|
수소(H2)가 세포를 손상시키는 활성산소를
선택적으로 환원시켜 치료적인 항산화제로 작용한다
오샤와 이쿠로 외 9명의 공동연구
(네이처 메디신 2007년 5월 호)
역자 주 : <네이처 메디신 Nature Medicine : 영국>이라는 의학 전문저널은 전 세계 연구자들의 발표의 장으로, 입증된 것만을 게재하는 것을 기본편집방침으로 하고 있다. 이 매체에 논문이 실렸다는 것은 연구자들에게는 실로 평생의 영광이며 세계적인 연구자로 평가된다. 또 노벨상의 후보자로 꼽히는 것은 물론이다. 이번 논문은 무려 10명의 전문 연구자들이 참여하여 일본 정부의 보건복지성, 후생성의 지원을 받아 장기간에 걸쳐 연구한 것으로, 수소와 활성산소의 관계에 관한 이정표적인 업적으로 평가된다. 논문에 필수적인 각종 그림, 그래프, 주(총 31개, 1쪽 반에 달함)는 편의상 제외한다.
핵심 내용
- H2는 배양세포에서 *OH를 선택적으로 환원시킨다(reduce)
- 매질에 용해되어 있는 H2가 세포를 *OH로부터 보호한다
- 스핀의 포획작용(spin-trapping)이 H2에 의해 환원된 활성산소를 확인한다
- H2는 무세포 체계에서 *OH와 ONOO*를 환원시킨다
- H2는 시험관내 허혈과 재관류로부터 신경을 보호한다
- H2 가스의 흡입은 재관류로 인한 뇌 손상을 보호한다
전체의 요약 내용 010-2383-6174
허혈-재관류(혈액 흐름의 재개)나 염증으로 빚어진 심각한 산화 스트레스는 조직에 심각한 손상을 일으키며, 지속적인 산화 스트레스는 암을 비롯한 많은 흔한 질병의 원인들의 하나로 인정되고 있다. 필자들은 이 논문에서 수소(H2)가 예방적이고도 치료적인 응용분야에서 항산화제로 잠재력이 있음을 증명한다. 우리는 3개의 독립적인 방법으로 배양 세포에서 심각한 산화 스트레스를 유도했다. H2는 반응성 산소(reactive oxigen species : ROS : 활성산소)중에서 세포에 가장 심각한 손상을 주는 하이드록실 라디칼을 선택적으로 환원시켰고, 세포를 효과적으로 보호했다. 그러나 H2는 생리적인 역할을 수행하는 다른 활성산소와는 반응하지 않았다. 우리는 산화 스트레스 손상이 뇌에서 초점이 되는 허혈이나 재관류에 의해 유발되는 급성 쥐 모델을 이용했다. H2 가스의 흡입은 산화 스트레스의 효과를 완화하여 뇌의 손상을 획기적으로 억제했다. 따라서 H2는 효과적인 항산화 요법으로 이용될 수 있는데, 이것은 세포막의 전역에 걸쳐 빠르게 확산될 수 있는 수소의 역량 때문이다. 수소는 세포에 손상을 주는 활성산소에 도달하고 반응하여 세포를 산화적인 손상으로부터 보호할 수 있다.
산화 스트레스는 과다한 활성산소, 다시 말해 유리기(free radical : 활성산소)가 세포에 작용하는 산화하는 잠재력으로부터 발생한다. 생산된 과산화물 음이온 라디칼(O2-*)의 대부분은 전자 수송 체인과 크렙스 사이클로부터 나온 전자 유출에 의해 미토콘드리아에서 생성된다. O2-*도 NADPH(Cytochrome C reductase : NADPH)) 산화제와 잔딘 산화제를 비롯한 대사적인 산화제에 의해 생산된다. 과산화물 디스뮤타아제(SOD)는 O2-*을 과산화수소(H2O2)로 전환시키고, 과산화수소는 글루타치온 페록시다아제나 카탈라아제에 의해 독소가 제거되어 물이 된다. 과도한 O2-*는 Fe3+(철 이온)과 Cu2*(구리 이온) 등 전이금속 이온을 환원시키고, 그것의 환원된 형태는 이어 과산화수소와 반응하여, 펜톤 반응에 의해 하이드록실 라디칼(*OH)을 생산한다. *OH는 활성산소들 중 가장 강력하며 핵산, 지질과 단백질과 무차별적으로 반응한다. *OH의 해독 시스템에 대해서는 알려진 것이 없고, 따라서 *OH의 청소는 핵심적인 항산화 작용이다.
O2-*와 H2O2(과산화수소)가 세포에 손상을 주는 효과에도 불구하고, 이들은 저농도에서는 중요한 생리 역할을 수행한다. 이들은 수많은 다단계의 신호전달 작용과 관련되어 조절하는 신호하는 분자들로 작용하고, 아울러 세포 소멸(apoptosis), 세포 증식과 세포 분화 등 생물학적 작용들을 조절한다. H2O2는 농도가 높아지면, 미엘로 퍼옥시다아제 (myeloperoxidase : 골수세포형 과산화효소)에 의해 차아 염소산(hypochlorous)으로 전환된다. 또 이런 차아염소산은 박테리아 침입에 대해 방어한다. 질소산화물(NO*)은 또 다른 활성산소로, 신경전달물질로 작용하고 혈관 확장에 필수적이다. 따라서 *OH 등 세포를 손상시키는 라디칼은 반드시 중화되어야 하고 아울러, 다른 생리적으로 유익한 활성산소의 필수적인 생물학적 활동을 손상시키지 않아야 한다. 여기에서 우리는 실증을 통해 분자 수소(dihydrogen, H2)가 *OH로 유발된 세포의 독소를 완화시킬 수 있으면서도, 다른 활성산소에게도 영향을 주지 않음을 입증하고, 아울러 H2가 치료적인 잠재력을 갖고 있다고 제안한다.
연구 결과
H2는 배양세포에서 *OH를 선택적으로 환원시킨다(줄인다 : reduce) 010-2383-6174
H2는 물의 방사선 분해나 광분해로 생산된 *OH을 환원시킨다. 그렇지만, H2가 살아있는 세포에서 *OH를 효과적으로 중화시킬 수 있는지는 지금까지 직접 연구되지 않았다. *OH의 자연발생적인 생산으로 생성된 세포 손상은 탐지가 가능할 정도로 충분하지 않으므로, 우리는 PC12의 배양된 세포에서 O2-*의 생산을 유도했다. 이것을 실천하고자, 우리는 그런 세포를 미토콘드리아 산소호흡 복합체 III 억제제(mitochondrial respiratory complex III), 안티마이신 A로 처리했다. 그런 처리에 따라, 이런 세포에 있는 O2-*은 빠르게 H2O2로 전환된다. 안티마이신 A의 첨가는 O2-*와 H2O2의 수치를 증가시켰고, 이것은
마이토삭스(MitoSOX)의 산화형태와, 2,7-디클로로디하이드로플루오레세인(H2DCF) 각각이 방출한 형광 신호로 판단됐다. 우리는 H2와 O2를 논문의 말미에 있는 <연구 방법들>에 설명된 것처럼 매질에 용해시켰고, H2 수치의 연장된 유지(24시간)를 확인했다. 배양 매질에 용해된 H2는 세포에 있는 마이토삭스와 DCF 신호들을 줄이지 않았다. 반면 H2 처리는 *OH 수치를 상당히 감소시켰고, 이것은 2-6-4-(하이드록시) 페녹시-3-에이치-잔덴-3-9-1-벤조에이트(HPF)의 산화형태가 방출한 형광 신호로 평가됐다.
우리가 그런 세포를 H2가 없는 상태에서, 안티마이신 A(30 μg/ml)에 노출시켰을 때, HPF 신호는 핵 부위와 세포질 양자에 증가했는데, 아마 H2O2가 *OH를 생산하기 위해 미토콘드리아로부터 확산됐기 때문일 것이다.
주목되는 점으로 H2는 심지어 핵에서 *OH 수치를 증가시켰다. (역자 주 : 세포학에서는 측정방법으로 형광물질을 착색해 이용하며, 이런 형광물질의 발견자는 노벨상을 받았다.)
안티마이신 A 처리 후 H2는 미토콘드리아의 막전위(膜電位)의 감소를 예방했고, 이것은 테트라에틸로다민 메틸 에스터(TMRM)의 형광으로 탐지됐다. 그것은 미토콘드리아의 막 전위에 달려 있지만, 반면 미토트래커 그린(MitoTracker: MTGreen)은 막의 전위와는 무관한 것으로, 그것의 형광 수치는 일체 변화하지 않았다.
이것은 곧 H2가 미토콘드리아를 *OH로부터 보호했음을 시사했다. H2로 처리된 세포는 정상 모습이지만, 반면 H2로 처리되지 않은 세포들은 줄어들고 변칙적인 원형 모양을 가졌다. H2가 미토콘드리아와 핵의 DNA를 보호했다는 사실은 곧 H2가 대다수의 막으로 침투하고 세포내의 소기관(organelles)으로 확산됐다는 증거를 제공했다.
매질에 용해되어 있는 H2가 세포를 *OH로부터 보호한다
우리는 PC12세포를 H2와 O2를 함유하는 배양 매질에 두고, 동시에 안티마이신 A를 첨가해 산화 스트레스를 유도했다. 안티마이신 A로 활성산소를 유발한지 24시간 후, H2가 핵 DNA를 산화로부터 보호하는 것 같음을 관찰했고, 이것은 산화된 구아닌(8-OH-G)의 수치 감소로 입증됐다. 나아가 H2는 또 4-하이드록실-2-노메날(HNE), 즉 지질 과산화물의 최종산물의 수치를 감소시켜, 지질을 과산화로부터 보호함을 나타냈다.
더욱이 매질에 용해된 H2는 세포를 투입량에 따라 세포 사망으로부터 보호했다. 우리가 H2를 H2로 포화되어 있는 매질로부터 제거했을 때, 보호 효과는 사라져, 관찰된 효과는 H2와 매질의 반응으로 인한 것이 아님이 입증됐다. 더욱이 H2는 두 개의 방법을 활용해, 세포의 생존력을 보호함을 우리는 확인했다.
그것은 조작된 MTT 시료(WST-1 시료)와 손상된 세포로부터 누출된 세포의 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase : 酸脫水素酵素: LDH)의 측정이었다. H2의 보호 효과가 안티마이신 A와의 반응으로 인한 것이라는 가능성을 배제하고자, 우리는 미토콘드리아 복합체 I에 작용하는 억제제인 메나디온을 첨가해 활성산소를 유도했고, H2가 이런 시스템에서도 마찬가지로 세포를 보호함을 관찰했다.
H2가 *OH에 대해 보호함을 확인하고자, 우리는 세포를 Cu2*로 사전 처리하고, 이들을 아스코르브산염에다 노출시켰다. 목적은 세포 사이의 Cu2*를 Cu*로 환원시키기 위함이다. Cu*는 이어 내생적으로 생산되는 H2O2로부터 나오는 *OH의 생산에서 촉매작용을 한다. 이런 처리는 주로 세포 내에서 *OH를 유발했고(펜톤 반응), 그리하여 H2가 세포를 세포 *OH로부터 보호함을 확인했다.
스핀의 포획작용(spin-trapping)이 H2에 의해 환원된 활성산소를 확인한다
H2가 환원하는 활성산소를 확인하고자, 우리는 H2가 스핀을 포획하는 시약들의 전자 스핀 공명(electron spin resonance: ESR)신호들에 미치는 영향을 연구했다. 우리는 세포의 펜턴 반응으로 *OH를 생산했고, 5-5-디메틸-1-파이로린 질소산화물(DMPO)을 이용해 스핀을 포획함으로써 *OH의 세포 수치를 절반쯤 정량화했다. ESR의 측정결과 H2 처리는 실제로 *OH로부터 유도된 *DMPO-OH의 수치를 줄인 것으로 드러났다.
더욱이 우리가 DMPO가 있는 경우 세포를 안티마이신 A로 처리함으로써 O2-*의 생산을 유도했을 때, 복수의 ESR신호를 관찰했다. 그런 신호는 *DMPO-OH와 *DMPO-H 라디칼들에서 온 것으로 구성되는 것 같았다. *DMPO-H 라디칼은 수소 라디칼(H*)로부터 유도되며, 그런 라디칼은 포르피린에 의해 유도될 수 있다. H2로 감소된 신호들을 시각화하고자, 우리는 미분 스펙트럼(differential spectrum)을 얻었다. 연구결과 오로지 *OH로 유도된 신호만이 H2 처리로 감소한 것으로 나타났다. 이런 결과는 H2 처리에 의한 세포의 *OH 선택적인 환원을 강력하게 시사한다.
H2는 무세포 체계에서 *OH(활성산소)와 ONOO*(활성질소)를 환원시킨다
이어 우리는 순수한 용액에서 형광을 이용하면, 펜턴 반응에 의한 연속적인 *OH 생산 중에서 H2에 의한 *OH의 환원을 모니터할 수 있음을 확인했다. 이런 조건에서, H2는 용량에 따라 HPF의 신호를 억제했다. 그러나 우리가 H2를 함유하는 용액을 *OH로 미리 산화된 HPF와 혼합했을 때, 산화된 HPF부터 나오는 형광 신호는 줄어들지 않아, H2가 *OH와 직접 반응했다는 아이디어를 뒷받침했다.
다음으로, 우리는 H2와 다른 활성산소나 활성질소들(RNS)의 반응성을 검사했다. 우리는 저장용액의 희석화로 H2O2와 페록시나이트레이트(peroxinitrate: ONOO* : 질소과산화물로 활성질소의 하나), 잔딘 산화제와 잔딘의 효소 반응으로 O2-*, 그리고 무세포계에서 1-하이드록시-2-옥소-3-(엔-메틸-3-아미노프로필-3-메틸-트리아젠(NOC7)의 자연발생반응으로 NO*를 준비했다. H2는 ONOO*를 다소 환원했지만, H2O2, NO*와 O2-*를 환원시키지 못했다. 세포가 없는 실험에서, 우리는 H2가 대사적인 산화-환원 반응과 관련된 생명분자의 산화된 형태를 환원했는지를 검사했다. 상온과 중립 pH(수소이온농도지수)에서, H2로 포화된 용액은 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD*)의 산화된 형태를 환원시키지 못했다. 그것은 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)의 산화 형태이거나 또는 시토크롬의 산화 형태이다. 그리하여 우리는 H2가 산화-환원반응과 관련된 대사나 또는 O2-*, H2O2, NO*의 수치에 영향을 주지 않는다고 추론한다. 그런 것은 모두 신호전달에서 핵심적인 역할을 수행한다.
H2는 시험관내 허혈과 재관류로부터 신경을 보호한다
우리는 또 많은 생리적인 상황 아래에서 산화 스트레스를 대뇌의 신피질(neocortical) 세포의 일차 배양에서 유도했다. 알려져 있는 사실은 허혈 상황으로부터 재관류로 가는 빠른 이행은 결국 산화 스트레스 손상을 초래한다는 것이다. 허혈을 모방하고자, 우리는 신피질 세포를 60분 동안 질소나 수소 가스가 있는 산소 포도당 결핍(oxygen glucose deprivatiln : OGD)상태에 두었고, 이어 O2와 포도당이 있는 매질을 가진 재관류가 뒤를 이었다.
HPF형광에 의하면, OGD의 완료와 뒤이은 재관류 10분 후, *OH의 수치는 특히 H2가 없을 때 증가했지만, H2가 있을 때에는 감소한 것으로 나타났다. OGD와 재관류 24시간 후, H2는 신경의 생존과 활력을 증가시켜, H2가 신경을 산화 스트레스로 빚어진 세포 사망으로부터 보호하는 것으로 나타났다.
H2 가스의 흡입은 재관류로 인한 뇌 손상을 보호한다
H2가 항산화제로 치료상으로 적용가능한지를 검사하고자, 우리는 허혈의 쥐 모델을 이용했다. 활성산소는 대뇌의 허혈과 재관류 중 생성되며, 뇌 손상의 주요 원인들의 하나이다. 우리는 쥐에서 중뇌의 대동맥(middle cerebral artery : MCA)을 폐쇄해 쥐에서 초점이 되는 허혈을 만들고, 이어 30분 동안 재관류를 시행했다. 4개 조건 중 3개에서 쥐는 H2 가스를 흡입했고, 마취 상태로 인해 질소산화물(N2O)과 섞였고, 전체는 120분 동안이었으며(H2, O2와 N2O(vol/vol/vol)의 비율은 1% 30% 69%, 2% 30% 68%, 그리고 4% 30% 66%였다), 제4의 조건에서 H2는 없었고, (H2 : O2 : N2O(vol/vol/vol)는 0% 30% 70%였다.
우리는 실험 중(연구방법 참조)에서 생리 변수들을 신중하게 감시했고, H2의 호흡으로 인한 발생하는 중요한 변화는 일체 찾지 못했다. 더욱이 대뇌의 혈액흐름에서 중요한 영향은 일체 없었으며, 이것은 도플러 효과로 측정됐다. 동맥 혈액에 용해된 H2는 흡입된 농도에 비례하여 H2의 흡입으로 증가했고, 정맥혈액에 용해되어 있는 H2의 양은 동맥의 그것보다 낮아, H2가 조직에 체화되어 있음을 나타냈다.
MCA 폐색 1일 후, 우리는 뇌를 해부하고 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 염화물(TTC)로 뇌를 착색했다. TTC는 미토콘드리아 산소 호흡의 기반층이다. 우리는 뇌 영역의 착색 정도를 평가함으로써(백색은 경색을 나타낸다) 경색의 양을 평가하고, 경색 량에서 분명한 H2에 의존적인 증가를 발견했는데, H2의 2-4%가 가장 실질적인 효과를 제공했다. 또 H2는 재관류 중 흡입될 때에만 효과를 발휘함에 주목했다. 다시 말해 H2가 허혈 중 흡입될 때, 경색량은 유의의하게 감소하지 않았다. 비교를 위해 우리는 다른 두 개의 화합물을 검사했다. 하나는 에다라본(edaravone)으로 일본에서 뇌경색의 치료를 위한 활성산소 청소제로 승인받은 것이고, 다른 하나는 FK506으로 미국에서 뇌경색용으로 임상실험 중에 있는 것이다.
H2는 에다라본보다 효과적이었고, 또 산화적인 손상을 경감하는데 FK506보다 효과적이었다.
이런 결과는 H2가 치료용으로 잠재력을 갖고 있음을 나타낸다.
H2 가스의 흡입은 손상의 진행을 억제한다
MCA 폐색 1주일에서, H2로 치료된 쥐와 그렇지 않은 쥐들 간의 경색량의 차이는 증가했고, 폐색 1일 후와 비교됐다. 각 쥐의 행동은 신경학적 점수에 따라 등급화됐고, 허혈과 재관류 중 H2의 흡입이 운동을 개선한 것으로 나타났다. 더욱이 H2 미치료 쥐의 체중과 체온은 점차 하락했지만, H2로 치료된 쥐의 그것은 결국 회복됐다. 따라서 H2는 초창기의 뇌손상은 물론이고 진행중인 손상을 억제했다.
우리는 폐색 12시간, 3일이나 7일 후 H2로 매개된 분자변화를 검사했고, 핵산의 산화 정도를 평가하기 위해, 8-OH-G로 가는 항체들로 뇌 부위를 착색함으로써 검사했다. 이어 지질의 과산화 정도를 평가하고자 HNE로 가는 항체로 착색했다. 이런 산화 표지들 양자에 대해, 착색작용은 H2로 치료되지 않은 쥐들에 비해 H2로 치료된 쥐들에서는 상당히 줄어들었다. 또 우리는 Iba1로 가는 항체들과 GFAP로 가는 항체들로 뇌의 동일한 구역들을 착색했다. GFAP는 각각 활성화된 미세 신경교와 별모양 세포(astrocyte : 성상세포)에 고유한 것이다. 연구조사해본 결과, 염증과 리모델링을 나타내는 미세 신경교의 누적에서 수소에 의존적인 명확한 감소가 보였다.
이를 모두 종합하면, 이런 결과는 곧 H2가 산화 스트레스를 현저하게 감소시키고 뇌 손상을 억제할 수 있음을 보여준다.
토론
이번 연구는 분자상태의 수소가 시험관에서 활성산소를 선택적으로 줄일 수 있음을 입증한다. *OH와 ONOO*는 다른 활성산소보다 훨씬 더 반응적이므로, H2가 오로지 가장 강력한 산화제와만 반응할 것임은 당연하다. 이것은 의료 처치에서는 경쟁력이 있는 유리한 것으로, 그것은 곧 H2의 이용이 심각한 원치 않는 부작용을 일으키지 않을 것이라는 뜻이다.
아마 H2는 충분히 경미해 대사의 산화-환원 반응을 교란시키거나 세포의 신호작용과 관련되어 있는 활성산소를 파괴하지 않을 정도일 것이다.
이것은 강력한 산화 반응성을 가진 일부 항산화제 보조식품과는 다른 성상이다. 그런 식품은 사망률을 증가시키는데, 아마 필수적인 방어 기제에 영향을 미침으로써 사망을 유발하는 것 같다.
H2는 유력한 항산화제로 많은 장점을 갖는다. 우선, 그것은 살아있는 세포들에 있는 *OH를 효과적으로 중화시키고, 세포 소기관들을 성공적으로 표적으로 삼을 수 없는 대부분의 알려져 있는 항산화제와는 달리, 다음과 같은 유리한 확산 특성을 갖고 있다.
즉, H2는 생체의 세포막들에 침투하고, 세포기질, 미토콘드리아와 핵까지 확산될 수 있다.
H2의 적당한 환원활동에도 불구하고, H2의 빠른 가스성 확산은 세포에 손상을 주는 라디칼을 환원시키는데 H2를 고도로 효과적인 것으로 만들 수도 있다.
수소가 핵의 DNA와 미토콘드리아를 보호하는 능력은 곧 H2가 생활스타일과 관련된 질병과 암의 발병 위험을 줄일 수 있음을 시사한다.
H2는 산화 스트레스를 뚜렷이 줄이고 또 허혈과 재관류로 빚어진 뇌 손상을 현저하게 억제했다. H2 가스의 흡입은 현재 뇌경색용으로 승인받은 치료제보다 효능이 컸고, 나아가 허혈과 재관류로 빚어진 간의 손상을 완화시켰다(후쿠다, 에스에이, 야마모토, 등 미공개 데이터).
이런 연구결과는 곧 H2의 유익한 효과가 대뇌 손상에 고유한 것이 아니라 다른 장기의 손상에 대해서도 활용될 수 있음을 보여준다.
이번 연구에 의하면, H2는 *OH를 청소하여 세포와 조직을 강력한 산화 스트레스로부터 보호하는 것으로 입증됐다. 그러나 여전히 가능한 사실이란, H2 역시 살아있는 세포에 있는 다른 강력한 활성산소들을 직접 또는 간접적으로 줄임으로써 스트레스로부터 보호한다는 것이다. 이를테면, H2는 세포를 보호하는 인자들을 유도할 수도 있다. 그러나 우리는 세포의 보호나 환원과 관련되어 있는 몇 개 유전자의 발현에서 H2로 유발된 변화를 일체 찾아내지 못했다.
후속 연구는 H2가 산화 스트레스가 세포와 조직을 보호하는 기제를 밝혀낼 것이다.
심각한 산화 스트레스는 몇 개의 요인들로 빚어질 수 있다 이를테면, 염증, 집중적인 운동, 심장 경색, 혈액 흐름의 중지와 장기 이식 등이 그것이다. 치료를 위해서는, 소금물에 용해되어 있는 H2가 혈관 안으로 쉽게 전달될 수 있을 것이다. 예방을 위해서는, 물에 포화되어 있는 H2가 투입될 수 있을 것이다. H2의 흡입은 이미 다이빙 선수들에서 감압 질병의 예방에서 활용되고 있고, 좋은 안전성 특징을 입증했다. 주목되는 점으로, H2는 대기 중 4.7% 이하의 농도에서는 인화성이나 폭발 위험성이 일체 없다는 점이다. 우리는 제안하건대, H2는 가장 잘 알려져 있는 분자들 중 하나로, 의료적인 응용분야에 안전하고도 효과적인 항산화제로 널리 활용될 수 있으면서도 부작용은 거의 없다는 점을 주장하고자 한다.
연구방법들
수소와 산소 측정. 우리는 수소전극(ABLE)과 산소전극(스트라트켈빈 인스트루먼츠)을 이용해 용액에 용해된 분자 수소(H2)와 산소(이산소, O2)를 각각 측정했다. 우리는 가스 크로마토그래피(chromatography: 색층분석 : 테라멕스 사 제품)로 수소 가스농도를 결정했다. 혈액 내 H2 수치를 측정하고자, 우리는 혈액 응고를 피하기 위해 헤파린으로 쥐를 전 처리하고, 시험관에다 동맥과 정맥 혈액(각각 5 밀리리터)을 수집하고, 즉시 그런 혈액 표본을 30 밀리리터의 공기를 보관하는 폐쇄된 알루미늄 백에다 주사했다. H2 가스가 혈액으로부터 공기로 완전히 이전된 후, 우리는 H2의 양을 측정하기 위해, 표준적인 H2 가스를 이용해, 20밀리리터의 공기를 가스 색층 분석기에다 두었다.
배양된 세포의 수소처리. 2시간에 걸쳐, 우리는 0.4 MPa 압력 하에서 DMEM(Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium : Dulbeco는 노벨상 수상자)매질에다 포화 수치 이상으로 H2를 용해시켰다. O2가스를 포화수치(42.5 mg/l)로 거품화시켜 O2를 제2의 매질에다 용해시키고 또 CO2가스를 거품화시켜 제3의 매질에다 CO2를 용해시켰다. 이런 3대 매질은 모두 대기압에서 유지됐다. 이어 우리는 3개 매질(H2 매질; O2 매질; CO2 매질)을 75% : 20% : 5%(vol/vol/vol의 비율로 통합시키고 1%의 최종 농도를 달성하고자 소태아혈청(fetal bovine serum 송아지 혈청: FBS)을 첨가했다. 배양을 위해 우리는 통합된 매질을 배양 플라스크에 두고 즉시 H2나 O2 전극으로 H2나 O2 농도를 검사했다. 이어 우리는 배양 플라스크를 75%의 H2, 20%의 O2, 그리고 5%의 CO2(vol/vol/vol)로 구성되는 배합된 가스로 채우고 폐쇄된 배양 플라스크에서 세포를 배양했다. 매질을 흔들어 H2가 없는 가스가 제거된 매질을 마련했다. 매질은 4시간 동안 개방된 용기에서 H2로 포화되어 있었고, H2의 농도를 수소 전극으로 점검했다. H2의 용량에 따르는 실험에서(결과는 그림 2f에 있다), 우리는 5%의 CO2를 함유하는 공기로 평형이 유지된 1%의 FBS를 함유하는 제4의 매질로 통합된 매질을 희석시켰다. 목적은 소정 농도의 H2를 얻고자 함이었다. 이어 우리는 5%의 CO2를 함유하는 가스로 희석된 혼합된 가스로 배양 플라스크를 채웠다.
안티마이신 A와 메나디온에 의한 산화 스트레스의 유도. 우리는 위에서 설명한 대로 혼합된 가스로 채워진 폐쇄된 플라스크에서 0.6mM H2가 있는 경우와 없는 경우 1%의 FBS를 함유하는 DMEM 매질에서 섭씨 37에서 PC12 세포를 유지했다. 세포를 메나디온이나 안티마이신 A로 처리했다. 이들은 미토콘드리아의 전자 수송 체인의 복합체 I이나 복합체 III를 각각 억제하고, 이어 (전자의 누출을 가속시켜) *OH을 생산한다. 안티마이신 A에 24시간 노출시킨 후 우리는 형광 현미경을 이용해, 1 μM 프로피디움 이오다인(죽은 세포는 핑크로 표시된다)과 5 μM 획스트 33342(죽은 세포와 살아있는 세포는 청색으로 표시된다)로 이중 착색된 세포를 수작업으로 계산해 세포의 생존을 평가했다. 미토콘드리아에 대한 H2의 보호적인 효과를 검사하고자, 우리는 세포에 4.5 g/l의 2-디옥시-디-포도당(당분해의 억제제)과 1mM 피루빈산염(산화성 인산화 반응의 기반층)을 30분간 침투시키고, 이들을 0.6 mM H2가 있는 경우나 없는 경우의 안티마이신 A에다 노출시키고 이어 세포 ATP 측정 키트(도요-비-네트)를 이용해 세포 ATP 수치를 정량화했다.
대뇌 경색 모델. 동물규칙은 일본 의과대학원의 동물보호와 이용위원회의 승인을 받았다. 우리는 질소산화물과 산소의 혼합물(70% 대 30%, vol/vol)에서 할로테인(유도용 4%, 유지용 1%)으로 수컷 스프레이그-도올리 쥐(체중, 250-300 그램)를 마취시켰다. 직장내에 온도계 탐침과 연결되어 있는 온도가 자동 조절되는 난방 담요를 이용해 온도를 섭씨 37.5 ± 0.5로 유지시켰고, 동시에 생리 변수들을 감시했다(꼬리 동맥에 카눌라를 이용함). 그런 변수들에는 혈중 가스(pCO2와 pO2), pH, 포도당 수치와 혈압 등이 들어있다. 우리는 할로테인과 N2O 대 O2 비율의 양을 조절해 pH와 pO2의 일정한 수치를 유지하려고 했다. 또 좌측 중 대뇌동맥(MCA)의 체내강 폐색을 실행해 초점이 되는 허혈을 만들었는데, 방법은 앞서 설명한 것처럼 끝이 둥근 모양의 나일론 모노필라멘트와 말단실리콘 고무 실린더를 이용했다. 쥐들은 90분간 MCA 폐색을 겪고 이어 30분간 재관류를 받았다. 이들은 그림 5d,e에 대응하는 실험을 제외하고는 전체 작용 중 H2 가스를 흡입했다. 우리는 쥐들을 에다라본과 FK506의 최대 효과적인 농도로 처리했다 쥐들이 마취로부터 회복된 후 이들은 섭씨 23도로 유지됐다.
MCA 폐색 24시간 후, 우리는 마취상태의 뇌를 제거하고 이들을 6개의 관상형의 서열적인 분편으로 조각을 냈다(두께는 2밀리미터). 이런 분편들을 2, 3, 5-트리페닐에트라졸리움 염화물(TTC)(3%)로 착색됐고, 이어 광학 해부기기 영상분석 시스템(맥 스코우프, 미츠야 쇼지)을 이용해 경색과 비경색 구역을 측정했다. 경색과 비경색 조직 사이에는 경계선을 그었고, 동측(同側)반구의 비손상 구역을 대측성 측면의 구역으로부터 차감해 경색 구역을 얻었다. 경색의 체적은 경색 구역 x 두께로 계산했다. MCA 폐색 12시간 후, 우리는 마취상태의 뇌를 제거하고, 이들을 10%의 포르말린으로 고정시켰다. 파라핀이 내장된 뇌를 일련의 6-μM 분편으로 조각냈고, 분편을 헤마톡실린과 에오신(H&E)로 착색했다. 이어 핑크 구역을 그래픽 분석장치(맥 스코프)로 정량화했다. 면역 착색작용을 위해, 우리는 그런 분편들을 기기납품업체의 지시문에 따라 벡타스테인 에이비씨 시약을 이용해 항체들로 착색했다.
통계 분석. 우리는 통계분석용으로는 스타트뷰(S) 소프트웨어(SAS 인스티튜트)를 이용했다. 개개의 비교를 위해, 우리는 양방형 스튜던트 검증방법(unpaired two-tailed Student's t-test)을 이용했다. 복수의 비교를 위해서는 분산분석(ANOVA)을 이용했고, 이어 피셔의 정밀 검사를 실시했다. 맹검 상태에서 정량화를 위해 실험을 실행했다. (참고 : 이 논문은 일본 정부의 후생성, 교육과학성 등의 자금지원을 받아 만들어졌다. 역자는 황홍선으로 과학논문의 전문번역자)
010-2383-6174 010-2641-1249