Re: 2023년 올해의 미생물로 선정된 B. subtilis(고초균) 생명공학에서 만능 도구 2023!!

[문형철]

고초균은 마른 볏집에 많은 박테리아로

기본적으로 호기성 세균이고

약산성, 중성, 약알칼리 환경에서 생존

협기성 환경이 되면 '포자'로 둘러싸 

동면에 드는 것처럼 버티기를 하는 균!!

고초균이 산소를 이용하면 그 환경은 산소가 부족한 혐기성 환경으로 바뀌고

혐기성 박테리아가 생존할 환경으로 전환됨!!

J Bacteriol

. 2023 May 4;205(5):e00102-23. doi: 10.1128/jb.00102-23

Bacillus subtilis, a Swiss Army Knife in Science and Biotechnology

Jörg Stülke a,✉, Anika Grüppen b, Marc Bramkamp c, Stefan Pelzer b,✉

Editor: George O'Tooled

• Author information
• Article notes
• Copyright and License information

PMCID: PMC10210981  PMID: 37140386

ABSTRACT

Next to Escherichia coli, Bacillus subtilis is the most studied and best understood organism that also serves as a model for many important pathogens. Due to its ability to form heat-resistant spores that can germinate even after very long periods of time, B. subtilis has attracted much scientific interest. Another feature of B. subtilis is its genetic competence, a developmental state in which B. subtilis actively takes up exogenous DNA. This makes B. subtilis amenable to genetic manipulation and investigation. The bacterium was one of the first with a fully sequenced genome, and it has been subject to a wide variety of genome- and proteome-wide studies that give important insights into many aspects of the biology of B. subtilis. Due to its ability to secrete large amounts of proteins and to produce a wide range of commercially interesting compounds, B. subtilis has become a major workhorse in biotechnology. Here, we review the development of important aspects of the research on B. subtilis with a specific focus on its cell biology and biotechnological and practical applications from vitamin production to concrete healing. The intriguing complexity of the developmental programs of B. subtilis, paired with the availability of sophisticated tools for genetic manipulation, positions it at the leading edge for discovering new biological concepts and deepening our understanding of the organization of bacterial cells.

초록

Escherichia coli 다음으로,

Bacillus subtilis는 가장 많이 연구되고 가장 잘 이해된 생물체로,

많은 중요한 병원균의 모델로도 사용됩니다.

B. subtilis는

매우 오랜 시간이 지난 후에도 발아할 수 있는 내열성 포자를 형성하는 능력으로 인해

많은 과학적 관심을 받아 왔습니다.

B. subtilis의 또 다른 특징은 유전적 유능성(genetic competence)으로,

이는 B. subtilis가 외인성 DNA를 능동적으로 흡수하는 발달 상태를 의미한다.

이로 인해

B. subtilis는 유전자 조작 및 연구에 적합하다.

이 박테리아는

최초로 전체 게놈 서열이 해독된 미생물 중 하나이며,

B. subtilis 생물학의 다양한 측면에 대한 중요한 통찰력을 제공하는

광범위한 게놈 및 프로테옴 연구의 대상이 되어 왔다.

대량의 단백질 분비 능력과 상업적으로 가치 있는 다양한 화합물 생산 능력 덕분에

B. subtilis는 생명공학 분야의 주요 작업마가 되었다.

본고에서는 B. subtilis 연구의 중요한 측면들,

특히 세포 생물학과 비타민 생산부터 콘크리트 보수에 이르는

생명공학적·실용적 응용 분야에 초점을 맞춰 그 발전 과정을 검토한다.

B. subtilis의 발달 프로그램이 지닌 흥미로운 복잡성과 정교한 유전자 조작 도구의 가용성은

이 균주를 새로운 생물학적 개념 발견과 세균 세포 조직에 대한 이해 심화의 최전선에 위치시킵니다.

KEYWORDS: sporulation, cell biology, biofilm formation, probiotics, biotechnology

INTRODUCTION

In 1835, one of the founders of microbiology, Christian Gottfried Ehrenberg, described a bacterium that he named Vibrio subtilis, probably to coin the motility (“vibration”) of the thin cells (1). The microbiologist and botanist Ferdinand Julius Cohn renamed the bacterium in 1872 to Bacillus subtilis—the subtle rod—as we know it today. Cohn also discovered that B. subtilis forms heat-resistant spores as part of its life cycle (2). This finding eventually paved the way to pasteurization. Ever since, B. subtilis has attracted scientific interest and has become the best-studied and best-understood bacterium besides E. coli. This is caused by several factors. First and foremost, the sporulation cycle first documented by Cohn provides a relatively simple model for studying processes related to cell differentiation and development. Second, the nonpathogenic nature, its versatile metabolism, and ease of culturing of B. subtilis make it useful for a wide variety of applications. These include the production of traditional food in Asia by fermentation of soybeans such as Natto in Japan, or the production of vitamins, amino acids, and enzymes for washing powders. Third, B. subtilis is a relative of many important Gram-positive pathogens such as Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus, or Listeria monocytogenes. B. subtilis serves as the model organism for these pathogens and all other Firmicutes. Finally, B. subtilis grows very fast and can easily be genetically manipulated due to the ability to take up foreign DNA and even to integrate this DNA into its own genome. Thus, B. subtilis has become extremely popular in microbiology and industry and was even named the “Microbe of the Year” by the German Association for General and Applied Microbiology in 2023, the sister organization of the ASM. Here, we will give an overview of some of the important and sometimes even spectacular discoveries that have been made with B. subtilis as the object of investigation and in the many applications of this bacterium in biotechnology, animal feeding, and concrete healing.

서론

1835년,

미생물학의 창시자 중 한 명인 크리스티안 고트프리트 에렌베르크(Christian Gottfried Ehrenberg)는

가늘고 긴 세포의 운동성(“진동”)을 표현하기 위해

Vibrio subtilis라는 이름을 붙인 박테리아를 기술했습니다(1).

미생물학자이자 식물학자인 페르디난트 율리우스 코른(Ferdinand Julius Cohn)은

1872년 이 박테리아를 오늘날 우리가 알고 있는

Bacillus subtilis(미세한 막대균)로 개명했습니다.

코른은 또한

B. subtilis가 생애 주기의 일환으로

내열성 포자를 형성한다는 사실을 발견했다(2).

이 발견은 결국 파스퇴르 살균법의 길을 열었다.

그 이후로 B. subtilis는 과학계의 관심을 끌었으며,

E. coli 다음으로 가장 많이 연구되고 가장 잘 이해된 박테리아가 되었다.

이는 여러 요인에 기인한다.

첫째, 코언이 최초로 기록한 포자 형성 주기는 세포 분화와 발달 관련 과정을 연구하기 위한 비교적 단순한 모델을 제공한다.

둘째, B. subtilis의 비병원성 특성, 다재다능한 대사 능력, 그리고 배양 용이성은 다양한 응용 분야에 유용하게 활용된다. 여기에는 일본의 낫토(納豆)와 같은 콩 발효를 통한 아시아 전통 식품 생산부터, 세제용 비타민, 아미노산, 효소 생산까지 포함된다.

셋째, B. subtilis는 Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes 등 많은 중요한 그람 양성 병원균과 근연 관계에 있다.

B. subtilis는

이들 병원균 및 기타 모든 Firmicutes의 모델 유기체 역할을 한다.

마지막으로,

B. subtilis는 매우 빠르게 증식하며

외래 DNA를 흡수하고 이를 자체 게놈에 통합할 수 있는 능력 덕분에 유전적 조작이 용이합니다.

따라서

B. subtilis는 미생물학 및 산업 분야에서 극히 대중화되었으며,

2023년에는 미국미생물학회(ASM)의 자매 기관인 독일 일반 및 응용 미생물학회로부터

“올해의 미생물”로 선정되기도 했습니다.

여기서는

B. subtilis를 연구 대상으로 삼아 이루어진 중요하고 때로는 놀라운 발견들,

그리고 이 박테리아가 생명공학, 동물 사료, 구체적 치료법 등

다양한 분야에서 활용된 사례들에 대한 개요를 제시할 것이다.

THE GENOME AND PROTEOME OF B. SUBTILIS

The nineties of the past century saw the beginning of the genomic revolution, and the genome sequence of B. subtilis was one of the first to be published (3). This was achieved in a huge combined European–Japanese collaboration, organized by Frank Kunst. This collaboration was the start to a long-lasting cooperation among the European B. subtilis labs, which eventually resulted in the initial identification of the set of essential genes in the determination of the expression‎ profiles of all B. subtilis genes under 104 different conditions and in the construction of a first genome-reduced strain that lacked all prophages (4 to 6). The genome sequence was generated with individually cloned genome fragments and hand-casted sequencing gels. It is thus not surprising that the genome sequence and also the list of essential genes has undergone revisions (7 to 9).

B. subtilis is a bacterium that was subject to intensive proteome research even before the word “proteome” existed. This line of research was pioneered by Michael Hecker and was performed with the goal of getting a map of all proteins and the patterns of their abundance during different growth stages (10). In the early days, before the use of tandem mass spectrometry for protein identification, the proteins were excised from gels and identified by N-terminal sequencing. In this way, all the proteins involved in central carbon metabolism and their regulation by glucose could be studied (11), and the global regulation of protein synthesis could even by visualized in a “movie of life” (12). Today, relative quantifications are available for all proteins, and absolute numbers (i.e., copy numbers per cell) are available for many proteins (13 to 15). Recently, proteome analysis was taken even a step further, and the global protein interactome was studied by in vivo cross-linking coupled with mass spectrometry (16). This was the first time that such an approach, which is bioinformatically challenging, was applied to a complex bacterium. The study identified a large number of novel interactions, many of them involving proteins of unknown function. This is an excellent starting point for the functional identification of such proteins, and indeed, PdhI, a novel inhibitory protein of pyruvate dehydrogenase, has been identified by this approach (16).

The development of the field of synthetic biology has drawn a lot of interest in the construction of minimal cells, with the aim of understanding the roles of all remaining components of the cell. This goal can be reached by bottom-up or top-down approaches. The artificial construction of a genome and of a living cell based on this designed genome has so far only been possible for one species, Mycoplasma mycoides. The generated artificial organism M. mycoides Syn3A contains the smallest known genome that allows host-independent growth (17). B. subtilis is one of the bacteria for which genome minimization by a top-down approach was attempted. In a first step, the set of genes that are likely to be required in a minimal organism was identified. It comprises 523 and 119 genes coding for proteins and RNAs, respectively (18). Based on this blueprint, the B. subtilis genome was reduced by 40%, which is the most significant genome reduction that has so far been achieved for any complex bacterium (13, 19). Interestingly, due to the deletion of all protease-encoding genes, these strains proved to be superior for the production of otherwise difficult secreted proteins, as shown for different staphylococcal antigens (20).

The availability of a large research community and the generation of different types of data on an organism are the keys to making advances in its understanding. However, all this information is much more valuable if it is integrated in one database. The B. subtilis scientific community can make use of the database SubtiWiki, which integrates all types of information in an intuitive and interactive manner (21). This is essential for the development of novel research hypotheses and their experimental validation, which may in turn result in the identification of new functions or new regulatory or physical interactions. To the best of our knowledge, SubtiWiki is the only organism-specific database for bacteria that fully integrates all information and is completely free to use.

B. SUBTILIS의 게놈과 프로테옴

지난 세기 90년대는

게놈 혁명의 시작을 알렸으며,

B. subtilis의 게놈 서열은 최초로 발표된 것 중 하나였습니다(3).

이는 프랭크 쿤스트(Frank Kunst)가

주도한 대규모 유럽-일본 공동 연구를 통해 이루어졌다.

이 협력은

유럽 내 B. subtilis 연구실 간의 장기적 협력의 시초가 되었으며,

결국 104가지 서로 다른 조건 하에서 모든 B. subtilis 유전자의 발현 프로파일을 규명하는 데

필수적인 유전자 집합의 초기 식별과

모든 프로파지를 결손시킨 최초의 게놈 축소 균주 구축으로 이어졌다(4 ~ 6).

게놈 서열은

개별적으로 클로닝된 게놈 단편과 수작업으로 주조한 시퀀싱 겔을 통해 생성되었습니다.

따라서

게놈 서열과 필수 유전자 목록이 수정을 거친 것은 놀라운 일이 아닙니다(7 ~ 9).

B. subtilis는

“프로테옴”이라는 용어가 존재하기 전부터

집중적인 프로테옴 연구 대상이 된 박테리아입니다.

이 연구 분야는 마이클 헤커(Michael Hecker)가 개척했으며,

다양한 성장 단계에서 모든 단백질의 지도와 그 풍부도 패턴을 파악하는 것을 목표로 수행되었습니다(10).

초기에는 단백질 식별을 위한 탠덤 질량 분석법이 사용되기 전이었기에,

단백질은 겔에서 절단되어 N-말단 시퀀싱을 통해 식별되었습니다.

이를 통해 중심 탄소 대사 및 포도당에 의한 그 조절에 관여하는 모든 단백질을 연구할 수 있었으며(11),

단백질 합성의 전역적 조절은 “생명의 영화”로 시각화되기도 했다(12).

오늘날에는 모든 단백질에 대한 상대적 정량화가 가능하며,

많은 단백질에 대해 절대적 수치(즉, 세포당 복제 수)도 확인할 수 있다(13 ~ 15).

최근에는 프로테옴 분석이 한 단계 더 발전하여

생체 내 교차결합과 질량 분석법을 결합한 방식으로

전역적 단백질 상호작용체 연구가 수행되었다(16).

이는 생물정보학적으로 도전적인

이 접근법이 복잡한 세균에 처음으로 적용된 사례였다.

이 연구를 통해 다수의 새로운 상호작용이 확인되었으며,

그중 상당수는 기능이 알려지지 않은 단백질들을 포함하고 있었다.

이는 해당 단백질들의 기능적 규명을 위한 탁월한 출발점이 되었으며,

실제로 피루브산 탈수소효소의 새로운 억제 단백질인 PdhI가 이 접근법을 통해 확인되었다(16).

합성생물학 분야의 발전은

세포의 모든 잔여 구성 요소의 역할을 이해하기 위한

최소 세포 구축에 많은 관심을 불러일으켰다.

이 목표는 상향식(bottom-up) 또는 하향식(top-down) 접근법으로 달성될 수 있다.

이러한 설계된 게놈을 기반으로 한 인공 게놈 및 살아있는 세포의 인공적 구축은

지금까지 단 하나의 종인 Mycoplasma mycoides에서만 가능했습니다.

생성된 인공 유기체 M. mycoides Syn3A는 숙주 독립적 성장을 가능하게 하는 가장 작은 알려진 게놈을 포함합니다(17).

B. subtilis는

탑다운 접근법을 통한 게놈 최소화가 시도된 박테리아 중 하나입니다.

첫 단계로 최소 유기체에 필요할 것으로 예상되는 유전자 집합을 식별하였다.

이는 단백질과 RNA를 각각 암호화하는 523개와 119개 유전자로 구성된다(18).

이 청사진을 바탕으로 B. subtilis 게놈을 40% 축소하였으며,

이는 현재까지 복잡한 세균에서 달성된 가장 큰 규모의 게놈 축소 사례이다(13, 19).

흥미롭게도,

모든 프로테아제 암호화하는 유전자의 삭제 덕분에 이 균주들은

다양한 포도상구균 항원 사례에서 입증된 바와 같이, 생산이 어려운 분비 단백질 생산에 더 적합한 것으로 나타났다(20).

광범위한 연구 커뮤니티의 존재와 특정 생물체에 대한 다양한 유형의 데이터 생성은

그 이해를 진전시키는 핵심 요소입니다.

그러나 이러한 모든 정보는

하나의 데이터베이스에 통합될 때 훨씬 더 가치가 높아집니다.

B. subtilis 과학 커뮤니티는 모든 유형의 정보를 직관적이고 상호작용적인 방식으로 통합한 데이터베이스 SubtiWiki를 활용할 수 있습니다(21). 이는 새로운 연구 가설의 개발과 실험적 검증을 위해 필수적이며, 이는 다시 새로운 기능이나 새로운 조절적·물리적 상호작용의 발견으로 이어질 수 있습니다. 저희가 아는 한, SubtiWiki는 모든 정보를 완전히 통합하고 완전히 무료로 사용할 수 있는 유일한 박테리아 전용 생물체 특이적 데이터베이스입니다.

THE CONTROL OF SPORULATION IN B. SUBTILIS—A TALE OF THE VALUE OF SCIENTIFIC CONTROVERSY

As mentioned above, the ability of B. subtilis to form heat-resistant spores was already discovered in the 19th century by Ferdinand Cohn. The elucidation of the underlying molecular program has been a long-lasting endeavor of the B. subtilis scientific community. Jim Hoch and Richard Losick, two of the heroes of Bacillus research, discovered that sporulation is controlled by a regulated genetic program. Hoch found that a complex two-component system, later called the phosphorelay, with Spo0A as the central player was critical to the onset of sporulation (22, 23). Losick studied the RNA polymerase and discovered the involvement of several alternative sigma factors in the genetic program of sporulation (24). How was this possible? Who of them was right and who was wrong? Was the two-component system not something that is typical for E. coli, whereas alternative sigma factors are a hallmark of the B. subtilis genetic system? Later on, when the activity control of some of the alternative sigma factors was studied, Losick found that the activity of the sporulation sigma factor SigF is controlled via protein–protein interactions by an antisigma factor and an anti-antisigma factor (25). In contrast, at the same time, Michael Yudkin discovered that the antisigma factor SpoIIAB, which is encoded just upstream of SigF, is in fact a protein kinase (26). These results were the subject of a battle rather than a discussion at the International Bacillus Conference 1993 in Paris. In both controversies, it turned out that both initially contradicting findings were correct, and that they had to be assembled to get the full picture. These discussions illustrate the importance of integrating different views as well as the value of good and careful experimental work.

B. SUBTILIS의 포자 형성 조절—과학적 논쟁의 가치에 관한 이야기

앞서 언급한 바와 같이,

B. subtilis가 내열성 포자를 형성하는 능력은

이미 19세기 페르디난트 코른(Ferdinand Cohn)에 의해 발견되었습니다.

그 기저에 있는 분자적 프로그램의 규명은

B. subtilis 과학계가 오랫동안 노력해 온 과제였습니다.

Bacillus 연구의 두 영웅인 짐 호크(Jim Hoch)와 리처드 로식(Richard Losick)은

포자 형성이 조절된 유전적 프로그램에 의해 제어된다는 사실을 발견했습니다.

호흐는 스포0A(Spo0A)를 핵심 요소로 하는 복잡한 이원계 시스템(후에 인산 전달 체계(phosphorelay)로 명명됨)이 포자 형성 개시에 결정적 역할을 한다는 사실을 발견했다(22, 23). 로식은 RNA 중합효소를 연구하며 포자 형성 유전 프로그램에 여러 대체 시그마 인자(alternative sigma factors)가 관여함을 밝혀냈다(24).

어떻게 이런 일이 가능했을까?

둘 중 누가 옳고 누가 틀렸을까?

이중 구성 요소 시스템은 대장균(E. coli)에 전형적인 반면, 대체 시그마 인자는 B. subtilis 유전 시스템의 특징이 아니었을까? 이후 일부 대체 시그마 인자의 활성 조절을 연구하던 로식(Losick)은 포자 형성 시그마 인자 시그파(SigF)의 활성이 항시그마 인자와 항-항시그마 인자에 의한 단백질-단백질 상호작용을 통해 조절된다는 사실을 발견했다(25). 반면, 같은 시기 마이클 유드킨은 SigF 바로 상류에 암호화되는 항시그마 인자 SpoIIAB가 사실은 단백질 키나아제임을 발견했다(26). 이러한 결과들은 1993년 파리에서 열린 국제 Bacillus 학회에서 논의라기보다는 논쟁의 대상이 되었다. 두 논쟁 모두에서, 처음에는 서로 모순되는 것처럼 보였던 두 발견이 모두 옳았으며, 전체 그림을 얻기 위해서는 이들을 결합해야 한다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 논의는 서로 다른 관점을 통합하는 것의 중요성과 훌륭하고 신중한 실험 작업의 가치를 보여준다.

B. SUBTILIS AS A MODEL ORGANISM FOR CELL BIOLOGY

The role of B. subtilis as a major model in bacterial cell and developmental biology was greatly pushed by the discovery of its natural competence (27). The fact that B. subtilis produces endospores using a simple developmental program, further fueled the scientific interest. Here, fundamental biological principles in cell differentiation could be analyzed with the power of efficient bacterial genetics. Consequently, research on spore formation has led to a variety of tools that laid the foundations for bacterial cell biology (28). Early electron microscopy studies revealed various stages of sporulation (29). It was clear that it must be possible to dissect the molecular mechanisms behind this series of cellular events. Struck by the obvious beauty of the system, several laboratories started to engage in B. subtilis sporulation research. Sporulation of B. subtilis is initiated by nutrient limitation, and Joel Mandelstam took advantage of this in a resuspension method, by which sporulation could be timed and reliably analyzed (30). Sporulation is initiated by an asymmetric septum formation close to one cell pole. This clear subcellular differentiation was an ideal example to test protein localization in vivo. Only very shortly after the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as a tool for cell biology (31), the labs of Richard Losick and others used the technique to generate translational fusions to sporulation genes and to localize proteins within living cells (32, 33).

B. subtilis quickly became the model organism for studying cell wall synthesis, cytokinesis, and chromosome organization. B. subtilis is, like all Firmicutes, surrounded by a thick cell wall made of peptidoglycan (PG) and teichoic acids. This cell wall acts as an exoskeleton and thus maintains the shape of the cell. It was long thought that PG synthesis relies on the transglycosylation activity of class A penicillin-binding-proteins (PBPs) that have transglycosylation activity connecting the sugar moieties of the PG scaffold and transpeptidase activity to generate the cross-links of the stem peptide (34). An unexpected finding in B. subtilis was the recent discovery of the SEDS-protein RodA being a glycosyltransferase, responsible for PG synthesis (35). PG synthesis in the rod-shaped bacilli occurs at the lateral side by a multiprotein complex termed the elongasome (36). The elongasome complex includes the bacterial actin-homologue MreB. Although the presence of actin-like proteins in bacteria was known for several years, it was only the localization of MreB-GFP fusions in B. subtilis that really pushed the idea of a bacterial actin cytoskeleton (37, 38). Initially, it was thought that MreB formed extended, helical filaments along the cell membrane. However, modern microscopy techniques rather showed that MreB forms dynamic patches that require active PG synthesis for their dynamics (39, 40; see Fig. 1A). In B. subtilis, MreB and its two paralogs Mbl and MreBH seem to modulate PG synthesis to constrain circumference, thereby helping to form the rod morphology (41).

세포 생물학의 모델 생물로서의 B. SUBTILIS

B. subtilis가

세균 세포 및 발생 생물학의 주요 모델로서의 역할은

그 자연적 유전적 수용성(competence)의 발견(27)에 의해 크게 촉진되었다.

B. subtilis가

단순한 발생 프로그램을 사용하여 내포자를 생성한다는 사실은

과학적 관심을 더욱 부채질했다.

여기서 세포 분화의 근본적 생물학적 원리를 효율적인 박테리아 유전학의 힘으로 분석할 수 있었다.

결과적으로 포자 형성 연구는

박테리아 세포 생물학의 기초를 마련한 다양한 도구들을 이끌어냈다(28).

초기 전자 현미경 연구는 포자 형성 과정의 다양한 단계를 밝혀냈다(29). 이 일련의 세포적 사건 뒤에 숨은 분자적 메커니즘을 해부할 수 있어야 한다는 점이 분명해졌다. 이 시스템의 명백한 아름다움에 매료된 여러 연구실들이 B. subtilis 포자 형성 연구에 착수했다. B. subtilis의 포자 형성은 영양분 제한에 의해 시작되며, 조엘 맨델스탐(Joel Mandelstam)은 이를 재현탁법(resuspension method)에 활용하여 포자 형성을 시간별로 측정하고 신뢰성 있게 분석할 수 있었다(30). 포자 형성은 한쪽 세포 극 근처에서 비대칭 격막(septum)이 형성되면서 시작된다. 이러한 명확한 세포 내 분화는 단백질의 생체 내 국소화를 검증하기에 이상적인 사례였습니다. 녹색 형광 단백질(GFP)이 세포 생물학 도구로 도입된 지 얼마 지나지 않아(31), 리처드 로식(Richard Losick) 연구실 등 여러 연구팀이 이 기술을 활용해 포자 형성 유전자에 번역 융합체를 생성하고 살아있는 세포 내에서 단백질의 위치를 규명했습니다(32, 33).

B. subtilis는

세포벽 합성, 세포 분열, 염색체 조직 연구의 모델 생물로 빠르게 자리 잡았다.

B. subtilis는

모든 Firmicutes와 마찬가지로 펩티도글리칸(PG)과 테이코산으로 구성된

두꺼운 세포벽으로 둘러싸여 있다.

이 세포벽은 외골격 역할을 하여 세포의 형태를 유지한다.

오랫동안 PG 합성은 A형 페니실린 결합 단백질(PBPs)의 트랜스글리코실화 활성에 의존한다고 여겨져 왔는데, 이 단백질들은 PG 골격의 당 잔기를 연결하는 트랜스글리코실화 활성과 스템 펩타이드의 가교를 생성하는 트랜스펩티다아제 활성을 지녔다(34). 그러나 최근 B. subtilis에서 예상치 못한 발견이 있었는데, SEDS 단백질인 RodA가 당전달효소(glycosyltransferase)로서 PG 합성을 담당한다는 사실이 밝혀졌다(35). 막대 모양의 간균(bacilli)에서 PG 합성은 엘롱가좀(elongasome)이라 불리는 다중 단백질 복합체에 의해 측면에서 이루어진다(36). 엘롱가좀 복합체에는 박테리아 액틴 유사체 MreB가 포함된다. 박테리아 내 액틴 유사 단백질의 존재는 수년간 알려져 있었으나, B. subtilis에서 MreB-GFP 융합체의 국소화 연구가 박테리아 액틴 세포골격 개념을 본격적으로 제시했다(37, 38). 초기에는 MreB가 세포막을 따라 연장된 나선형 필라멘트를 형성한다고 여겨졌다. 그러나 현대 현미경 기술은 오히려 MreB가 동적 패치를 형성하며, 이 동적 특성은 활성 포도당 합성(PG synthesis)을 필요로 함을 보여주었다(39, 40; 그림 1A 참조). B. subtilis에서 MreB와 그 두 개의 파라로그(paralog)인 Mbl 및 MreBH는 포도당 합성을 조절하여 둘레를 제한함으로써 막대형 형태 형성에 기여하는 것으로 보인다(41).

그림 1.

FIG 1.

Open in a new tab

Subcellular localization of proteins in B. subtilis. (A) Localization of MreB-mCherry along the lateral sides the cell. (B) FtsZ-GFP (green) localization at midcell; nucleoids (DNA) are shown in blue and the plasma membrane in red. (C) Single molecule localization microscopy of the polar scaffold protein DivIVA (DivIVA-PA-mCherry). DivIVA localizes at both sides of the division septum and in cluster along the membrane. (D) Flotillin (FloT-GFP) patches along the plasma membrane in B. subtilis. Scale bars 1 μm (A and D) and 0.5 μm (B and C).

While the elongasome is regulated by MreB, cell wall synthesis at the site of cell division is governed by the bacterial tubulin homologue FtsZ. Early immune fluorescence imaging showed that FtsZ localizes precisely at midcell (42; see Fig. 1B); however, fluorescent fusions recently revealed that dynamic treadmilling of FtsZ drives Z-ring condensation and constriction, thereby directing septal PG synthesis (43). FtsZ recruits a set of proteins collectively termed the divisome. Work on B. subtilis revealed that the divisome assembles at least in two steps, first assembling an “inner ring” on the cytoplasmic side, and in a second step recruitment of the membrane integral to PG synthesis machinery and their regulatory proteins (44). Spatial regulation of FtsZ is governed by a ParB-like nucleoid occlusion protein Noc, which binds to specific DNA sequences on the chromosome and to the plasma membrane. This membrane anchoring likely sterically hinders FtsZ ring formation across the nucleoid (45). B. subtilis uses a variation of the miniature cell (Min) system to ensure that division takes place only once per cell cycle. The polar scaffold proteins DivIVA and MinJ recruit the MinCD complex to prevent divisome reassembly at previously used division sites (46). DivIVA uses the physical cue of negative membrane curvature at constricting septa for its positioning (47; see Fig. 1C).

B. subtilis was also a prime model organism for the study of chromosome organization and segregation. Since one copy of the genome has to be transferred into the prespore during sporulation, DNA segregation mutants were identified among sporulation mutants. These included Spo0J (ParB) and Soj (ParA). Studies on Spo0J/Soj localization in the lab of Jeff Errington proposed the idea of a “mitotic like DNA segregation” system, suggesting that DNA (or at least oriC) segregation in bacteria can be an actively driven process (48). Again, work in B. subtilis revealed that Spo0J (ParB) is a CTPase and that CTP binding and hydrolysis act as a molecular switch that allows binding, spreading, and release of ParB-like proteins from DNA (49). Spo0J is required to load the structural maintenance of chromosome SMC onto the chromosome close to the origin of replication (50, 51). SMC brings the replichore arms together and is likely compacting the chromosome by a loop extrusion mechanism. Failing to load SMC leads to a block in oriC segregation (52).

In the last decade, B. subtilis has also become a model system to study plasma membrane organization and membrane fluidity (53). Several proteins that were thought to be eukaryotic inventions are actually present in B. subtilis. Among those are the flotillins FloA and FloT that are highly similar to their eukaryotic counterparts (54; Fig. 1D). Flotillins regulate membrane fluidity and membrane domain formation (55, 56). Lack of these activities leads to pleiotropic phenotypes in cell wall synthesis, biofilm formation, and signaling. Membrane surveillance and repair was shown to include the dynamin-like protein DynA (57). Again, the elaborated molecular biological toolbox allowed fast progress of membrane research in B. subtilis, likely securing B. subtilis a seat at the forefront of membrane biology research.

B. subtilis에서 단백질의 세포 내 국소화. (A) 세포 측면을 따라 MreB-mCherry의 국소화. (B) 세포 중앙에서의 FtsZ-GFP(녹색) 국소화; 핵소체(DNA)는 파란색, 세포막은 빨간색으로 표시됨. (C) 극성 스캐폴드 단백질 DivIVA(DivIVA-PA-mCherry)의 단일 분자 국소화 현미경. DivIVA는 분열 격막 양측과 막을 따라 군집 형태로 국소화된다. (D) B. subtilis에서 세포막을 따라 나타나는 플로틸린(FloT-GFP) 패치. 스케일 바: 1μm(A, D) 및 0.5μm(B, C).

엘롱가좀은 MreB에 의해 조절되는 반면, 세포 분열 부위의 세포벽 합성은 박테리아 튜불린 동족체 FtsZ에 의해 지배된다. 초기 면역 형광 이미징은 FtsZ가 정확히 세포 중간부(midcell)에 국소화됨을 보여주었다(42; 그림 1B 참조). 그러나 최근 형광 융합 단백질 연구는 FtsZ의 동적 트레드밀링(treadmilling)이 Z-링 응축 및 수축을 주도하여 분열막 포도당질(PG) 합성을 유도함을 밝혀냈다(43). FtsZ는 분열체(divisome)로 통칭되는 단백질 집합체를 모집한다. B. subtilis에 대한 연구에 따르면, 분열체는 적어도 두 단계로 조립됩니다. 첫 번째 단계에서는 세포질 측에 “내부 고리”를 조립하고, 두 번째 단계에서는 PG 합성 기구와 그 조절 단백질에 필수적인 막을 모집합니다 (44). FtsZ의 공간적 조절은 ParB와 유사한 핵소체 폐쇄 단백질 Noc에 의해 제어되며, Noc는 염색체의 특정 DNA 서열과 세포막에 결합합니다. 이러한 막 고정 작용은 핵소체를 가로지르는 FtsZ 고리 형성을 입체적으로 방해할 가능성이 높다(45). B. subtilis는 세포 주기당 분열이 한 번만 일어나도록 하기 위해 미니어처 세포(Min) 시스템의 변형을 사용한다. 극성 스캐폴드 단백질 DivIVA와 MinJ는 MinCD 복합체를 모집하여 이전에 사용된 분열 부위에서 분열체 재조립을 방지한다(46). DivIVA는 수축 중인 격막의 음의 막 곡률이라는 물리적 신호를 위치 결정에 활용한다(47; 그림 1C 참조).

B. subtilis는 염색체 조직화와 분리를 연구하는 주요 모델 생물이기도 했다. 포자 형성 과정에서 게놈의 한 사본이 전포자(prespore)로 전달되어야 하므로, 포자 형성 돌연변이체들 사이에서 DNA 분리 돌연변이체들이 확인되었다. 여기에는 Spo0J(ParB)와 Soj(ParA)가 포함된다. Jeff Errington 연구실에서 수행된 Spo0J/Soj 국소화 연구는 “유사 분열적 DNA 분리” 시스템이라는 개념을 제안하며, 박테리아에서 DNA(또는 최소한 oriC) 분리가 능동적으로 유도되는 과정일 수 있음을 시사했다(48). 다시 한번, B. subtilis 연구를 통해 Spo0J(ParB)가 CTPase이며, CTP 결합 및 가수분해가 ParB 유사 단백질의 DNA 결합, 확산 및 방출을 가능하게 하는 분자 스위치 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다(49). Spo0J는 복제 기점 근처의 염색체에 염색체 구조 유지 단백질 SMC를 부착하는 데 필요하다(50, 51). SMC는 복제권 팔을 함께 모으고 루프 압출 메커니즘을 통해 염색체를 압축하는 것으로 보인다. SMC 로딩 실패는 oriC 분리 차단으로 이어진다(52).

지난 10년간 B. subtilis는 또한 세포막 조직과 막 유동성 연구를 위한 모델 시스템이 되었다 (53). 진핵생물에서만 존재한다고 여겨졌던 여러 단백질들이 실제로 B. subtilis에 존재한다. 그중에는 진핵생물 단백질과 매우 유사한 플로틸린 FloA와 FloT가 포함된다(54; 그림 1D). 플로틸린은 막 유동성과 막 도메인 형성을 조절한다(55, 56). 이러한 기능의 결핍은 세포벽 합성, 생물막 형성 및 신호전달에서 다중표현형(pleiotropic phenotypes)을 유발한다. 막 감시 및 수리 과정에는 다이나민 유사 단백질 DynA가 관여하는 것으로 밝혀졌다(57). 다시 한번, 정교한 분자생물학적 도구 상자는 B. subtilis에서의 막 연구를 빠르게 진전시켰으며, 이는 B. subtilis가 막 생물학 연구의 최전선에 자리매김하는 데 기여했을 것이다.

IMPORTANT DISCOVERIES MADE WITH B. SUBTILIS

The research with B. subtilis has resulted in important discoveries in many fields. In the early days of molecular biology, many researchers thought that what was true for E. coli was also true for all other bacteria and maybe even the elephant. The research of the past few years has shown that B. subtilis rather than E. coli can serve as a model at least for many bacteria.

The first paradigm of a regulatory mechanism was the dual control of the E. coli lac operon by lactose as the inducer and glucose that caused carbon catabolite repression. The latter regulation acts via the signal molecule cyclic AMP and a dedicated receptor protein that serves as transcription activator for the lac and many other catabolic operons (58). However, neither cAMP nor its receptor protein are present in B. subtilis, even though glucose causes catabolite repression in this bacterium as well. Pioneering work in the lab of Milton Saier identified that HPr, a small protein that is part of the PTS, a protein cascade of consecutively phosphorylated proteins that finally transport and phosphorylate a set of sugars, can be phosphorylated at a second site (Ser-46) in addition to the phosphorylation site used for sugar uptake (59). Moreover, this phosphorylation depends on the availability of glucose. Later, it could be shown in the lab of Wolfgang Hillen that this regulatory form of HPr phosphorylated on Ser-46 acts as the cofactor of the transcription repressor CcpA and that this complex in fact is responsible for catabolite repression in B. subtilis (60). Yet, the protein kinase that is responsible for the phosphorylation of HPr on Ser-46 was still unknown and was the subject of intensive research in many labs. Finally, only the availability of the B. subtilis genome sequence allowed the identification of the gene based on the N-terminal amino acid sequence of the purified protein. After a highly competitive race, two groups eventually identified the hprK gene and characterized the corresponding protein (61, 62).

For a long time, it was generally assumed that bacterial populations grow homogeneously and that all cells in a culture have identical properties. However, we now know that differentiation of cell types, such as the development of genetic competence or of biofilms, only takes place in subpopulations within B. subtilis cultures (see Fig. 2). Indeed, each cell must decide to go its own path, and once this decision is made, the complete program is expressed until the cells are competent or form a biofilm. Pioneering work in this field was made in the labs of David Dubnau and Oscar Kuipers. Decision-making is based on so-called bistable switches that decide about the expression‎ of key regulators, ComK and SinR in the case of genetic competence and biofilm formation (63 to 65). A B. subtilis biofilm displays features of multicellularity that we know from eukaryotes like fungi, with distinct localization of activities within the biofilm and division of labor, with some cells producing the extracellular matrix, while others sporulate (66, 67). As shown by Nicola Stanley-Wall, the B. subtilis biofilm is coated by a hydrophobic protein, BslA, which repels water more efficiently than even Teflon, providing exquisite protection from phage predation and water-soluble antimicrobials (68; see Fig. 3).

B. SUBTILIS를 통해 이루어진 중요한 발견들

B. subtilis 연구는

다양한 분야에서 중요한 발견을 이끌어냈다.

분자생물학 초기에는 많은 연구자들이 E. coli에 적용되는 것이

다른 모든 박테리아, 심지어 코끼리에게도 적용될 것이라고 생각했다.

그러나 최근 몇 년간의 연구는

E. coli보다 B. subtilis가 적어도 많은 박테리아에 대한 모델로

더 적합할 수 있음을 보여주었다.

규제 기전의 첫 번째 패러다임은 유도체인 락토오스와 탄소 분해 억제를 유발하는 포도당에 의한 대장균 lac 오페론의 이중 조절이었다. 후자의 조절은 신호 분자인 사이클릭 AMP(cAMP)와 전용 수용체 단백질을 통해 작용하며, 이 수용체 단백질은 lac 및 기타 많은 분해 오페론의 전사 활성화제 역할을 한다(58). 그러나 B. subtilis에는 cAMP도 그 수용체 단백질도 존재하지 않음에도, 이 박테리아에서도 포도당이 분해 억제를 유발한다. 밀턴 사이어 연구실의 선구적 연구를 통해, PTS(단백질 전이 시스템)의 일부인 소단백질 HPr이 포도당 흡수에 사용되는 인산화 부위(Ser-46) 외에도 두 번째 부위(Ser-46)에서 인산화될 수 있다는 사실이 밝혀졌다(59). 더욱이 이 인산화는 포도당 가용성에 의존한다. 이후 볼프강 힐렌 연구실에서 Ser-46에 인산화된 이 조절 형태의 HPr이 전사 억제인자 CcpA의 보조인자 역할을 하며, 이 복합체가 실제로 B. subtilis에서 대사 억제를 담당한다는 사실이 밝혀졌다(60). 그러나 HPr의 Ser-46 인산화를 담당하는 단백질 키나아제는 여전히 알려지지 않았으며, 여러 연구실에서 집중적인 연구 대상이 되었다. 결국, B. subtilis 게놈 서열의 확보를 통해 정제된 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 기반으로 한 유전자 동정이 가능해졌다. 치열한 경쟁 끝에 두 연구 그룹이 결국 hprK 유전자를 동정하고 해당 단백질을 규명하였다(61, 62).

오랫동안 박테리아 군집은 균일하게 성장하며 배양액 내 모든 세포가 동일한 특성을 가질 것으로 일반적으로 가정되어 왔다. 그러나 현재 우리는 유전적 유능성 발달이나 생물막 형성과 같은 세포 유형의 분화가 B. subtilis 배양 내 일부 하위 집단에서만 발생한다는 사실을 알고 있다(그림 2 참조). 실제로 각 세포는 자신의 길을 선택해야 하며, 일단 결정되면 유능성을 획득하거나 생물막을 형성할 때까지 전체 프로그램이 발현된다. 이 분야의 선구적 연구는 데이비드 더브나우(David Dubnau)와 오스카르 쿠이퍼스(Oscar Kuipers) 연구실에서 이루어졌다. 결정 과정은 소위 이중안정성 스위치(bistable switches)에 기반하며, 이는 유전적 유능성과 생물막 형성의 경우 핵심 조절인자인 ComK와 SinR의 발현을 결정한다(63 ~ 65). B. subtilis 생물막은 곰팡이와 같은 진핵생물에서 관찰되는 다세포성 특징을 보여줍니다. 생물막 내 활동의 명확한 국소화와 분업이 이루어지며, 일부 세포는 세포외 기질을 생성하는 반면 다른 세포는 포자화를 진행합니다(66, 67). 니콜라 스탠리-월(Nicola Stanley-Wall)이 밝힌 바와 같이, B. subtilis 생물막은 테플론보다도 더 효율적으로 물을 밀어내는 소수성 단백질 BslA로 코팅되어 있어, 파지 포식 및 수용성 항균제로부터 탁월한 보호 기능을 제공합니다(68; 그림 3 참조).

FIG 2.

Open in a new tab

Bistable expression‎ of motility and biofilm genes. Fluorescence microscopy of cells harboring both Phag-cfp and either PtapA-yfp fusion in a wild-type strain of B. subtilis. Cells were observed using fluorescence microscopy. Phag-CFP was false, colored in blue, and PtapA-YFP in yellow. (Reproduced from reference 108).

FIG 3.

Open in a new tab

Biofilm formation of B. subtilis. (A) Colony of B. subtilis on agar surface. (B) B. subtilis biofilm surfaces are highly hydrophobic. A drop of colored water (5 μL) is placed on top of the colony. (C) Scanning electron microscopy of a B. subtilis biofilm. Note the evenly covered surface of the biofilm, which occurs because of the hydrophobic protein BslA. (D) Transmission electron microscopy image of a thin section through a B. subtilis biofilm. Cells at the bottom of the biofilm tend to lyse and appear lighter. Scale bars are 0.5 cm (A) and 10 μm (C and D).

A field of research that was most strongly stimulated by discoveries with B. subtilis is the field of RNA switch-mediated regulation of gene expression‎. The expression‎ of several sugar catabolic operons is controlled by mutually exclusive RNA structures that upon binding of a regulatory protein adopt a structure that allows transcription, whereas a transcription terminator is formed in the absence of the proteins (69). In the case of the tryptophan biosynthetic operon, binding of a ring-like protein in the presence of tryptophan causes transcription termination (70). While such protein-mediated regulation fits very well into the general picture of gene expression‎, work in the lab of Tina Henkin identified something very unexpected: there are RNA switches, the T-boxes that are controlled by interaction with tRNAs. The T-boxes are present upstream of genes involved in amino acid homeostasis, and the genes are induced by starvation for the cognate amino acid as a result of an interaction between the uncharged tRNA and the T-box RNA that leads to transcription read-through (71, 72). Even more spectacular was the discovery of RNA switches that are triggered by metabolites, the so-called riboswitches. Again, the Henkin lab pioneered in identifying a so-called S-box regulatory RNA element upstream of many genes involved in methionine biosynthesis (73). In this case, S-adenosylmethionine binds to the S-box and induces a structural change that results in transcription termination (74). In parallel, Ron Breaker identified RNA structures that bind thiamine and FMN and coined the term riboswitch for small molecule-binding RNA switches (75, 76). Bioinformatic analyses revealed that riboswitches are widespread in bacteria and that they can bind a multitude of different molecules, among them metal ions, ribonucleotide-based intermediates of metabolism, and second messengers (77). This link between riboswitches and RNA-based nucleotides can be seen as a remainder of the RNA world that preceded the current protein-based life (78).

Ground-breaking discoveries have been made with B. subtilis in many fields of research. Several metal ions are essential for life, but they may become toxic at high intracellular concentrations. The lab of John Helmann has made significant contributions to this research area (79). Regulation of amino acid homeostasis has for a long time been studied by Boris Belitsky and Linc Sonenshein. They have discovered that B. subtilis contains an active glutamate dehydrogenase, RocG, that converts glutamate to 2-oxoglutarate. This enzyme is part of the arginine degradative pathway. In contrast, a second, constitutively expressed glutamate dehydrogenase, GudB, is cryptic in laboratory strains in B. subtilis (80, 81). However, in undomesticated strains, GudB is active and is the major player in glutamate utilization. Recently it was discovered that the activity of GudB is inhibited in wild-type strains by direct interaction of the enzyme with the biosynthetic enzyme glutamate dehydrogenase GltAB. In this way, the formation of a futile cycle that would result in a waste of glutamate can be prevented. This kind of interaction of opposing enzymes has been coined counterenzyme complex (82). A huge variety of regulatory systems that respond to distinct external stimuli have been discovered in B. subtilis and other bacteria. Recently, it has been shown that electrochemical signaling using potassium ions plays an important role in spore germination and biofilm formation in B. subtilis (83, 84). Glyphosate is an herbicide that is used worldwide. The weed killer inhibits the 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, which is essential for the synthesis of aromatic amino acids. However, until recently, no transporter for this important molecule has been identified. Using B. subtilis as the model organism, it could be demonstrated that glyphosate enters the cell via a glutamate transporter, GltT (85). Most phototrophic organisms as well as animals possess an internal circadian clock. In humans, this clock is responsible for the control of the sleep–wake cycle. The recent discovery of a circadian clock in the nonphotosynthetic bacterium B. subtilis (86) came as quite a surprise and indicates that there is likely much more hidden in the biology of this bacterium that deserves further research. The large body of knowledge that we have about this bacterium will now also allow us to study proteins and functions for which our knowledge is still limited (87).

B. subtilis의 생물막 형성. (A) 한천 표면의 B. subtilis 콜로니. (B) B. subtilis 생물막 표면은 높은 소수성을 띤다. 착색된 물 한 방울(5μL)을 콜로니 위에 떨어뜨렸다. (C) B. subtilis 생물막의 주사전자현미경(SEM) 사진. 소수성 단백질 BslA로 인해 생물막 표면이 균일하게 덮여 있는 것을 확인할 수 있다. (D) B. subtilis 생물막을 통과하는 얇은 단면의 투과전자현미경(TEM) 이미지. 생물막 하부의 세포는 용해되는 경향이 있어 더 밝게 보인다. 척도 막대는 0.5cm(A) 및 10μm(C와 D)이다.

B. subtilis 연구를 통해 가장 크게 촉진된 연구 분야는 RNA 스위치에 의한 유전자 발현 조절 분야이다. 여러 당 분해 대사와 관련된 오페론의 발현은 상호 배타적인 RNA 구조에 의해 조절된다. 이 구조는 조절 단백질이 결합하면 전사를 허용하는 형태를 취하는 반면, 단백질이 결여된 상태에서는 전사 종결자가 형성된다(69). 트립토판 생합성 오페론의 경우, 트립토판 존재 하에서 고리 모양 단백질의 결합이 전사 종결을 유발한다(70). 이러한 단백질 매개 조절은 유전자 발현의 일반적 그림에 매우 잘 부합하지만, 티나 헨킨 연구실의 연구는 매우 예상치 못한 것을 밝혀냈다: tRNA와의 상호작용에 의해 조절되는 RNA 스위치인 T-박스(T-box)가 존재한다는 것이다. T-박스들은 아미노산 항상성 관련 유전자 상류에 존재하며, 해당 아미노산 결핍 시 비충전 상태의 tRNA와 T-박스 RNA 간 상호작용으로 인해 전사 통과가 유도되어 유전자 발현이 촉진된다(71, 72). 더욱 놀라운 발견은 대사산물에 의해 작동되는 RNA 스위치, 이른바 리보스위치였다. 다시 한번, 헨킨 연구실은 메티오닌 생합성에 관여하는 여러 유전자 상류에서 소위 S-박스 조절 RNA 요소를 최초로 확인했습니다(73). 이 경우 S-아데노실메티오닌이 S-박스에 결합하여 구조적 변화를 유도하고, 이는 전사 종결로 이어집니다(74). 동시에 론 브레이커(Ron Breaker)는 티아민과 FMN을 결합하는 RNA 구조를 확인하고, 소분자 결합 RNA 스위치에 대해 '리보스위치'라는 용어를 만들었습니다(75, 76). 생물정보학적 분석을 통해 리보스위치가 박테리아에 널리 분포하며 금속 이온, 리보뉴클레오티드 기반 대사 중간체, 제2신호물질 등 다양한 분자를 결합할 수 있음이 밝혀졌다(77). 리보스위치와 RNA 기반 뉴클레오티드 간의 이러한 연관성은 현재의 단백질 기반 생명체 이전에 존재했던 RNA 세계의 잔재로 볼 수 있다(78).

B. subtilis를 이용한 획기적인 발견들이 다양한 연구 분야에서 이루어졌다. 여러 금속 이온은 생명에 필수적이지만, 세포 내 농도가 높아지면 독성이 될 수 있다. John Helmann 연구실은 이 연구 분야에 중요한 기여를 해왔다(79). 아미노산 항상성 조절은 오랫동안 보리스 벨리츠키(Boris Belitsky)와 린크 소넨샤인(Linc Sonenshein)에 의해 연구되어 왔다. 그들은 B. subtilis에 글루타메이트를 2-옥소글루타레이트로 전환하는 활성 글루타메이트 탈수소효소 RocG가 존재함을 발견했다. 이 효소는 아르기닌 분해 경로의 일부이다. 반면, 두 번째 상시 발현 글루타메이트 탈수소효소인 GudB는 B. subtilis 실험실 균주에서는 잠재적 상태이다(80, 81). 그러나 야생형 균주에서는 GudB가 활성 상태이며 글루타메이트 이용의 주요 역할을 담당한다. 최근 야생형 균주에서 GudB의 활성이 생합성 효소인 글루타메이트 탈수소효소 GltAB와의 직접적 상호작용에 의해 억제된다는 사실이 밝혀졌다. 이를 통해 글루타메이트 낭비를 초래할 수 있는 무의미한 순환(futile cycle)의 형성을 방지할 수 있다. 이러한 대립 효소 간의 상호작용은 대항효소 복합체(counterenzyme complex)라는 용어로 명명되었다(82). B. subtilis 및 기타 세균에서는 다양한 외부 자극에 반응하는 수많은 조절 시스템이 발견되었다. 최근에는 칼륨 이온을 이용한 전기화학적 신호 전달이 B. subtilis의 포자 발아 및 생물막 형성에 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다(83, 84). 글리포세이트는 전 세계적으로 사용되는 제초제이다. 이 제초제는 방향족 아미노산 합성에 필수적인 5-에놀피루비릴-시키메이트-3-인산 합성효소를 억제한다. 그러나 최근까지 이 중요한 분자를 운반하는 수송체는 확인되지 않았다. 모델 생물인 B. subtilis를 이용해 글리포세이트가 글루타메이트 수송체 GltT를 통해 세포 내로 유입된다는 사실이 입증되었다(85). 대부분의 광영양 생물과 동물은 내부 생체 시계를 가지고 있습니다. 인간에서는 이 시계가 수면-각성 주기 조절을 담당한다. 최근 광합성 능력이 없는 박테리아 B. subtilis에서 생체시계가 발견된 것은(86) 상당히 놀라운 일이며, 이 박테리아의 생물학에는 더 많은 연구가 필요한 숨겨진 부분이 많을 것임을 시사한다. 이 박테리아에 대해 우리가 보유한 방대한 지식은 이제 우리가 아직 잘 알지 못하는 단백질과 기능을 연구할 수 있게 해줄 것이다 (87).

B. SUBTILIS: AN ESSENTIAL WORKHORSE FOR INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY

There are multiple reasons why B. subtilis has become established as an important expression‎ host in the biotech industry. It is a robust, rapidly growing microorganism that efficiently and rapidly converts organic substrates into biotechnological products in short fermentation cycles. In addition, it also possesses the extraordinary ability to secrete large quantities of protein (20 to 25 g/L) into the culture medium, making it a frequent choice as an industrial platform organism for large-scale production of degradative enzymes and proteins (88). Numerous molecular biological tools for selective metabolic engineering have been developed in recent decades, including efficient, simple CRISPR Cas9 methods that allow researchers to edit the genome with base-by-base precision (89, 90).

Of all industrial processes utilizing B. subtilis to generate an organic molecule via fermentation, vitamin B2 (riboflavin) production is likely the most significant. As a precursor of flavin coenzymes (FAD, FMN), vitamin B2 is essential for metabolism in all living cells. For their growth and reproduction, animals and humans in particular depend on riboflavin intake in the form of nutritional supplements and feed additives. As such, research on microbial production methods began as early as the 1940s (91). According to more recent market estimates, approximately 12,700 metric tons of riboflavin were produced in 2021 at a value of nearly $400 million (USD) (https://www.mordorintelligence.com/industry-reports/riboflavin-market). Roughly 70% of this volume has traditionally been used for animal feeds, with the other 30% going to human nutritional supplements and/or pharmaceuticals.

From a biotechnology perspective, fermentative vitamin B2 production is the classic example of a biotech process replacing a chemical production process, having done so within just 15 years. The microbial production process delivers more than just economic benefits, however—it is especially valuable in many aspects of sustainability as well. Establishing today’s highly efficient processes required the use of all available methods of efficient strain and process development (see reference 92 for review). It is worth noting that the Russian Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, Moscow, used riboflavin in 1983 in an example of what was presumably the first genetically modified production strain created for a small organic molecule (88).

Riboflavin is not the only organic molecule, however, that can be produced using B. subtilis. The patent literature describes processes for producing pantothenic acid (vitamin B5) (88). In addition, B. subtilis is also known for producing a huge diversity of secondary metabolites such as surfactin and other lipopeptides such as fengycin (93). Another interesting, industrially significant substance produced by B. subtilis is γ-polyglutamic acid, an anionic homopolyamide consisting of D- and L-glutamic acid units that is used as a thickener, moisturizer, or antifreeze in the food and cosmetics industries (94).

In addition to their many uses in the food, beverage, textile, leather, detergent, and cleaning industries, large quantities of industrial enzymes are also needed in animal nutrition and various medical applications. The market for industrial enzymes was valued at approximately $6 billion in 2021 (https://www.mordorintelligence.com/industry-reports/industrial-enzymes-market). Here again, B. subtilis plays a critical role as an efficient, heterologous expression‎ host for hydrolytic enzymes such as proteases, amylases, and lipases (95). Protein secretion in B. subtilis and possibilities for its improvement have been extensively studied in the group of Jan Maarten van Dijl (20, 96, 97). In fact, enzymes produced with B. subtilis or close relatives such as Bacillus licheniformis are the major active compounds in all commercially available washing powders. In addition, B. subtilis is also the natural source of neutral and alkaline proteases, whose biological function guarantees access to organic materials in the soil. Because these intrinsic proteases negatively affect heterologous expression‎ of hydrolytic enzymes, however, the WB800N strain was produced, in which all 8 of the known B. subtilis proteases were inactivated (98). Recently, genome-reduced strains of B. subtilis were suggested to be superior hosts for the secretion of heterologous proteins (20).

Despite its wide variety of potential applications in industrial biotechnology, B. subtilis is often a source of unwelcome contamination problems in production facilities, as its biofilms can adhere to tubing and conduits, and its resilient spores are very difficult to remove.

B. SUBTILIS: 산업용 생명공학의 핵심 작업마

B. subtilis가

생명공학 산업에서 중요한 발현 숙주로 자리 잡은 데에는 여러 이유가 있다.

이 미생물은 강건하고 빠르게 성장하며,

짧은 발효 주기 동안 유기 기질을

효율적이고 신속하게 생명공학적 제품으로 전환한다.

또한 배지 내 대량의 단백질(20~25 g/L)을 분비하는 탁월한 능력을 지녀,

분해 효소 및 단백질의 대규모 생산을 위한 산업 플랫폼 유기체로 자주 선택됩니다(88).

최근 수십 년간 선택적 대사 공학을 위한 수많은 분자생물학적 도구들이 개발되었으며,

여기에는 연구자들이 염기 단위로 정밀하게 게놈을 편집할 수 있게 해주는

효율적이고 간단한 CRISPR Cas9 방법도 포함됩니다(89, 90).

B. subtilis를 활용하여 발효를 통해

유기 분자를 생성하는 모든 산업 공정 중에서

비타민 B2 (리보플라빈) 생산이 가장 중요할 것이다.

플라빈 보조효소(FAD, FMN)의 전구체인 비타민 B2는

모든 생체 세포의 대사에 필수적이다.

동물, 특히 인간은 성장과 번식을 위해 영양 보충제나 사료 첨가제 형태로 리보플라빈을 섭취해야 한다. 이에 따라 미생물 생산 방법에 대한 연구는 1940년대 초반부터 시작되었다(91). 최근 시장 추정치에 따르면, 2021년 약 12,700메트릭톤의 리보플라빈이 생산되었으며 그 가치는 약 4억 달러(USD)에 달합니다(https://www.mordorintelligence.com/industry-reports/riboflavin-market). 이 중 약 70%는 전통적으로 동물 사료에 사용되었으며, 나머지 30%는 인간 영양 보충제 및/또는 의약품에 공급되었습니다.

생명공학적 관점에서 발효를 통한 비타민 B2 생산은

화학 생산 공정을 대체한 생명공학적 공정의 전형적인 사례로,

불과 15년 만에 이를 달성했습니다.

그러나 미생물 생산 공정은 경제적 이점 이상의 가치를 제공합니다—지속가능성의 여러 측면에서도 특히 중요합니다.

오늘날의 고효율 공정 확립에는 효율적인 균주 및 공정 개발을 위한 모든 가능한 방법의 활용이 필요했습니다(리뷰는 참고문헌 92 참조).

주목할 점은 모스크바 소재 러시아 산업 미생물 유전학 및 선발 연구소가 1983년 리보플라빈을 사용하여 소분자 유기 화합물 생산을 위해 개발된 최초의 유전자 변형 생산 균주 사례를 제시했다는 것입니다(88).

그러나

리보플라빈만이 B. subtilis를 이용해 생산 가능한 유기 분자는 아닙니다.

특허 문헌에는

판토텐산(비타민 B5) 생산 공정이 기술되어 있습니다(88).

또한 B. subtilis는 서팩틴과 같은

다양한 2차 대사산물 및 펜기신과 같은 기타 지질펩타이드 생산으로도 알려져 있습니다(93).

B. subtilis가 생산하는 또 다른 흥미롭고 산업적으로 중요한 물질은

γ-폴리글루탐산으로, D- 및 L-글루탐산 단위로 구성된 음이온성 동종 폴리아미드이며,

식품 및 화장품 산업에서 증점제, 보습제 또는 부동액으로 사용됩니다(94).

식품, 음료, 섬유, 가죽, 세제 및 청소 산업에서의 다양한 용도 외에도,

산업용 효소는 동물 영양 및 다양한 의료 응용 분야에서도 대량으로 필요합니다.

2021년 산업용 효소 시장은

약 60억 달러 규모로 평가되었습니다(https://www.mordorintelligence.com/industry-reports/industrial-enzymes-market).

여기서도 B. subtilis는

프로테아제, 아밀라제, 리파제와 같은 가수분해 효소를 위한

효율적인 이종 발현 숙주로서 중요한 역할을 합니다(95).

B. subtilis에서의 단백질 분비 및 그 개선 가능성은 Jan Maarten van Dijl 연구팀에서 광범위하게 연구되었습니다(20, 96, 97).

실제로 B. subtilis 또는 Bacillus licheniformis와 같은 근연종으로 생산된 효소는

시판되는 모든 세탁 세제의 주요 활성 성분입니다.

또한 B. subtilis는 중성 및 알칼리성 프로테아제의 천연 공급원이며,

이들의 생물학적 기능은 토양 내 유기물 접근을 보장한다.

그러나 이러한 내재적 프로테아제가 가수분해 효소의 이종 발현에 부정적 영향을 미치기 때문에, 알려진

B. subtilis 프로테아제 8종 모두를 비활성화시킨 WB800N 균주가 개발되었다 (98).

최근, B. subtilis의 게놈 축소 균주가

이종 단백질 분비를 위한 우수한 숙주임이 제안되었다(20).

산업 생물공학 분야에서 다양한 잠재적 응용 가능성에도 불구하고,

B. subtilis는 생산 시설에서 종종 원치 않는 오염 문제의 원인이 된다.

그 생물막이 튜브와 도관에 부착될 수 있고,

그 탄력적인 포자는 제거하기가 매우 어렵기 때문이다.

APPLICATION OF B. SUBTILIS AS A PROBIOTIC

The term “probiotic” was first coined in 1954 to describe substances crucial to a healthy life. In 2001, a WHO expert committee proposed the following definition of probiotics, which remains valid today: “live microorganisms which, when consumed in appropriate amounts in food, confer a health benefit on the host” (99). In addition to representatives of the genus Lactobacillus, many Bacillus species, and especially strains of B. subtilis, have also been used in a variety of ways as probiotics for animals and humans.

Among its various metabolic properties, its ability to form spores in particular makes B. subtilis attractive as a probiotic. The heat resistance of Bacillus spores does more than ensure shelf-life stability of corresponding products at temperatures exceeding room temperature—it also means that manufacturers can mix the spores directly into animal feeds, which are pelletized at 80 to 85°C. In addition, many spores also survive the low-pH environment of the gastric passage and the bile acids of the small intestine. Once the spores germinate, the effects of the probiotics can be shown in the upper and, most especially, in the lower intestinal tract. Depending on the strain, Bacillus-based probiotics in particular exhibit a variety of different modes of action such as direct or indirect inhibition of pathogens. Certain probiotics also strengthen the intestinal barrier and the immune system, produce metabolites that other microbiota selectively metabolize (“cross-feeding”), or secrete enzymes that make indigestible food available to the host and to microbiota.

Based on the collected genetic information and the physiological properties of B. subtilis strains, the European Food Safety Authority (EFSA) has included the microbe on its Qualified Presumption of Safety (QPS) list, provided the strains used are not resistant to antibiotics and do not produce other toxic substances. Some of the enzymes produced by B. subtilis and used in industry, such as nattokinase, also have the “Generally Regarded as Safe” (GRAS) status with the U.S. Food and Drug Administration (FDA).

프로바이오틱스로서의 B. SUBTILIS 적용

“프로바이오틱스”라는 용어는

건강한 삶에 필수적인 물질을 설명하기 위해 1954년 처음 만들어졌다.

2001년 WHO 전문가 위원회는

프로바이오틱스에 대해 다음과 같은 정의를 제안했으며,

이는 현재까지 유효합니다:

“적정량으로 식품을 섭취할 때 숙주에게 건강상의 이점을 제공하는 생체 미생물” (99).

Lactobacillus 속의 대표균종 외에도,

많은 Bacillus 종, 특히 B. subtilis 균주들도 동물과 인간을 위한

프로바이오틱스로 다양한 방식으로 사용되어 왔습니다.

다양한 대사 특성 중에서도

특히 포자 형성 능력은

B. subtilis를 프로바이오틱스로 매력적으로 만듭니다.

Bacillus 포자의 내열성은 실온을 초과하는 온도에서

해당 제품의 유통기한 안정성을 보장할 뿐만 아니라,

제조업체가 포자를 80~85°C에서 펠릿화되는 동물 사료에 직접 혼합할 수 있음을 의미합니다.

또한 많은 포자는

위장관의 낮은 pH 환경과 소장의 담즙산에도 생존합니다.

포자가 발아하면 프로바이오틱스의 효과는

상부 장, 특히 하부 장에서 나타납니다.

균주에 따라 특히 바실러스 기반 프로바이오틱스는

병원체의 직접적 또는 간접적 억제 등 다양한 작용 방식을 보입니다.

일부 프로바이오틱스는 장 장벽과 면역 체계를 강화하거나, 다른 미생물 군집이 선택적으로 대사하는 대사 산물(“교차 공급”)을 생성하거나, 소화 불가능한 음식을 숙주와 미생물 군집이 이용할 수 있도록 하는 효소를 분비하기도 합니다.

수집된 유전 정보와 B. subtilis 균주의 생리적 특성에 근거하여, 유럽 식품안전청(EFSA)은 사용된 균주가 항생제 내성이 없고 다른 독성 물질을 생성하지 않는다는 전제 하에 이 미생물을 안전성 추정(QPS) 목록에 포함시켰습니다. 나토키나제와 같이 산업에서 사용되는 B. subtilis가 생성하는 일부 효소들은 미국 식품의약국(FDA)으로부터 “일반적으로 안전하다고 인정되는 물질(GRAS)” 지위를 획득하기도 했습니다.

B. SUBTILIS IN LIVESTOCK FARMING AND HUMAN USE

Bacillus-based probiotics for poultry and pig farming have been developed and launched as spore products as early as the late 1980s. Even at that time, the primary motivation was preventive control of pathogens and support for intestinal health as an alternative to the use of antibiotics. It should be emphasized that, at the time, the use of antibiotics went beyond medical justification—the lion’s share of these were what are known as antibiotic growth promoters (AGPs), which were used in subtherapeutic doses because they improved animals’ performance. The WHO sees a clear correlation between the growing use of antibiotics in livestock farming and in human and veterinary medicine, on the one hand, and the ever-growing spread of antibiotic-resistant bacteria limiting treatment options in hospitals, on the other. AGPs were therefore banned entirely in the EU starting in 2006. Other countries followed suit; nevertheless, quantities have gone up worldwide, with 73% of all antibiotic use in 2021 still attributable to meat production (https://www.fairr.org/index/key-findings/risk-opportunity-factors/antibiotics/).

The EU’s ban on AGPs, along with more restrictive prescription practices, have led to increased interest in alternative feed additives, whereby probiotics are considered to have the greatest potential. According to various market studies, the current size of the market for animal feed probiotics was approximately $2.7 billion in 2021 (https://www.feedandadditive.com/global-feed-probiotics-market/). Fragmented among hundreds of manufacturers, this market encompasses Bacillus as well as lactic acid bacteria and certain yeast products.

Subclinical necrotic enteritis, an illness caused by toxin-producing Clostridium perfringens strains, represents a huge challenge in the poultry industry, especially when producers need to do away with antibiotics. The disease produces lesions in the intestinal wall, resulting in losses on the order of $6 billion annually (100). Identifying and developing a Bacillus-based probiotic involved a complex screening process carried out on an extensive collection of 500 Bacillus strains. Covering over 20 parameters—including sporulation efficiency, heat resistance, survival under intestinal tract conditions, inhibition of pathogens such as C. perfringens (Fig. 4), and safety eval‎uation and production efficiency—the analysis led to, among other results, the identification of the strain B. subtilis DSM 32315 (101). The poultry product based on this strain was subjected to numerous animal studies in 2017 that successfully demonstrated its efficiency, particularly in C. perfringens models (102).

가축 사육 및 인간 사용에서의 B. SUBTILIS

가금류 및 돼지 사육용 Bacillus 기반 프로바이오틱스는 1980년대 후반에 이미 포자 제품으로 개발 및 출시되었습니다.

당시에도 주요 목적은 항생제 사용을 대체하는 병원체 예방적 관리 및 장 건강 지원이었습니다. 특히 당시 항생제 사용은 의학적 필요를 넘어선 측면이 컸다는 점을 강조해야 합니다. 그 대부분은 소위 항생제 성장 촉진제(AGPs)로, 치료 용량 미만으로 사용되어 가축의 생산성을 향상시켰습니다. 세계보건기구(WHO)는 축산업 및 인간·수의학 분야에서의 항생제 사용 증가와 병원 치료 옵션을 제한하는 항생제 내성균의 확산 사이에 명확한 상관관계를 확인했습니다. 이에 따라 EU에서는 2006년부터 AGP 사용을 전면 금지했습니다. 다른 국가들도 이를 따랐지만, 전 세계적으로 사용량은 증가했으며, 2021년 전체 항생제 사용량의 73%가 여전히 육류 생산에 기인한다(https://www.fairr.org/index/key-findings/risk-opportunity-factors/antibiotics/).

EU의 AGP 금지 조치와 더 엄격해진 처방 관행은 대체 사료 첨가제에 대한 관심을 높였으며, 그중 프로바이오틱스가 가장 큰 잠재력을 지닌 것으로 평가됩니다. 다양한 시장 조사에 따르면, 2021년 동물 사료용 프로바이오틱스 시장 규모는 약 27억 달러였습니다(https://www.feedandadditive.com/global-feed-probiotics-market/). 수백 개의 제조업체로 분산된 이 시장은 Bacillus(바실러스)뿐만 아니라 유산균 및 특정 효모 제품까지 포괄합니다.

독소 생성 Clostridium perfringens(클로스트리디움 퍼프린젠스) 균주에 의해 발생하는 질병인 아임상성 괴사성 장염은 특히 생산자들이 항생제 사용을 중단해야 할 때 가금류 산업에 큰 도전 과제를 제시합니다. 이 질병은 장벽에 병변을 유발하여 연간 약 60억 달러의 손실을 초래합니다(100). Bacillus 기반 프로바이오틱스의 식별 및 개발에는 500종의 광범위한 Bacillus 균주 컬렉션에 대한 복잡한 선별 과정이 수행되었습니다. 포자 형성 효율, 내열성, 장내 환경에서의 생존력, C. perfringens(그림 4)와 같은 병원균 억제력, 안전성 평가 및 생산 효율 등 20개 이상의 매개변수를 분석한 결과, B. subtilis DSM 32315 균주가 확인되었습니다(101). 이 균주를 기반으로 한 가금류 제품은 2017년 다수의 동물 연구를 거쳤으며, 특히 C. perfringens 모델에서 그 효능이 성공적으로 입증되었습니다(102).

FIG 4.

Open in a new tab

Pathogen Inhibition assay. To analyze the effect of B. subtilis on the pathogen Clostridium perfringens, the pathogenic strain was plated onto a Caso-Yeast agar plate. Small holes were punched into the agar and similar amounts of liquid Bacillus cultures or only medium as negative control were filled into them. The plates were incubated for 24 h under anaerobic conditions. The culture diffuses into the agar and inhibits the growth of C. perfringens around the holes. In comparison to the other two tested Bacillus strains, the culture of B. subtilis DSM 32315 shows the biggest inhibition halo and therefore the highest inhibition of C. perfringens.

The market for probiotic food supplements has traditionally been dominated by Lactobacillus strains and primarily addresses intestinal health. Market studies have shown that end-consumer sales of food supplements came to roughly $8.9 billion in 2019 (103). Enterogermina, registered in Italy in 1958, was one of the first over-the-counter medicinal supplements containing Bacillus-based probiotics. The product, claiming to strengthen the immune system, was marketed as containing four B. subtilis strains that were later reclassified as B. clausii. Recent years have also seen an increased focus on developing Bacillus-containing products to improve intestinal health.

Synbiotic concepts for improving intestinal health have shown particular innovation potential. A synbiotic is a combination of a living microorganism and a substrate selectively metabolized by host microorganisms that confers a health benefit on the host. When combined here with the L-alanyl-L-glutamine dipeptide, the B. subtilis DSM 32315 strain indicated above again produces surprising effects. Extensive studies have demonstrated that the presence of this synbiotic not only prompts microbiota to increase butyrate production in vitro—the same observation could even be confirmed via feces analyses in a human pilot study. In addition to serving as an important source of energy for enterocytes, butyrate has also been shown in the literature to have many benefits, which include strengthening intestinal integrity, improving the immune system and metabolic health, and producing anti-inflammatory effects. Surprisingly, blood analyses also revealed a positive impact on lipid and glucose metabolism in test subjects who had taken the synbiotic (104).

병원체 억제 분석. 병원체 Clostridium perfringens에 대한 B. subtilis의 효과를 분석하기 위해 병원성 균주를 카소-효모 한천 배지에 접종했습니다. 한천에 작은 구멍을 뚫고, 액체 Bacillus 배양액 또는 음성 대조군으로 배지만을 동일한 양으로 채웠다. 플레이트는 혐기성 조건에서 24시간 동안 배양되었다. 배양액은 한천으로 확산되어 구멍 주변의 C. perfringens 성장을 억제한다. 다른 두 가지 시험된 Bacillus 균주와 비교했을 때, B. subtilis DSM 32315 배양액은 가장 큰 억제 환을 보이며, 따라서 C. perfringens에 대한 가장 높은 억제 효과를 나타냈다.

프로바이오틱 식품 보조제 시장은 전통적으로 Lactobacillus 균주가 주도해 왔으며, 주로 장 건강을 대상으로 한다. 시장 조사에 따르면, 2019년 식품 보조제의 최종 소비자 판매액은 약 89억 달러에 달했다 (103). 1958년 이탈리아에서 등록된 엔테로제르미나(Enterogermina)는 Bacillus 기반 프로바이오틱스를 함유한 최초의 일반의약품 보조제 중 하나였습니다. 면역 체계 강화 효과를 주장한 이 제품은 4종의 B. subtilis 균주를 함유한 것으로 마케팅되었으나, 이후 B. clausii로 재분류되었습니다. 최근 몇 년간 장 건강 개선을 위한 Bacillus 함유 제품 개발에도 관심이 증가하고 있습니다.

장 건강 개선을 위한 신바이오틱스 개념은 특히 혁신적 잠재력을 보여주고 있다. 신바이오틱스는 살아있는 미생물과 숙주 미생물이 선택적으로 대사하는 기질의 조합으로, 숙주에게 건강상의 이점을 제공한다. 여기서 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드와 결합할 때, 앞서 언급된 B. subtilis DSM 32315 균주는 다시 한번 놀라운 효과를 발휘한다. 광범위한 연구를 통해 이 신바이오틱의 존재가 시험관 내에서 미생물 군집이 부티레이트 생성을 증가시킬 뿐만 아니라, 인간 파일럿 연구에서 대변 분석을 통해 동일한 관찰 결과가 확인될 수 있음이 입증되었습니다. 부티레이트는 장상피세포의 중요한 에너지원 역할을 할 뿐만 아니라, 문헌에 따르면 장 점막 장벽 강화, 면역 체계 및 대사 건강 개선, 항염증 효과 등 다양한 이점이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 놀랍게도, 시너지제제를 섭취한 시험 대상자의 혈액 분석 결과 지질 및 포도당 대사에 긍정적인 영향이 관찰되었습니다(104).

B. SUBTILIS-BASED SELF-HEALING CONCRETE

With an annual global demand of around 10 billion metric tons, concrete is the world’s most important construction material. Concrete is primarily a blend of cement, an inorganic binder, water, and aggregates such as sand, gravel, or crushed limestone. Producing some four billion metric tons of cement worldwide requires burning limestone, a process that contributes greatly to the global CO2 emissions. Being the source of 8 to 10% of the global anthropogenic emissions of CO2 makes cement production one of the world’s most emissions-intense industrial processes (105). In addition to establishing methods that produce less CO2, one particularly effective way of reducing emissions is to make concrete that lasts longer.

As concrete ages, small cracks arise that allow water and salt ions to penetrate; this process can cause steel reinforcements to rust and to corrode. A microbiological approach to close these cracks is biomineralization, specifically microbiologically induced calcium carbonate precipitation (MICP) (105). This process was described in the late 20th century and can be achieved in autotrophic and, especially, heterotrophic bacteria via various metabolic pathways. To put it simply, MICP is a process by which the metabolic activity of microorganisms results in the production of CO32– ions in an alkaline environment. The Ca2+ ions present in solution during cement hydration bind to negatively charged groups on the microbial cell wall and then react with the carbonate ions, resulting in extracellular formation of insoluble CaCO3. The conditions under which these microorganisms have to produce these effects are very challenging: the environment inside concrete is highly alkaline (pH 13), there is little oxygen available, and the curing process produces temperatures of 60°C.

These conditions once again greatly favor Bacillus spores, which are used in MICP. Here, spores of B. subtilis DSM 32315 achieved yet another success, in this case as an additive for self-healing concrete, whereby the water that penetrates cracks causes the spores to germinate and then close those cracks via CaCO3 precipitation (106; Fig. 5).

B. SUBTILIS 기반 자가 치유 콘크리트

전 세계 연간 수요가 약 100억 톤에 달하는 콘크리트는 세계에서 가장 중요한 건설 자재입니다. 콘크리트는 주로 시멘트(무기 결합제), 물, 그리고 모래, 자갈, 분쇄 석회석 등의 골재로 구성됩니다. 전 세계적으로 약 40억 톤의 시멘트를 생산하려면 석회석을 소성해야 하며, 이 과정은 전 세계 CO2 배출에 크게 기여합니다. 전 세계 인위적 CO2 배출량의 8~10%를 차지하는 시멘트 생산은 세계에서 가장 배출 집약적인 산업 공정 중 하나입니다(105). CO2 배출량을 줄이는 방법을 확립하는 것 외에도, 특히 효과적인 배출 감소 방법은 콘크리트의 수명을 연장하는 것입니다.

콘크리트가 노후화되면 미세한 균열이 발생하여 물과 염 이온이 침투하게 되는데, 이 과정은 철근 보강재의 부식과 부식을 유발할 수 있습니다. 이러한 균열을 메우는 미생물학적 접근법이 바로 생물광물화, 특히 미생물 유도 탄산칼슘 침전(MICP)입니다(105). 이 과정은 20세기 후반에 기술되었으며, 다양한 대사 경로를 통해 자영생물성 박테리아, 특히 이영생물성 박테리아에서 달성될 수 있다. 간단히 말해, MICP는 미생물의 대사 활동이 알칼리성 환경에서 CO32– 이온을 생성하는 과정이다. 시멘트 수화 과정에서 용액에 존재하는 Ca2+ 이온은 미생물 세포벽의 음전하 그룹에 결합한 후 탄산 이온과 반응하여 세포 외부에 불용성 CaCO3를 형성합니다. 이러한 미생물이 효과를 발휘해야 하는 조건은 매우 까다롭습니다: 콘크리트 내부는 고알칼리성(pH 13) 환경이며, 이용 가능한 산소가 거의 없고, 양생 과정에서 60°C의 온도가 발생합니다.

이러한 조건은 MICP에 사용되는 Bacillus 포자(spores)에 다시 한번 매우 유리합니다.

여기서 B. subtilis DSM 32315 포자는

자가 치유 콘크리트 첨가제로 또 다른 성공을 거두었는데,

균열로 침투한 물이 포자를 발아시켜 CaCO3 침전을 통해 균열을 메우는 방식입니다(106; 그림 5).

FIG 5.

Open in a new tab

Use of B. subtilis DSM 32315 for concrete healing. (A) Picture of a concrete test object after mechanical introduction of a 0.5- to 1-mm crack. (B) Picture of the test object after 28 days of incubation in a cloud chamber at 20°C/65% relative humidity, followed by 14 days of incubation in a cloud chamber (20°C/100% relative humidity). The presence of B. subtilis spores induced biomineralization and filling of the crack via CaCO3 formation. (Photos courtesy of Anke Reinschmidt, used with permission).

FUTURE APPLICATIONS

The examples shown here reinforce the significance of B. subtilis for industrial biotechnology. In addition, numerous B. subtilis products have already been introduced for biomining, as additives in household cleansers and as microbial biostimulants, a class of bacteria that support plant growth by protecting plants from biotic and abiotic stress. Because its surface structure interacts with metals and rare earth elements, B. subtilis is also employed in biomining, the use of microorganisms for binding and extracting metals. Another interesting potential application of B. subtilis for human health could be Alzheimer’s disease. In the corresponding research, it was observed that the gut-associated biofilm in the Alzheimer’s model Caenorhabditis elegans had a protective effect on nerve cells (107).

Various properties, such as microbiome modulation and enzyme production, make B. subtilis ideal for use in innovative cleansers for hard surfaces, especially in hospitals, where it inhibits colonization by pathogenic organisms. In terms of industrial applications, B. subtilis is already indispensable, and many more innovations are anticipated.

콘크리트 치유를 위한 B. subtilis DSM 32315의 활용. (A) 0.5~1mm 균열을 기계적으로 도입한 후의 콘크리트 시험체 사진. (B) 20°C/65% 상대습도 구름 챔버에서 28일 배양 후, 20°C/100% 상대습도 구름 챔버에서 14일 추가 배양한 시험체 사진. B. subtilis 포자의 존재는 CaCO3 형성을 통한 균열의 생체광물화 및 충진을 유도하였다. (사진 제공: Anke Reinschmidt, 허가를 받아 사용함).

향후 응용 분야

여기 제시된 사례들은 산업용 생명공학 분야에서 B. subtilis의 중요성을 재확인시켜 줍니다. 또한, 이미 다수의 B. subtilis 제품들이 바이오마이닝, 가정용 세정제 첨가제, 그리고 생물적·비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하여 식물 생장을 지원하는 박테리아 계열인 미생물 생장촉진제로 출시되었습니다. 표면 구조가 금속 및 희토류 원소와 상호작용하기 때문에 B. subtilis는 미생물을 이용해 금속을 결합 및 추출하는 바이오마이닝 분야에서도 활용됩니다. B. subtilis의 또 다른 흥미로운 잠재적 응용 분야는 인간 건강, 특히 알츠하이머병 치료일 수 있습니다. 관련 연구에서 알츠하이머 모델인 Caenorhabditis elegans의 장 관련 생물막이 신경 세포에 보호 효과를 나타내는 것이 관찰되었습니다(107).

미생물군 조절 및 효소 생산과 같은 다양한 특성 덕분에 B. subtilis는 특히 병원과 같은 환경에서 병원성 미생물의 집락을 억제하는 경질 표면용 혁신적인 세정제 개발에 이상적입니다. 산업적 응용 측면에서 B. subtilis는 이미 필수 불가결한 존재이며, 더 많은 혁신이 기대됩니다.

ACKNOWLEDGMENTS

We are grateful to Urśka Repnik (central microscopy facility Kiel), Sarah Baur, and Helge Feddersen (Kiel) for help with the images. We thank all the employees of the Evonik Biotech Hub who contributed to these results, as well as all group members of the Bramkamp and Stülke labs for their contributions to Bacillus research. Anke Reinschmidt is acknowledged for providing photos in Fig. 5.

Work in the Bramkamp and Stülke laboratories is funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (BR2915/7 and BR2915/10 to M.B., Priority Program SPP1879 [STU 214/16] and SFB 1565 [Projektnummer 469281184 (P11)] to J.S.).

Contributor Information

Jörg Stülke, Email: jstuelk@gwdg.de.

Stefan Pelzer, Email: stefan.pelzer@evonik.com.

George O'Toole, Geisel School of Medicine at Dartmouth.

REFERENCES

• 1.Ehrenberg CG. 1835. Dritter Beitrag zur Erkenntnis grosser Organisation in der Richtung des kleinsten Raumes. Physikal Abh Königl Akad Wiss Berlin 1833:143–336. [Google Scholar]
• 2.Cohn F. 1877. Untersuchungen über Bakterien. IV. Beiträge zur Biologie der Bacillen. Beitr Biol Pflanz 2:249–276. [Google Scholar]
• 3.Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, Albertini AM, Alloni G, Azevedo V, Bertero MG, Bessières P, Bolotin A, Borchert S, Borriss R, Boursier L, Brans A, Braun M, Brignell SC, Bron S, Brouillet S, Bruschi CV, Caldwell B, Capuano V, Carter NM, Choi SK, Cordani JJ, Connerton IF, Cummings NJ, Daniel RA, Denziot F, Devine KM, Düsterhöft A, Ehrlich SD, Emmerson PT, Entian KD, Errington J, Fabret C, Ferrari E, Foulger D, Fritz C, Fujita M, Fujita Y, Fuma S, Galizzi A, Galleron N, Ghim SY, Glaser P, Goffeau A, Golightly EJ, Grandi G, Guiseppi G, Guy BJ, Haga K, et al. 1997. The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390:249–256. doi: 10.1038/36786. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 4.Kobayashi K, Ehrlich SD, Albertini A, Amati G, Andersen KK, Arnaud M, Asai K, Ashikaga S, Aymerich S, Bessieres P, Boland F, Brignell SC, Bron S, Bunai K, Chapuis J, Christiansen LC, Danchin A, Débarbouille M, Dervyn E, Deuerling E, Devine K, Devine SK, Dreesen O, Errington J, Fillinger S, Foster SJ, Fujita Y, Galizzi A, Gardan R, Eschevins C, Fukushima T, Haga K, Harwood CR, Hecker M, Hosoya D, Hullo MF, Kakeshita H, Karamata D, Kasahara Y, Kawamura F, Koga K, Koski P, Kuwana R, Imamura D, Ishimaru M, Ishikawa S, Ishio I, Le Coq D, Masson A, Mauël C, et al. 2003. Essential Bacillus subtilis genes. Proc Natl Acad Sci USA 100:4678–4683. doi: 10.1073/pnas.0730515100. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 5.Nicolas P, Mäder U, Dervyn E, Rochat T, Leduc A, Pigeonneau N, Bidnenko E, Marchadier E, Hoebeke M, Aymerich S, Becher D, Bisicchia P, Botella E, Delumeau O, Doherty G, Denham EL, Fogg MJ, Fromion V, Goelzer A, Hansen A, Härtig E, Harwood CR, Homuth G, Jarmer H, Jules M, Klipp E, Chat LL, Lecointe F, Lewis P, Liebermeister W, March A, Mars RAT, Nannapaneni P, Noone D, Pohl S, Rinn B, Rügheimer F, Sappa PK, Samson F, Schaffer M, Schwikowski B, Steil L, Stülke J, Wiegert T, Devine KM, Wilkinson AJ, van Dijl JM, Hecker M, Völker U, Bessières P, et al. 2012. Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science 335:1103–1106. doi: 10.1126/science.1206848. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 6.Westers H, Dorenbos R, van Dijl JM, Kabel J, Flanagan T, Devine KM, Jude F, Seror SJ, Beekman AC, Darmon E, Eschevins C, de Jong A, Bron S, Kuipers OP, Albertini AM, Antelmann H, Hecker M, Zamboni N, Sauer U, Bruand C, Ehrlich DS, Alonso JC, Salas M, Quax WJ. 2003. Genome engineering reveals large dispensable regions in Bacillus subtilis. Mol Biol Evol 20:2076–2090. doi: 10.1093/molbev/msg219. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 7.Barbe V, Cruveiller S, Kunst F, Lenoble P, Meurice G, Sekowska A, Vallenet D, Wang T, Moszer I, Médigue C, Danchin A. 2009. From a consortium sequence to a unified sequence: the Bacillus subtilis 168 reference genome a decade later. Microbiology (Reading) 155:1758–1775. doi: 10.1099/mic.0.027839-0. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 8.Commichau FM, Pietack N, Stülke J. 2013. Essential genes in Bacillus subtilis: a re-eval‎uation after ten years. Mol Biosyst 9:1068–1075. doi: 10.1039/c3mb25595f. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 9.Koo BM, Kritikos G, Farelli JD, Todor H, Tong K, Kimsey H, Wapinski I, Galardini M, Cabal A, Peters JM, Hachmann AB, Rudner DZ, Allen KN, Typas A, Gross CA. 2017. Construction and analysis of two-genome-scale deletion libraries for Bacillus subtilis. Cell Syst 4:291–305.e7. doi: 10.1016/j.cels.2016.12.013. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 10.Antelmann H, Bernhardt J, Schmid R, Mach H, Völker U, Hecker M. 1997. First steps from a two-dimensional protein index towards a response-regulation map for Bacillus subtilis. Electrophoresis 18:1451–1463. doi: 10.1002/elps.1150180820. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 11.Tobisch S, Zühlke D, Bernhardt J, Stülke J, Hecker M. 1999. Role of CcpA in regulation of the central pathways of carbon catabolism in Bacillus subtilis. J Bacteriol 181:6996–7004. doi: 10.1128/JB.181.22.6996-7004.1999. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 12.Bernhardt J, Weibezahn J, Scharf C, Hecker M. 2003. Bacillus subtilis during feast and famine: visualization of the overall regulation of protein synthesis during glucose starvation by proteome analysis. Genome Res 13:224–237. doi: 10.1101/gr.905003. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 13.Reuß DR, Altenbuchner J, Mäder U, Rath H, Ischebeck T, Sappa PK, Thürmer A, Guérin C, Nicolas P, Steil L, Zhu B, Feussner I, Klumpp S, Daniel R, Commichau FM, Völker U, Stülke J. 2017. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Res 27:289–299. doi: 10.1101/gr.215293.116. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 14.Maass S, Sievers S, Zühlke D, Kuzinski J, Sappa PK, Muntel J, Hessling B, Bernhardt J, Sietmann R, Völker U, Hecker M, Becher D. 2011. Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics. Anal Chem 83:2677–2684. doi: 10.1021/ac1031836. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
• 15.Muntel J, Fromion V, Goelzer A, Maaβ S, Mäder U, Büttner K, Hecker M, Becher D. 2014. Comprehensive absolute quantification of the cytosolic proteome of Bacillus subtilis by data independent, parallel fragmentation in liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MSE). Mol Cell Proteomics 13:1008–1019. doi: 10.1074/mcp.M113.032631. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]