Re: B. subtilis(고초균)에 의해 생성되는 박테리아 생성 2차 대사산물의 분류와 기능들 2023 리뷰!!

[문형철]

Open AccessReview

Classification and Multifaceted Potential of Secondary Metabolites Produced by Bacillus subtilis Group: A Comprehensive Review

by 

Sajid Iqbal

 1,

1

Atta-ur-Rahman School of Applied Biosciences, National University of Sciences and Technology (NUST), Islamabad 44000, Pakistan

2

Department of Biochemistry, Abdul Wali Khan University Mardan (AWKUM), Mardan 23200, Pakistan

3

Molecular Diagnostic Laboratory, Johns Hopkins Aramco Healthcare, Dhahran 31311, Saudi Arabia

4

College of Medicine, Alfaisal University, Riyadh 11533, Saudi Arabia

5

Department of Public Health and Nutrition, The University of Haripur, Haripur 22610, Pakistan

6

Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, University of Hafr Al Batin, Hafr Al Batin 39831, Saudi Arabia

7

Department of Pediatrics, College of Medicine, Taibah University, Al-Madinah 41491, Saudi Arabia

8

Department of Infection Prevention and Control, Prince Mohammad Bin Abdulaziz Hospital, National Guard Health Affairs, Al-Madinah 41491, Saudi Arabia

9

Infectious Diseases Section, Medical Specialties Department, King Fahad Medical City, Riyadh 12231, Saudi Arabia

10

Department of Life Sciences, Abasyn University Islamabad Campus, Islamabad 44000, Pakistan

*

Author to whom correspondence should be addressed.

Molecules 2023, 28(3), 927; https://doi.org/10.3390/molecules28030927

Submission received: 15 December 2022 / Revised: 31 December 2022 / Accepted: 4 January 2023 / Published: 17 January 2023

(This article belongs to the Special Issue Microbial Natural Products in Drug Discovery Chemistry)

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Abstract

Despite their remarkable biosynthetic potential, Bacillus subtilis have been widely overlooked. However, their capability to withstand harsh conditions (extreme temperature, Ultraviolet (UV) and γ-radiation, and dehydration) and the promiscuous metabolites they synthesize have created increased commercial interest in them as a therapeutic agent, a food preservative, and a plant-pathogen control agent. Nevertheless, the commercial-scale availability of these metabolites is constrained due to challenges in their accessibility via synthesis and low fermentation yields. In the context of this rising in interest, we comprehensively visualized the antimicrobial peptides produced by B. subtilis and highlighted their prospective applications in various industries. Moreover, we proposed and classified these metabolites produced by the B. subtilis group based on their biosynthetic pathways and chemical structures. The biosynthetic pathway, bioactivity, and chemical structure are discussed in detail for each class. We believe that this review will spark a renewed interest in the often disregarded B. subtilis and its remarkable biosynthetic capabilities.

초록

탁월한 생합성 잠재력에도 불구하고,

Bacillus subtilis는 널리 간과되어 왔다.

그러나

극한 온도, 자외선(UV) 및 감마선(γ-radiation), 탈수 등

가혹한 조건을 견딜 수 있는 능력과 다종 대사물을 합성하는 특성으로 인해

치료제, 식품 방부제, 식물 병원체 방제제로서의 상업적 관심이 증가하고 있다.

그럼에도 불구하고,

이러한 대사 산물의 상업적 규모의 가용성은

합성을 통한 접근성 문제와 낮은 발효 수율로 인해 제한되어 있다.

이러한 관심 증가의 맥락에서,

우리는 B. subtilis가 생산하는 항균 펩타이드를 종합적으로 시각화하고

다양한 산업 분야에서의 잠재적 응용 가능성을 부각시켰다.

또한, 우리는

B. subtilis 그룹이 생산하는 이러한 대사 산물을 생합성 경로와

화학적 구조에 기반하여 제안하고 분류하였다.

각 분류군에 대해

생합성 경로, 생물학적 활성 및 화학 구조를 상세히 논의하였다.

본 리뷰가 종종 간과되던 B. subtilis와

그 놀라운 생합성 능력에 대한 새로운 관심을 불러일으킬 것으로 기대한다.

Keywords: 

Bacillus subtilis; secondary metabolites; non-ribosomal peptides (NRPs); ribosomal peptides (RPs) polyketides (PKs); hybrid NRPs/PKs; applications

Graphical Abstract

1. Introduction

The Bacillus subtilis (B. subtilis) group is a ubiquitous Gram-positive bacteria with a remarkable adaptability potential that enables it to survive in highly diverse environments [1]. It is non-pathogenic and presents incredible genetic diversity even within closely related strains [2]. The B. subtilis group consists of four species, including Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, and Bacillus amyloliquefaciens, discovered several decades ago. Over time, numerous new species and subspecies have been described based on molecular evolution, physiology, and chemotaxonomic characterization [3]. B. subtilis is a model organism used to investigate cell motility, biofilm formation, protein secretion, cell division, secondary metabolites biosynthesis, adherence to plant root and fungal hyphae, cytoplasm altercation via intracellular nanotubes, and kin-recognition [4]. In biotechnological industries, B. subtilis is a popular workhorse used for the biosynthesis of a broad range natural products, from enzymes to purified bioactive compounds [5,6]. Its natural competence to genetic engineering and well-described gene expression‎ system makes it attractive on many occasions [6]. Moreover, recently, it also earned attention as a biocontrol agent in agronomy by antagonizing phytopathogens and promoting plant growth [7].

1. 서론

Bacillus subtilis (B. subtilis) 군은

놀라운 적응력을 지닌 광범위하게 분포하는 그람 양성균으로,

매우 다양한 환경에서 생존할 수 있습니다 [1].

이 균주는

비병원성이며, 근연종 내에서도 놀라운 유전적 다양성을 보인다[2].

B. subtilis 그룹은

수십 년 전에 발견된

Bacillus subtilis,

Bacillus pumilus,

Bacillus licheniformis,

Bacillus amyloliquefaciens 등

네 종으로 구성된다.

시간이 지남에 따라

분자 진화, 생리학, 화학적 분류학적 특성에 기반하여

수많은 새로운 종과 아종이 기술되었다[3].

B. subtilis는

세포 운동성, 생물막 형성, 단백질 분비, 세포 분열, 2차 대사산물 생합성, 식물 뿌리 및 균사체 부착,

세포내 나노튜브를 통한 세포질 교환, 친족 인식 등을 연구하는

모델 생물체로 활용된다[4].

생명공학 산업에서 B. subtilis는

효소부터 정제된 생리활성 화합물에 이르기까지

광범위한 천연물 생합성에 널리 활용되는 핵심 작업마차입니다[5,6].

유전자 공학에 대한 자연적 수용성과 잘 규명된 유전자 발현 시스템은

다양한 상황에서 이를 매력적인 대상으로 만듭니다[6].

또한 최근에는 식물 병원체를 억제하고

식물 생장을 촉진함으로써 농업 분야의 생물학적 방제제로서도 주목받고 있습니다 [7].

The impressive skill set of B. subtilis for producing diverse bioactive metabolites was recognized in the last decade. It has been demonstrated that ~5% of a wild-type B. subtilis genome is exclusively devoted to the synthesis of bioactive compounds [8]. For a long time, it was considered for the production only of cyclic peptides such as iturins, surfactins, and fengycins [9,10]. Nonetheless, due to the discovery of numerous antimicrobial exhibiting linear lipopeptides, PKs, and volatile metabolites, it has gained a high commercial interest. The versatile bioactive metabolites produced by the B. subtilis group may be classified based on several criteria, including their biosynthetic pathways, function, structure, source, physicochemical properties, molecular targets, or bonding patterns [11]. Herein, we classified the bioactive metabolites from B. subtilis based on their molecular structures and biosynthetic pathways (Figure 1). In the current review, the bioactive metabolites produced by B. subtilis are classified into five classes, including non-ribosomal peptides (NRPs), polyketides (PKs), ribosomal peptides (RPs), and hybrid and volatile metabolites. These five classes are further categorized into various subclasses and described in detail.

다양한 생리활성 대사산물을 생산하는 B. subtilis의 인상적인 능력은

지난 10년간 인정받았다.

야생형 B. subtilis 게놈의 약 5%가

생리활성 화합물 합성에 전적으로 기여한다는 것이 입증되었다[8].

오랜 기간 동안 이 균주는

이투린, 서팩틴, 펜지신과 같은 순환 펩타이드 생산에만 활용되는 것으로 여겨졌다[9,10].

그러나

수많은 항균 활성을 지닌

선형 지질펩타이드,

PK(폴리키네타인),

휘발성 대사산물의 발견으로 인해 상업적 관심이 크게 높아졌다. 

linear lipopeptides,

PKs, and

volatile metabolites

B. subtilis 그룹이 생산하는 다양한 생리활성 대사산물은

생합성 경로, 기능, 구조, 기원, 물리화학적 특성, 분자 표적 또는 결합 패턴 등

여러 기준에 따라 분류될 수 있다[11].

본고에서는 

B. subtilis의 생리활성 대사산물을

분자 구조와 생합성 경로에 기반하여 분류하였다(그림 1).

본 리뷰에서는 B. subtilis가 생성하는 생리활성 대사산물을

비리보솜 펩타이드(NRPs),

폴리케타이드(PKs),

리보솜 펩타이드(RPs),

하이브리드 및 휘발성 대사산물 등 5개 클래스로 분류하였다.

이 5개 클래스는 다시 다양한 하위 클래스로 세분화되어 상세히 기술되었다.

Figure 1. Classification of bioactive metabolites produced by B. subtilis complex.

Additionally, we comprehensively summarized all the reported bioactive metabolites produced by the B. subtilis group (Supplementary Material, Table S1–S5). Previous reports only focused on a single subclass or class, such as lipopeptides, lantibiotics, macrolides, and volatile metabolites [12,13,14,15]. Currently, in a time of drug resistance and high demand for eco-friendly pest control strategies, B. subtilis and its bioactive compounds could be the right choice. Therefore, we expect that this review will increase commercial interest in utilizing B. subtilis origin antimicrobial metabolites and biosurfactants in various industries.

또한, 우리는

B. subtilis 그룹이 생성하는 보고된 모든 생리활성 대사산물을 종합적으로 정리하였다(보충 자료, 표 S1–S5).

기존 보고들은

지질펩타이드, 란티바이오틱, 마크로라이드, 휘발성 대사산물 등

단일 하위군 또는 군에만 초점을 맞추었다[12,13,14,15].

현재 항생제 내성 시대와 친환경 해충 방제 전략에 대한 수요가 높은 시점에서,

B. subtilis와 그 생리활성 화합물은 적절한 선택지가 될 수 있습니다.

따라서 본 리뷰가 다양한 산업 분야에서

B. subtilis 유래 항균성 대사산물 및 생체계면활성제 활용에 대한

상업적 관심을 높일 것으로 기대합니다.

2. Non-Ribosomal Peptides (NRPs)

NRPs are molecular assembly machines that use multi-modular enzyme complexes rather than a DNA template to construct a protein [16]. A module is a part of the non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) enzymes that assimilates the amino acid into a peptide backbone of a specific kind. Further, each module may be divided into three domains, adenylation (A), thiolation (T) or peptidyl carrier protein (PCP), as well as a condensation (C) domain that catalyzes the individual steps of NRP synthesis [17] (Figure 2). The synthesis of the primary product might be post-synthetically modified to obtain its mature form via glycosylation, methylation, hydroxylation, acylation, heterocyclic ring formation, and halogenation [18,19]. NRPs exhibit vast structural diversity and may be found as linear, branched, and cyclic structures. So far (January 2022), the Norine (Non-ribosomal peptide database) contains 1740 peptides, including information about their biosynthesis, structures, and evolution [20].

2. 비리보솜 펩타이드(NRPs)

NRPs는

DNA 템플릿 대신 다중 모듈형 효소 복합체를 이용해

단백질을 합성하는 분자 조립 기계입니다[16].

모듈은 비리보솜 펩타이드 합성효소(NRPS)의 일부로,

특정 종류의 펩타이드 골격에 아미노산을 동화시키는 역할을 합니다.

또한 각 모듈은

아데닐화(A), 티올화(T) 또는

펩티딜 캐리어 단백질(PCP) 도메인과 NRP 합성의 개별 단계를 촉매하는

축합(C) 도메인으로 세분화될 수 있다[17] (그림 2).

1차 생성물은

합성 후 당화, 메틸화, 하이드록실화, 아실화, 헤테로환 형성 및 할로겐화 등을 통해

성숙 형태를 얻을 수 있다[18,19].

NRP는 광범위한 구조적 다양성을 보이며

선형, 분지형 및 고리형 구조로 존재할 수 있다. 현재(2022년 1월 기준)

Norine(비리보솜 펩타이드 데이터베이스)에는

생합성, 구조 및 진화 정보가 포함된 1740개의 펩타이드가 수록되어 있다[20].

Figure 2. Biosynthesis of non-ribosomal peptides (NRPs), consisting of core and auxiliary domain. Core domain encoding NRP includes A; Adenylation, PCP; peptidyl carrier domain, C; condensation ans TE; thioesterase domain. Auxiliary or optional domains responsible for cyclization (Cy), N-methylation (MT) and epimerization (E).

The NRPs may be synthesized via a multi-enzyme thio-template mechanism or without the multi-enzyme [21]. The NRPs synthesized through a thio-template are usually 2–50 amino acids and some other moieties such as a fatty acid chain, whereas the NRPs synthesized without a multi-enzyme template are comparatively smaller [22]. Based on biosynthetic pathways, NRPs can be divided into thio-template and non-thiotemplate NRPs.

그림 2. 핵심 및 보조 도메인으로 구성된 비리보솜 펩타이드(NRP)의 생합성.

NRP를 암호화하는 핵심 도메인은 A; 아데닐화, PCP; 펩티딜 캐리어 도메인, C; 축합 및 TE; 티오에스테라제 도메인을 포함한다.

보조 또는 선택적 도메인은 고리화(Cy), N-메틸화(MT) 및 에피머화(E)를 담당한다.

NRP는 다중 효소 티오-템플릿 메커니즘을 통해 또는 다중 효소 없이 합성될 수 있다[21].

티오-템플릿을 통해 합성된 NRP는 일반적으로 2~50개의 아미노산과 지방산 사슬과 같은 다른 모이어티로 구성되는 반면,

다중 효소 템플릿 없이 합성된 NRP는 비교적 더 작다[22]. 생합성 경로에 따라

NRPs는 티오-템플릿 NRPs와 비-티오-템플릿 NRPs로 구분될 수 있다.

2.1. Thio-Template NRPs

The thio-template NRPs can be classified as cyclic lipopeptides and non-cyclic or linear lipopeptides based on their chemical structures (Supplementary Material Table S1).

2.1.1. Cyclic Lipopeptides

Thio-template non-ribosomal cyclic lipopeptides were first isolated during the 1950s–1960s from Bacillus spp. The cyclic lipopeptides are primarily synthesized via the sequential addition of residues, either in an iterative or a non-iterative manner. The lipopeptide synthesis pathways are very flexible; therefore, the synthesized peptides are incredibly diverse in nature. The cyclic lipopeptides produced by B. subtilis can be classified into four classes [23].

•  
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2.1. 티오-템플릿 NRPs
티오-템플릿 NRPs는 화학 구조에 따라 고리형 지질펩타이드와 비고리형 또는 선형 지질펩타이드로 분류될 수 있다 (보충 자료 표 S1).

2.1.1. 고리형 지질펩타이드

티오-템플릿 비리보솜 고리형 지질펩타이드는 

1950년대부터 1960년대 사이에 

Bacillus 속 균주에서 최초로 분리되었다. 

고리형 지질펩타이드는 

주로 반복적 또는 비반복적 방식으로 잔기들을 순차적으로 첨가하여 합성된다.

 지질펩타이드 합성 경로는 

매우 유연하여 합성된 펩타이드의 다양성이 매우 크다. 

B. subtilis가 생성하는 순환 지질펩타이드는 

네 가지 유형으로 분류될 수 있다 [23].

--> 항생제, 항진균제 효과

서팩틴(Surfactins): 서팩틴은 1968년 B. subtilis 배양 상청액에서 최초로 분리되었으며, 우수한 생체계면활성제 활성을 나타냈다[24]. 이후 서팩틴은 그림 3에 표시된 바와 같이 항종양, 항균, 항응고 및 저콜레스테롤제 작용을 하는 것으로 입증되었다[25]. 서팩틴의 전형적인 구조는 보충 자료 그림 S1에 제시되어 있다.

이투린(Iturins): 1949년 월튼(Walton)과 우드러프(Woodruff)는 B. subtilis에서 최초의 항진균성 이투린을 분리했다. 이후 1950년, 두 번째 유사 화합물인 이투린이 보고되었으며, 그 이름은 이투리(Ituri, 콩고에서 토양 샘플을 채취한 장소명)에서 유래되었다[26]. 이투린의 정확한 구조는 알킬 사슬에 부착된 고리형 간지질펩타이드로 규명되었다(그림 S1). 이투린은 강력한 항진균 활성을 나타내며 여러 식물 병원체 방제 제품의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 밀접하게 관련된 고리형 지질펩타이드로는 이투린: 바실리마이신 L[27], 마이코서브틸린[28], 바실리마이신 D, 바실리마이신 F[29], 모하벤신 A[30], 서브툴렌 A[31] 등이 분류될 수 있다.

펑기신(Fengycins): 1986년 일본과 독일 과학자들이 동시에 B. subtilis에서 펑기신을 발견하였다[32]. 초기 연구에서 펑기신은 균사성 곰팡이의 성장을 억제하지만 비균사성 곰팡이와 박테리아에는 효과가 없는 것으로 확인되었다. 그러나 이후 항바이러스[10], 항균[33], 항암 특성이 보고되었다 [34]. 또한 농업 산업에서 바람직한 식물 생장 촉진 특성도 나타냈다.

쿠르스타킨: 쿠르스타킨은 여러 B. subtilis 균주에서 생성되는 항진균 활성을 나타내는 지질-헵타펩타이드이다. 쿠르스타킨은 배양 상층액에서 회수될 수 없으나 생산 세포와 연관되어 존재한다[35]. 그럼에도 불구하고 생산 균주와 비생산 균주를 이용한 공동 감염 연구를 통해 세포 외 물질임이 입증되었다[36]. 이러한 모순은 쿠르스타킨이 세포막에 높은 친화성을 지닌 세포 외 대사산물임을 시사한다. 이러한 친화성은 히스티딘의 존재로 인한 것으로 추정되며, 이는 쿠르스타킨에 양전하를 부여하여 막의 인지질과 정전기적 상호작용을 가능하게 합니다.

플리파스타틴: 플리파스타틴은 처음에 B. cereus에서 항인산리파아제로 보고된 후, B. subtilis에서 확인되었습니다 [37]. 플리파스타틴은 펑시신과 밀접한 관련이 있다. 두 개의 입체중심 반전으로 인한 구조 변화로 플리파스타틴의 백본은 독특한 3차원 구조를 갖는다. 주목할 점은 이러한 미세한 구조적 차이가 항진균 활성의 상실을 초래한다는 것이다 [38].

Figure 3. Potential application of secondary metabolites synthesized by Bacillus subtilis.

2.1.2. Linear Lipopeptides

Linear lipopeptides have been produced by several B. subtilis strains. They can be classified into the following two subclasses

a.

Gageopeptides

Recently, several linear lipopeptides have been reported and characterized from B. Subtilis. For instance, Gageostatin was reported from a marine-derived B. subtilis [39]. Gageostatin consists of 3-beta hydroxyl fatty acid attached to heptapeptide (Figure S2). It is composed of the same residues as reported for surfactin. However, differences were found in their structures and molecular masses. Gageostatins were found in linear form with exclusively L-leucine, while surfactins are cyclic lipopeptides with L and D-leucine.

Interestingly, it was reported that a mixture of the two metabolites (gageostatin A and gageostatin B) was more effective and appeared to work synergistically against bacteria and fungi. However, the future application of gageostatins as a drug candidate may be limited due to their broad cytotoxicity [39]. Gageotetrins A–C and gageopeptides A–D are linear antimicrobial peptides comparable to gageostatins. Unlike gageostatins, they exhibit no cytotoxicity and strongly antagonize bacteria and fungi [40]. They are probably synthesized via a hybrid biosynthesis pathway, and gageotetrin A is a potential precursor for gageotetrin B. Gageotetrins were more recently isolated from B. subtilis strain 109GGC020 and displayed promising antibacterial and antifungal activities in a time-dependent manner [40].

b.

Siderophores

Siderophores are small molecules having a high affinity toward ferric iron. Besides iron scavenging, they are also used to form stable complexes with environmentally important metals. Based on their chemical moiety, siderophore can be categorized into three types, i.e., hydroxamate, catecholate, and carboxylate siderophores. Most of the siderophores produced by bacteria are catecholate, and few are carboxylate and hydroxamate [41]. Bacillibactin is a well-known catecholate siderophore produced by different B. subtilis strains that exhibits strong antibacterial properties and moderate cytotoxicity [42]. The chemical structures of representative siderophores are shown in Figure S2. Bacillus spp. are widely studied for the synthesis of bioactive metabolites. However, their siderophore-producing capabilities have not yet been much explored. Previously, a siderophore-producing Bacillus spp. was reported that enhanced the bioremediation of metals and increased plant growth. B. subtilis strain CAS15 was isolated from the rhizosphere and identified as producing siderophore, and it also inhibits the growth of phytopathogens [43]. Similarly, the siderophore-mediated bioaccumulation of cadmium (Cd) has been reported in B. subtilis and demonstrated as a substitute bioremediation strategy [44]. In recent years, the biological control of phytopathogens has been the subject of research, because it helps in limiting the use of hazardous chemically synthesized pesticides. The siderophore-producing bacteria provide a promising alternative disease management strategy, as they are able to enhance crop yields and, at the same time, protect plants from pathogens.

2.1.2. 선형 지질펩티드

여러 B. subtilis 균주에서 선형 지질펩티드가 생산되었다. 이들은 다음과 같은 두 하위 분류로 구분될 수 있다.

a.가게오펩티드

최근 B. Subtilis에서 여러 선형 지질펩티드가 보고되고 특성화되었다.

예를 들어, 해양 유래 B. subtilis에서 가게오스타틴이 보고되었다 [39].

가게오스타틴은 헵타펩타이드에

3-베타 하이드록실 지방산이 부착된 구조를 가진다(그림 S2).

이는 서팩틴과 동일한 잔기들로 구성되어 있으나,

구조와 분자량에서 차이가 발견되었다.

가게오스타틴은 L-류신만을 포함하는 선형 형태인 반면,

서팩틴은 L- 및 D-류신을 포함하는 고리형 지질펩타이드이다.

흥미롭게도,

두 대사산물(가게오스타틴 A와 가게오스타틴 B)의 혼합물이 박테리아와 곰팡이에 대해 더 효과적이며

시너지 효과를 나타내는 것으로 보고되었다.

그러나

가게오스타틴 계열 물질의 광범위한 세포독성으로 인해

향후 약물 후보로서의 적용은 제한될 수 있다 [39].

가게오테트린 A–C와 가게오펩타이드 A–D는 가게오스타틴과 유사한 선형 항균 펩타이드이다. 가게오스타틴과 달리 세포독성을 나타내지 않으며 세균과 곰팡이에 대해 강력한 항균 효과를 보인다 [40]. 이들은 아마도 혼합 생합성 경로를 통해 합성되며, 가게오테트린 A는 가게오테트린 B의 잠재적 전구체이다. 가게오테트린은 최근 B. subtilis 균주 109GGC020에서 분리되었으며, 시간 의존적 방식으로 유망한 항균 및 항진균 활성을 나타냈다[40].

b.

사이드로포어

사이드로포어는

철(III) 이온에 대한 높은 친화력을 가진 소분자이다.

철 이온 제거 외에도 환경적으로 중요한 금속과 안정적인 복합체를 형성하는 데 사용된다.

화학 구조에 따라 사이드로포어는

하이드록사메이트, 카테콜레이트, 카르복실레이트 사이드로포어의

세 가지 유형으로 분류될 수 있다.

박테리아가 생성하는 대부분의 사이드로포어는 카테콜레이트이며,

카르복실레이트와 하이드록사메이트는 소수에 불과하다[41].

바실리박틴(Bacillibactin)은

다양한 B. subtilis 균주에서 생성되는 잘 알려진 카테콜산계 사이드로포어로,

강력한 항균성과 중간 정도의 세포독성을 나타낸다[42].

대표적 사이드로포어의 화학 구조는 그림 S2에 제시되어 있다.

Bacillus 속 균주는 생리활성 대사산물의 합성 연구에서 널리 연구되어 왔다. 그러나 이들의 사이드로포어 생성 능력은 아직 충분히 탐구되지 않았다. 이전에, 금속의 생물학적 정화를 향상시키고 식물 성장을 증가시키는 사이드로포어 생성 Bacillus 속 균주가 보고된 바 있다. B. subtilis 균주 CAS15는 뿌리권에서 분리되었으며 사이드로포어를 생성하는 것으로 확인되었고, 또한 식물 병원균의 성장을 억제한다 [43]. 마찬가지로, B. subtilis에서 시데로포어 매개 카드뮴(Cd)의 생물축적이 보고되었으며 대체 생물학적 정화 전략으로 입증되었다 [44]. 최근 몇 년간 식물 병원균의 생물학적 방제는 유해한 화학 합성 농약 사용을 제한하는 데 도움이 되기 때문에 연구 주제로 부상했다. 철수송체 생성균은 작물 수확량을 증대시키면서 동시에 식물을 병원균으로부터 보호할 수 있어 유망한 대체 질병 관리 전략을 제공한다.

2.2. Non-Thio-Template NRPs

B. subtilis is capable of synthesizing antimicrobial NRPs via non-thio-template mechanism. Rhizocticins are non-thio-template peptides that consist of an arginine linked with L-2-amino-5-phosphono-3-cis-pentanoic acid. Sometimes they are supplemented with leucine, isoleucine, and valine [45]. Besides rhizocticins, B. subtilis can also synthesize dipeptide NRPs such as bacilysin (tetain) and chlorotetain (Supplementary Material Figure S2). Regardless of their simple composition (L-alanine link with L-anticapsine), they exhibit strong antibacterial and antifungal activity [46]. The antibacterial activity is mediated by the L-anticapsine, which inhibits the synthesis of glucosamine-6 phosphate. Its inhibition stops the synthesis of peptidoglycan, which is a major constituent of the bacterial cell wall. For antifungal activity, it has been suggested that anticapsine can suppress the biosynthesis of chitin and fungal cell membrane mannoproteins [47]. Tetain and chlorotetain are shown to inhibit the growth of Aspergillus fumigatus and Candida albicans [48]. Mycobacillin and bacitracin are non-thio-template polypeptides produced by B. subtilis. Mycobacillin inhibit the growth of Aspergillus niger by altering its cell membrane [49]. The biosynthesis of mycobacillin is unique. The NRPS complex catalyzed and divided it into three parts, i.e., A, B, and C, but it does not use the thio-template mechanism [50]. Each part of the complex comprises a single polypeptide enzyme that catalyzes the polymerization of pentapeptide A, nonapeptide B, and tridecapeptide C. Bacitracin is a heptapeptide that widely antagonizes Gram-positive bacteria by inhibiting the biosynthesis of petidoglycan [51].

2.2. 비-티오-템플릿 NRPs

B. subtilis는 비-티오-템플릿 메커니즘을 통해 항균성 NRPs를 합성할 수 있다.

리조토신(Rhizocticins)은

L-2-아미노-5-포스포노-3-시스-펜탄산과 연결된 아르기닌으로

구성된 비-티오-템플릿 펩타이드이다.

때로는 류신, 이소류신, 발린이 추가되기도 한다[45].

리조크틴 외에도 B. subtilis는

바실리신(테테인) 및 클로로테테인(보충 자료 그림 S2)과 같은 디펩타이드 NRPs도 합성할 수 있다.

단순한 구성(L-알라닌과 L-안티캡신 연결)에도 불구하고,

이들은 강력한 항균 및 항진균 활성을 나타낸다[46].

항균 활성은 글루코사민-6-인산 합성을 억제하는 L-안티캡신에 의해 매개된다.

이 억제는 박테리아 세포벽의 주요 구성 성분인 펩티도글리칸 합성을 중단시킨다.

항진균 활성의 경우, 안티캡신이 키틴 및 진균 세포막 만노단백질의 생합성을 억제할 수 있다고 제안되었다[47].

테타인과 클로로테타인은

Aspergillus fumigatus 및 Candida albicans의 성장을 억제하는 것으로 나타났습니다[48].

마이코바실린과 바시트라신은

B. subtilis가 생성하는 비-티오-템플릿 폴리펩타이드입니다.

마이코바실린은 세포막을 변형시켜

Aspergillus niger의 성장을 억제합니다[49].

마이코바실린의 생합성 과정은 독특합니다.

NRPS 복합체는 이를 촉매하여 A, B, C 세 부분으로 분할하지만, 티오-템플릿 메커니즘을 사용하지는 않는다 [50]. 복합체의 각 부분은 펜타펩티드 A, 노나펩티드 B, 트라이데카펩티드 C의 중합을 촉매하는 단일 폴리펩티드 효소로 구성된다. 바시트라신은 헤프타펩티드로, 펩티도글리칸 생합성을 억제하여 그람양성균에 광범위하게 항균 작용을 한다 [51].

3. Ribosomal Peptides (RPs)

Ribosomal peptides (RPs), also known as ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs), are derived from a relatively short precursor peptide and are matured through post-translational modification [52]. Several enzymes are involved in these modifications; thus, structurally diverse peptides are generated (Figure 4). In order to classify the RiPPs produced from B. subtilis, several classifications have been proposed, and the classification based on the biosynthetic pathway or chemical structure is reasonable, as reported for bacteriocin produced by Enterococcus spp. and Streptococcus spp. [13]. Consequently, the known B. subtilis producing RiPPs could be classified into three main classes and several subclasses (Supplementary Material Table S2).

3. 리보솜 펩타이드(RPs)

리보솜 펩타이드(RPs)는

리보솜 합성 후 번역 후 변형 펩타이드(RiPPs)로도 알려져 있으며,

비교적 짧은 전구체 펩타이드에서 유래되어 번역 후 변형을 통해 성숙됩니다[52].

이러한 변형에는

여러 효소가 관여하므로 구조적으로 다양한 펩타이드가 생성됩니다 (그림 4).

B. subtilis에서 생성되는 RiPPs를 분류하기 위해 여러 분류법이 제안되었으며,

Enterococcus spp. 및 Streptococcus spp.에서 생성되는

박테리오신에 대해 보고된 바와 같이

생합성 경로나 화학 구조를 기반으로 한 분류가 합리적이다[13].

결과적으로, RiPPs를 생성하는 것으로 알려진

B. subtilis는 세 가지 주요 분류군과 여러 하위 분류군으로 분류될 수 있다(보충 자료 표 S2).

Figure 4. Schematic representation of biosynthesis of ribosomal peptides (RPs). The short precursor peptides are converted into core peptides, and then the core peptide is matured via post-translational modifications.

그림 4. 리보솜 펩타이드(RP) 생합성 개략도. 짧은 전구체 펩타이드가 핵심 펩타이드로 전환된 후, 핵심 펩타이드가 번역 후 변형을 통해 성숙된다.

3.1. Class I—RiPPs

Class I consists of biologically active short peptides that are ribosomally synthesized and undergo post-translation modification (PTM), resulting in a unique structure and properties. According to PTM differences, class I can be divided into several subclasses.

3.1. 제1군—RiPPs

제1군은 리보솜에서 합성되고 번역 후 변형(PTM)을 거쳐 독특한 구조와 특성을 갖게 되는 생물학적 활성 단백질로 구성된다. PTM 차이에 따라 클래스 I은 여러 하위 클래스로 구분될 수 있다.

3.1.1. Lanthipeptides

Class 1 lanthipeptides consist of highly diverse post-translationally modified peptides that characteristically contain cross-link thioether between non-proteinogenic lanthionine and 3-methyllanthionine [53]. Lanthipeptides are produced as precursor peptides and consist of a leader and a core peptide. The precursor peptide is post-translationally modified and cross-linked with thioether, and, subsequently, the leader peptide is removed, and a mature lanthipeptide is released [54]. Lanthipeptides exhibit promising antimicrobial activity, and, indeed, a lanthipeptide “nisin” is commercially used in the food industries. Nisin prevents the synthesis of peptidoglycan transglycosylation and forms a membrane-spanning pore [55]. Several gene clusters are associated with the biosynthesis and maturation of class I lanthipeptides, as identified in the B. subtilis genome using computational tools. Recently, a more robust computational tool has been designed to identify the lanthipeptide gene cluster from genomic data [56]. However, their specific products are yet not purified from the producer strains.

3.1.1. 란티펩타이드

클래스 1 란티펩타이드는

비단백질성 란티오닌과 3-메틸란티오닌 사이의 가교 티오에테르를 특징적으로 포함하는

매우 다양한 번역 후 변형 펩타이드로 구성된다 [53]

란티펩타이드들은 전구체 펩타이드 형태로 생성되며,

리더 펩타이드와 코어 펩타이드로 구성된다.

전구체 펩타이드는 번역 후 변형을 거쳐 티오에테르로 가교 결합된 후,

리더 펩타이드가 제거되어 성숙한 란티펩타이드가 방출된다[54].

란티펩타이드들은 유망한 항균 활성을 보이며,

실제로 란티펩타이드인 “니신”은 식품 산업에서 상업적으로 사용된다.

니신은 펩티도글리칸의 트랜스글리코실화 합성을 방해하고 막을 관통하는 기공을 형성한다 [55]. B. subtilis 게놈에서 계산 도구를 사용하여 확인된 바와 같이, 여러 유전자 클러스터가 I형 란티펩타이드의 생합성과 성숙과 연관되어 있다. 최근에는 게놈 데이터로부터 란티펩타이드 유전자 클러스터를 식별하기 위한 보다 강력한 계산 도구가 설계되었다[56]. 그러나 생산 균주로부터 특정 생성물을 아직 정제하지는 못했다.

3.1.2. Lasso Peptides

Lasso peptides are a relatively newly characterized class of RiPPs composed of short-chain peptides comprising an N-terminal macrolactam by which the C-terminal is linked [57]. The N-terminal “ring” is formed by 7 to 9 amino acids that are linked by an isopeptide bond between the N-terminal amino group of the first residue and the carboxylate chain of glutamate or aspartate residue [54]. The first residue of lasso peptides, cysteine or glycine, is highly conserved. Therefore, bioinformatics approaches are recommended for the discovery of new lasso peptides [58]. However, few lasso peptides have been discovered with alanine or serine as their first amino acid [59]. Lasso peptides’ gene clusters have been identified from the B. subtilis genome, but the specific product is yet not fully characterized. Lasso peptides are important antimicrobial peptides, and their biosynthesis involves the synthesis of a precursor A-peptide via A-protein. The precursor is post-translationally modified via B-protein and C-protein. B-protein is an ATP-dependent lasso protease that removes the leader peptide, and C-protein is an ATP-dependent synthetase (lasso cyclase) that catalyzes the synthesis of the macrolactam ring between the N-terminal of an amino group and the side chain of glutamate or aspartate in the peptide. Due to the specific threaded loop topology, the peptides resemble “lassos”, hence the term “lasso peptides” [54].

3.1.2. 라소 펩타이드

라소 펩타이드는

비교적 최근에 규명된 RiPPs의 한 종류로,

N-말단에 위치한 마크로락탐과 C-말단이 연결된 단쇄 펩타이드로 구성된다[57].

N-말단 “고리”는 첫 번째 잔기의 N-말단 아미노기와 글루타메이트 또는

아스파르트산 잔기의 카르복실산 사슬 사이의 이소펩타이드 결합으로 연결된

7~9개의 아미노산으로 형성된다[54].

라소 펩타이드의 첫 번째 잔기인

시스테인 또는 글라이신은 매우 보존적이다.

따라서

새로운 라소 펩타이드 발견을 위해 생물정보학적 접근법이 권장된다 [58].

그러나 첫 번째 아미노산이 알라닌 또는 세린인 라소 펩타이드의 발견은 드물다 [59]. 라소 펩타이드 유전자 클러스터는 B. subtilis 게놈에서 확인되었으나, 구체적인 생성물은 아직 완전히 규명되지 않았다. 라소 펩타이드는 중요한 항균 펩타이드이며, 그 생합성 과정에는 A-단백질을 통한 전구체 A-펩타이드의 합성이 포함된다. 이 전구체는 B-단백질과 C-단백질을 통해 번역 후 변형을 거친다. B-단백질은 선두 펩타이드를 제거하는 ATP 의존성 라소 프로테아제이며, C-단백질은 펩타이드의 아미노기 N-말단과 글루타메이트 또는 아스파르테이트의 측쇄 사이에서 매크롤락탐 고리 합성을 촉매하는 ATP 의존성 합성효소(라소 사이클레이스)이다. 특이적인 실루프 구조로 인해, 이 펩타이드들은 “올가미”를 닮았기에 “올가미 펩타이드(lassopeptides)”라는 용어가 사용됩니다 [54].

3.1.3. Sactipeptides

Sectippetides are biologically active peptides with exceptional cross-links between the sulfur of cysteine and the alpha carbon of other residues catalyzed by S-adenosylmethionine (SAM) [60]. The post-translational link of a thiol group to the alpha carbon is unusual in RiPPs and is responsible for the antimicrobial activity of sactipeptides [61,62]. Genome mining can efficiently detect the unique SAM enzyme whose coding genes are co-localized with the sactipeptides biosynthesis gene cluster [63]. Several sactipeptides have been identified from Bacillus spp., such as subtilosin A, a sactipeptide produced by the synthesis of B. subtilis 168 from the predecessor by the proteolytic cleavage of the leader peptide and the cyclization of the N and C-terminals via covalent linkage [64,65]. Further, modification of threonine, cysteine, and phenylalanine occurs, and the mature peptide is exported via ABC transporters [13]. Sactipeptides are reported to be active against Bacillus spp. Listeria monocytogen, Gardnerella vaginalis, and Enterococcus faecalis by making pores in their cell membrane [65,66,67].

3.1.3. 삭티펩타이드(Sactipeptides)

삭티펩타이드는

시스테인의 황과 다른 잔기의 알파 탄소 사이에 S-아데노실메티오닌(SAM)에 의해 촉매되는

특이적인 가교 결합을 가진 생물학적 활성 펩타이드입니다 [60].

알파 탄소에 티올 그룹을 전사 후 연결하는 것은

리프(RiPPs)에서 흔치 않으며,

사크티펩타이드의 항균 활성을 담당한다 [61,62].

게놈 마이닝은 사크티펩타이드 생합성 유전자 클러스터와 함께 위치하는 코딩 유전자를 가진 독특한 SAM 효소를 효율적으로 탐지할 수 있다 [63]. 여러 사크티펩타이드가 Bacillus spp.에서 확인되었으며, 예를 들어 서브틸로신 A는 B. subtilis 168 균주가 전구체에서 리더 펩타이드의 단백질 분해적 절단과 N-말단 및 C-말단의 공유 결합을 통한 고리화를 통해 합성하는 사크티펩타이드이다 [64,65]. 또한 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌의 변형이 발생하며, 성숙된 펩타이드가 ABC 수송체를 통해 분비된다 [13]. 삭티펩타이드들은 Bacillus 속, Listeria monocytogenes, Gardnerella vaginalis, Enterococcus faecalis의 세포막에 구멍을 만들어 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 [65,66,67].

3.1.4. Linear Azole-Containing Peptides (LAPs)

The linear azole-containing peptides (LAPs) are heterocyclic peptides derived from the threonine, cysteine, and serine of a short precursor peptide [68]. They consist of four obligatory modules: a precursor peptide that is also known as peptide A, a heterotrimeric enzyme complex (dehydrogenase B), and cyclodehydratase C and D. Plantazolicin is a LAP produced by B. amyloliquefaciens. Its biosynthesis initiates with the formation of azoline heterocycles via the C and D complex from threonine/serine and cysteine, followed by dehydrogenation by B leading to the synthesis of the corresponding azole [69,70]. Regardless of the low amino acid identity of the BCD complex between LAP loci, numerous reports revealed that BCD genes could be associated with various LAP biosynthesis pathways by converting the precursor peptide into the active RiPP [70,71]. Therefore, these genes are used in genome mining [72]. Sonorensin was initially reported from a marine-derived Bacillus sp. that effectively antagonizes the growth of both Gram-positive and negative bacteria. Further, it was proposed that growth inhibition occurred due to the increased cell membrane permeability. The sonorensin-coated low-density polyethylene film efficiently controls the food spoilage of Gram-positive bacteria such as S.aureus and L. monocytogenes [73]. The bio-preservative property of the sonorensin-coated film in meat and vegetables demonstrates its potential application in the food industries.

3.1.4. 선형 아졸 함유 펩타이드(LAPs)

선형 아졸 함유 펩타이드(LAPs)는

짧은 전구체 펩타이드의 트레오닌, 시스테인, 세린에서 유래한 헤테로사이클릭 펩타이드이다 [68].

이들은 네 가지 필수 모듈로 구성된다:

전구체 펩타이드(펩타이드 A로도 알려짐),

이종 삼량체 효소 복합체(탈수소효소 B), 그리고

사이클로탈수효소 C와 D. 플란타졸리신은 B. amyloliquefaciens에 의해 생성되는 LAP이다.

그 생합성은 C 및 D 복합체를 통해 트레오닌/세린과 시스테인으로부터 아졸린 헤테로사이클의 형성과 함께 시작되며, 이후 B에 의한 탈수소화를 거쳐 해당 아졸의 합성으로 이어진다 [69,70]. LAP 유전자좌 간 BCD 복합체의 낮은 아미노산 동일성에도 불구하고, 수많은 보고서에 따르면 BCD 유전자들은 전구체 펩타이드를 활성 RiPP로 전환함으로써 다양한 LAP 생합성 경로와 연관될 수 있음이 밝혀졌다[70,71]. 따라서 이러한 유전자들은 게놈 마이닝에 활용된다[72]. 소노렌신은 그람 양성균과 음성균 모두의 성장을 효과적으로 억제하는 해양 유래 Bacillus sp.에서 최초로 보고되었다. 또한 세포막 투과성 증가로 인해 성장 억제가 발생한다고 제안되었다. 소노렌신 코팅 저밀도 폴리에틸렌 필름은 S.aureus 및 L. monocytogenes와 같은 그람양성균의 식품 부패를 효과적으로 제어한다[73]. 소노렌신 코팅 필름의 육류 및 채소 생물학적 방부 특성은 식품 산업에서의 잠재적 응용 가능성을 입증한다.

3.1.5. Thiopeptides

Thiopeptides are an emerging group of antibiotics and include more than 100 compounds. Thiopeptides not only exhibit antibacterial activity but also possess broad bioactivities such as anticancer, antiplasmodial, and anti-immunosuppressive activities [74]. Few completely characterized thiopeptides have been reported from the B. subtilis group. Recently, only one thiopeptide was purified and identified among 80 thiopeptide biosynthetic gene clusters detected via genome mining approaches [75].

3.1.6. Cyclic (Head-to-Tail) Peptides

The head-to-tail cyclic peptides are relatively long peptides with 35–70 amino acid residues. The peculiar features of cyclic peptides are not only their large size but also the modifying enzymes associated with their cyclization. Due to their macrocyclization, these peptides are relatively resistant to higher temperatures, pH changes, and several proteases [76]. These peptides are distinguished from lanthipeptides in that they do not contain lanthionine, methyl lanthionine, and hydrated amino acid residues [77]. Amylocyclicin was reported as a new head-to-tail cyclized peptide from B. amyloliquefaciens, which is derived from 112 amino acid residues precursor encoded by the acnA gene [78]. The cyclization of amylocyclicin occurs between leucine one and tryptophan 64. Amylocyclicin inhibits the growth of Gram-positive bacteria, including B. subtilis [78]. Recently, another novel cyclized peptide, “pumilarin”, was detected via genome mining in the B. pumilus genome and was reported to have a cyclized structure and exhibit a wide range of bioactivities [79]. Pumilarin was found to be post-translationally modified so that its N and C-terminals are linked via a peptide bond. The pumilarin biosynthetic gene cluster comprises the pumA, pumB, pumC, pumC1, and pumD genes [79]. However, the exact biosynthetic pathway for pumilarin is yet to be elucidated.

3.1.5. 티오펩타이드

티오펩타이드는 새롭게 부상하는 항생제 그룹으로 100종 이상의 화합물을 포함한다. 티오펩타이드는 항균 활성뿐만 아니라 항암, 항말라리아, 항면역억제 활성 등 광범위한 생물학적 활성을 지닌다 [74]. B. subtilis 그룹에서 완전히 규명된 티오펩타이드는 거의 보고된 바 없다. 최근 게놈 마이닝 접근법을 통해 검출된 80개의 티오펩타이드 생합성 유전자 클러스터 중 단 하나의 티오펩타이드만이 정제 및 동정되었다[75].

3.1.6. 순환(헤드-투-테일) 펩타이드

헤드-투-테일 순환 펩타이드는 35~70개의 아미노산 잔기를 가진 비교적 긴 펩타이드이다. 순환 펩타이드의 독특한 특징은 큰 크기뿐만 아니라 순환화와 관련된 변형 효소들이다. 거대 순환화 특성으로 인해, 이 펩타이드들은 상대적으로 높은 온도, pH 변화 및 여러 프로테아제에 대해 내성을 보인다 [76]. 이 펩타이드들은 란티오닌, 메틸란티오닌 및 수화 아미노산 잔기를 포함하지 않는다는 점에서 란티펩타이드와 구별된다 [77]. 아밀로사이클리신은 B. amyloliquefaciens에서 발견된 새로운 머리-꼬리 순환화 펩타이드로 보고되었으며, 이는 acnA 유전자에 의해 암호화되는 112개 아미노산 잔기 전구체에서 유래된다 [78]. 아밀로사이클리신의 고리화는 류신 1번과 트립토판 64번 사이에서 발생한다. 아밀로사이클리신은 B. subtilis를 포함한 그람 양성균의 성장을 억제한다[78]. 최근 B. pumilus 게놈의 게놈 마이닝을 통해 또 다른 새로운 고리화 펩타이드인 “푸밀라린”이 검출되었으며, 고리화 구조를 가지며 광범위한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 [79]. 푸밀라린은 번역 후 변형을 거쳐 N말단과 C말단이 펩타이드 결합으로 연결된 것으로 밝혀졌다. 푸밀라린 생합성 유전자 클러스터는 pumA, pumB, pumC, pumC1, pumD 유전자로 구성된다[79]. 그러나 푸밀라린의 정확한 생합성 경로는 아직 규명되지 않았다.

3.2. Class II Peptides

Class II metabolites are heat stable (121 °C), short peptides of less than 10 kDa, and are usually not post-translationally modified [80,81]. Previously, lactic acid bacteria were reported to be the main producer of RiPPs due to their long history of safe use in food [82]. In 1960, nisin was approved as a safe food additive and used in more than 50 countries as an antibacterial agent against Gram-positive bacteria [83]. Nevertheless, the quest for new antimicrobial agents rapidly stretched to other RiPP producing bacterial species. Bacillus species have become increasingly attractive due to being “generally recognized as safe (GRAS)” and having a broader antimicrobial spectrum. [21,84,85].

The non-modified RiPPs produced by the B. subtilis group can be further divided into three subclasses based on the conserved amino acid motifs near N-terminus.

3.2. Class II 펩타이드

Class II 대사산물은 열안정성(121°C)을 가지며, 10 kDa 미만의 짧은 펩타이드이고, 일반적으로 번역 후 변형되지 않는다 [80,81]. 이전에는 유산균이 식품에서 오랜 기간 안전하게 사용되어 온 역사로 인해 RiPPs의 주요 생산자로 보고되었다 [82]. 1960년, 니신(nisin)은 안전한 식품 첨가물로 승인되어 그람 양성균에 대한 항균제로 50개 이상의 국가에서 사용되었다[83]. 그럼에도 불구하고 새로운 항균제 탐구는 다른 RiPP 생산 세균 종으로 빠르게 확대되었다. 바실러스(Bacillus) 종은 “일반적으로 안전하다고 인정됨(GRAS)”이며 더 넓은 항균 스펙트럼을 지닌다는 점에서 점점 더 주목받고 있다[21,84,85].

B. subtilis 그룹이 생성하는 비변형 RiPP는 N-말단 근처의 보존된 아미노산 모티프에 따라 세 가지 하위 분류로 추가 구분될 수 있다.

3.2.1. Pediocin-like Peptides

The pediocin-like peptides inhibit numerous clinically relevant pathogens and have a conserved YGNGVXC motif. Despite their great potential as antibacterial agents, the problems associated with their commercial-scale production limit their industrial application. So far, coagulin is the single complete characterized pediocine-like peptide reported from B. coagulans [86]. Coaguline was first reported in 1998, and the complete amino acid sequence was reported in 2000 [80].

3.2.1. 페디오신 유사 펩타이드

페디오신 유사 펩타이드는 다수의 임상적으로 중요한 병원체를 억제하며 보존된 YGNGVXC 모티프를 가진다. 항균제로서의 큰 잠재력에도 불구하고, 상업적 규모의 생산과 관련된 문제로 인해 산업적 적용이 제한된다. 현재까지 B. coagulans에서 보고된 유일한 완전 규명된 페디오신 유사 펩타이드는 코아굴린이다 [86]. 코아굴린은 1998년에 처음 보고되었으며, 완전한 아미노산 서열은 2000년에 보고되었다[80].

3.2.2. Other Non-Modified Peptides

The non-modified peptides have a conserved motif of DWTXWSXL at the N-terminus. In 2001, a hydrophobic and thermotolerant antimicrobial peptide, lichenin, was purified and characterized from B. licheniformis culture [87]. Recently, the biosynthetic gene clusters encoding the class IIb non-modified peptide BhIA were reported from the B. subtilis, B. lechniformis, B. pumilus, and B. amyloliquefaciens genomes via genome mining approaches. The structural analysis revealed significant similarities with holins produced by Geobacillus spp [88]. Holins are phage-encoded peptides involved in the disruption of bacterial cell membranes [89]. However, the function of each biosynthetic coding module remains unknown. The holin-like BhIA metabolite exhibited antibacterial activity against pathogenic Gram-positive bacteria such as Micrococcus luteus and multi-drug resistant S. aureus [90]. The peptide BhIA is composed of 70 amino acids with a transmembrane domain at the N-terminus. Several hydrophilic amino acid residues at the N-terminal and specific membrane topology distinguish BhIA from holin [90]. Aureocin A53 is another new member of the non-modified peptides whose biosynthetic gene cluster was detected in the B. pumilus genome. Aureocin antagonizes the growth of L. monocytogenes by disturbing the cell membrane and inhibits the synthesis of DNA, protein, and polysaccharides simultaneously [91]. LCI was initially isolated from B. subtilis strain A014 and exhibits promising bioactivity against the plant pathogen Xanthomonas campestris [92]. X. campestris causes leaf blight disease in rice, which is a severe threat to rice production and causes significant losses in the rice field annually. LCI is a beta-structured antibacterial peptide comprising 47 amino acid residues. It also carries a hydrophobic core consisting of valine, tryptophan, and tyrosine [93]. LCI is a cationic peptide causing short-lived channels in the target bacterial cell membrane [93].

3.2.2. 기타 비변형 펩타이드

비변형 펩타이드들은 N-말단에 DWTXWSXL이라는 보존된 모티프를 가지고 있다. 2001년, B. licheniformis 배양액에서 소수성 및 내열성 항균 펩타이드인 리케닌(lichenin)이 정제 및 특성화되었다 [87]. 최근, B. subtilis, B. lechniformis, B. pumilus 및 B. amyloliquefaciens 게놈에서 게놈 마이닝 접근법을 통해 IIb형 비변형 펩타이드 BhIA를 암호화하는 생합성 유전자 클러스터가 보고되었다. 구조 분석 결과 Geobacillus 속이 생성하는 홀린(holins)과 상당한 유사성을 보였다 [88]. 홀린은 박테리아 세포막 파괴에 관여하는 파지 암호화된 펩타이드이다[89]. 그러나 각 생합성 코딩 모듈의 기능은 아직 알려지지 않았다. 홀린 유사 대사산물 BhIA는 Micrococcus luteus 및 다제내성 S. aureus와 같은 병원성 그람양성균에 대해 항균 활성을 나타냈다[90]. BhIA 펩타이드(70개 아미노산)는 N-말단에 막횡단 도메인을 지닌다. N-말단의 여러 친수성 아미노산 잔기 및 특이적인 막 토폴로지는 BhIA를 홀린 [90]. 아우레오신 A53은 B. pumilus 게놈에서 생합성 유전자 클러스터가 검출된 비변형 펩타이드의 또 다른 신규 구성원이다. 아우레오신은 세포막을 교란하여 L. monocytogenes의 성장을 억제하며, 동시에 DNA, 단백질 및 다당류 합성을 억제한다 [91]. LCI는 B. subtilis 균주 A014에서 최초로 분리되었으며, 식물 병원균 Xanthomonas campestris에 대해 유망한 생물학적 활성을 나타낸다 [92].. X. campestris는 벼에 잎마름병을 유발하며, 이는 벼 생산에 심각한 위협이 되어 매년 논에서 상당한 손실을 초래한다. LCI는 47개의 아미노산 잔기로 구성된 베타 구조의 항균 펩타이드이다. 또한 발린, 트립토판, 티로신으로 구성된 소수성 코어를 지닌다 [93]. LCI는 양이온성 펩타이드로 표적 세균 세포막에 단기간 지속되는 채널을 형성한다 [93].

3.2.3. Large Antimicrobial Peptides

The large antimicrobial peptides are relatively larger and include bioactive metabolites having a size of more than 10 kDa. Their biosynthetic gene cluster consists of an immunity gene and a structural gene. Several Bacillus species, such as B. thuringiensis, B. coagulans, and B. cereus, are reported to produce large antimicrobial peptides [88]. However, as yet, none have been reported from the B. subtilis group.

3.2.3. 대형 항균 펩타이드

대형 항균 펩타이드는 상대적으로 크며, 10 kDa 이상의 크기를 가진 생리활성 대사산물을 포함한다. 이들의 생합성 유전자 클러스터는 면역 유전자와 구조 유전자로 구성된다. B. thuringiensis, B. coagulans, B. cereus 등 여러 Bacillus 종이 대형 항균 펩타이드를 생산하는 것으로 보고되었다 [88]. 그러나 지금까지 B. subtilis 그룹에서는 보고된 바 없다.

4. Polyketides (PKs)

Polyketides are structurally diverse bioactive metabolites that contain an alternative methylene and carbonyl group [94]. Polyketides are widely used as therapeutic agents to treat numerous diseases [95]. For instance, tetracycline and erythromycin are used as antibacterials [96], amphotericin is used as an antifungal [97], and anthracyclin is used as an antitumor drug [98]. The biosynthesis of PKs is carried out by a multi-domain enzyme, which consists of ketosynthase, acyltransferase, and thioesterase. Its biosynthesis is initiated by loading the acyl CoA on acyl carrier protein (ACP), catalyzed by acyltransferase (AT). The ketosynthase (KS) extends the carbon chain via decarboxylative condensation. The ketoreductase (KR), enoyl reductase (ER), and dehydratase (DH) domain may further modify the beta-keto group to produce diverse PKs (Figure 5). Subsequently, the thioesterase domain terminates the elongation process by cyclizing or hydrolyzing the PK chain from ACP and releasing a mature PK peptide [99].

4. 폴리케타이드(PKs)

폴리케타이드는

메틸렌과 카르보닐 그룹이 번갈아 포함된 구조적으로 다양한 생리활성 대사산물이다 [94].

폴리케타이드는

다양한 질병 치료제로 널리 사용된다 [95].

예를 들어,

테트라사이클린과 에리스로마이신은 항균제로 사용되며 [96],

암포테리신은 항진균제로 [97],

안트라사이클린은 항종양제로 사용된다 [98].

PK의 생합성은

케토신타제, 아실전달효소 및 티오에스테라아제로 구성된

다중 도메인 효소에 의해 수행된다.

생합성은

아실전달효소(AT)의 촉매 작용으로

아실 CoA가 아실 운반 단백질(ACP)에 부하되면서 시작된다.

케토신타제(KS)는

탈카르복실화 축합을 통해 탄소 사슬을 연장합니다.

케토환원효소(KR), 에노일환원효소(ER), 탈수효소(DH) 도메인은

베타-케토기를 추가로 변형시켜

다양한 폴리케톤을 생성할 수 있습니다(그림 5).

그 후, 티오에스테라제 도메인은 ACP로부터 PK 사슬을 환원하거나 가수분해하여

성숙한 PK 펩타이드를 방출함으로써 연장 과정을 종료합니다 [99].

Figure 5. Schematic representation of enzyme domains involved in the biosynthesis of Polyketide (PKs). Core and auxillary (optional) domains are color coded. Core domains: AT; Acyltransferse, ACP; Acyle carrier protein, KS; Ketosynthase and TE; Thioesterase. Auxiliary domains: KR; Ketoreductase, DH; dehydrase, and ER; Enoyl acyle reductase.

PKs can be classified into three subclasses based on the structural organization of the functional module, i.e., type I PKs, type II PKs, and type III PKs. The type I PKs consist of a large multi-functional enzyme complex carrying several modules bonded covalently and linearly arranged. Type II PKs are multi-enzyme complexes that consist of individual monofunctional enzymes combined during the biosynthesis of ketides. In contrast, type III PKs are chalcone synthase (CHS) like polyketide synthetases, which activate the CoA thioesters directly without the ACP domain [100]. Apart from the structural organization of the functional domain, PKs can be categorized as iterative and non-iterative depending on the number of ketosynthase involved in the biosynthesis of PKs. Bacteria used non-iterative type I polyketide synthase (PKS) enzymes to produce polyketides, and this consensus linearity is employed to identify PKs via genome mining approaches [101]. Besides these differences, due to the great diversity, some other alteration has also been observed. As some times PKs biosynthesis pathways mixed by combining different types of PKSs or even can be associated with NRPSs or fatty acid synthetases to produce a hybrid peptide such as compactin, bacillaene, and fusarin C. bacillaene was previously classified as a PKs-polyene [22]. But, here, based on biosynthetic pathways classified as hybrid PKS/NRPS and will discuss later in hybrid metabolites. PKs can be divided into several classes based on typical structure and carbon skeleton [102]. However, the PKs produced by B. subtilis can be divided into two major types, i.e., Polyenes and enediynes (Supplementary Material Table S3).

그림 5. 폴리케타이드(PKs) 생합성에 관여하는 효소 도메인의 개략도. 핵심 및 보조(선택적) 도메인은 색상으로 구분됨. 핵심 도메인: AT; 아실전달효소, ACP; 아실 운반 단백질, KS; 케토합성효소, TE; 티오에스테라제. 보조 도메인: KR; 케토환원효소, DH; 탈수효소, ER; 에노일 아실 환원효소.

PK는 기능 모듈의 구조적 조직에 따라 세 가지 하위 분류로 구분됩니다: 즉, 제1형 PK, 제2형 PK, 제3형 PK입니다. 제1형 PK는 여러 모듈이 공유 결합으로 연결되어 선형 배열된 대형 다기능 효소 복합체로 구성됩니다. II형 PK는 케타이드 생합성 과정에서 결합된 개별 단일 기능성 효소들로 구성된 다중 효소 복합체이다. 반면 III형 PK는 ACP 도메인 없이 CoA 티오에스터를 직접 활성화하는 칼콘 합성효소(CHS)와 유사한 폴리케타이드 합성효소이다 [100]. 기능 도메인의 구조적 조직 외에도, PK는 생합성에 관여하는 케토신타제 수에 따라 반복형(iterative)과 비반복형(non-iterative)으로 분류될 수 있다. 박테리아는 비반복형 제1형 폴리케타이드 합성효소(PKS)를 이용해 폴리케타이드를 생산하며, 이러한 공통된 선형 구조는 게놈 마이닝 접근법을 통한 PK 식별에 활용된다 [101]. 이러한 차이점 외에도, 매우 다양한 특성으로 인해 다른 변형들도 관찰되었다. 때로는 PKs 생합성 경로가 서로 다른 유형의 PKS들을 결합하여 혼합되거나, 심지어 NRPSs나 지방산 합성효소와 연관되어 컴팩틴(compactin), 바실라엔(bacillaene), 푸사린(fusarin)과 같은 하이브리드 펩타이드를 생성하기도 한다. C. bacillaene은 이전에 PKs-폴리엔(polyene)으로 분류되었다 [22]로 분류되었으나, 본 연구에서는 생합성 경로에 기반하여 하이브리드 PKS/NRPS로 분류하며, 후술할 하이브리드 대사산물에서 논의할 예정이다. PK는 전형적인 구조와 탄소 골격에 따라 여러 클래스로 분류될 수 있다[102]. 그러나 B. subtilis가 생성하는 PK는 폴리엔(Polyenes)과 에네디인(enediynes)이라는 두 가지 주요 유형으로 구분된다(보충 자료 표 S3).

4.1. Polyenesa.

Difficidin

Difficidins are unsaturated macrocyclic polyene synthesized by the type 1 PKS (Supplementary Material Figure S3A). Oxydifficidin is an oxidative form of difficidin having an additional hydroxyl group at position 5 [103]. It is encoded by the diff operon that has 14 open reading frames. Several KR, DH, and ER domains are missing within the diff operon and deviate from the colinearity rule. Moreover, the function of diffJ and diffK are unknown, and their activities do not appear in the final product [104]. Difficidin has broad-spectrum antibacterial activity and inhibits the biosynthesis of protein in E. coli [103,105]. Difficidin is produced by B. amyloliquefaciens ATCC strain numbers 39,320 and 39,374 (classified initially as B. subtilis) [103]. B. amyloliquefaciens strain FZB42 showed biocontrol activity against Xanthomonas oryzae by producing difficidin. Scan electron microscopy results showed that difficidin inhibits the growth of a phytopathogen by rupturing the targeted bacterial cell wall. Further, the biocontrol experiments revealed that difficidin caused the downregulation of genes associated with Xanthomonas cell wall synthesis, cell proliferation and virulence [106]. Collectively these studies discuss the future prospective of the strains as a biological control agent against plant pathogens.

b.

Aurantinin

The antibacterial exhibiting polyketide aurantinin A and B were isolated initially from Bacillus aurantinus [107]. Recently, along with these two aurantinins, C and D were reisolated in combination with the genome mining approach [108]. The structure of aurantinin and its analogues are very unusual, as they have 5, 6, 7, and 8-membered rings with a highly diverse tail (Supplementary Material Figure S3B). Nevertheless, the absolute structure is yet not elucidated, leaving numerous questions about conformation unanswered. Aurantinin B, C and D exhibit promising antibacterial activity against Clostridium sporogenes and S. aureus. However, they did not show any cytotoxicity against human epithelial colorectal adenocarcinoma and cellosaurus cell lines. The antibacterial mechanism was examined and revealed that aurantinin B-D disrupts bacterial cell membranes causes breakage of cytoplasm and leads to cell death [108]. Owing to their safety profile and discriminatory activity against G-negative bacteria highlights its scope for commercial applications.

Besides that, four antibacterial metabolites have recently been isolated from marine B. subtilis that exhibit antagonistic activity against G-negative food pathogens [109]. Their biosynthetic pathway was speculated to be synthesized via the PKS. Their cytotoxicity, antifungal activity, and complete structure are still unclear.

c.

Macrolactins

Macrolactins and their derivatives (7-O-succinyl or 7-O-malonyl) are synthesized via a type 1 PKS. Macrolactins inhibit the growth of bacteria and have been isolated from various species such as Bacillus sp. strain AH1591-1 and B. amyloliquefeciens strain FBZ42 [110,111]. Macrolactins usually consist of 24 lactone rings and three diene moieties in the carbon skeleton. Its biosynthetic gene cluster mln composed of nine operons and 11 KS domains with acetate and malonate is the only used building block. Like dif gene cluster organization, mln appears in an occasional splitting of the modules. The second module is split between mlnB and mlnC, and a similar arrangement can be observed for modules number 5, 7, 8, and 10. A comparison of catalytic domain organization revealed that the ER domain is missing in module number 2, while two DH domains are missing in modules 7 and 10 [110].

The B. subtilis group mostly produces biosynthetic derivatives of macrolactin A (Supplementary Material Figure S3C). For instance, 7-O succinylmacrolactin A showed antibacterial activity against S. aureus with mild cytotoxicity [112,113]. It also exhibits anticancer activity via the CYP2P9 and P13K pathways [114,115,116]. Conveniently, 7-O succinylmacrolactin A also shows anti-inflammatory activity via the same pathways [112]. Compared to macrolactine A, 7-O succinylmacrolactin A might be a better candidate as a lead due to its superior stability and pharmacokinetics [115,117]. The compound 7-O-malonylmacrolactin A exhibits similar anti-inflammatory activity to macrolactin A and 7-O succinylmacrolactin A; however, due to its activity against MRSA, it gained more attention [112]. Bacillomycin D and 7-O malonylmacrolactin A produced by the B. subtilis group have been employed as biocontrol agents against phytopathogenic bacteria and fungi with bioorganic fertilizers [118,119]. Therefore, the coproduction of various bioactive metabolites might be a productive approach for wide-ranging biological control, highlighting the value of B. subtilis.

Moreover, aromatic and unsaturated macrolactin have been reported with 7-O-6′-(2″-acetylphenyl)-5′-hydroxyhexanoate-macrolactin A, demonstrating a fine example of esterification of two PKS products [113]. The compound 7-O-6′-(2″-acetylphenyl)-5′-hydroxyhexanoate-macrolactin A was isolated from a seaweed associated B. subtilis with good antibacterial activity against Gram-positive bacteria [113]. However, its structure is yet to be elucidated. Conversely, 7-O-2′E-butenoylmacrolactin A was extracted from sea-sediment-derived B. subtilis and showed moderate antifungal activity against Colletotrichum gloeosporioides and Pestalotiopsis theae [116]. The compound 7-O-methyl-5′-hydroxy-3′-heptenoate macrolactin A isolated from the algal-associated B. subtilis strain MTCC 10,403 displayed moderate antibacterial activity [120], but the investigator further did not report bioactivity and structure-related information.

Macrolactin B is 7-O-β-glycosylate was first isolated in 1989 and was reisolated from marine B. subtilis [121,122]. Macrolactin B exhibit potent antifungal activity; however, unlike macrolactin A, it is not cytotoxic, indicating the structure-activity relationship of macrolactins. Macrolactin W is the only example of macrolactin which is both 7-O glycosylated and esterified. Its antimicrobial property is similar to macrolactin A and B, though it has no cytotoxic activity [122,123]. The cytotoxic, antiviral, and anti-inflammatory activity is observed for the parent metabolite macrolactin A and as yet not determined for its derivatives. It is anticipated that these compounds are hydrolyzed in vivo and release the active metabolite macrolactin A.

4.2. Enediynes

To date, the PK enediyne is the most cytotoxic natural product, and its application as an anticancer drug has been clinically demonstrated [124]. Due to the substantial cytotoxicity of enediyne, its application is minimal. However, its application in various antibody-drug conjugates and polymer-based drug delivery systems has had great success [125,126]. Enediynes are commonly produced by Streptomyces spp. However, recently reported from Bacillus sp. via the genome mining approach [127]. The complete biosynthetic machinery and structure yet remain to be elucidated.

5. Hybrid Metabolites

Hybrid metabolites are the products of biosynthetic pathways that comprise both (NRPS/PKS) types of modular enzymes. Questions relating to the synthesis of hybrid products are of great present-day interest, as their answer concerns genetic engineering efforts. Both depend on thio-template for acyl chain elongation and monomers triggering. Presently, the factors of molecular events that offer a hybrid pathway to accommodate various assembly line chemical moieties functionally are yet not completely elucidated. However, based on the current knowledge, the hybrid metabolites produced by B. subtilis can be classified as bacillaene and isocoumarins (Supplementary Material Table S4).

a.

Bacillaene

Bacillaene has a linear structure (Supplementary Material Figure S3D) and was first reported from B. subtilis strains 55,422 and 3610 [128]. It is encoded by a hybrid PKS-NRPS biosynthetic gene cluster known as bacillaene PksX synthase (Figure 6). The pksX mega gene cluster in B. subtilis 168 genome consisted of 5 open reading frames named pksJ, pksL, pksM, pksN, and pksR [104,129]. The first two adenylation domains of pksJ incorporate glycin and α-hydroxy-isocaproic acid. The third adenylation domain (pksN) is responsible for the incorporation of alanine. While the three open reading frames pksC, baeD, and baeE encode for three separate AT domains are responsible for incorporating malonyl-CoA [130]. Bacillaene inhibits the growth of various bacteria and fungi such as Myxococcus xanthus, and Trichoderma spp. [131,132]. Bacillaene selectively inhibits the biosynthesis of protein in bacteria, indicating a selective inhibition of other strains in their habitat [128].

Figure 6. The biosynthetic gene cluster (pksX) and biosynthesis of hybrid bacillaene. Key: KS (ketosynthase), AT (acyltransferase), T (thiolation), DH (dehydratase), KR (ketoreductase), MT (methyltransferase), A (adenylation), C (condensation), ATd (AT-docking), Hyd (Zn-dependent hydrolase), Ox (flavin mononucleotide-dependent oxidase), HCF (HMG-CoA synthase), ECH (enoyl-CoA hydratase), and TE: (thioesterase).

b.

Isocoumarins

Isocoumarins form a large, diverse class of biologically active metabolites with more than 200 metabolites [133]. However, fewer are reported from B. subtilis. It has been reported that B. subtilis specifically produce isopropyl-8-hydroxy-3,4-dihydroisocoumarins with an active side chain or functionalized amino acid [134]. Amicoumacin A-C (Supplementary Material Figure S3E,F) and amicoumacin F are dihydroisocoumarins initially reported from B. pumilus [135,136,137]. Later, they were reported from B. subtilis and determined its strong antibacterial activity against the gastric pathogen Helicobacter pylori [138]. Biosynthesis of these bioactive metabolites has been recently reported from B. subtilis 1779 via a genome mining approach [139]. The BGC encoding amicoumacin was predicted to be 47.4 kb in size and consists of 12 open reading frames. Further, the investigator expressed the biosynthetic gene cluster in a heterologous host and obtained amicoumacin A–C. Based on these findings, they predicted the biosynthetic pathway for amicoumacin to be synthesized via hybrid PKS-NRPS modular enzymes [139]. The biosynthetic gene cluster consists of eight modules that synthesize two discrete pre-amicoumcin molecules. The unique dihydroisocoumarins core is likely to be synthesized via removing the AmiJ-M megasynthase complex to produce an oxygenated PK chain that reorganizes into a cyclic dihydroisocoumarin [139]. Amicoumacin exhibit promising anti-inflammatory and antibacterial activity and has gained increased interest as a pro-drug candidate. Specifically, amicoumacin A is more attractive due to its potent anticancer activity and antibacterial activity against MRSA, with MIC less than 1 µg/mL [136,137]. The antibacterial mechanism of amicoumacin was recently shown to be bind on the ribosome and inhibit protein biosynthesis [140,141]. Amicoumacin A and C exhibit antibacterial activity, while amicoumacin B is non-antibacterial. Interestingly, the hydroxy group in amicoumacin A and C is responsible for their antibacterial activity as the phosphate ester-containing amicoumacin B lacks antibacterial activity [142].

Bacilosarcin A (3-oxa-6,9-diazabicyclo [3.3.1]nonane ring) and B (rare 2-hydroxymorpholine moiety) with unique heterocyclic core structures were isolated from the marine-derived B. subtilis strain TP-B0611 [143]. Later on, their complete chemical structures and structure-activity relationships were demonstrated [144]. Unlike amicoumacin A and B, bacilosarcin A and B displayed marginal anti-herbicidal activity. The low anti-herbicidal activity reflects the side chain functional group and highlights the importance of the side chain for bioactivity. This hypothesis is further supported by the non-antibacterial activity of bacilosarcin C, which has –COOH (carboxylic) instead of –NH2 (amide) group [145].

The piperazin-containing damxungmacin A (dihydroisocoumarin) has an unusual heterocyclic ring that displays weak antibacterial activity and cytotoxicity [146]. Unlike other dihydroisocoumarin, damxungmacin exhibits weak bioactivity, low yield, and a complex molecular structure that offers distinctive bioprocessing techniques development. Similarly, damxungmacin B was isolated and showed no bioactivity against tested strains.

Hetiamacin A has shown promising antibacterial activity against oxacillin resistant S. aureus, Streptococcus pneumonia, and S. epidermidis with MIC less than 2 µm/mL [147,148]. The small differences in their structure and vast differences in their biological activity make them an attractive area of research to investigate the structure-activity relationship. Similar to amicoumacins, hetiamacin B has shown potent antibacterial activity; however, the structure configuration and biosynthesis of hetiamacin is still unknown. Hetiamacin C and D were also isolated from the same bacillus strain, but due to the low yield, their biological activity was not determined [149].

The instantaneous application of amicoumacin in agriculture and human medicine may not be appropriate. However, their strong anti-MRSA activity appears an attractive starting point for drug development. To date, their mode of action is yet not fully elucidated, therefore, compelling further investigation. Whereas some isocoumarins discussed above have already been synthesized, and the paths could be further extended towards sustainable and economical production, amicoumacin derivatives demand further studies to demonstrate the structure-activity relationship of the metabolites.

4.1. 폴리엔

a.디피시딘

디피시딘은 1형 PKS에 의해 합성되는 불포화 대환식 폴리엔이다(보충 자료 그림 S3A). 옥시디피시딘은 5위에 추가된 하이드록실기를 가진 디피시딘의 산화 형태이다[103]. 이는 14개의 오픈 리딩 프레임을 가진 diff 오페론에 의해 암호화된다. diff 오페론 내에는 여러 KR, DH 및 ER 도메인이 누락되어 있으며, 이는 선형성 규칙에서 벗어난다. 또한 diffJ와 diffK의 기능은 알려지지 않았으며, 이들의 활성은 최종 생성물에 나타나지 않는다 [104]. 디피시딘은 광범위한 항균 활성을 가지며, E. coli에서 단백질 생합성을 억제한다 [103,105]. 디피시딘은 B. amyloliquefaciens ATCC 균주 번호 39,320 및 39,374(초기 분류상 B. subtilis)에 의해 생산됩니다 [103]. B. amyloliquefaciens 균주 FZB42는 디피시딘을 생성하여 Xanthomonas oryzae에 대한 생물학적 방제 활성을 나타냈다. 주사전자현미경 결과, 디피시딘이 표적 세균 세포벽을 파괴함으로써 식물 병원체의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 생물학적 방제 실험을 통해 디피시딘이 Xanthomonas의 세포벽 합성, 세포 증식 및 병원성과 관련된 유전자의 발현을 억제한다는 사실이 밝혀졌다 [106]. 종합적으로 이러한 연구들은 해당 균주들이 식물 병원체에 대한 생물학적 방제제로서의 미래 가능성을 논의한다.

b.

오란티닌

항균 활성을 나타내는 폴리케타이드 오란티닌 A와 B는 Bacillus aurantinus에서 최초로 분리되었다 [107]. 최근, 이 두 오란티닌과 함께 C 및 D가 게놈 마이닝 접근법과 결합하여 재분리되었다[108]. 오란티닌과 그 유사체의 구조는 매우 특이한데, 5, 6, 7, 8원 고리를 가지며 매우 다양한 꼬리 구조를 지니기 때문이다(보충 자료 그림 S3B). 그럼에도 불구하고 절대 구조는 아직 규명되지 않아 구조적 특성에 관한 수많은 의문이 남아 있다. 오란티닌 B, C, D는 Clostridium sporogenes 및 S. aureus에 대해 유망한 항균 활성을 나타낸다. 그러나 인간 대장 선암종 상피세포 및 셀로사우루스 세포주에 대해서는 세포독성을 전혀 보이지 않았다. 항균 기전을 조사한 결과, 오란티닌 B-D는 세균 세포막을 파괴하여 세포질 파열을 유발하고 세포 사멸로 이어지는 것으로 밝혀졌다[108]. 안전성 프로필과 그람음성균에 대한 선택적 활성 덕분에 상업적 응용 가능성이 부각된다.

또한 최근 해양성 B. subtilis에서 분리된 4종의 항균성 대사산물은 G음성 식품 병원체에 대해 항균 활성을 나타냈다[109]. 이들의 생합성 경로는 PKS를 통해 합성된 것으로 추정된다. 세포독성, 항진균 활성 및 완전한 구조는 아직 명확하지 않다.

c.마크로락틴

마크로락틴과 그 유도체(7-O-숙신일 또는 7-O-말론일)는 1형 PKS를 통해 합성됩니다. 마크로락틴은 세균의 성장을 억제하며, Bacillus sp. 균주 AH1591-1 및 B. amyloliquefeciens 균주 FBZ42와 같은 다양한 종에서 분리되었습니다 [110,111]. 마크로락틴은 일반적으로 탄소 골격 내에 24개의 락톤 고리와 세 개의 디엔 모이어티로 구성된다. 아세테이트와 말로네이트를 유일한 구성 요소로 사용하는 9개의 오페론과 11개의 KS 도메인으로 구성된 생합성 유전자 클러스터 mln이 유일하게 사용된다. dif 유전자 군집 조직과 유사하게, mln 군집도 모듈 간 가끔 분할되는 형태를 보인다. 두 번째 모듈은 mlnB와 mlnC 사이에 분할되며, 모듈 번호 5, 7, 8, 10에서도 유사한 배열이 관찰된다. 촉매 도메인 조직 비교 결과, 모듈 번호 2에서는 ER 도메인이 결여된 반면, 모듈 7과 10에서는 두 개의 DH 도메인이 결여된 것으로 나타났다[110].

B. subtilis 그룹은 주로 마크롤락틴 A의 생합성 유도체를 생산한다(보충 자료 그림 S3C). 예를 들어, 7-O 숙시닐마크롤락틴 A는 S. aureus에 대해 항균 활성을 보였으며 세포 독성은 경미했다[112,113]. 또한 CYP2P9 및 P13K 경로를 통해 항암 활성을 나타낸다 [114,115,116]. 편리하게도, 7-O 숙시닐마크롤락틴 A는 동일한 경로를 통해 항염증 활성도 보인다 [112]. 마크라락틴 A에 비해, 7-O 숙시닐마크라락틴 A는 우수한 안정성과 약동학 특성으로 인해 선도 화합물 후보로서 더 나은 선택일 수 있다[115,117].. 화합물 7-O-말론일마크롤락틴 A는 마크롤락틴 A 및 7-O 숙신일마크롤락틴 A와 유사한 항염증 활성을 나타내지만, MRSA에 대한 활성으로 인해 더 많은 주목을 받았다 [112]. B. subtilis 군에서 생성되는 바실로마이신 D와 7-O 말로닐마크롤락틴 A는 생물유기비료와 함께 식물 병원성 세균 및 곰팡이에 대한 생물학적 방제제로 활용되어 왔다[118,119]. 따라서 다양한 생리활성 대사산물의 동시 생산은 광범위한 생물학적 방제를 위한 생산적인 접근법이 될 수 있으며, 이는 B. subtilis의 가치를 부각시킨다.

또한, 7-O-6′-(2″-아세틸페닐)-5′-하이드록시헥사노에이트-마크로락틴 A와 같은 방향족 및 불포화 마크로락틴이 보고되었으며, 이는 두 PKS 산물의 에스테르화 반응을 보여주는 훌륭한 사례이다 [113]. 7-O-6′-(2″-아세틸페닐)-5′-하이드록시헥산오에이트-마크롤락틴 A 화합물은 해조류 관련 B. subtilis에서 분리되었으며 그람 양성균에 대한 우수한 항균 활성을 나타낸다 [113]. 그러나 그 구조는 아직 규명되지 않았다. 반면, 7-O-2′E-부테노일마크롤락틴 A는 해저 퇴적물 유래 B. subtilis에서 추출되었으며, Colletotrichum gloeosporioides 및 Pestalotiopsis theae에 대해 중간 정도의 항진균 활성을 보였다 [116]. 해조류 관련 B. subtilis 균주 MTCC 10,403에서 분리된 화합물 7-O-메틸-5′-하이드록시-3′-헵테노산 마크롤락틴 A는 중간 정도의 항균 활성을 나타냈으나 [120], 그러나 연구자는 생물학적 활성 및 구조 관련 정보를 추가로 보고하지 않았다.

마크롤락틴 B는 7-O-β-글리코실레이트로 1989년 최초로 분리되었으며 해양성 B. subtilis에서 재분리되었다 [121,122]. 마크롤락틴 B는 강력한 항진균 활성을 나타내지만, 마크롤락틴 A와 달리 세포독성이 없어 마크롤락틴 계열의 구조-활성 관계를 시사한다. 마크라락틴 W는 7-O 글리코실화 및 에스테르화 모두를 가진 유일한 마크라락틴 예시이다. 세포독성 활성은 없으나 항균성은 마크라락틴 A 및 B와 유사하다 [122,123]. 모대사산물인 마크라락틴 A에서는 세포독성, 항바이러스성 및 항염증 활성이 관찰되나, 그 유도체에 대해서는 아직 확인되지 않았다. 이러한 화합물들은 생체 내에서 가수분해되어 활성 대사산물인 마크롤락틴 A를 방출할 것으로 예상됩니다.

4.2. 에네디인

현재까지 PK 에네디인은 가장 세포독성이 강한 천연물이며, 항암제로서의 적용이 임상적으로 입증되었습니다 [124]. 에네디인의 상당한 세포독성으로 인해 그 적용은 제한적입니다. 그러나 다양한 항체-약물 접합체 및 고분자 기반 약물 전달 시스템에서의 적용은 큰 성공을 거두었다[125,126]. 에네디인은 일반적으로 Streptomyces 속 균주에 의해 생산된다. 그러나 최근 게놈 마이닝 접근법을 통해 Bacillus 속 균주에서도 보고되었다[127]. 완전한 생합성 기전과 구조는 아직 규명되지 않았다.

5. Hybrid Metabolites

Hybrid metabolites are the products of biosynthetic pathways that comprise both (NRPS/PKS) types of modular enzymes. Questions relating to the synthesis of hybrid products are of great present-day interest, as their answer concerns genetic engineering efforts. Both depend on thio-template for acyl chain elongation and monomers triggering. Presently, the factors of molecular events that offer a hybrid pathway to accommodate various assembly line chemical moieties functionally are yet not completely elucidated. However, based on the current knowledge, the hybrid metabolites produced by B. subtilis can be classified as bacillaene and isocoumarins (Supplementary Material Table S4).

a.

Bacillaene

Bacillaene has a linear structure (Supplementary Material Figure S3D) and was first reported from B. subtilis strains 55,422 and 3610 [128]. It is encoded by a hybrid PKS-NRPS biosynthetic gene cluster known as bacillaene PksX synthase (Figure 6). The pksX mega gene cluster in B. subtilis 168 genome consisted of 5 open reading frames named pksJ, pksL, pksM, pksN, and pksR [104,129]. The first two adenylation domains of pksJ incorporate glycin and α-hydroxy-isocaproic acid. The third adenylation domain (pksN) is responsible for the incorporation of alanine. While the three open reading frames pksC, baeD, and baeE encode for three separate AT domains are responsible for incorporating malonyl-CoA [130]. Bacillaene inhibits the growth of various bacteria and fungi such as Myxococcus xanthus, and Trichoderma spp. [131,132]. Bacillaene selectively inhibits the biosynthesis of protein in bacteria, indicating a selective inhibition of other strains in their habitat [128].

Figure 6. The biosynthetic gene cluster (pksX) and biosynthesis of hybrid bacillaene. Key: KS (ketosynthase), AT (acyltransferase), T (thiolation), DH (dehydratase), KR (ketoreductase), MT (methyltransferase), A (adenylation), C (condensation), ATd (AT-docking), Hyd (Zn-dependent hydrolase), Ox (flavin mononucleotide-dependent oxidase), HCF (HMG-CoA synthase), ECH (enoyl-CoA hydratase), and TE: (thioesterase).

b.

Isocoumarins

Isocoumarins form a large, diverse class of biologically active metabolites with more than 200 metabolites [133]. However, fewer are reported from B. subtilis. It has been reported that B. subtilis specifically produce isopropyl-8-hydroxy-3,4-dihydroisocoumarins with an active side chain or functionalized amino acid [134]. Amicoumacin A-C (Supplementary Material Figure S3E,F) and amicoumacin F are dihydroisocoumarins initially reported from B. pumilus [135,136,137]. Later, they were reported from B. subtilis and determined its strong antibacterial activity against the gastric pathogen Helicobacter pylori [138]. Biosynthesis of these bioactive metabolites has been recently reported from B. subtilis 1779 via a genome mining approach [139]. The BGC encoding amicoumacin was predicted to be 47.4 kb in size and consists of 12 open reading frames. Further, the investigator expressed the biosynthetic gene cluster in a heterologous host and obtained amicoumacin A–C. Based on these findings, they predicted the biosynthetic pathway for amicoumacin to be synthesized via hybrid PKS-NRPS modular enzymes [139]. The biosynthetic gene cluster consists of eight modules that synthesize two discrete pre-amicoumcin molecules. The unique dihydroisocoumarins core is likely to be synthesized via removing the AmiJ-M megasynthase complex to produce an oxygenated PK chain that reorganizes into a cyclic dihydroisocoumarin [139]. Amicoumacin exhibit promising anti-inflammatory and antibacterial activity and has gained increased interest as a pro-drug candidate. Specifically, amicoumacin A is more attractive due to its potent anticancer activity and antibacterial activity against MRSA, with MIC less than 1 µg/mL [136,137]. The antibacterial mechanism of amicoumacin was recently shown to be bind on the ribosome and inhibit protein biosynthesis [140,141]. Amicoumacin A and C exhibit antibacterial activity, while amicoumacin B is non-antibacterial. Interestingly, the hydroxy group in amicoumacin A and C is responsible for their antibacterial activity as the phosphate ester-containing amicoumacin B lacks antibacterial activity [142].

Bacilosarcin A (3-oxa-6,9-diazabicyclo [3.3.1]nonane ring) and B (rare 2-hydroxymorpholine moiety) with unique heterocyclic core structures were isolated from the marine-derived B. subtilis strain TP-B0611 [143]. Later on, their complete chemical structures and structure-activity relationships were demonstrated [144]. Unlike amicoumacin A and B, bacilosarcin A and B displayed marginal anti-herbicidal activity. The low anti-herbicidal activity reflects the side chain functional group and highlights the importance of the side chain for bioactivity. This hypothesis is further supported by the non-antibacterial activity of bacilosarcin C, which has –COOH (carboxylic) instead of –NH2 (amide) group [145].

The piperazin-containing damxungmacin A (dihydroisocoumarin) has an unusual heterocyclic ring that displays weak antibacterial activity and cytotoxicity [146]. Unlike other dihydroisocoumarin, damxungmacin exhibits weak bioactivity, low yield, and a complex molecular structure that offers distinctive bioprocessing techniques development. Similarly, damxungmacin B was isolated and showed no bioactivity against tested strains.

Hetiamacin A has shown promising antibacterial activity against oxacillin resistant S. aureus, Streptococcus pneumonia, and S. epidermidis with MIC less than 2 µm/mL [147,148]. The small differences in their structure and vast differences in their biological activity make them an attractive area of research to investigate the structure-activity relationship. Similar to amicoumacins, hetiamacin B has shown potent antibacterial activity; however, the structure configuration and biosynthesis of hetiamacin is still unknown. Hetiamacin C and D were also isolated from the same bacillus strain, but due to the low yield, their biological activity was not determined [149].

The instantaneous application of amicoumacin in agriculture and human medicine may not be appropriate. However, their strong anti-MRSA activity appears an attractive starting point for drug development. To date, their mode of action is yet not fully elucidated, therefore, compelling further investigation. Whereas some isocoumarins discussed above have already been synthesized, and the paths could be further extended towards sustainable and economical production, amicoumacin derivatives demand further studies to demonstrate the structure-activity relationship of the metabolites.

5. 하이브리드 대사산물

하이브리드 대사산물은 (NRPS/PKS) 유형의 모듈형 효소를 모두 포함하는 생합성 경로의 산물이다. 하이브리드 제품 합성과 관련된 질문은 유전자 공학 노력과 연관되어 있어 현재 큰 관심을 받고 있다. 둘 다 아실 사슬 연장 및 단량체 트리거링을 위해 티오-템플릿에 의존한다. 현재 다양한 조립 라인 화학 모이어티를 기능적으로 수용하는 하이브리드 경로를 제공하는 분자적 사건의 요인들은 아직 완전히 규명되지 않았다. 그러나 현재 지식에 따르면, B. subtilis가 생성하는 하이브리드 대사산물은 바실라엔(bacillaene)과 이소쿠마린(isocoumarins)으로 분류될 수 있다(보충 자료 표 S4).

a.

바실라엔

바실라엔은 선형 구조를 가지며(보충 자료 그림 S3D), 최초로 B. subtilis 균주 55,422 및 3610에서 보고되었다[128]. 이는 바실라엔 PksX 합성효소로 알려진 하이브리드 PKS-NRPS 생합성 유전자 클러스터에 의해 암호화된다 (그림 6)로 알려진 하이브리드 PKS-NRPS 생합성 유전자 클러스터에 의해 암호화된다. B. subtilis 168 게놈의 pksX 메가 유전자 클러스터는 pksJ, pksL, pksM, pksN, pksR이라는 5개의 개방 독서 프레임(ORF)으로 구성된다[104,129]. pksJ의 첫 두 아데닐화 도메인은 글리신과 α-하이드록시-이소카프로산을 도입한다. 세 번째 아데닐화 도메인(pksN)은 알라닌을 도입하는 역할을 한다. 한편, pksC, baeD, baeE라는 세 개의 개방 독서틀은 각각 별개의 AT 도메인을 암호화하며 말로닐-CoA를 도입하는 역할을 한다[130]. 바실라엔은 Myxococcus xanthus 및 Trichoderma spp.와 같은 다양한 세균 및 진균의 성장을 억제한다[131,132]. 바실라엔은 세균 내 단백질 생합성을 선택적으로 억제하여 서식지 내 다른 균주에 대한 선택적 억제 효과를 나타낸다[128].

그림 6. 하이브리드 바실라엔의 생합성 유전자 클러스터(pksX) 및 생합성 과정. 키: KS (케토신타제), AT (아실트랜스퍼라제), T (티올화), DH (탈수화효소), KR (케토환원효소), MT (메틸트랜스퍼라제), A (아데닐화), C (축합), ATd (AT 도킹), Hyd (Zn 의존성 가수분해효소), Ox (플라빈 모노뉴클레오티드 의존성 산화효소), HCF (HMG-CoA 합성효소), ECH (에노일-CoA 가수분해효소), TE: (티오에스테라제).

• b.

이소쿠마린

이소쿠마린은 200개 이상의 대사 산물을 가진 생물학적 활성 대사 산물의 크고 다양한 계통을 형성합니다 [133]. 그러나 B. subtilis에서 보고된 것은 더 적습니다. B. subtilis는 활성 측쇄 또는 기능화된 아미노산을 가진 이소프로필-8-하이드록시-3,4-디하이드로이소쿠마린을 특이적으로 생성하는 것으로 보고되었습니다 [134]. 아미쿠마신 A-C(보충 자료 그림 S3E, F) 및 아미쿠마신 F는 B. pumilus에서 최초로 보고된 디하이드로이소쿠마린이다[135,136,137]. 이후, 이들은 B. subtilis에서 보고되었으며 위장 병원체 Helicobacter pylori에 대한 강력한 항균 활성이 확인되었다 [138]. 이러한 생리활성 대사산물의 생합성은 최근 게놈 마이닝 접근법을 통해 B. subtilis 1779에서 보고되었다 [139]. 아미쿠마신을 암호화하는 BGC는 47.4kb 크기로 예측되었으며 12개의 개방 독서 프레임(ORF)으로 구성된다. 연구진은 이 생합성 유전자 클러스터를 이종 숙주에 발현시켜 아미쿠마신 A–C를 얻었다. 이러한 결과를 바탕으로 아미쿠마신 생합성 경로는 하이브리드 PKS-NRPS 모듈러 효소를 통해 이루어진다고 예측하였다 [139]. 이 생합성 유전자 클러스터는 두 개의 별개의 프리-아미쿠마신 분자를 합성하는 여덟 개의 모듈로 구성된다. 독특한 디하이드로이소쿠마린 코어는 아마도 AmiJ-M 메가신타제 복합체를 제거하여 산소화된 PK 사슬을 생성하고, 이 사슬이 재구성되어 고리형 디하이드로이소쿠마린을 생성하는 방식으로 합성될 가능성이 높다 [139]. 아미쿠마신은 유망한 항염증 및 항균 활성을 나타내며, 전구체 후보 물질로서 관심이 높아지고 있다. 특히 아미쿠마신 A는 강력한 항암 활성과 MRSA에 대한 항균 활성(MIC < 1 µg/mL)으로 인해 더욱 주목받고 있다[136,137]. 아미쿠마신의 항균 기전은 최근 리보솜에 결합하여 단백질 생합성을 억제하는 것으로 밝혀졌다[140,141]. 아미쿠마신 A와 C는 항균 활성을 나타내는 반면, 아미쿠마신 B는 항균 활성이 없다. 흥미롭게도, 아미쿠마신 A와 C의 하이드록시 그룹이 항균 활성의 원인이 되는 것으로 밝혀졌는데, 인산 에스터를 포함하는 아미쿠마신 B는 항균 활성이 없기 때문이다 [142].

독특한 헤테로환 구조를 가진 바실로사신 A(3-옥사-6,9-디아자비사이클로[3.3.1]노난 고리)와 B(희귀한 2-하이드록시모르폴린 모이어티)는 해양 유래 B. subtilis 균주 TP-B0611에서 분리되었습니다 [143]. 나중에, 그들의 완전한 화학 구조와 구조-활성 관계가 입증되었다 [144]. 아미쿠마신 A와 B와 달리, 바실로사신 A와 B는 미미한 제초 활성을 나타냈다. 낮은 제초 활성은 측쇄의 작용기를 반영하며, 생물 활성에 대한 측쇄의 중요성을 강조한다. 이 가설은 –NH2 (아미드) 그룹 대신 –COOH (카르복실) 그룹을 가진 바실로사르신 C의 비항균 활성에 의해 더욱 뒷받침된다 [145].

피페라진 함유 담슌마신 A(디하이드로이소쿠마린)는 특이한 헤테로환 구조를 가지며, 약한 항균 활성과 세포 독성을 나타낸다[146]. 다른 디하이드로이소쿠마린과 달리 담슝마신은 약한 생물학적 활성, 낮은 수율, 복잡한 분자 구조를 보이며 이는 독특한 생물공정 기술 개발을 가능케 한다. 마찬가지로 담슝마신 B도 분리되었으나 시험 균주에 대해 생물학적 활성을 나타내지 않았다.

헤티아마이신 A는 옥사실린 내성 S. aureus, Streptococcus pneumoniae 및 S. epidermidis에 대해 MIC 2 µm/mL 미만의 유망한 항균 활성을 나타냈다[147,148]. 이들 화합물의 구조적 차이는 미미한 반면 생물학적 활성의 차이는 매우 커서 구조-활성 관계를 연구하기에 매력적인 분야이다. 아미쿠마신과 유사하게 헤티아마신 B도 강력한 항균 활성을 보였으나, 헤티아마신의 구조 배열과 생합성 경로는 아직 알려지지 않았다. 동일한 바실러스 균주에서 헤티아마신 C와 D도 분리되었으나, 낮은 수율로 인해 생물학적 활성은 확인되지 않았다[149].

아미쿠마신의 농업 및 인간 의학 분야 즉각적 적용은 적절하지 않을 수 있다. 그러나 강력한 항-MRSA 활성은 신약 개발의 유망한 출발점으로 보인다. 현재까지 작용 기전은 완전히 규명되지 않아 추가 연구가 필요하다. 앞서 논의된 일부 이소쿠마린은 이미 합성되었으며, 지속 가능하고 경제적인 생산을 위한 경로 확장이 가능하지만, 아미쿠마신 유도체는 대사 산물의 구조-활성 관계를 입증하기 위한 추가 연구가 필요하다.

6. Volatile Metabolites

Volatile metabolites enhance the efficacy of several secondary metabolites produced by bacteria in a specific habitat. The increased vapor pressure facilitates the low molecular biologically active metabolites to move over a longer distance and act on the target organism in soil [150,151]. B. subtilis emit highly diverse volatile secondary metabolites, including terpenes, nitrogen, and sulfur-containing compounds, benzenoids, and hydrocarbons [152]. These metabolites are primarily considered cell signaling molecules mediating inter and intracellular interaction [153]; however, they also displayed antifungal and antibacterial activity [154,155]. For instance, a volatile dimethyl disulfide, promote the growth and survival of plants along with antimicrobial activity [156]. B. subtilis releases many volatile metabolites with an average of 14 metabolites per strain [12]. These volatile metabolites are involved in the biogeochemical cycles and bioconversion of the food chain and numerous metabolic activities such as nitrification and nitrogen mineralization. B. subtilis producing volatile metabolites may be inorganic or organic volatiles (Supplementary Material Table S5).

6. 휘발성 대사 산물

휘발성 대사산물은

특정 서식지에서 박테리아가 생성하는 여러 2차 대사산물의 효능을 증진시킵니다.

증기압 증가로 인해 저분자 생물학적 활성 대사산물이

더 먼 거리를 이동하여 토양 내 표적 생물에 작용할 수 있습니다 [150,151].

B. subtilis는

테르펜, 질소 및 황 함유 화합물, 벤젠계 화합물, 탄화수소 등

매우 다양한 휘발성 2차 대사산물을 방출합니다 [152].

이러한 대사산물은

주로 세포 간 및 세포 내 상호작용을 매개하는 세포 신호 전달 분자로 간주되지만[153],

항진균 및 항균 활성도 나타낸다[154,155].

예를 들어 휘발성 디메틸 디설파이드(dimethyl disulfide)는

항균 활성과 함께 식물의 생장 및 생존을 촉진한다[156].

B. subtilis는

균주당 평균 14종의 휘발성 대사산물을 방출한다[12].

https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2020.00559/full

이러한 휘발성 대사산물은

생물지화학적 순환과 먹이사슬의 생물학적 전환,

질산화 및 질소 광물화와 같은 다양한 대사 활동에 관여한다.

B. subtilis가 생성하는 휘발성 대사산물은

무기 또는 유기 휘발성 물질일 수 있다(보충 자료 표 S5).

6.1. Volatile Inorganic Metabolites

The volatile inorganic metabolites are a by-product of the primary metabolites. They are usually nitrogen and sulfur-containing compounds such as ammonia (NH3), hydrogen sulfide (H2S), and hydrogen cyanide (HCN) (Supplementary Material Figure S4). Nitrogen-containing compounds are mainly emitted in the top sediment layer by denitrifying B. subtilis strains. The B. subtilis group also produces nitric oxide, which induces a systemic acquired resistance in plants against Ralstonia solanacearum [157]. In an oxygen-deficient environment, bacteria emit various volatile inorganic metabolites such as hydrogen sulfide and hydrogen. These compounds act as a precursor for amino acid, antimicrobial metabolites synthesis, or act as electron acceptors. B. subtilis produce hydrogen sulfide from sulfate hydrolysis or a by-product of L-cysteine and L-methionine catabolism [158,159]. It is reported that hydrogen sulfide inhibits the growth of phytopathogens, such as Penicillium italicum and Aspergillus niger [160]. Indeed it is also demonstrated that it provides self-protection to producer organisms against antibiotics [161]. Hydrogen cyanide produced from amino acid (glycine) catabolism potentially inhibits the growth of plant pathogens such as Agrobacterium tumefaciens crown and Meloidogyne incognita juveniles [162].

6.1. 휘발성 무기 대사산물

휘발성 무기 대사산물은

1차 대사산물의 부산물이다.

이들은 일반적으로

암모니아(NH3), 황화수소(H2S), 시안화수소(HCN)와 같은 질소 및 황 함유 화합물이다(보충 자료 그림 S4).

질소 함유 화합물은

주로 탈질화 B. subtilis 균주에 의해 최상층 침전층에서 배출됩니다. 

B. subtilis 군은 또한 식물에서 

Ralstonia solanacearum에 대한 체계적 획득 저항성을 유도하는 산화질소를 생성합니다 [157].

산소 결핍 환경에서 박테리아는

황화수소 및 수소와 같은 다양한 휘발성 무기 대사 산물을 배출합니다.

이러한 화합물은

아미노산, 항균성 대사 산물 합성의 전구체 역할을 하거나 전자 수용체로 작용합니다. 

B. subtilis는

황산염 가수분해 또는 L-시스테인 및 L-메티오닌 대사의 부산물로 황화수소를 생성합니다 [158,159].

황화수소는 

Penicillium italicum 및 Aspergillus niger와 같은

식물 병원균의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다[160].

실제로 이는 생산 생물체가 항생제에 대한 자가 보호 기능을 제공하는 것으로도 입증되었다[161]. 아미노산(글리신) 대사 과정에서 생성되는 시안화수소는 Agrobacterium tumefaciens 크라운 병균 및 Meloidogyne incognita 유충과 같은 식물 병원체의 성장을 잠재적으로 억제할 수 있다[162].

6.2. Volatile Organic Metabolites

Volatile organic metabolites are low molecular weight molecules having a lipophilic moiety, a low boiling point, and high vapor pressure. These characteristics offer fast evaporation and distant distribution in a complex matter like soil [163]. Their production by soil bacteria and distribution in the soil is strongly influenced by the availability of nutrients and oxygen, pH, temperature, soil humidity, architecture, and texture [151,164]. Volatile organic metabolites are mainly a product of the glycolysis and citric acid cycle [163,165]. However, they can also be synthesized via different pathways, such as fermentation, amino acid degradation, terpenes biosynthesis, sulfur reduction, and heterotrophic carbon degradation [166]. So far, 1860 microbial volatile organic metabolites emitted by 944 various microbial species are listed in the mVOC (microbial volatile organic compounds) database [167]. It is reported that about 70% of the Bacillus volatile organic compounds (bVOCs) in the mVOC database are either fatty acid or nitrogen-containing metabolites. A few representatives of the volatile organic metabolites are shown in Supplementary Material Figure S4. The volatile organic metabolites emitted by the B. subtilis group can be classified into seven subclasses.

6.2. 휘발성 유기 대사산물

휘발성 유기 대사산물은

친유성 모이어티를 지닌 저분자량 분자로,

낮은 비점과 높은 증기압을 가진다.

이러한 특성으로 인해 토양과 같은 복잡한 매질에서 빠른 증발과 먼 거리까지의 분포가 가능합니다 [163]. 토양 박테리아에 의한 이들의 생산과 토양 내 분포는 영양분과 산소의 가용성, pH, 온도, 토양 습도, 구조 및 질감의 영향을 크게 받습니다 [151,164].

휘발성 유기 대사 산물은

주로 당분해와 시트르산 회로의 산물입니다 [163,165].

그러나

발효, 아미노산 분해, 테르펜 생합성, 황 환원, 이종 영양 탄소 분해 등

다른 경로를 통해서도 합성될 수 있다[166].

현재까지 944종의 다양한 미생물 종이 배출하는

1860종의 미생물 휘발성 유기 대사산물(mVOC)이

mVOC(미생물 휘발성 유기 화합물) 데이터베이스에

등재되어 있다[167].

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5753297/

미생물의 대사 능력에는 2차 대사산물(예: 항생제) 생산이 포함됩니다. 미생물 휘발성 유기 화합물(mVOCs) 분석은 의학, 농업 및 생명공학 분야의 응용 및 기초 과학에 막대한 영향을 미치는 신흥 연구 분야입니다. mVOC 데이터베이스(v1)는 미생물군집 연구와 함께 성장해 왔으며, 종 정보와 배출 휘발성 물질 데이터를 통합하였습니다. 본 연구에서는 약 1000종의 생물체에서 유래한 약 2000개의 화합물과 데이터베이스 활용을 위한 새로운 기능을 갖춘 mVOC 2.0 데이터베이스를 소개합니다. 확장된 화합물 컬렉션에는 식물, 균류, 박테리아 및 (무)척추동물에 대한 mVOC 매개 효과를 포함한 데이터가 추가되었습니다. mVOC 데이터베이스 2.0은 이제 화합물 식별을 위한 신속한 질량 스펙트럼 비교 및 종 특이적 VOC 시그니처 생성을 가능하게 하는 질량 스펙트럼 파인더 기능을 제공합니다. 자동 업데이트, 유용한 링크 및 mVOC 문헌 검색 기능도 포함됩니다. mVOC 데이터베이스는 미생물 휘발성 물질에 관한 이용 가능한 정보를 집약하고 정제하여, 해당 연구 분야 과학자들에게 포괄적이고 유익한 플랫폼을 제공하는 것을 궁극적 목표로 합니다. 이러한 요구를 충족하기 위해, 우리는 공개적으로 이용 가능한 mVOC 데이터베이스를 다음 주소에서 운영하고 있습니다: http://bioinformatics.charite.de/mvoc.

https://bioinformatics.charite.de/mvoc/

mVOC 데이터베이스에 수록된 Bacillus 휘발성 유기 화합물(bVOCs)의 약 70%가 지방산 또는 질소 함유 대사산물인 것으로 보고되었다. 휘발성 유기 대사산물의 몇 가지 대표 예시는 보충 자료 그림 S4에 제시되어 있다. B. subtilis 군이 배출하는 휘발성 유기 대사산물은 일곱 가지 하위 분류로 구분될 수 있다.

6.2.1. Terpenes and Terpenoids

Terpenoids, also known as isoprenoids, are widely produced by all living organisms [168]. The end product of the deoxy xylulose phosphate pathway, isopentenyl pyrophosphate (IPP), and their isomer dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) usually act as precursors for terpenoid biosynthesis [158]. However, terpenoids may also be synthesized from isoprene [169]. As previously shown, the isoprene produced by B. subtilis is not synthesized via the deoxy-xylulose phosphate pathway. Isoprenoid plays a vital role in physiological functions such as membrane fluidity, electron transport, light-harvesting, and cell signaling [170]. The involvement of terpenoids in cell signaling is particularly important, as it is associated with some mutualistic, antagonistic, and multitrophic interactions [171]. Isoprenoids may potentially be used as a flavor, nutraceuticals, fragrance, and therapeutic agent in malaria and cancer treatment [172]. However, due to ecological constraints, their natural yields are often insufficient. The vast structural diversity of terpenoids led to the discovery of up to 40,000 compounds by a few groups engaged in pharmaceutical industries [173]. Terpenes are mostly known for their antibacterial, antifungal, antinematode, and insecticidal activities [174,175]. Terpenoids (sesquiterpenes) were previously isolated from B. subtilis KSM 6–10 culture supernatant. Additionally, the authors revealed its enzymatic biosynthesis from a cyclic 30 carbon precursor by squalene cyclases (sqhC) [176]. Besides that, monoterpenes and isoprene isolated from B. subtilis strains were shown to inhibit the growth of nematode and cyanobacteria [175,177]. The mode of action of terpenoids is yet not fully elucidated; however, it could be linked to their lipophilic nature, which enables them to disrupt the integrity of the cell membrane [178]. They may be further classified into three subclasses. (i) Monoterpenes (ii) Isoprene and (iii) Sesquiterpenes [163].

6.2.1. 테르펜 및 테르페노이드

테르페노이드(이소프렌오이드라고도 함)는

모든 생물체에서 광범위하게 생성된다[168].

데옥시-자일룰로스 인산 경로의 최종 생성물인

이소펜틸 피로인산(IPP)과 그 이성질체인 디메틸알릴 피로인산(DMAPP)은

일반적으로 테르페노이드 생합성의 전구체 역할을 한다[158].

그러나

테르페노이드는

이소프렌으로부터도 합성될 수 있다[169].

앞서 밝힌 바와 같이,

B. subtilis가 생성하는 이소프렌은 데옥시-자일룰로스 인산 경로를 통해 합성되지 않는다.

이소프렌류는

막 유동성, 전자 전달, 광수확, 세포 신호전달과 같은

생리적 기능에서 중요한 역할을 한다[170].

테르페노이드가

세포 신호 전달에 관여하는 것은 특히 중요하며,

이는 공생적, 적대적, 다영양적 상호작용과 연관되어 있다[171].

이소프렌오이드는

향료, 기능성 식품, 향료, 말라리아 및 암 치료제 등으로 잠재적으로 활용될 수 있다[172].

그러나

생태학적 제약으로 인해 자연적 수율은 종종 불충분하다.

테르페노이드의 방대한 구조적 다양성으로 인해

제약 산업에 종사하는 소수 그룹에 의해

최대 40,000개의 화합물이 발견되었다[173].

테르펜은

주로 항균, 항진균, 항선충 및 살충 활성으로 알려져 있다[174,175].

테르페노이드(세스퀴테르펜)는

이전에 B. subtilis KSM 6–10 배양 상층액에서 분리된 바 있다.

또한 저자들은 스쿠알렌 사이클라제(sqhC)에 의한

순환형 30탄소 전구체로부터의 효소적 생합성을 밝혀냈다[176].

그 외에도,

B. subtilis 균주에서 분리된 모노테르펜과 이소프렌은

선충 및 시아노박테리아의 성장을 억제하는 것으로 나타났습니다 [175,177].

테르페노이드의 작용 기전은

아직 완전히 규명되지 않았지만,

세포막의 완전성을 파괴할 수 있는 친유성 특성과 관련이 있을 수 있습니다 [178].

테르페노이드는 세 가지 하위 분류로 추가 구분된다.

(i) 모노테르펜 (ii) 이소프렌 (iii) 세스퀴테르펜 [163].

6.2.2. Nitrogen-Containing Metabolites

Nitrogen-containing metabolites can be distinguished based on their degree of cyclization. To date, three groups of non-cyclic (amine, amide, and imines) and five groups of cyclic compounds (pyrazines, azole, pyridines, pyrimidines, and pyridazines) have been detected. Pyrazines are broadly represented among mVOCs and are categorized into two subclasses: higher alkylated and lower alkylated pyrazines [158]. These metabolites are characterized by a strong odor, and most of the B. subtilis strains isolated from rhizosphere and fermented products have been considered as pyrazine producers [179,180]. The compound 2,5-Dimethyl pyrazine was isolated from B. subtilis strain, exhibiting strong antifungal activity and inhibiting P. chlamydospora [181]. Pyrazine produced by B. subtilis strains also inhibits the growth of bacteria such as E. coli, S. aureus, and P. valgaris [182]. The B. subtilis strains are also able to produce other biologically active terpenoids such as 1H-imidazole, 1-ethyl inhibits the growth of phytopathogens [163,183].

The complete biosynthetic pathways for nitrogen-containing volatile organic metabolites remain unknown. However, it is proposed that two major paths may be followed, i.e., the terpenoids such as pyrazines are synthesized from non-enzymatic amination [158] or synthesized from the intermediate produced during amino acid catabolism [184].

6.2.2. 질소 함유 대사산물

질소 함유 대사산물은

고리화 정도에 따라 구분된다.

지금까지

비환식 화합물(아민, 아미드, 이미인) 3개 그룹과

환식 화합물(피라진, 아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진) 5개 그룹이 검출되었다.

피라진은

미생물 유래 휘발성 유기화합물(mVOCs)에서 광범위하게 발견되며

고도 알킬화 피라진과 저도 알킬화 피라진 두 하위 분류로 구분된다[158].

이러한 대사산물은 강한 냄새가 특징이며, 뿌리권 및 발효 제품에서 분리된 대부분의 B. subtilis 균주는 피라진 생성균으로 간주되어 왔다[179,180]. B. subtilis 균주에서 분리된 2,5-디메틸피라진 화합물은 강력한 항진균 활성을 나타내며 P. chlamydospora를 억제한다[181].

B. subtilis 균주가 생성하는 피라진은

대장균(E. coli), 황색포도상구균(S. aureus), 포도상구균(P. valgaris) 등의

세균 성장도 억제한다[182].

B. subtilis 균주는 또한

1H-이미다졸, 1-에틸 등 다른 생물학적 활성 테르페노이드를 생성할 수 있으며,

이는 식물 병원균의 성장을 억제한다[163,183].

질소 함유 휘발성 유기 대사 산물의 완전한 생합성 경로는

아직 알려지지 않았다.

그러나 두 가지 주요 경로가 제안되고 있다.

즉, 피라진과 같은 테르페노이드는

비효소적 아미노화 반응[158]을 통해 합성되거나

아미노산 분해 과정에서 생성된 중간체를 통해 합성될 수 있다[184].

6.2.3. Sulfur-Containing Metabolites

Sulfur-containing volatile organic metabolites are synthesized from two primary sources, i.e. organic or inorganic [158]. These metabolites often originate from the catabolism of amino acids, such as methionine, and sometimes from cysteine. However, the inorganic sulfate and sulfite may also act as a precursor for sulfur metabolites. The B. subtilis group produces numerous antifungal and antinematicidal sulfur metabolites such as S-methyl butanethioate, S-methyl thioacetate, 2-methyl disulfide, and 3-methyl trisulfide. Among these, dimethyl disulfide also exhibits antibacterial activity [185,186,187,188]. It is known that dimethyl sulfide disrupts bacterial cell communication by decreasing the sum of acyl-homoserine lactone [189].

6.2.3. 황 함유 대사산물

황 함유 휘발성 유기 대사산물은

주로 유기적 또는 무기적 두 가지 원천에서 합성된다[158].

이러한 대사산물은 종

종 메티오닌과 같은 아미노산의 분해 대사에서 비롯되며,

때로는 시스테인에서도 유래한다.

그러나 무기 황산염 및 아황산염 역시 황 대사산물의 전구체 역할을 할 수 있다. B. subtilis 그룹은 S-메틸 부탄티오에이트, S-메틸 티오아세테이트, 2-메틸 디설파이드, 3-메틸 트리설파이드 등 다양한 항진균 및 항선충성 황 함유 대사 산물을 생성한다. 이 중 디메틸 디설파이드(dimethyl disulfide)는 항균 활성도 나타낸다[185,186,187,188]. 디메틸 설파이드(dimethyl sulfide)는 아실-호모세린 락톤(acyl-homoserine lactone)의 총량을 감소시켜 세균 세포 간 통신을 방해하는 것으로 알려져 있다[189].

6.2.4. Benzenoids

Benzenoids are a diverse subclass often linked with sulfur or/and nitrogen. Most of the benzenoids produced by the B. subtilis group displayed antifungal activity, while some inhibited the growth of bacteria and nematodes. Their antimicrobial mode of action is partially characterized. Nevertheless, the fungal and bacterial cell disruption is documented after exposure to bVOCs.

The B. subtilis strain CF-3 was eval‎uated for their volatile organic metabolites potential. The investigator identified a plethora of volatile compounds based on solid headspace microextraction. Among them, benzothiazole exhibiting strong antimicrobial activity against fruit fungal pathogens [190]. The volatile organic compounds produced by B. amyloliqueficiens were eval‎uated for their effect on the growth and pathogenicity of tomato bacterial pathogen R. solanacearum. The results showed that the strain emits several volatile organic compounds, including 1, 3 dimethoxy benzenes, inhibiting 62–85% growth of the tomato pathogen [191].

Similarly, benzoxazole, benzothiazole, and benzyl acetone were isolated from B. subtilis ZD01, strongly inhibited the growth of plant pathogen Alterneria solani. Moreover, the qRT-PCR results indicate that these volatile organic metabolites down-regulate the expression‎ of fungal virulence genes i.e., slt2 and sod [192]. Thus, the strain ZD01 provides a potential application as a biocontrol agent against early blight disease.

6.2.4. 벤조이드

벤조이드는 황 및/또는 질소와 결합된 다양한 하위 분류군이다. B. subtilis 그룹이 생성하는 대부분의 벤조이드는 항진균 활성을 보였으며, 일부는 박테리아 및 선충의 성장을 억제했다. 이들의 항균 작용 기전은 부분적으로 규명되었다. 그럼에도 불구하고 bVOCs 노출 후 진균 및 박테리아 세포 파괴가 보고되었다.

B. subtilis 균주 CF-3의 휘발성 유기 대사산물 잠재력을 평가하였다. 연구자는 고체 헤드스페이스 미세추출법을 기반으로 다수의 휘발성 화합물을 확인하였다. 그중 벤조티아졸은 과일 곰팡이 병원체에 대해 강력한 항균 활성을 나타냈다[190]. B. amyloliqueficiens가 생성한 휘발성 유기 화합물은 토마토 세균성 병원체 R. solanacearum의 성장 및 병원성에 미치는 영향을 평가하였다. 결과에 따르면, 이 균주는 1,3-디메톡시벤젠을 포함한 여러 휘발성 유기 화합물을 방출하여 토마토 병원체의 성장을 62~85% 억제했습니다[191].

마찬가지로, B. subtilis ZD01에서 분리된 벤조옥사졸, 벤조티아졸 및 벤질아세톤은 식물 병원체 Alterneria solani의 성장을 강력히 억제했습니다. 또한 qRT-PCR 결과는 이러한 휘발성 유기 대사산물이 곰팡이 병원성 유전자(slt2 및 sod)의 발현을 하향 조절함을 시사한다[192]. 따라서 균주 ZD01은 조기마름병에 대한 생물학적 방제제로서의 잠재적 적용 가능성을 제공한다.

6.2.5. Ketones

The biosynthesis of ketones is usually the result of fatty acid decarboxylation. Acetoin and its oxidative form butanedion are synthesized during the anaerobic fermentation of pyruvate. The two pyruvate molecules are condensed and converted to acetolactate by the acetolactate synthase enzyme. The acetolactate is further decarboxylated to form acetoin. Ketones are mainly known to inhibit the growth of plant pathogenic fungi. However, its antibacterial activity is yet not reported. Two ketones metabolites, i.e., 2-decanone, and 2-nonanone, displayed 100% growth inhibition of F. oxysporum [193]. In contrast, pentadecanone and 2-tetradecanone displayed bulky peaks on GCs but did not exhibit significant antifungal activity [193].

Recently, five ketones metabolites were collected from B. velezensis culture, and their antifungal activity was eval‎uated. The ketone metabolite 6-methyl 5-hepten 2-nonadecanone was revealed to inhibit 85.59% of the growth of A. solani, while 2-tetradecanone and 2-nonadecanone only showed mild antifungal activity [194]. The investigators further demonstrated that the antifungal activity of volatile metabolites might not be correlated with the number of carbon atoms in the metabolite [193,194]. In addition to its antimicrobial activity, ketone VOCs may also perform some other important functions. For example, acetone and butanone have been associated with plant growth and stress tolerance and induce systemic resistance [195].

6.2.5. 케톤

케톤의 생합성은 일반적으로 지방산의 탈카르복실화 결과로 발생한다. 아세토인과 그 산화 형태인 부탄디온은 피루브산의 혐기성 발효 과정에서 합성된다. 두 피루브산 분자는 아세톨락테이트 합성효소에 의해 축합되어 아세톨락테이트로 전환된다. 아세톨락테이트는 추가 탈카복실화를 거쳐 아세토인을 형성한다. 케톤은 주로 식물 병원성 곰팡이의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 그 항균 활성은 아직 보고되지 않았다. 두 가지 케톤 대사산물인 2-데카논과 2-노난온은 F. oxysporum의 성장을 100% 억제하였다[193]. 반면 펜타데카논과 2-테트라데카논은 가스 크로마토그래피(GC)에서 큰 피크를 보였으나 유의미한 항진균 활성은 나타내지 않았다[193].

최근 B. velezensis 배양액에서 5종의 케톤 대사산물을 분리하여 항균 활성을 평가하였다. 케톤 대사산물인 6-메틸-5-헵텐-2-노나데카논은 A. solani의 생장을 85.59% 억제하는 것으로 밝혀진 반면, 2-테트라데카논과 2-노나데카논은 약한 항균 활성만을 나타냈다[194]. 연구진은 휘발성 대사산물의 항진균 활성이 대사산물의 탄소 원자 수와 상관관계가 없을 수 있음을 추가로 입증하였다[193,194]. 항균 활성 외에도 케톤 VOC는 다른 중요한 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 아세톤과 부탄온은 식물 생장 및 스트레스 내성과 연관되어 있으며 전신적 저항성을 유도한다[195].

6.2.6. Hydrocarbon Metabolites

Hydrocarbon metabolites include alkane, alkene, and alkyne metabolites usually derived from fatty acid degradation via elongation decarboxylation or head-to-head condensation. Hydrocarbons are the most stable volatile organic metabolites and tend to remain in their original architecture over a long period of time. They may be used as a biomarker to estimate the age of primeval‎ bacteria [196]. The B. subtilis group secretes various types of hydrocarbons such as nonane, tridecane, tetradecane, 2-methylpropane, and cyclohexane. Hydrocarbons like alkane, alkene, nonane, and decane are gaining particular interest due to their use as antimicrobial agents and fossil fuels. Nonane and 8-methyl heptadecane were isolated from B. velezensis and exhibited antifungal activity against several fungal pathogens [197]. Likewise, 1 3-butadiene inhibits the growth of phytopathogen and, additionally, negatively influences the chemotoxicity of the fungal pathogens [198].

6.2.6. 탄화수소 대사산물

탄화수소 대사산물에는 일반적으로 지방산 분해 과정에서 연장 탈카복실화 또는 머리-머리 축합을 통해 생성되는 알칸, 알켄, 알킨 대사산물이 포함됩니다. 탄화수소는 가장 안정적인 휘발성 유기 대사산물로 장기간 원형 구조를 유지하는 경향이 있습니다. 원시 박테리아의 연대를 추정하는 생체지표로 활용될 수 있다[196]. B. subtilis 군은 노난, 트라이데칸, 테트라데칸, 2-메틸프로판, 사이클로헥산 등 다양한 유형의 탄화수소를 분비한다. 알칸, 알켄, 노난, 데칸과 같은 탄화수소는 항균제 및 화석 연료로의 활용 가능성으로 인해 특히 주목받고 있다. 노난과 8-메틸헵타데칸은 B. 벨레젠시스에서 분리되었으며 여러 곰팡이 병원체에 대해 항진균 활성을 나타냈다[197]. 마찬가지로, 1,3-부타디엔은 식물 병원체의 성장을 억제하며, 추가적으로 곰팡이 병원체의 화학적 독성에 부정적인 영향을 미친다[198].

6.2.7. Organic Acids

Volatile organic acids are less abundantly produced as compared to benzenoids and ketones by B. subtilis group. However, several strains have been reported to emit beneficial organic acids. For instance, acetic acid and oleic acid emitted by the B. subtilis group are used as flavoring and preservative agents in food industries.

Acetic acid and 2-methyl propionic acid were isolated from B. amyloliquefaciens and were investigated for their antifungal activities. The authors find that these organic acids significantly inhibit the growth of F. oxysporum and M. perniciosa [199]. The endophytic B. subtilis strain DZSY21 was identified as inhibiting the growth of the maize leaf spot pathogen Curvalaria lunata, [154]. The growth inhibition towards C. lunata was observed in a time-dependent manner, i.e., the inhibition started on the 3rd day and reached 36.2% on day seven. The conjoint analysis of antagonistic activity and GC-MS identified that volatile organic metabolites, including isopentyl acetate and 2-methyl butyric acid, are responsible for antifungal activity [154].

6.2.7. 유기산

휘발성 유기산은 B. subtilis 그룹에 의해 벤조이드 및 케톤에 비해 상대적으로 적게 생산됩니다. 그러나 여러 균주가 유익한 유기산을 배출하는 것으로 보고되었습니다. 예를 들어, B. subtilis 그룹이 배출하는 아세트산과 올레산은 식품 산업에서 향료 및 방부제로 사용됩니다.

B. amyloliquefaciens에서 분리된 아세트산과 2-메틸프로피온산은 항진균 활성 연구 대상이 되었다. 연구자들은 이 유기산들이 F. oxysporum과 M. perniciosa의 생장을 현저히 억제함을 확인하였다 [199]. 내생성 B. subtilis 균주 DZSY21은 옥수수 잎반점병 병원균인 Curvalaria lunata의 생장을 억제하는 것으로 확인되었다[154]. C. lunata에 대한 성장 억제는 시간 의존적 방식으로 관찰되었으며, 즉 억제는 3일째 시작되어 7일째 36.2%에 도달했다. 항균 활성과 GC-MS의 병합 분석을 통해 이소펜틸 아세테이트 및 2-메틸 부티르산을 포함한 휘발성 유기 대사산물이 항진균 활성의 원인 물질임을 확인했다 [154].

6.2.8. Other Volatile Organic Metabolites

Besides the classes of volatile organic metabolites, the B. subtilis group also produces alkanes, alkenes, aldehydes, esters, and furans. Recently, Marco kai summarized that the B. subtilis group emits 15% ketones, 14% nitrogen-containing metabolites, hydrocarbons, aromatic metabolites, 11% benzenoid and alcohols, 7% organic acids, 6.5% each aldehyde and esters, and 3% sulfur-containing metabolites [12]. The alkenes (1H-indene, 1-methylene) and Furan, 2-pentyl were previously isolated from B. subtilis and B. pumilus strains and displayed significant antifungal activity against soil-born plant pathogenic fungi. However, the sclerotium and mycelial plugs grew normally in a fresh medium after treatment with the antifungal volatiles for one week, hindering the fungicidal activity of the volatiles [200]. This non-anti fungicidal effect may be related to its solubility in water, where the metabolites are adsorbed in an agar medium to perform their function. Aldehyde (nonanal) emitted by B. subtilis strain JA potentially inhibits the growth of the fruit and vegetable pathogen Botrytis cinerea [201]. Esters are recently reported to have antifungal and plant growth-promoting properties. Isopentyle acetate produced by B. subtilis strain DZSY21 was shown to inhibit the growth of plant pathogen Culvularia lunata [154]. The underlying molecular mechanism by which these volatiles impede the growth of fungi is still poorly understood. However, the antifungal activity of volatile metabolites could be related to the cell disruption phenomenon. It induces membrane permeability in fungal spores and decreases the transport of potassium ions into the cell [202]. In order to compensate for this imbalance, the proton efflux pump is activated to increase the flow of hydrogen ions into the cell and maintain the net charge on both sides of the membrane. This probably induces a rapid change in pH inside the cell, and disturbs cell physiology leads to death. Several studies highlighted the ability of volatile metabolites to interrupt pH gradients between extracellular and intracellular medium [203,204,205,206].

6.2.8. 기타 휘발성 유기 대사산물

휘발성 유기 대사산물 계열 외에도,

B. subtilis 군은 알칸, 알켄, 알데하이드, 에스터 및 푸란을 생성한다.

최근 Marco Kai는

B. subtilis 그룹이 케톤 15%,

질소 함유 대사산물, 탄화수소, 방향족 대사산물 14%, 벤젠계 및 알코올 11%,

유기산 7%, 알데히드 및 에스터 각각 6.5%, 황 함유 대사산물 3%를 방출한다고 요약했다[12].

알켄(1H-인덴, 1-메틸렌)과 푸란, 2-펜틸은 이전에 B. subtilis 및 B. pumilus 균주에서 분리되어 토양에 서식하는 식물 병원성 곰팡이에 대해 상당한 항진균 활성을 나타냈다. 그러나, 경질균핵과 균사 플러그는 항진균성 휘발성 물질로 1주일 동안 처리한 후 신선한 배지에서 정상적으로 성장하여 휘발성 물질의 살균 활성을 저해했습니다 [200]. 이러한 비살균 효과는 물에 대한 용해성과 관련이 있을 수 있는데, 이 경우 대사 산물은 한천 배지에 흡착되어 기능을 수행한다. B. subtilis 균주 JA가 방출하는 알데히드(노난알)는 과일 및 채소 병원균인 Botrytis cinerea의 성장을 잠재적으로 억제한다 [201]. 에스테르가 항균 및 식물 생장 촉진 특성을 지닌다는 최근 보고가 있다. B. subtilis 균주 DZSY21이 생성하는 이소펜틸 아세테이트는 식물 병원균 Culvularia lunata의 생장을 억제하는 것으로 나타났다 [154]. 이러한 휘발성 물질이 곰팡이 성장을 방해하는 근본적인 분자적 메커니즘은 아직 잘 알려져 있지 않다. 그러나 휘발성 대사산물의 항진균 활성은 세포 파괴 현상과 관련될 수 있다. 이는 곰팡이 포자의 막 투과성을 유도하고 세포 내 칼륨 이온 수송을 감소시킨다[202]. 이러한 불균형을 보상하기 위해 양성자 유출 펌프가 활성화되어 세포 내 수소 이온 유입을 증가시키고 막 양측의 순전하를 유지한다. 이는 아마도 세포 내 pH의 급격한 변화를 유발하고 세포 생리학을 교란시켜 사멸로 이어질 것이다. 여러 연구에서 휘발성 대사산물이 세포외-세포내 매질 간 pH 구배를 방해하는 능력을 강조하였다[203,204,205,206].

7. Miscellaneous Metabolites

There are few bioactive metabolites produced by B. subtilis that do not fit into any class. For instance, bacilysocin is neither synthesized via NRPS nor PKS. Instead, it is a phospholipid antibiotic that accumulates within the B. subtilis cell and presents a unique example of a modified phospholipid. Bacilysocin’s structure is composed of a central glycerol linked with glyceryl phosphate and an anteiso-fatty acid tail. The putative biosynthetic pathway for the bacilysocin initiate is from the conversion of phosphatidic acid to phosphatidylglycerol and then lysophospholipase (YtpA) convert phosphatidylglycerol to bacilysocin. The antimicrobial activity of bacilysocin is limited to Gram-positive bacteria and a few fungal strains, including S. aureus, Candida pseudotropicalis and S. cerevisiae. To date, the biological role, absolute biosynthetic pathway, mode of action, and the specific activity of bacilysocin is unclear.

B. subtilis strain 84R5 produces aminosaccharide 3,3′-neotrehalosadiamine, which exhibits marginal activity against K. pneumoniea and S. aureus [207]. The biosynthetic pathway and mode of action of aminosacharide 3,3-neotrehalosadiamine are yet not elucidated; however, a putative aminotransferase, associated with its biosynthesis has been purified and characterized thoroughly [208].

7. 기타 대사산물

B. subtilis가 생성하는 생리활성 대사산물 중 특정 분류에 속하지 않는 것들이 소수 존재한다. 예를 들어, 바실리소신(bacilysocin)은 NRPS나 PKS 경로를 통해 합성되지 않는다. 대신, 이는 B. subtilis 세포 내에 축적되는 인지질 항생제로서 변형된 인지질의 독특한 사례를 제시한다. 바실리소신의 구조는 중심 글리세롤에 글리세릴 인산과 안테이소 지방산 꼬리가 연결된 형태이다. 바실리소신 전구체의 추정 생합성 경로는 포스파티드산이 포스파티딜글리세롤로 전환된 후, 리소포스파티딜리파아제(YtpA)가 포스파티딜글리세롤을 바실리소신으로 전환하는 과정으로 시작된다. 바실리소신의 항균 활성은 그람양성균과 S. aureus, Candida pseudotropicalis, S. cerevisiae를 포함한 일부 곰팡이 균주에 한정된다. 현재까지 바실리소신의 생물학적 역할, 완전한 생합성 경로, 작용 기전 및 특정 활성은 명확하지 않다.

B. subtilis 균주 84R5는 아미노사카라이드 3,3′-네오트레할로사디아민을 생산하며, 이는 K. pneumoniea 및 S. aureus에 대해 미미한 활성을 나타낸다 [207]. 아미노사카라이드 3,3-네오트레할로사디아민의 생합성 경로와 작용 기전은 아직 밝혀지지 않았으나, 그 생합성과 관련된 추정 아미노트랜스퍼라제가 정제되어 철저히 특성화되었다 [208].

8. Conclusions and Future Prospective

Ubiquitous bacteria like B. subtilis are usually disregarded and their biosynthetic potential is underestimated; however, they produce promising bioactive metabolites that have earned much attention recent years. Herein, we review in-depth all of the bioactive metabolites produced by the B. subtilis group and described their potential applications in various industries. B. subtilis synthesize a plethora of biologically active metabolites exhibiting broad-spectrum antimicrobial, anticancer, anti-inflammatory, and antinematicidal activities. The bioactive metabolites produced by B. subtilis are also associated with the promotion of plant growth and induce systemic resistance in plants. This great versatility is intensifying the commercial interest in B. subtilis strains, considering their antimicrobial activity against plant and food-borne pathogens and their long history of safe use in food. The current review also proposed a classification system for the bioactive metabolites synthesized by B. Subtilis group. This classification system will assist in establishing robust practices for the characterization and the discovery of new bioactive metabolites. Undeniably, the majority of the reported biologically active metabolites are partially purified and may contain a mixture of metabolites, or the biosynthetic pathways have been identified via genome mining approaches. Therefore, the bioactivity of individual metabolites and the confirmation of particular pathways via gene knockout is required. Further, the concentrations of the partially purified metabolites are often unknown, and it is also rarely reported that the bioactive metabolites within the mixture displayed a synergistic effect. The newly isolated bioactive metabolites need proper identification, characterization, and classification in these cases.

Collectively, the biologically active metabolites produced by B. subtilis present a resilient foundation for developing this species to be utilized in the agronomy, food, and pharmaceutical industries. Nonetheless, the isolation and purification of these metabolites presents a primary challenge, and, also, the isolated yields and their direct applications may not be viable.

8. 결론 및 향후 전망

B. subtilis와 같은 보편적 세균은 일반적으로 간과되며 생합성 잠재력이 과소평가되지만, 최근 주목받는 유망한 생리활성 대사물을 생산한다. 본고에서는 B. subtilis 군이 생산하는 모든 생리활성 대사산물을 심층적으로 검토하고 다양한 산업 분야에서의 잠재적 응용 가능성을 기술하였다. B. subtilis는 광범위한 항균, 항암, 항염증 및 항선충 활성을 나타내는 다수의 생물학적 활성 대사산물을 합성한다. B. subtilis가 생산하는 생리활성 대사산물은 또한 식물 생장 촉진 및 식물 내 체계적 저항성 유도와 연관되어 있다. 이러한 탁월한 다기능성은 식물 및 식품 매개 병원체에 대한 항균 활성과 식품에서의 오랜 안전 사용 이력을 고려할 때, B. subtilis 균주에 대한 상업적 관심을 증대시키고 있다. 본 고찰은 또한 B. subtilis 군이 합성하는 생리활성 대사산물의 분류 체계를 제안하였다. 이 분류 체계는 새로운 생리활성 대사산물의 특성 분석 및 발견을 위한 견고한 실무 확립에 기여할 것이다. 분명히 보고된 생물활성 대사산물의 대부분은 부분적으로 정제되었으며 대사산물 혼합물을 포함할 수 있거나, 생합성 경로는 게놈 마이닝 접근법을 통해 확인된 경우가 많다. 따라서 개별 대사산물의 생물활성과 유전자 녹아웃을 통한 특정 경로의 확인이 필요하다. 또한 부분 정제된 대사산물의 농도는 종종 알려지지 않았으며, 혼합물 내 생물활성 대사산물이 시너지 효과를 나타낸다는 보고도 드물다. 이러한 경우 새로 분리된 생리활성 대사산물은 적절한 동정, 특성 분석 및 분류가 필요하다.

종합적으로, B. subtilis가 생성하는 생리활성 대사산물은 이 종을 농업, 식품 및 제약 산업에 활용하기 위한 탄탄한 기반을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 대사산물의 분리 및 정제는 주요 도전 과제이며, 또한 분리 수율과 직접적 응용 가능성은 실현되지 않을 수 있다.

Supplementary Materials

The following supporting information can be downloaded at: https://www.mdpi.com/article/10.3390/molecules28030927/s1, Figure S1: Showing various confirmations of surfactin and iturin cyclic lipopeptides; S2: Showing molecular structure of gageopeptide (gageostatin A, B and C) (A) and siderophore (bacilysin, chlorotetain, and bacillibactin) linear lipopeptide (B and C); S3: Chemical structure of polyketides (PKs), difficidine (A), aurantinin (B) and macrolactin (C) and Hybrid NRPs/PKs metabolites bacillaene (D) and amicoumacin A and B (E) and amicoumacin C (F); S4: Representing structure of volatile bioactive metabolites produced by B. subtilis group. Table S1: NRPs from B. subtilis group.; S2: Ribosomal peptides (RPs) from B. subtilis group; S3: PolyKetides (PKs) from B. subtilis group; S4: Hybrid (NRP/PK) metabolites from B. subtilis group; S5: Volatile metabolites from B. subtilis group. References [209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265] are cited in the supplementary materials.

Author Contributions

S.I. and F.B. designed and wrote the original draft of the manuscript. A.A.R., M.A., B.R.A.S., A.A. (Abdulsalam Alawfi), A.A. (Amer Alshengeti) and T.S.: designing and editing the manuscript, validated and generated tables data. A.K.: design, generated figures, and editing the final manuscript. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

Funding

This research received no external funding.

Institutional Review Board Statement

Not applicable.

Informed Consent Statement

Not applicable.

Data Availability Statement

No new data were created or analyzed in this study. Data sharing is not applicable to this article.

Conflicts of Interest

The authors declare no conflict of interest.

References

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