc.) [39].

Bacillus subtilis의 단백질 분비 시스템

Bacillus subtilis는

강력한 단백질 발현 및 분비 능력을 지녀

산업용 효소 제제 생산에 널리 활용되고 있다.

앞서 설명한 풍부한 프로모터 및 플라스미드 발현 시스템 외에도,

B. subtilis는 다양한 단백질 분비 요구를 충족시키기 위한

효율적인 단백질 분비 시스템을 보유하고 있다.

B. subtilis에는

세 가지 고전적인 단백질 분비 경로가 존재한다:

일반 단백질 분비 경로(Sec),

트윈-아르기닌 전위 경로(Tat), 그리고

ATP 결합 캐스케이드(ABC) 수송체 [39] (그림 3).

Sec 경로는 주요 수송 경로로,

다량의 수출 단백질을 수송할 수 있다.

Sec 경로의 필수 요소로는

신호 인식 입자(SRP), Sec 전좌체, 제1형 신호 펩티다아제 및 샤페론이 있습니다.

전구체 단백질 합성 후 Sec 경로를 통해

두 가지 경로가 존재한다.

첫 번째 경로에서는

세포질 샤페론의 도움으로 신호 인식 입자(SRP)가 신호 펩타이드를 인식한 후,

SRP의 수용체 단백질인 FstY와 결합하기 위해 막으로 전달되어

Sec 전위체 복합체의 채널(전위 채널)로 수송된다.

두 번째 경로는

세포 내 분자 접힘 보조 단백질을 이용해 전구체 단백질의 완전한 접힘을 방지함으로써

전위 능력을 유지한 후 Sec 전위체 복합체로 전달됩니다.

이후 신호 펩티다제에 의해

N-말단 신호 펩타이드 서열이 절단됩니다.

마지막으로

전위 중인 단백질은

세포 외 분자 접힘 보조 단백질의 도움으로 세포 외 공간에서 접힙니다 [30, 40].

Sec 경로가 접히지 않은 기질에 의존하는 것과 달리,

Tat 경로는 신호 펩타이드 서열에 보존된 쌍아르기닌 모티프를 포함하는 단단히 접힌 단백질을 수송한다.

수송 전, 전구체는

보조인자의 도움으로 세포질 내에서 접힌 후, 세포질막을 가로지르는 pH 구배로부터 에너지를 활용하여

Tat 단백질 복합체(Tat 수송체)를 통해 분비된다.

수송 후, 제1형 신호 펩티다아제가 신호 펩타이드를 처리하고,

최종적으로 접힌 성숙 단백질이 세포 외부로 분비됩니다.

ATP 결합 캐스케이드(ABC) 수송체는

기질 결합 부위를 정의하는 두 개의 막 관통 도메인(TMD)과 모터 도메인 역할을 하는

두 개의 용해성 뉴클레오티드 결합 도메인(NBD)을 포함합니다[30, 39].

이들은 기질에 대해 상대적으로 특이적이며

다양한 분자(이온, 아미노산, 펩타이드, 항생제, 다당류, 단백질 등)를

수출하거나 수입할 수 있습니다[39].

Fig. 3

Schematic diagram of protein secretion pathways in B. subtilis. The mechanism of the non-classical secretion pathway is not clear

Full size image

In addition to the three classical protein secretion pathways mentioned above, researchers also found that many non-classical secretion pathways are used to secrete non-classical proteins lacking any known signal peptides or secretion motifs [41]. Wang et al. used four typical non-classical secretory proteins as signals to direct the export of the nucleoskeletal-like protein (Nsp) from B. subtilis cells. Two of them were able to guide the export of alkaline phosphatase (PhoA), and one of them was able to guide the secretion of the thermostable reporter protein β-galactosidase (BgaB) [42]. Chen et al. used d-psicose 3-epimerase (RDPE) to directly secrete two of five foreign proteins from other bacteria. The fusion proteins not only retained the corresponding enzymatic or biological activities, but also had the activity of RDPE [43] (Fig. 3).

위에서 언급한 세 가지 고전적 단백질 분비 경로 외에도,

연구자들은 알려진 신호 펩타이드나 분비 모티프가 전혀 없는

비고전적 단백질을 분비하기 위해 많은 비고전적 분비 경로가 사용된다는 사실을 발견했습니다[41].

Wang 등은 네 가지 전형적인 비고전적 분비 단백질을 신호로 사용하여 B. subtilis 세포에서 뉴클레오스켈레탈 유사 단백질(Nsp)의 수출을 유도했습니다. 그 중 두 개는 알칼리성 인산 가수분해 효소(PhoA)의 수출을 유도할 수 있었고, 하나는 내열성 리포터 단백질 β-갈락토시다아제(BgaB)의 분비를 유도할 수 있었다 [42]. Chen 등은 d-시코오스 3-에피머레이스(RDPE)를 사용하여 다른 박테리아에서 유래한 5개의 외래 단백질 중 2개를 직접 분비시켰습니다. 융합 단백질은 해당 효소적 또는 생물학적 활성을 유지할 뿐만 아니라 RDPE의 활성도 보유했습니다 [43] (그림 3).

Industrial application of chemicals produced by Bacillus subtilis

The industrial application of B. subtilis has developed rapidly in the last decades, and it has become the major microbial cell factory for many industrial products [44, 45], including enzymes [46], heterologous proteins [31], antibiotics [47], vitamins [48], and amino acids [26]. Chemicals produced by B. subtilis also play an important role in various fields, such as food, feed, cosmetics, chemicals, and pharmaceuticals. Here, we will focus on vitamins and other chemicals produced by B. subtilis, among which the vitamin B2, vitamin K, scyllo-inositol, hyaluronic acid, and N-acetylglucosamine will be discussed in detail. Table 1 also lists some other representative chemicals produced by B. subtilis.

Bacillus subtilis가 생산하는 화학 물질의 산업적 응용

B. subtilis의 산업적 응용은

지난 수십 년간 급속히 발전하여,

효소[46], 이종 단백질[31], 항생제[47], 비타민[48], 아미노산[26] 등

다양한 산업 제품의 주요 미생물 세포 공장으로 자리매김하였다[44, 45].

B. subtilis가 생산하는 화학 물질은

또한 식품, 사료, 화장품, 화학 제품 및 의약품과 같은 다양한 분야에서 중요한 역할을 합니다.

본고에서는

B. subtilis가 생산하는 비타민 및 기타 화학 물질에 초점을 맞추며,

그중 비타민 B2, 비타민 K, scyllo-inositol, 히알루론산, N-아세틸글루코사민에 대해 상세히 논의할 것이다.

표 1에는 B. subtilis가 생산하는 다른 대표적인 화학 물질들도 나열되어 있다.

Table 1 Representative chemicals produced by B. subtilis

ProductsStrainsCharacteristicsTiterReferences

Riboflavin	B. subtilis 125	The deregulation of the rib operon and purine de novo synthesis pathway	4232 ± 34.42 mg/L	[50]
Menaquinone-7	B. subtilis 20-QT	Co-overexpression‎ of tatAD-CD and qcrA-C	410 mg/L	[60]
Scyllo-Inositol	B. subtilis KU303	Deletion of iolABCDEF, iolHIJ, iolX and iolR, combined with the expression‎ of IolG, IolW, IolT and PntAB	27.6 g/L	[61]
Hyaluronic acid	B. subtilis E168TH	Expression‎ of hasA, tuaD, gtaB, glmU, glmM, glmS, and H6LHyal	19.38 g/ L	[64]
N-acetylglucosamine	B. subtilis 168 BNDR122	Deletion of nagP, gamP, gamA, gamR, nagA, nagB, ldh, alsRSD, pta, ackA, glcK, pckA, pyk, lacA and amyE, combined with the expression‎ of GNAI	131.6 g/L	[67]
Amorphadiene	B. subtilis 1A1	Overexpression‎ of dxs, idi and ads	20 mg/L	[96]
Poly-γ-glutamic acid	B. subtilis ZJU − 7	Optimizing culture conditions	101.1 g/L	[97]
Acetoin	B. subtilis CGMCC 13,141	Deletion of araR, bdhA and acoA	83.7 g/L	[98]
Shikimate	B. subtilis 168 CLC6-PYKA	Deletion of pykA and aroI	4.67 g/L	[99]
2,3-Butanediol	B. subtilis F9	Deletion of upp, acoA, bdhA, pta, and ldh, combined with the expression‎ of alsS, alsD, budC, and udhA	103.7 g/L	[100]
Isobutanol	B. subtilis UL08	Deletion of alsS, ldh, pdhC and pgi, combined with the expression‎ of zwf and udhA	6.12 g/L	[101]
Chondroitin	B. subtilis E168H	Expression‎ of kfoC-kfoA and kfiC-kfiA, combined with the upregulation of tuaD	5.22 g /L	[102]
Heparosan	B. subtilis E168H	Expression‎ of kfoC-kfoA and kfiC-kfiA, combined with the upregulation of tuaD	5.82 g/ L	[102]

Full size table

Vitamins as high-value products

In a recent review, microbial cell factories for the production of B vitamins were described in detail [48]. B. subtilis can be used to produce vitamins B1, B2, B5, B6, and B7, and many production strains were constructed by metabolic engineering or screened and selected from mutant libraries [48]. Vitamin B2 is one of the most successful microbial fermentation products on an industrial scale [49]. Also known as riboflavin (RF), Vitamin B2 is the precursor of flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide [50], and it is widely used for its antioxidant, immunity enhancing, anticancer, as well as food and feed enhancing effects [51]. Metabolic engineering strategies based on the riboflavin metabolic pathway of B. subtilis are usually based on optimization of the central carbon metabolism, overexpression‎ and deregulation of the RF synthesis and purine biosynthesis pathways, as well as blocking the synthesis of by-products [52]. The precursor supply in the RF biosynthesis pathway can be enhanced by redirecting the carbon flux through the PPP (pentose phosphate pathway) from the EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) pathway, and increasing the expression‎ of purine biosynthesis genes (pur operon), thus increasing GTP production [53, 54]. The yield of riboflavin in fed-batch fermentation using B. subtilis reached up to 826.52 mg/L [54]. The excellent RF productivity of B. subtilis can also be attributed to its excellent productivity of chemicals sharing the same precursors, such as ribose, purine nucleoside, and folic acid. In addition, the yield of RF can be increased by improving the host characteristics. Recent studies found that the introduction of heat shock proteins from thermophilic bacteria can improve the heat resistance and osmotic tolerance of B. subtilis, enabling it to ferment at a higher temperature, thereby shortening the fermentation time and improving the RF titer [55].

In addition to B vitamins, B. subtilis can also produce menaquinone-7 (MK-7), a member of the valuable vitamin K2 family, which can promote blood coagulation and osteogenic ability, and is also known for other nutraceutical and pharmacological properties. In the fermentation process of MK-7, glycerol, glucose, sucrose, or starch are used as carbon sources, and yeast extract, peptone, sodium nitrate, or soybean peptone as nitrogen sources [56]. Using ethanol to extract MK-7 directly from the cells after fermentation produced a MK-7 yield of 1.47 mg/g [57]. Wu and Ahn optimized the medium components via a three-step response surface methodology (RSM) approach, and the yield of vitamin K increased to 71.95 ± 1.00 mg/L [58]. Yang et al. found that the expression‎ of menA, dxs, dxr, yacM, yacN and glpD constitutes bottlenecks for MK-7 production. Knocking out dhbB can promote the production of MK-7, and it was further improved by adopting high-density fermentation technology [59]. In addition, MK-7 is an important component of the microbial membrane, where it plays an important role in the process of electron transport and oxidative phosphorylation. Cui et al. regulated the membrane composition and electron transport by co-expression‎ of the cell membrane protein tatAD-CD and menaquinol-cytochrome lyase qcrA-C, which increased the titer of MK-7 to 410 mg/L in shake flasks [60].

고부가가치 제품으로서의 비타민

최근 리뷰에서는

B 비타민 생산을 위한 미생물 세포 공장에 대해 상세히 기술하였다[48].

B. subtilis는

비타민 B1, B2, B5, B6, B7 생산에 활용될 수 있으며,

대사 공학을 통해 다수의 생산 균주가 구축되거나 돌연변이 라이브러리에서 선별 및 선택되었다[48].

비타민 B2는

산업 규모에서 가장 성공적인 미생물 발효 제품 중 하나이다[49].

리보플라빈(RF)으로도 알려진 비타민 B2는

플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)와 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)의 전구체이다[50].

항산화, 면역 증진, 항암 효과 및 식품·사료 기능 강화 효과로

널리 활용된다[51].

B. subtilis의 리보플라빈 대사 경로를 기반으로 한

대사 공학 전략은 일

반적으로 중심 탄소 대사 최적화, RF 합성 및 퓨린 생합성 경로의 과발현 및 조절 해제,

그리고 부산물 합성 차단에 기반한다[52].

RF 생합성 경로의 전구체 공급은

EMP(엠브덴-마이어호프-파르나스 경로)에서 PPP(오탄당 인산 경로)로 탄소 흐름을 전환하고,

퓨린 생합성 유전자(pur 오페론)의 발현을 증가시켜

GTP 생산을 증가시킴으로써 향상될 수 있다[53, 54].

B. subtilis를 이용한 공급배치 발효에서

리보플라빈 수율은 최대 826.52 mg/L에 달했다[54].

B. subtilis의 우수한 RF 생산성은

리보스, 퓨린 뉴클레오사이드, 엽산 등 동일한 전구체를 공유하는 화학물질의 탁월한 생산성에도 기인한다.

또한 숙주 특성을 개선함으로써 RF 수율을 높일 수 있다.

최근 연구에 따르면

고온성 세균의 열충격 단백질을 도입하면

B. subtilis의 내열성과 삼투압 내성이 향상되어

더 높은 온도에서 발효가 가능해져 발효 시간을 단축하고 RF 타이터를 개선할 수 있다[55].

비타민 B군 외에도, B. subtilis는

귀중한 비타민 K2 계열의 일원인 메나퀴논-7(MK-7)도 생산할 수 있으며,

이는 혈액 응고 및 골 형성 능력을 촉진할 수 있으며,

다른 기능성 식품 및 약리학적 특성으로도 알려져 있습니다.

MK-7의 발효 공정에서는

글리세롤, 포도당, 자당 또는 전분을 탄소원으로 사용하고,

효모 추출물, 펩톤, 질산나트륨 또는 대두 펩톤을 질소원으로 사용합니다 [56].

발효 후 세포에서 에탄올을 사용하여 MK-7을 직접 추출한 결과,

MK-7 수율은 1.47 mg/g을 나타냈다 [57].

Wu와 Ahn은 3단계 반응면 방법론(RSM) 접근법을 통해

배지 성분을 최적화했으며,

비타민 K 수율은 71.95±1.00 mg/L로 증가했다 [58].

Yang 등은 menA, dxs, dxr, yacM, yacN 및 glpD 유전자 발현이 MK-7 생산의 병목 현상을 유발함을 발견했다. dhbB 유전자 제거는 MK-7 생산을 촉진하며, 고밀도 발효 기술 적용으로 생산성이 추가로 향상되었다[59]. 또한, MK-7은 미생물 막의 중요한 구성 성분으로, 전자 전달 및 산화적 인산화 과정에서 중요한 역할을 한다. Cui 등은 세포막 단백질 tatAD-CD와 메나퀴놀-시토크롬 리아제 qcrA-C를 공동 발현시켜 막 구성과 전자 전달을 조절함으로써, 흔들어 주는 플라스크에서 MK-7의 역가를 410 mg/L로 증가시켰다 [60].

Scyllo-inositol (SI)

Scyllo-inositol (SI), a stereoisomer of inositol, is being investigated as a potential therapeutic agent for Alzheimer’s disease. However, this compound is far less abundant than its analog myo-inositol (MI), which is the most abundant inositol stereoisomer in nature and can be obtained from rice bran. Consequently, many studies have investigated strategies to convert MI into SI using microorganisms. Tanaka et al. constructed a strain with modified inositol metabolism by deleting all genes related to inositol metabolism, and overexpressing the key enzymes, IolG and IolW, in B. subtilis, resulting in a cell factory that can convert MI into SI with increased efficiency [61]. Through the genetic modification of inositol metabolism and phytase secretion pathway of B. subtilis, the signal peptide of B. subtilis was optimized, the main MI transporter, IolT, was overexpressed, and the substrate absorption was improved. At the same time, the pntAB gene of E. coli was introduced to improve the NADPH production, which improves the activity of inositol dehydrogenase, IolW. These modifications successfully increased the conversion efficiency of MI to 30 g/L/48 h [62].

스킬로-이노시톨(SI)

이노시톨의 입체이성체인 스킬로-이노시톨(SI)은

알츠하이머병 치료제로서의 잠재력을 연구 중이다.

그러나 이 화합물은

자연에서 가장 풍부한 이노시톨 입체이성체인 유사체 미오-이노시톨(MI)보다 훨씬 적게 존재하며,

쌀겨에서 얻을 수 있다.

따라서

많은 연구에서 미생물을 이용해 MI를 SI로 전환하는 전략을 탐구해왔다.

Tanaka 등은 

B. subtilis에서 이노시톨 대사와 관련된 모든 유전자를 삭제하고

핵심 효소인 IolG 및 IolW를 과발현시켜

이노시톨 대사를 변형한 균주를 구축함으로써,

MI를 SI로 변환하는 효율이 향상된 세포 공장을 만들었다 [61]. 

B. subtilis의 이노시톨 대사 및 피타제 분비 경로의 유전자 변형을 통해 

B. subtilis의 신호 펩타이드를 최적화하고,

주요 MI 수송체인 IolT를 과발현하여 기질 흡수를 개선했습니다.

동시에 E. coli의 pntAB 유전자를 도입하여 NADPH 생산을 향상시켜

이노시톨 탈수소효소 IolW의 활성을 개선했습니다.

이러한 개량을 통해 MI 전환 효율을 30 g/L/48시간으로 성공적으로 향상시켰다 [62].

Hyaluronic acid (HA)

Hyaluronic acid (HA) is a high-value glycosaminoglycan, which is widely used in the biomedical, pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Notably, HA preparations with different molecular weight show different effects [63]. Peng Jin et al. downregulated the glycolysis pathway by co-expressing identified committed genes (tuaD, gtaB, glmU, glmM, and glmS). They used the ribosome binding site engineering strategy to regulate the translational level of hyaluronidase and optimized the HA synthesis pathway, which led to the specific production of low-molecular-weight HA [64]. Li et al. recently reported an engineered strain of B. subtilis that can produce HA with different molecular weights and titers at different temperatures. They found that when the biomass increased, the molecular weight of the produced HA decreased while the titer increased [63].

히알루론산(HA)

히알루론산(HA)은

고부가가치 글리코사미노글리칸으로,

생의학, 제약, 화장품 및 식품 산업에 널리 사용된다.

특히 분자량이 다른 HA 제제는 서로 다른 효과를 나타낸다 [63].

Peng Jin 등은

식별된 결정적 유전자(tuaD, gtaB, glmU, glmM, glmS)를 공동 발현시켜

당분해 경로를 하향 조절하였다.

그들은 리보솜 결합 부위 공학 전략을 사용하여 히알루로니다제의 번역 수준을 조절하고 HA 합성 경로를 최적화하여 저분자량 HA의 특이적 생산을 이끌어냈다 [64]. Li 등은 최근 다양한 온도에서 서로 다른 분자량과 역가의 HA를 생산할 수 있는 B. subtilis 공학 균주를 보고했다. 그들은 생물량이 증가할수록 생산된 HA의 분자량은 감소하는 반면 역량은 증가한다는 사실을 발견했다[63].

N-acetylglucosamine (GlcNAc)

In addition to naturally occurring products, scientists are also introducing new pathways into B. subtilis to produce new chemicals. N-acetylglucosamine is an acetylated amine derivative of glucose, which plays an important role in the maintenance and repair of cartilage and joint tissue function. Liu et al. divided the GlcNAc biosynthesis network into a glycolysis module, a GlcNAc biosynthesis module, and a peptidoglycan biosynthesis module. By applying modular pathway engineering, they increased the production of GlcNAc in B. subtilis from 1.85 to 31.65 g/L [65]. Then, by knocking out acetolactate synthase (AlsS) and acetolactate decarboxylase (AlsD), the formation of the neutral byproduct acetoin was reduced, and the carbon flux from fructose-6-phosphate toward the GlcNAc synthesis pathway was increased. Consequently, the titer and yield of GlcNAc increased to 48.9 g/L and 0.32 g/g glucose, respectively [66]. The catabolism of GlcNAc in B. subtilis is regulated by GlcN6P. Recently, Liu et al. built a coupled ADC system consisting of a GlcN6P-responsive biosensor and CRISPRi. Using this system, a genetic feedback circuit was constructed to fine-tune the metabolic flow toward GlcNAc synthesis and competing modules, which increased the titer of GlcNAc in a 15-L fed-batch bioreactor to 131.6 g/L [67].

N-아세틸글루코사민(GlcNAc)

자연 발생 제품 외에도 과학자들은

새로운 화합물 생산을 위해 

B. subtilis에 새로운 경로를 도입하고 있다.

N-아세틸글루코사민은

포도당의 아세틸화 아민 유도체로, 연골 및 관절 조직 기능의 유지와 회복에 중요한 역할을 한다.

Liu 등은 글루코사민 생합성 네트워크를

당분해 모듈, 글루코사민 생합성 모듈, 펩티도글리칸 생합성 모듈로 구분하였다.

모듈식 경로 공학을 적용하여 B. subtilis 내 글루코사민 생산량을 1.85 g/L에서 31.65 g/L로 증가시켰다[65]. 그런 다음 아세토락테이트 합성효소(AlsS)와 아세토락테이트 탈카복실효소(AlsD)를 녹아웃함으로써 중성 부산물인 아세토인의 생성을 감소시키고, 글루코스-6-인산에서 글루코사민산 합성 경로로의 탄소 유동을 증가시켰다. 결과적으로 글루코사민산(GlcNAc)의 생산량과 수율은 각각 48.9 g/L 및 0.32 g/g 포도당으로 증가하였다[66]. B. subtilis에서 글루코사민산(GlcNAc)의 분해 대사는 글루코노-6-인산(GlcN6P)에 의해 조절된다. 최근 Liu 등은 GlcN6P 반응성 바이오센서와 CRISPRi로 구성된 결합형 ADC 시스템을 구축했다. 이 시스템을 활용해 GlcNAc 합성 및 경쟁 모듈로의 대사 흐름을 미세 조정하는 유전자 피드백 회로를 구축했으며, 이를 통해 15L 공급배치형 생물반응기에서 GlcNAc의 생산량을 131.6 g/L로 증가시켰다 [67].

Enzymes produced by Bacillus subtilis

Due to its rapid growth on inexpensive substrates, strong protein secretion ability, non-pathogenicity, and favorable downstream processing, B. subtilis has become an ideal expression‎ host for the production of various industrial enzymes. According to incomplete statistics, enzymes produced using B. subtilis account for 50% of the total enzyme market [44]. Many enzymes have been successfully expressed in B. subtilis, including amylases, xylanases, lichenase, β-galactosidase [68], cellulases [69], alkaline serine proteases [42], and many others. These enzymes play important roles in the food, feed, detergent, textile, leather, paper, and pharmaceutical industries [46]. Due to its GRAS status, proteases from B. subtilis can be used in various food applications, such as soybean hydrolysate preparation, meat tenderization, casein hydrolysate preparation, milk coagulation, and food waste treatment [70]. Here, we will introduce illustrative examples of engineered B. subtilis factories for the production of enzymes such as amylases, xylanases, and lichenases.

Bacillus subtilis에서 생산되는 효소

저렴한 기질에서의 빠른 성장, 강력한 단백질 분비 능력, 비병원성,

그리고 유리한 다운스트림 공정 덕분에 B. subtilis는

다양한 산업용 효소 생산을 위한 이상적인 발현 숙주가 되었습니다.

불완전한 통계에 따르면, 

B. subtilis를 사용하여 생산된 효소는

전체 효소 시장의 50%를 차지합니다 [44].

아밀라아제,

자일라나아제,

리케나아제,

β-갈락토시다아제[68],

셀룰라아제[69],

알칼리성 세린 프로테아제[42] 등

수많은 효소가 B. subtilis에서 성공적으로 발현되었다.

amylases,

xylanases - 자일란 분해효소, 식물세포벽의 구성성분 자일란,

lichenase - 베타 글루칸(다당류) 분해효소,

β-galactosidase [68],

cellulases [69],

alkaline serine proteases - 단백질 분해효소

이러한 효소들은

식품, 사료, 세제, 섬유, 가죽, 제지 및 제약 산업에서 중요한 역할을 합니다[46].

B. subtilis 유래 프로테아제는

GRAS(일반적으로 안전하다고 인정되는 물질) 지위를 획득하여

대두 가수분해물 제조, 육류 연화, 카제인 가수분해물 제조, 우유 응고 및 식품 폐기물 처리 등

다양한 식품 응용 분야에 활용될 수 있습니다[70].

여기서는

아밀라제, 자일라나제, 리케나제 등의 효소 생산을 위한

공학적으로 개량된 B. subtilis 공장 사례를 소개한다.

Alpha-amylase

Alpha-amylase (EC 3.2.1.1) catalyzes the cleavage of α-1,4-glucosidic bonds, releasing glucose from starch. It is widely used in the textile and paper industries, and B. subtilis is a major host for the production of heterologous α-amylases [71]. Ma et al. used atmospheric and room temperature plasma mutagenesis followed by a novel screening method, and combined with a fermentation optimization strategy, significantly improved the yield of alkaline amylase in B. subtilis 168 [72]. Other studies focused on regulating protein transport and transcription levels by integrating signal peptides and promoter engineering [73]. PrsA is an effective folding catalyst for proteins expressed in B. subtilis. Overexpression‎ of native PrsA from B. subtilis can improve the yield of amylase, but for heterologous amylase, co-expressing the cognate prsA gene had a better effect. QuesadaGanuza et al. developed a new recombinant PrsA variant, which not only increased the yield of amylase in B. subtilis, but also relieved the secretion pressure of the strain [74]. By optimizing the signal peptide and overexpression‎ partner, followed by error-prone PCR and high throughput screening technology to screen improved mutants, the α-amylase activity was improved to 9201.1 U/mL [75].

알파-아밀라제

알파-아밀라제(EC 3.2.1.1)는

α-1,4-글루코사이드 결합의 절단을 촉매하여

전분으로부터 포도당을 방출한다.

섬유 및 제지 산업에서 널리 사용되며,

B. subtilis는 이종 알파-아밀라아제 생산의 주요 숙주입니다 [71].

Ma 등은 대기압 및 실온 플라즈마 돌연변이 유발 후 새로운 선별 방법을 적용하고 발효 최적화 전략을 결합하여 B. subtilis 168에서 알칼리성 아밀라아제 수율을 크게 향상시켰습니다 [72]. 다른 연구들은 신호 펩타이드와 프로모터 공학을 통합하여 단백질 수송 및 전사 수준 조절에 초점을 맞추었다[73]. PrsA는 B. subtilis에서 발현되는 단백질의 효과적인 접힘 촉매이다. B. subtilis의 고유 PrsA 과발현은 아밀라아제 수율을 향상시킬 수 있으나, 이종 아밀라아제의 경우 해당 prsA 유전자의 공동 발현이 더 나은 효과를 보였다. Quesada-Ganuza 등은 새로운 재조합 PrsA 변이체를 개발하여 B. subtilis 내 아밀라아제 수율을 증가시킬 뿐만 아니라 균주의 분비 압력을 완화시켰다 [74]. 신호 펩티드와 과발현 파트너를 최적화한 후, 오류 발생 가능성이 높은 PCR 및 고속 대량 스크리닝 기술을 통해 개선된 돌연변이체를 선별함으로써 α-아밀라아제 활성을 9201.1 U/mL로 향상시켰습니다 [75].

Xylanases

Xylanases (EC. 3.2.1.8) are enzymes that catalyze the hydrolysis of β-1,4 glycosidic linkages of xylans, releasing oligosaccharides and disaccharides containing reducing sugars and xylose [76]. They have significant application value in biotechnology and can be used to modify lignocellulosic materials. Xylanases are used in animal feed manufacturing, the paper and textile industries, and biofuel production. Commercial xylanases are mainly produced in B. subtilis. Sanchez-Alponti et al. created and characterized single mutants individually replacing five residues in the mesophilic xylanase of B. subtilis with homologous residues from thermophilic enzymes. When the five mutants were combined in a random combinatorial library, a double mutant with improved specific activity and thermal stability was obtained [77]. Yardimci and Cekmecelioglu used Box–Behnken response surface methodology to optimize xylanase production in a co-culture of B. subtilis and Kluyveromyces marxianus, which improved the xylanase yield 4.4-fold (reached 49.5 IU/mL) compared to the initial un-optimized single culture [76].

자일라나제

자일라나제(EC. 3.2.1.8)는

자일란의 β-1,4 글리코시드 결합의 가수분해를 촉매하여

환원당과 자일로스(xylose)를 포함하는

올리고당 및 이당류를 방출하는 효소입니다 [76].

이 효소는 생명 공학 분야에서 상당한 응용 가치를 가지며,

리그노셀룰로오스 물질의 변형에 사용될 수 있습니다.

자일라나제는

동물 사료 제조, 제지 및 섬유 산업, 바이오연료 생산에 사용됩니다.

상업용 자일라나제는

주로 B. subtilis에서 생산된다.

Sanchez-Alponti 등은 B. subtilis의 중온성 자일라나제에서 5개 잔기를 고온성 효소의 동족 잔기로 개별 대체한 단일 돌연변이체를 생성하고 특성화하였다. 5개 돌연변이체를 무작위 조합 라이브러리에 결합했을 때, 특이 활성과 열 안정성이 향상된 이중 돌연변이체를 얻었다 [77]. 야르딤치(Yardimci)와 체크메첼리올루(Cekmecelioglu)는 박테리움 서브틸리스(B. subtilis)와 클루베로미세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)의 공배양에서 자일라나아제 생산을 최적화하기 위해 박스-베헴켄(Box–Behnken) 반응 표면 방법론을 사용했으며, 이는 초기 최적화되지 않은 단일 배양에 비해 자일라나아제 수율을 4.4배(49.5 IU/mL에 도달) 향상시켰다[76].

Lichenase

Lichenase (EC. 3.2.1.73) is a mixed linked β-glucan (MLG) endo-hydrolase found in both microorganisms and plants, which has become a focus of studies on the feasibility of biofuel production [78]. However, due to its poor thermal stability, it is not suitable for biocatalytic biomass conversion. Wang et al. used SpyTag/SpyCatcher-mediated cyclization and non-chromatographic ITC purification to obtain cyclo-lichenase with good heat resistance, which is superior to linear lichenase [78]. In addition, in terms of the catalytic activity of the enzyme, studies have shown that the assembly of subunits induced by the collagen triple helix domain and essential oligomers, such as comp and foldon, can cause target enzyme trimerization, thus improving the activity of lichenase [79].

리케나제

리케나제(EC. 3.2.1.73)는 미생물과 식물 모두에서 발견되는

혼합 결합 β-글루칸(MLG) 엔도 가수분해 효소로,

바이오 연료 생산의 타당성에 대한 연구의 초점이 되고 있습니다 [78].

그러나 열 안정성이 낮아 생물학적 촉매를 이용한 바이오매스 전환에는 적합하지 않습니다. Wang 등은 SpyTag/SpyCatcher 매개 환원 및 비크로마토그래피 ITC 정제를 통해 선형 리케나아제보다 우수한 내열성을 지닌 사이클로-리케나아제를 얻었습니다 [78]. 또한 효소의 촉매 활성 측면에서, 콜라겐 삼중 나선 도메인과 comp 및 foldon과 같은 필수 올리고머에 의해 유도된 서브유닛의 조립이 표적 효소의 삼량체화를 유발하여 리케나아제의 활성을 향상시킬 수 있다는 연구 결과가 있습니다 [79].

Application of Bacillus subtilis in agriculture, biomaterials and medicine

Because it is a non-pathogenic probiotic, B. subtilis is often used as a microbial additive to improve intestinal function in animals. It was found promote animal growth and prevent diseases [80]. It can be manufactured in the form of endospores, which then enter the intestinal tract of animals and quickly reactivate to secrete highly active proteases, as lipases and amylases in the upper intestinal tract, which is helpful to degrade complex carbohydrates in plant feed. Furthermore, B. subtilis can produce polypeptides that have an antagonistic effect against intestinal pathogens, effectively improving the digestibility of feed. Additionally, it can be used in water bioremediation and prevent diseases in aquaculture organisms such as shrimp and fish [7]. Because B. subtilis is an aerobic bacterium, it contributes to the anaerobic environment by consuming oxygen in the intestines, which in turn promotes the reproduction of dominant bacteria in the intestine, maintaining the ecological balance of intestines.

B. subtilis can secrete a variety of low molecular weight antimicrobial peptides and bacteriocins, such as surfactin [81], bacilysin [82], and subtilin [83], which have potential value in biomedical engineering, food and agriculture [84]. Antimicrobial peptides from B. subtilis are promising therapeutic tools, because of their broad activity and rapid killing activity against a variety of pathogens. With the increasing problems of microbial resistance due to the non-rational use of conventional antibiotics, antimicrobial peptides will play a more significant role in the treatment of bacterial infections [85]. Antimicrobial peptides also have the advantages of safety and environmental friendliness. They are widely used as feed additives in agriculture and animal husbandry to enhance animal fiber digestion and intestinal health. B. subtilis can improve the balance of intestinal flora and has the potential to improve intestinal health and food absorption efficiency. Studies have shown that adding B. subtilis spores to dairy cattle feed can improve milk and protein production [86]. Furthermore, adding B. subtilis to the diet of laying hens can improve their performance as well as the shell quality of eggs produced by aged laying hens [87].

Biofilms are structured communities of tightly associated cells that constitute the predominant state of bacterial growth in natural and human-made environments [88]. Biofilms can be used to produce living materials with self-healing functions, which are desirable for many products [89]. B. subtilis can form complex and robust biofilms and is a good model strain for studying biofilm formation. Recent studies have shown that biofilms based on the TasA amyloid protein mechanism in B. subtilis exhibit viscoelastic behavior of hydrogels. Studies have shown that biofilms can be accurately fabricated into various three-dimensional (3D) microstructures through 3D-printing and microencapsulation technology [90]. Compared with chemical materials, this artificial living material has metabolic activity, self-renewal ability, and programmability [89]. In addition, the ability of B. subtilis to form biofilms promotes the synthesis of quorum-sensing pentapeptide and nitric oxide (NO), which can delay the aging of the host [91]. Biofilm formation improves the ability of microorganisms to metabolize nutrients and produce chemicals, and can be used to improve the stability of fermentation processes. Recent studies show that a biofilm reactor can promote the extracellular secretion of MK-7 [92].

When faced with starvation, B. subtilis produces endospores that can survive for a long time in a state of anabiosis. And when nutrients are available, it germinate again [93]. This characteristic is conducive to the successful expression‎ of heterologous antigens or increasing the relative activity, thermostability, pH stability, and reusability of enzymes on the surface of spores. The enormous stress resistance of endospores can be coopted to improve the stability and promote the reusability of enzymes in complex environments [94]. In addition, spore surface display technology has recently been successfully applied in the production of protein polymers, vaccines and industrial enzymes [95]. Enzymes such as lipase and chitinase have been successfully expressed on the surface of endospores [94].

농업, 생체재료 및 의학 분야에서의 Bacillus subtilis 적용

비병원성 프로바이오틱스인

B. subtilis는 동물 장 기능 개선을 위한 미생물 첨가제로 자주 사용됩니다.

이는 동물 성장 촉진 및 질병 예방 효과가 있는 것으로 확인되었습니다 [80].

내포자 형태로 제조되어 동물의 장내로 유입된 후 신속히 재활성화되어

상부 장관에서 고활성 프로테아제,

리파제 및 아밀라제를 분비함으로써

식물성 사료의 복합 탄수화물 분해에 기여한다.

또한 B. subtilis는

장내 병원체에 대한 길항 효과를 지닌 폴리펩타이드를 생성하여

사료 소화율을 효과적으로 향상시킨다.

또한 수생 환경 생물학적 정화에 활용될 수 있으며

새우, 어류 등 양식 생물의 질병 예방에도 기여한다[7].

B. subtilis는

호기성 세균이므로 장내 산소를 소비함으로써

혐기성 환경 조성에 기여하며,

이는 장내 우점균의 증식을 촉진하여 장내 생태계 균형을 유지한다.

B. subtilis는

서팩틴[81], 바실리신[82], 서브틸린[83] 등 다양한 저분자 항균 펩타이드 및 박테리오신을 분비할 수 있으며,

이는 생의학 공학, 식품 및 농업 분야에서 잠재적 가치를 지닙니다[84].

B. subtilis 유래 항균 펩타이드들은

광범위한 활성과 다양한 병원체에 대한 신속한 살균 활성으로 인해 유망한 치료 도구입니다.

기존 항생제의 비합리적 사용으로 인한 미생물 내성 문제가 증가함에 따라,

항균 펩타이드들은 세균 감염 치료에서 더욱 중요한 역할을 할 것입니다[85].

항균 펩타이드에는

안전성과 환경 친화성이라는 장점도 있습니다.

이들은

농업 및 축산업에서 사료 첨가제로 널리 사용되어

동물 섬유소 소화 및 장 건강을 증진시킵니다.

B. subtilis는

장내 미생물 군집의 균형을 개선하고

장 건강 및 영양소 흡수 효율을 향상시킬 잠재력을 지닙니다.

연구에 따르면 젖소 사료에 B. subtilis 포자를 첨가하면

우유 및 단백질 생산량이 증가하는 것으로 나타났습니다[86].

또한 산란계 사료에

B. subtilis를 첨가하면

노령 산란계의 생산성과 산란란의 껍질 품질을 개선할 수 있다[87].

바이오필름은

자연 및 인공 환경에서 세균 증식의 주요 형태를 이루는 밀접하게 연관된

세포들의 구조화된 군집이다[88].

바이오필름은

자가 치유 기능을 가진 생체 재료 생산에 활용될 수 있으며,

이는 다양한 제품에 바람직한 특성이다[89].

B. subtilis는

복잡하고 견고한 생물막을 형성할 수 있으며

생물막 형성을 연구하기 위한 우수한 모델 균주이다.

최근 연구에 따르면

B. subtilis의 TasA 아밀로이드 단백질 메커니즘을 기반으로 한 생물막은

하이드로겔의 점탄성 거동을 나타낸다.

연구 결과 생물막은 3D 프린팅 및 마이크로캡슐화 기술을 통해 다양한 3차원(3D) 미세구조로 정밀하게 제작될 수 있음이 입증되었다[90]. 화학 물질과 비교할 때, 이 인공 생체 재료는 대사 활동, 자가 재생 능력 및 프로그래밍 가능성을 지닌다[89]. 또한, B. subtilis의 생물막 형성 능력은 쿼럼 센싱 펜타펩타이드와 산화질소(NO)의 합성을 촉진하여 숙주의 노화를 지연시킬 수 있다[91].

생물막 형성은

미생물의 영양소 대사 및 화학물질 생산 능력을 향상시키며

발효 공정 안정성 개선에 활용될 수 있다.

최근 연구에 따르면 생물막 반응기는

MK-7의 세포외 분비를 촉진할 수 있다[92].

영양 결핍 상태에서 B. subtilis는

장기간 무생물 상태로 생존 가능한 내포자를 생성한다.

영양분이 공급되면

다시 발아한다[93].

이 특성은

이종 항원의 성공적 발현이나 포자 표면 효소의 상대적 활성,

내열성, pH 안정성 및 재사용성 향상에 유리하다.

내포자의 막대한 스트레스 저항성은

복잡한 환경에서 효소의 안정성을 개선하고 재사용성을 촉진하기 위해 활용될 수 있다[94].

또한 최근 포자 표면 발현 기술은 단

백질 고분자, 백신 및 산업용 효소 생산에 성공적으로 적용되었다[95].

리파아제 및 키티나제와 같은 효소들이

내포자 표면에 성공적으로 발현되었다[94].

Conclusions and future perspectives

As the main model species of Gram-positive bacteria, B. subtilis has a broad array of mature genetic tools, promoters, and plasmid expression‎ systems, which can be used in metabolic engineering, protein expression‎, and synthetic biology. It can produce chemicals, enzymes, and other industrial bio-products, but also be used as a platform for vaccine preparation or a feed additive in agriculture. Moreover, it is also an ideal model for studying biofilm formation and other physiological characteristics of attached cells. This paper reviewed the advantages of B. subtilis as a chassis cell from several aspects, including genetic manipulation, and heterologous gene expression‎, as well as its application in industry, agriculture, and medicine.

However, although B. subtilis has various attractive applications, it remains far less studied than its Gram-negative counterpart, E. coli. This remains true even in the present era with rich methodology and rapid tool development. One major bottleneck in the application of new methods attribute to the lower efficiency of plasmids construction in B. subtilis compared with E. coli. To solve this, future engineered strains of B. subtilis can be developed to allow direct plasmid construction. Conversely, the high recombination rate of B. subtilis has some advantages for the development of genome editing tools.

Our goal was to provide reads with a general understanding of the characteristics of B. subtilis, so one can take advantage of its features for certain applications or research purposes. Of course, as more and more scientists and engineers contribute studies on B. subtilis, more technologies, tools, and methods will be applied to B. subtilis in the future, and the potential of this bacterium for scientific and industrial applications will be enhanced further.

결론 및 향후 전망

그람 양성균의 주요 모델 종인 

B. subtilis는

대사 공학, 단백질 발현 및 합성 생물학에 활용 가능한 다양한 성숙한 유전자 도구,

프로모터 및 플라스미드 발현 시스템을 보유하고 있습니다.

화학 물질, 효소 및 기타 산업용 생물 제품을 생산할 수 있을 뿐만 아니라

백신 제조 플랫폼이나 농업용 사료 첨가제로도 사용될 수 있습니다.

또한 부착 세포의 생물막 형성 및 기타 생리적 특성 연구를 위한

이상적인 모델이기도 하다.

본 논문은

유전자 조작, 이종 유전자 발현, 산업·농업·의학 분야 적용 등

여러 측면에서 B. subtilis의 섀시 세포로서의 장점을 검토하였다.

그러나 

B. subtilis가 다양한 매력적인 응용 가능성을 지녔음에도,

그람 음성균인 E. coli에 비해 연구가 훨씬 덜 이루어지고 있다.

풍부한 방법론과 신속한 도구 개발이 가능한 현시대에도

이 사실은 여전히 유효하다.

새로운 방법 적용의 주요 병목 현상은 

E. coli에 비해 B. subtilis에서 플라스미드 구축 효율이 낮다는 점에 기인한다.

이를 해결하기 위해

향후 B. subtilis의 직접적인 플라스미드 구축을 가능하게 하는 공학적으로 개량된 균주를 개발할 수 있다.

반대로, B. subtilis의 높은 재조합률은 게놈 편집 도구 개발에 몇 가지 장점을 제공한다.

본 연구의 목표는 

B. subtilis의 특성에 대한 일반적인 이해를 제공하는 것이었으며,

이를 통해 특정 응용 분야나 연구 목적에 그 특징을 활용할 수 있도록 하기 위함이다.

물론, 점점 더 많은 과학자와 공학자들이 

B. subtilis에 관한 연구를 기여함에 따라,

앞으로 더 많은 기술, 도구 및 방법이 B. subtilis에 적용될 것이며,

이 박테리아의 과학적 및 산업적 응용 가능성은 더욱 확대될 것이다.

Availability of data and supporting materials

Not applicable.

Abbreviations

RBS:

Ribosome binding site

GlcNAc:

N-acetylglucosamine

CSM:

Counter-selectable marker

SSR:

Site-specific recombination system

CRISPR:

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats

CRISPRi:

CRISPR interference

Sec:

Secretion pathway

Tat:

Twin-arginine translocation pathway

ABC:

ATP-binding cassette

SRP:

Signal recognition particle

TMD:

Transmembrane domain

NBD:

Nucleotide binding domain

Nsp:

Nucleoskeletal-like protein

PhoA:

Alkaline phosphatase

BgaB:

β-Galactosidase

RDPE:

d-Psicose 3-epimerase

RF:

Riboflavin

PP pathway:

Pentose phosphate pathway

MK-7:

Menaquinone-7

RSM:

Response surface methodology

SI:

scyllo-inositol

MI:

myo-Inositol

HA:

Hyaluronic acid

AlsS:

Acetolactate synthase

AlsD:

Acetolactate decarboxylase

MLG:

Mixed linked β-glucan

3D:

Three-dimensional

References

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