염소수 및 산성화아염소산수 세척이 시금치

[희야]

1. 연구 배경
 시금치는 비타민 A와 C, 루테인, 철, 엽산과 마그네슘과 같이 건강에 유익한 성분을 다량 함유하고 있는 엽채류이다. 이러한 풍부한 영양가치로 인해 신선 시금치 및 가공품 소비 증가와 동시에 Escherichia coli O157:H7에 의한 식중독 사고도 증가하고 있다. 미국에서는 2006년 9월, 시금치를 섭취한 뒤 E. coli O157:H7 집단식중독이 여러 주에서 동시다발적으로 발생하여 3명이 사망하고, 약 200여명의 환자가 발생하였다. 식중독리스크를 낮추기 위해서는 부착되어있는 식중독 원인 균을 효과적으로 제거, 살균하는 것이 중요하다는 것은 말할 나위가 없으며, 그 한가지 방법으로 세척을 들 수 있다. 일반적으로 식품제조현장에서는 차아염소산나트륨 또는 분말화된 염소계살균소독제가 사용되고 있다. 그런데, 활성 차아염소산은 식품의 질소화합물과 반응함으로 유효염소가 감소되어 활성을 잃으면서 인체에 유해한 트리할로메탄 등의 유기염소화합물을 생성한다. 이러한 잠재적 발암성과 세척처리 중 살균력 저하와 같은 문제로 인한 대체 살균제가 필요해지고 있다. 이산화염소(ClO2)는 염소보다 수용성이 높고, 분자당 산화력도 차아염소산에 비해 2.5배 크다. 몇 가지 연구에 의하면 이산화염소가 염소와 동등 또는 그 이상의 효과적인 살균제라고 판명되었다. 이산화염소는 염소만큼 쉽게 식품표면과의 접촉에 의한 염소화합물을 생성하지 않으므로, 이산화염소가 염소를 대체하는 살균제로서의 이용이 기대된다. 이산화염소는 산성화아염소산수 (ASC; Acidified sodium chlorite)에서 발생되는데, ASC는 아염소산나트륨과 일반적으로 안전하다고 인정된 (GRAS; Generally recognized as safe) 유기산을 혼합하여 조제한다. 화학반응에 의해 생성된 이산화염소가 낮은 pH와 함께 강한 살균작용을 발휘한다. 미국에서는 1999년부터 식품의약품국 (FDA) 에 의해 ASC를 축산물 및 가공 채소, 과일의 살균에 사용하는 것이 가능하게 되었고, 일본에서는 1995년 말부터 아염소산나트륨을 신선채소류 및 란류의 살균에 사용가능하게 되었다.
이 실험의 목적은 1) 시금치 엽에 침지 및 점적 접종된 E. coli O157:H7에 대한 ASC수의 효과 2) 자연발생적 미생물상(일반세균수 및 대장균군)에 대한 ASC수의 효과 3) 색상에 대한 ASC수의 효과를 검토하고자 하였다.

1. 연구 배경
<시험 균주>
 4가지 strain의 E. coli O157:H7 (CR-3, MN-28, MY-29, DT-66)가 사용되었다. 시금치에서 자연 발생하는 미생물의 생장을 억제하기 위하여 모든 균주는 50 μg/mL rifampicin이 첨가된 tryptic soy broth (pH 7.3, Nissui Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에서 항생물질인 rifampicin에 내성을 갖는 변이주를 유도하였다. rifampicin이 포함된 배지의 이용은 자연적으로 존재하는 미생물의 생장을 억제하고 접종한 균주을 효과적으로 분별하여 검출 효율을 높일 수 있다. 항생물질 내성균주를 접종균주로 사용하는 방법은 효과적인 접종실험방법이라고 보고되었다

<접종균액 준비>
 각 E. coli O157:H7 균주는 50 μg/mL rifampicin을 첨가한 brain heart infusion (BHI; Nissui) 5 mL에 접종하여 37 ℃에서 20시간 배양하였다. 배양 후 세포를 모으기 위해 원심분리 (3,000 ×g, 5분, 20 ℃) 한 후 멸균된 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) 5 mL로 현탁하였다. 동일 농도의 4가지 균주가 포함되도록 “칵테일법”으로 혼합하였다. 최종 균주현탁액은 7.0 log CFU/mL가 되게 하였으며 22±2℃에서 보관하며 조제 후 30분이내에 시금치에 접종하였다.

<시금치 준비>
 시금치 (Spinacia oleracea L.) 는 시내 슈퍼마켓에서 구입하여 4 ℃에 보관하며 2일 이내에 실험에 사용하였다. 시금치는 70 %(v/v) ethyl alcohol 로 멸균한 도마와 칼을 사용하여 65～70 mm 길이로 절단하였다.

<접종과정>
 시금치 세척시 E. coli O157:H7의 제거정도에 미치는 접종방법의 영향을 구명하기 위하여 E. coli O157:H7 혼합현탁액 접종을 점적과 침지 2가지 방법으로 실시하였다.
첫 번째로 침지(dip) 접종은 200 g의 시금치 엽을 2 L 접종액에 침지하여 유리봉으로 1분간 부드럽게 저으며 혼합하였다. 접종액을 제거한 후 시금치 엽을 꺼낸 후 크린벤치 안에 둔 멸균된 스테인레스망 위에서 실온(22±2℃) 건조 30분 후 세척시험에 사용하였다.
두 번째로 점적(spot) 접종은 200 μL의 접종액을 마이크로피펫으로 취하여 절단된 시금치 엽 표면에 용이하도록 되도록 적은 량을 25～30군데에 나누어 한방울씩 점적하였다. 접종된 200g의 시금치는 실온건조 30분 후 비닐백에서 골고루 혼합한 후 세척시험에 사용하였다.

<세척수 준비>
 ASC수는 3종의 15 mg/L sodium chlorite와 200 mg/L의 citric acid를 사용하여 조제하였다. 상업적으로 이용 가능한 sodium chlorite인 Keeper PRO (Bio-cide International, Inc., Oklahoma, USA), Seal Bright 25FD (Japan calit Co., Ltd, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 시약인 NaClO2 (Nacalai tesque, Kyoto, Japan)를 이용하였다. 염소수는 sodium hypochlorite(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)를 사용하였고, 농도는 100 g/L로 조정하였다. 대조구로 증류수(DW)가 사용되었다. 세척수는 사용되기 전 30분 이내에 조제하였다.

<세척 과정>
 모든 실험조건은  40 g의 접종시금치를 스텐레스 용기 (15cm×15cm×15cm) 에 담긴 800 mL 살균수로 세척하였다. 세척은 유리봉을 사용하여 부드럽게 교반하면서 5분간 실시하였다. 살균세척수를 제거한 후 800 mL 증류수로 헹구었다. 멸균 스텐레스망 위에서 증류수를 제거한 후 20 μm두께 polyethylene 봉지에 담아 10 ℃ 항온기에 5일간 보관하였다.

<미생물 분석>
 접종 E. coli O157:H7 균수 측정은 단계희석 평판법을 사용하였다. 10 g의 시금치 엽을 stomacher bag에 취하여 90 mL의 PBS (pH 7.2) 를 첨가하여 60초간 균질화 하였다. PBS를 사용하여 단계 희석하여 50 μg/mL rifampicin이 첨가된 tryptic soy agar (TSA-Rif)와 sorbitol MacConkey (SMAC-Rif) 배지에 평판하였다. rifampicin을 제외한 모든 성분은 121 ℃에서 15분간 멸균한 후 샤레에 붓기 전 rifampicin 용액을 첨가하였다. 시료 희석액을 넣어 굳은 증균배지는 거꾸로 하여 37 ℃ 항온기에서 24 시간 배양하였다. 접종한 균주와 검출된 균주가 동일한 것을 확인하기 위하여 분리하여 triple sugar iron (Nissui) 사면배지 및 IMViC 테스트를 실시하였다.
일반세균과 대장균군은 접종하지 않은 시금치 엽을 사용하여 측정하였다. 단계희석 평판법을 사용하여 일반세균수는 plate count agar (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo, Japan) 에서 35 ℃에서 48시간, 대장균군수는 desoxycholate agar (Eiken Co., Ltd., Tokyo, Japan) 에서 35 ℃, 24시간 배양한 후 형성된 집락을 계수하여 log colony forming unit (cfu)로 표시하였다.

<색상 측정>
 시금치 엽의 색상은 portable color meter (model SP-62, X-rite, Grandville, Mich.)를 사용하여 세척전후 각 10개 엽을 측정하였다. 처리에 의한 색상차이를 비교하기 위해 △E값을 구하였다.

<통계처리>
 미생물 분석을 실시한 모든 실험은 각 2개씩의 시료에 대해 4회 반복실험을 실시하였다. 각 시료의 균수를 대수화한 수 평균치차를 5%수준의 유의차 검정으로 통계처리 하였다. 품질평가 분석은 4개의 시료에 대한 평균과 표준오차를 나타내었다.

3. 연구 결과
 <미생물 밀도에 대한 세척처리 효과>
 표 1은 세척된 시금치의 E. coli O157:H7 밀도를 보여준다. 접종된 시금치는 TSA-Rif와 SMAC-Rif 배지에서 각 5.2±0.1 log CFU/g과 4.9±0.2 log CFU/g의 E. coli O157:H7가 부착됨을 보였다. 본 실험에 있어 접종하지 않은 시금치에서 E. coli O157:H7는 검출되지 않았다. 시금치 접종조건이나 처리와 관계없이 TSA-Rif 배지에서 SMAC-Rif 배지보다 더 높은 E. coli O157:H7 검출 효율을 보였다. 대조구인 증류수로 세척한 시금치에서 선택배지에 비하여 TSA-Rif에서 0.2～0.4 log CFU/g 정도 검출 효율이 높았다. 선택배지에서의 낮은 계수에 대한 기존 보고와 일치하며, 이는 손상균의 회복력이 낮은 데서 기인한 것으로 보인다.
증류수로 세척하였을 때 1.0 log CFU/g의 E. coli O157:H7수가 감소하였다(표 1). 그러나, 차아염소산나트륨수(100 ppm NaOCl) 처리는 약 1.5 log CFU/g 정도 균수가 감소하였다. 산성화아염소산수(15 ppm) 처리는 1.1-1.5 log CFU/g 감소하였다. 조제에 사용된 3종의 sodium chlorite로 만들어진 ASC수간에 유의차는 없었다.

Table 1. Population of E. coli O157:H7 on spinach leaves washed by different sanitizers for 5 min, and stored at 10℃. Inoculation of E. coli O157:H7 was carried out by dipping spinach leaves to inoculum.
a Population data were represented by means of four independent trials with two samples and standard error (n = 8). b Spinach leaves were washed with distilled water (DW), sodium hypochlorite, acidified sodium chlorite (ASC). Source of sodium chlorite was commercially available chemicals Keeper PRO (KP; Bio-cide International, Inc., Oklahoma, USA) and Seal Bright 25FD (FD; Japan Carlit Co., Ltd., Tokyo, Japan) , and test reagent chemical (NaClO2 ; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)

일반세균수와 대장균군수에 대한 세척효과는 표 2에 나타내었다. 초기 일반세균수와 대장균군수는 각 5.8±0.3 과 4.8±0.5 log CFU/g 이었다. 증류수는 일반세균수와 대장균군수를 유의하게 감소시켰으며(P＜0.05), 각 0.7 log CFU/g정도 감소를 보였다. 그러나, 차아염소산나트륨수(100 ppm) 처리에서는 일반세균수 및 대장균군수에 대하여 각 1.7, 1.2 log CFU/g 감소하였다. 이는 대조구인 DW세척에 비하여 0.5-1.1 log CFU/g 감소를 보여준다. 3종의 ASC수에 의해서는 일반세균수는 1.2-1.9 log CFU/g, 대장균군수는 1.1-1.4 log CFU/g 감소하였다. DW에 비해 높은 감소를 보였지만, 염소수 세척과는 거의 유사한 감소를 보였다.

Table 2.  Population of aerobic microflora and coliform on spinach leaves washed by different sanitizers for 5 min.

<세척 후 10℃ 저장 5일 후 미생물 변화>
세척 후 10℃ 저장 5일 후 미생물의 변화는 표 1, 표 2에 나타내었다. 세척조건에 관계없이 10℃ 저장 동안 E. coli O157:H7은 유의하게 증가하였으나(P ＜ 0.05), 5일 저장 후 매우 소량(0.2-0.6 log CFU/g) 증가하였다. 대조적으로, 일반세균수와 대장균군수는 모두 높은 증가를 보여 일반세균수는 7.0-7.6 log CFU/g, 대장균군수는 6.3-6.8 log CFU/g를 보였다. 10℃ 5일 저장 후 세척조건에 의한 영향은 없었다.

<E. coli O157:H7 감소에 대한 접종방법의 영향>
E. coli O157:H7 감소에 대한 접종방법과 세척처리에 의한 효과는 표 3과 같다. 침지접종한 시금치에서 점적접종한 시금치보다 더 낮은 감소를 보였다. DW, NaOCl, ASC로 세척하였을 때 1.1-1.8 log CFU/g정도 감소하였다. 세척수 종류에 상관없이 점적접종하였을 때 침지접종보다 높은 미생물 감소를 보였으나, 그 차이는 0.5 log CFU/g정도였다.

Table 3.  Population of E. coli O157:H7 on spinachleaves after washing with different sanitizers for 5 min. E. coli O157:H7 was inoculated by dip and spot methods.

<시금치 색상에 대한 세척처리 영향>
시금치 엽의 색상변화는 표 4와 같다. 세척 후 눈에 띄는 색상변화는 없었다. L*, a*, b*값으로 계산한 전체 색상차는 3.0～4.3로 색상에 큰 차이가 없음을 알 수 있었다. 세척수 종류에 관계없이 색상차는 변화가 없었다(P ＞ 0.05).

Table 4.   Color changes of spinach leaves after washing with different sanitizers.

a Color data were represented by means of four independent trials with one sample and standard error (n = 4).

4. 고찰
 물 세척은 신선농산물의 표면에 존재하는 미생물을 물리적으로 제거할 수 있으나, 많은 농산물에서 미생물 오염 제거에 대한 물 세척의 효과는 거의 없는 것으로 많은 연구에서 보고되었고, 시금치에서 E. coli O157:H7 감소 효과도 없다고 하였으나 본 연구에서는 물 세척에 의해서 E. coli O157:H7, 일반세균, 대장균군이 약간 감소함이 관찰되었다. 신선농산물에 있어 염소수 세척은 그 살균효과와 상대적으로 싼 가격 등의 경제적 이유로 사용되어지고 있다. 이 연구에서는 시금치에서 염소수 세척에 의해 2.0 log CFU/g이하의 E. coli O157:H7, 일반세균, 대장균군 감소가 관찰되었다. 15ppm ASC수도 염소수와 거의 유사한 감소효과를 나타내었으며, 서로 다른 chlorite로 조제된 ASC수의 감소 효과도 큰 차이 없었다. 최근 일본에서는 상업적인 sodium chlorite 용액이 이용가능해지고 농산물 생산업자나 유통업자 사이에서 제한적으로 사용되어지고 있다. 따라서, 15ppm의 ASC수는 100ppm의 NaOCl과 동일한 효과를 얻을 수 있으며, 경제적으로나 환경적인 부하를 저하시킬 수 있다. 따라서 15ppm의 ASC수나 100ppm의 NaOCl 이용은 E. coli O157:H7를 완전히 제거할 수는 없으나 어느 정도 감소효과는 있었다. 또한, ASC수나 NaOCl 이용에 의해 일반세균이나 대장균군은 DW에 비하여 1.0 log CFU/g의 추가감소가 가능하였다. 미생물은 신선채소의 품질열화나 저장기간과 연관이 되어있다. 따라서 적절한 화학적 살균은 시금치의 저장기간을 증가시킨다고 여겨진다.
미생물적 오염은 세척처리에 의해 완전히 제거하는 것은 어려우며, 잔존하는 미생물은 특정 저장조건하에서 새롭게 다시 자랄 수 있다. 시금치에 점적 접종한 E. coli O157:H7은 침지접종보다 세척후 높은 감소를 보였다. 감소효과는 특정 살균제에 노출되었을 때 접종방법의 차이에 의해 높게 혹은 낮게 평가될 수 있다. 세척수 종류에 의한 시금치 엽의 색상은 영향을 받지 않았다. ASC수에 의해 신선채소의 외관에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다. 따라서, ASC수는 시금치의 미생물 제어에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.