Re: 산화질소 signaling 2022년 Cell(영향력지수 45)

[문형철]

Nitric oxide (NO • ) is a ubiquitous molecular mediator in biology. Many signalling actions of NO •  generated by mammalian NO •  synthase (NOS) result from targeting of the haem moiety of soluble guanylate cyclase. Some pathogenic and environmental bacteria also produce a NOS that is evolutionary related to the mammalian enzymes, but a bacterial haem-containing receptor for endogenous enzymatically generated NO •  has not been identified previously. Here, we show that NOS of the human pathogen  Staphylococcus aureus , in concert with an NO • -metabolizing flavohaemoprotein, regulates electron transfer by targeting haem-containing cytochrome oxidases under microaerobic conditions to maintain membrane bioenergetics. This process is essential for staphylococcal nasal colonization and resistance to the membrane-targeting antibiotic daptomycin and demonstrates the conservation of NOS-derived NO • -haem receptor signalling between bacteria and mammals. 산화질소(NO•)는 생물학에서 어디에나 존재하는 분자 매개체입니다. 포유류 NO• 합성효소(NOS)에 의해 생성된 NO•의 많은 신호 작용은 수용성 구아닐레이트 사이클라제의 헴 부분의 표적화에서 비롯됩니다. 일부 병원성 및 환경성 박테리아도 포유류 효소와 진화적으로 관련된 NOS를 생산하지만, 내인성 효소 생성 NO•에 대한 박테리아 헴 함유 수용체는 이전에 확인된 적이 없습니다. 여기에서는 인간 병원균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 NOS가 NO•-metabolizing flavohaemoprotein과 함께 미세호기성 조건에서 haem을 함유한 사이토크롬 산화효소를 표적으로 삼아 전자 전달을 조절함으로써 막 생체 에너지를 유지한다는 것을 보여줍니다. 이 과정은 포도상구균의 코 점막 내 집락화와 막 표적 항생제인 답토마이신에 대한 내성을 위해 필수적이며, 박테리아와 포유류 사이에서 NOS에서 유래된 NO•-haem 수용체 신호 전달의 보존을 보여줍니다.

Summary

The surprising discovery that the diatomic gas nitric oxide (NO) is generated by mammalian cells and serves to regulate a multitude of physiological processes has continued to fascinate biologists for almost four decades. The biochemistry of NO is complex, and novel insights into the control of NO biosynthesis and mechanisms of signal transduction are continuously emerging. NO is a key regulator of cardiovascular function, metabolism, neurotransmission, immunity, and more, and aberrant NO signaling is a central feature of many major disorders including cardiovascular disease, diabetes, and cancer. Here, we discuss the basics of NO biology emphasizing recent advances in the field including novel means of increasing NO bioactivity with therapeutic and nutritional implications.

요약

이산화질소(NO)가

포유류 세포에서 생성되어

다양한 생리학적 과정을 조절하는 데 사용된다는 놀라운 발견은

거의 40년 동안 생물학자들을 매료시키고 있습니다.

NO의 생화학은 복잡하며,

NO 생합성 조절과 신호 전달 메커니즘에 대한

새로운 통찰이 지속적으로 등장하고 있습니다.

NO는

심혈관 기능, 신진대사, 신경 전달, 면역 등

다양한 기능의 핵심 조절 물질이며,

NO 신호 전달의 이상은

심혈관 질환, 당뇨병, 암 등

여러 주요 질환의 핵심 특징입니다.

여기서는

NO 생물학의 기초에 대해 논의하고,

치료 및 영양적 의미를 지닌 NO 생체 활성을 증가시키는 새로운 방법을 포함하여

이 분야의 최근 발전에 대해 강조합니다.

Introduction and historical context

Nitric oxide (NO) is an ancient messenger. In fact, NO generated by lightning when earth was anoxic has been suggested as a crucial factor to the origin of life itself (Santana et al., 2017; Wong et al., 2017). Nitrogen is essential for life, but the abundant atmospheric N2 cannot be utilized by organisms unless it is first reduced or oxidized, and NO has been proposed as one of the major sources of utilizable nitrogen in the primitive earth. Later, bacteria and plants started to synthesize NO via nitrate (NO3−) and nitrite (NO2−) reductases; NO is an obligate intermediate in the denitrification part of the nitrogen cycle and can be utilized as an electron acceptor for respiration in the absence of oxygen (Lundberg et al., 2004). The discovery of NO as a secretory product of mammalian cells took much longer. Nevertheless, in the mid-80s, the intense search for the elusive nature of an endogenous vasodilator termed endothelium-derived relaxing factor (EDRF) (Furchgott and Zawadzki, 1980) came to an end when this labile mediator turned out to be NO (Palmer et al., 1987; Ignarro et al., 1987). The identification of EDRF as NO was facilitated by the earlier finding that nitroglycerine, an old vasoactive drug used to treat angina pectoris, acts through the release of NO and activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) (Arnold et al., 1977; Katsuki et al., 1977).

In sharp contrast to bacteria, mammalian cells use molecular oxygen for generation of NO with the nitrogen source being L-arginine (Hibbs et al., 1988; Palmer et al., 1988). The reaction is catalyzed by specific oxidoreductases, the NO synthases of which three isoforms exist (Bredt et al., 1991; Geller et al., 1993; Janssens et al., 1992). The discovery of mammalian NO synthesis started an avalanche of research rapidly unraveling the ubiquitous nature of NO signaling and its vast impact on physiological processes ranging from vasodilation and platelet function to neurotransmission, penile erection, immunity, and control of metabolic function. In addition to the oxygen-dependent NO synthases, a reminiscence of the nitrogen cycle described above is found also in mammals (Benjamin et al., 1994; Lundberg et al., 1994b). Through this cycle, NO and chemically related bioactive nitrogen oxides are formed in a process dependent on commensal bacteria (Lundberg et al., 2008). The biochemistry of NO is intriguingly complex, and this free radical gas mediates its effects either through direct interaction with its cellular targets or through the formation of other reactive nitrogen oxide species, some of which have signaling properties in their own right. Even to this day, many questions remain regarding control of NO biosynthesis and transduction of NO bioactivity. In this review, we discuss the basics of NO biology and highlight recent advances and controversies in our understanding of the molecular mechanisms that govern NO signaling in health and disease, expanding the scope to include novel therapeutic opportunities.

소개 및 역사적 맥락

산화질소(NO)는

고대부터 존재해 온 메신저입니다.

 ancient messenger

사실,

지구가 산소가 없는 상태에서 번개에 의해 생성된 NO가

생명체 자체의 기원에 중요한 요소로 제시된 바 있습니다(Santana et al., 2017; Wong et al., 2017).

질소는 생명체에 필수적이지만,

풍부한 대기 중의 N2는

먼저 환원 또는 산화되지 않으면 유기체에 의해 활용될 수 없습니다.

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5295087/

그리고

NO는

원시 지구에서 활용 가능한 질소의 주요 공급원 중 하나로 제시되었습니다.

나중에 박테리아와 식물은

질산염(NO3-)과 아질산염(NO2-) 환원효소를 통해

NO를 합성하기 시작했습니다.

NO는

질소 순환의 탈질화 과정에서 필수적인 중간 물질이며,

산소가 없는 상태에서 호흡을 위한 전자 수용체로 활용될 수 있습니다(Lundberg et al., 2004).

포유류 세포의 분비 산물로서

NO가 발견되기까지는

훨씬 더 오랜 시간이 걸렸습니다.

그럼에도 불구하고,

80년대 중반, 내피유래이완인자(EDRF)라고 불리는

내인성 혈관 확장제의 본질에 대한 강렬한 탐색은

이 불안정한 매개체가 NO로 밝혀지면서 끝을 맺었습니다

(Furchgott and Zawadzki, 1980; Palmer et al., 1987; Ignarro et al., 1987).

내피세포 유래 이완 인자(EDRF)는 일부 혈관 확장제의 작용을 매개하는 불안정한 체액성 물질입니다. 산화질소(NO)를 방출하여 작용할 수 있는 니트로바소디레이터는 EDRF의 효과를 모방하며, 최근 Furchgott1에 의해 EDRF가 NO일 수 있다는 주장이 제기되었습니다. 우리는 배양된 내피세포에서 EDRF와 NO의 방출을 연구함으로써 이 주장을 조사했습니다. NO는 오존2과의 반응의 화학 발광 생성물로 결정되었습니다. EDRF와 NO의 생물학적 활성은 생물학적 분석3으로 측정되었습니다. EDRF에 의해 유발된 생물학적 분석 조직의 이완은 NO에 의해 유발된 것과 구별할 수 없었습니다. 두 물질 모두 똑같이 불안정했습니다. 브래디키닌은 EDRF의 생물학적 활성을 설명하기에 충분한 양의 NO를 농도 의존적으로 세포에서 방출시켰습니다. EDRF와 NO에 의해 유발된 이완은 헤모글로빈에 의해 억제되었고, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제에 의해 비슷한 정도로 강화되었습니다. 따라서 내피 세포에서 방출된 NO는 생물학적 활성, 안정성, 억제제 및 촉진제에 대한 민감성 측면에서 EDRF와 구별할 수 없습니다. 우리는 EDRF와 NO가 동일하다고 생각합니다.

EDRF를 NO로 확인하는 데는 협심증 치료에 사용되는 오래된 혈관 활성 약물인 니트로글리세린이 NO의 방출과 수용성 구아닐릴 사이클라제의 활성화(sGC)를 통해 작용한다는 이전의 발견이 도움이 되었습니다(Arnold et al., 1977; Katsuki et al., 1977).

박테리아와 극명한 대조를 이루는

포유류 세포는

분자 산소를 이용하여 NO를 생성하며,

질소 공급원은 L-아르기닌입니다(Hibbs et al., 1988; Palmer et al., 1988).

https://www.mdpi.com/1422-0067/22/1/56

기능성 아미노산(AA)인 L-아르기닌(Arg)은 단백질의 구성 요소일 뿐 아니라 포유류(인간 포함)의 산화질소(NO), 크레아틴, 폴리아민, 호모아르기닌, 아그마틴 합성에 필수적인 기질로도 사용됩니다. NO(주요 혈관 확장제)는 조직으로의 혈류를 증가시킵니다. 아르기닌과 그 대사 산물은 신진대사와 생리학에서 중요한 역할을 합니다. 아르기닌은 암모니아를 해독하기 위해 요소 순환을 활성 상태로 유지하는 데 필요합니다. 이 AA는 또한 포유류에서 세포 기계적 타겟인 라파마이신(MTOR)과 초점 부착 키나제 세포 신호 전달 경로를 활성화하여, 단백질 합성을 촉진하고, 자가포식 및 단백질 분해를 억제하며, 세포 이동과 상처 치유를 강화하고, 정자 형성 및 정자의 질을 향상시키고, 태아의 생존과 성장을 개선하고, 모유 단백질 생성을 증가시킵니다. 인간에서 아르기닌은 글루타민/글루타메이트와 프롤린으로부터 처음부터 형성되지만, 이러한 합성 경로로는 유아나 성인의 아르기닌을 충분히 공급할 수 없습니다. 따라서 인간과 다른 동물들은 최적의 성장, 발달, 수유, 생식 능력을 위해 아르기닌을 섭취해야 합니다. 많은 증거에 따르면, 생리적 범위 내에서 아르기닌을 경구 투여하면 NO 합성을 증가시켜 조직(예: 골격근과 음경의 해면체)의 혈류를 증가시켜 남녀 모두에게 건강상의 이점을 제공할 수 있습니다. NO는 혈관 확장제, 신경 전달 물질, 영양 대사 조절제, 박테리아, 곰팡이, 기생충, 바이러스(SARS-CoV 및 SARS-CoV-2(COVID-19를 유발하는 바이러스)를 포함한 코로나바이러스 포함)의 살해제입니다. 따라서 아르기닌 보충제는 면역력, 항감염 및 항산화 반응, 생식력, 상처 치유, 암모니아 해독, 영양소 소화 및 흡수, 제지방 조직량, 갈색 지방 조직 발달을 향상시킬 수 있습니다. 또한 대사 증후군(이상지질혈증, 비만, 당뇨병, 고혈압 포함)을 개선하고, 발기 부전, 겸상 적혈구 빈혈, 근이영양증, 자간전증 환자를 치료할 수 있습니다.

https://kr.iherb.com/pr/doctor-s-best-pure-l-arginine-powder-10-6-oz-300-g/63469

이 반응은

특정 산화 환원 효소에 의해 촉매 작용을 받는데,

그 중 세 가지 이소형이 존재하는 NO 합성 효소(Bredt et al., 1991; Geller et al., 1993; Janssens et al., 1992)가

그 역할을 합니다.

NO synthases

산화질소 합성효소(EC 1.14.13.39) (NOSs)는

L-아르기닌으로부터 산화질소(NO)의 생성을 촉진하는

효소의 일종입니다.

NO는

중요한 세포 신호 전달 물질입니다.

혈관 긴장도,

인슐린 분비,

기도 긴장도,

연동 운동 조절에 관여하며,

혈관 신생과

신경 발달에 관여합니다.

역행성 신경 전달 물질로 작용할 수 있습니다.

산화질소는

포유류에서 칼슘-칼모둘린에 의해 조절되는

동종효소 eNOS(내피 NOS)와 nNOS(신경성 NOS)에 의해 매개됩니다.[2]

면역 반응에 관여하는 유도성 동종효소 iNOS는

생리학적으로 적절한 농도에서 칼모둘린에 결합하고,

NO가 짝을 이루지 않은 전자를 가진 자유 라디칼이기 때문에

면역 방어 메커니즘으로 NO를 생성합니다.

이것은

패혈성 쇼크의 직접적인 원인이며,

자가면역 질환에서 기능할 수 있습니다.

NOS는 반응을 촉진합니다:[3]

• 2 L-arginine + 3 NADPH + 3 H+ + 4 O2 2 citrulline +2 nitric oxide + 4 H2O + 3 NADP+

NOS의 이소형은 NADPH를 희생하여 superoxide를 생성하는 것과 같은 다른 누출 및 부반응을 촉진합니다.

따라서, 이 화학량론은 일반적으로 관찰되지 않으며, NADPH에 의해 NO당 공급되는 3개의 전자를 반영합니다.

진핵생물 NOS 이소효소는

촉매 작용을 통해 스스로를 자급자족합니다.

전자 흐름은 NADPH → FAD → FMN → 헴 → O2입니다.

테트라하이드로비오테린은 촉매 작용 사이클 동안 추가적인 전자를 제공하며,

이 전자는 전환 과정에서 대체됩니다.

아연은 보조 인자는 아니지만

구조적 요소로서 참여합니다.[4]

NOS는

5개의 보조 인자를 사용한다는 점에서 독특하며,

플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD),

플라빈 모노뉴클레오티드(FMN),

헴,

테트라하이드로비오테린(BH4),

칼모둘린을 결합하는 유일한 효소입니다.[citation needed]

산화질소 합성효소(NOS)는 헴 기반의 단일 산소화 효소 heme-based monooxygenases 로, L-아르기닌을 고등 생물의 신호 전달 분자이자 세포 독성 물질인 산화질소(NO)로 산화시킵니다. NOS와 유사한 활동이 많은 박테리아에서 보고되었지만, 현재까지 포유류 NOS(mNOS)의 박테리아 동족체 중 몇 개만이 특성화되었습니다. 촉매 및 환원효소 도메인을 모두 보유한 mNOS와는 달리, 박테리아 효소는 환원효소 도메인이 없고 NO를 생성하기 위해 적절한 환원제를 공급해야 합니다. 주목할 만한 예외는 새로운 유형의 환원효소 모듈을 포함하는 그람 음성 박테리아의 NOS입니다. 놀랍게도, 박테리아 NOS는 mNOS와는 다른 기능을 가지고 있는 것으로 보입니다. 예를 들어, 다른 대사 산물의 질화 작용과 산화 스트레스에 대한 보호 작용이 그것입니다. 박테리아 NOS에 대한 연구는 아마도 NO 합성 메커니즘에 대한 이해를 높이고 미생물에서 NO의 다양한 새로운 기능을 밝혀낼 것입니다.

포유류에서 NO 합성이 발견되면서,

NO 신호가 어디에나 존재한다는 사실과

혈관 확장, 혈소판 기능, 신경 전달, 음경 발기, 면역, 대사 기능 조절에 미치는

광범위한 영향에 대한 연구가 급증하기 시작했습니다.

산소 의존성 NO 합성 효소 외에도, 위에서 설명한 질소 순환의 기억은 포유류에서도 발견됩니다(Benjamin et al., 1994; Lundberg et al., 1994b).

이 과정을 통해

공생 박테리아에 의존하는 과정에서

NO와 화학적으로 관련된 생체 활성 질소 산화물이 형성됩니다(Lundberg et al., 2008).

NO의 생화학은 흥미롭게도 복잡하며,

이 자유 라디칼 가스는 세포에 직접 상호 작용하거나

다른 반응성 질소 산화물 종의 형성을 통해 그 효과를 전달하며,

그 중 일부는 그 자체로 신호 전달 특성을 가지고 있습니다.

오늘날까지도

NO 생합성 조절과 NO 생체 활성 전달에 관한

많은 의문점이 남아 있습니다.

이 리뷰에서는

NO 생물학의 기초에 대해 논의하고,

건강과 질병에서 NO 신호를 조절하는 분자 메커니즘에 대한 최근의 발전과 논란을 강조하고,

새로운 치료 기회를 포함하도록 범위를 확장합니다.

NO biosynthesis and cellular mechanisms

NO synthase

In mammals, nitric oxide synthase (NOS) exists in three isoforms, all of which generate NO and L-citrulline from L-arginine, molecular oxygen, and NADPH (Figure 1).

NO 생합성 및 세포 메커니즘

NO 합성효소

포유류에서 산화질소 합성효소(NOS)는

세 가지 이소형으로 존재하며,

이 세 가지 모두 L-아르기닌, 분자 산소, NADPH로부터

NO와 L-시트룰린을 생성합니다(그림 1).

sGC = soluble guanylate cyclase

NOS is a homodimeric heme-containing enzyme with an N-terminal oxygenase domain linked via a calmodulin (CaM)-binding sequence to a C-terminal reductase domain (Stuehr, 1997). Electrons from NADPH flow through the reductase domain aided by two co-factors FAD and FMN and then pass over to the oxygenase domain in a process that requires the binding of CaM to the mid-section of the enzyme (Stuehr, 1997). The final destination of these electrons is heme iron in the oxygenase domain that is reduced, thereby enabling binding of O2 to start the biosynthesis of NO. Tetrahydrobiopterine (BH4) is the second cofactor in the oxygenase domain. Its role seems to be to act as both a one-electron reductant and later in the catalytic cycle as an oxidant during the two-step oxidation of L-arginine (Stuehr and Haque, 2019). Donation of an electron from BH4 to the heme-bound oxygen results in activation of O2 enabling reaction with arginine and the intermediate N(G)-Hydroxy-L-arginine (NOHA). Ultimately, when NOHA is oxidized, a ferric heme-NO species is formed that can release NO. How free NO is released from the ferric heme is still not entirely clear although direct measurements of NOS-derived NO gas in the airways or intestines clearly shows that it can occur (Lundberg et al., 1997b). An interesting recent hypothesis suggests that the entire heme-NO complex is released from NOS rather than free NO and then functions as a signaling entity in its own right through insertion at the heme-binding site of sGC (Kleschyov, 2017) (Box 1).

Although there is still an insufficient amount of data available, partial support for this theory was presented recently with the demonstration that NOS-derived NO finds heme in the cytosol, binds to it and then the entire heme-NO complex is carried to sGC to trigger its assembly and activation (Dai et al., 2022). The main on-off switch for eNOS is binding of CaM to the enzyme which is regulated by changes in intracellular calcium fluxes and any agent capable of mobilizing intracellular calcium, including acetylcholine as classically used by Furchgott (Furchgott and Zawadzki, 1980), would in principle be able to activate eNOS provided that CaM is activated. The sensitivity of CaM toward eNOS can be additionally regulated by heat shock protein 90 (Brouet et al., 2001). Direct in vivo evidence for agonist-induced activation of eNOS comes from measurements of authentic NO gas in exhaled breath of pigs and humans after i.v. administration of various vasoactive drugs (Malmström et al., 2003). A dose-dependent and L-NAME-inhibitable release of exhaled NO, originating from the pulmonary endothelium, was observed for acetylcholine (ACh), bradykinin, and other eNOS activating compounds. Although overwhelming evidence exists for eNOS activation by the above vasoactive compounds, their true role in physiological regulation of NO signaling in the vasculature is less clear. Phosphorylation represents an important means of eNOS regulation and occurs at least at 7 different sites, 4 of which are stimulatory and 3 inhibitory. Protein kinase B (Akt) was described early to phosphorylate a serine (S1177 in humans and S1176 in rodents) on eNOS to activate it (Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999). Later studies have identified a number of other kinases including AMPK and protein kinase A, G, and C that can phosphorylate this and other sites (Garcia and Sessa, 2019). The role of Akt-stimulated eNOS regulation in vivo has been confirmed using a variety of mutant mice. As an example, mice in which serine 1176 on eNOS is replaced with an alanine, making it nonresponsive, exhibit reduced endothelial-dependent vasodilatation, increased blood pressure, insulin resistance and increased weight, i.e., a similar phenotype as the global eNOS KO (Atochin et al., 2007; Kashiwagi et al., 2013).

NOS는

N-말단 산소화 효소 도메인과 C-말단 환원효소 도메인(Stuehr, 1997)을

칼모둘린(CaM) 결합 서열로 연결한

동종 이량체 헴 함유 효소입니다.

NADPH의 전자는

두 가지 보조인자 FAD와 FMN의 도움을 받아 환원효소 도메인을 통과한 다음,

효소의 중간 부분에 CaM이 결합하는 과정을 거쳐

산소화 효소 도메인으로 전달됩니다(Stuehr, 1997).

이 전자들이 최종적으로 도달하는 곳은

산소화 효소 영역의 헴 철입니다.

이 철은 환원되어

O2와 결합함으로써

NO 생합성을 시작할 수 있게 합니다.

테트라하이드로비오프테린(BH4)은

산소화 효소 영역의 두 번째 보조인자입니다.

이것의 역할은

L-아르기닌의 2단계 산화 과정에서

1전자 환원제 역할을 하는 동시에

촉매 사이클의 후반부에 산화제 역할을 하는 것으로 보입니다(Stuehr and Haque, 2019).

BH4에서 헴 결합 산소로 전자가 이동하면

O2가 활성화되어

아르기닌과 중간 물질인 N(G)-Hydroxy-L-arginine(NOHA)과의 반응이 가능해집니다.

궁극적으로

NOHA가 산화되면,

NO를 방출할 수 있는 제2철 헴-NO 종이 형성됩니다.

기도나 장에서 NOS에서 유래된 NO 가스의 직접 측정이

명확하게 발생한다는 것을 보여주고 있지만,

제2철 헴으로부터 얼마나 많은 자유 NO가 방출되는지는

아직 완전히 밝혀지지 않았습니다(Lundberg et al., 1997b).

흥미로운 최근 가설에 따르면,

전체 헴-NO 복합체는

유리 NO가 아니라 NOS로부터 방출된 후

sGC의 헴 결합 부위에 삽입되어

그 자체로 신호 전달체 역할을 한다고 합니다(Kleschyov, 2017) (박스 1).

아직 이용 가능한 데이터가 충분하지는 않지만,

최근 NOS에서 유래된 NO가 세포질에서 헴을 발견하고 결합한 다음,

전체 헴-NO 복합체가 sGC로 운반되어

그 조립과 활성화를 촉발한다는 것을 증명함으로써

이 이론에 대한 부분적인 지지가 제시되었습니다(Dai et al., 2022).

eNOS의 주요 온-오프 스위치는

CaM이 효소에 결합하는 것입니다.

이 효소는

세포 내 칼슘 플럭스의 변화와

세포 내 칼슘을 동원할 수 있는 모든 작용제에 의해 조절됩니다.

여기에는

Furchgott가 전통적으로 사용했던 아세틸콜린(Furchgott and Zawadzki, 1980)을 포함하여,

CaM이 활성화되어 있다면 원칙적으로 eNOS를 활성화할 수 있는 모든 작용제가 포함됩니다.

CaM의 eNOS에 대한 민감도는

열 충격 단백질 90(heat shock protein 90)에 의해

추가로 조절될 수 있습니다(Brouet et al., 2001).

eNOS의 작용제 유발 활성화에 대한 직접적인 생체 내 증거는

다양한 혈관 활성 약물의 정맥 투여 후 돼지와 인간의 내쉬는 숨에서

실제 NO 가스를 측정함으로써 얻을 수 있습니다(Malmström et al., 2003).

폐 내피에서 유래된

아세틸콜린(ACh),

브라디키닌, 그리고

다른 eNOS 활성화 화합물에서 용량 의존적이고

L-NAME에 의해 억제 가능한 호기성 NO 방출이 관찰되었습니다.

위의 혈관 활성 화합물에 의한 eNOS 활성화에 대한 압도적인 증거가 존재하지만,

혈관계에서 NO 신호의 생리적 조절에 있어서

이들의 진정한 역할은 명확하지 않습니다.

인산화는

eNOS 조절의 중요한 수단이며,

적어도 7개의 다른 부위에서 발생하며,

그 중 4개는 자극적이고 3개는 억제적입니다.

단백질 키나아제 B(Akt)는

eNOS의 세린(인간에서는 S1177, 설치류에서는 S1176)을

인산화하여 활성화시키는 것으로 일찍부터 설명되어 왔습니다(Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999).

이후의 연구에서

AMPK와 단백질 키나아제 A, G, C를 포함한 여러 다른 키나아제가

이 부위와 다른 부위에 인산화 작용을 할 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다(Garcia and Sessa, 2019).

다양한 돌연변이 마우스를 사용하여 생체 내 Akt에 의해 자극된 eNOS 조절의 역할이 확인되었습니다.

예를 들어,

eNOS의 세린 1176이 알라닌으로 대체되어 반응하지 않는 마우스는

내피 의존성 혈관 확장이 감소하고,

혈압이 상승하며, 인슐린 저항성이 증가하고 체중이 증가하는 등,

전역 eNOS KO와 유사한 표현형을 나타냅니다(Atochin et al., 2007; Kashiwagi et al., 2013).

For the other phosphorylation sites, there is still no clear evidence of a physiologically relevant role in vivo. Importantly, the mere presence of eNOS phosphorylation is not necessarily coupled to a change in eNOS activity as assessed by modulation of sGC activity or vasoactivity. Examples are insulin and vascular endothelial growth factor (VEGF), which induce robust Akt-dependent phosphorylation of S1177 in endothelial cells but no appreciable cGMP formation or vasodilation (Eroglu et al., 2019; Fleming et al., 2003). A major physiological trigger of vascular eNOS activation is when hemodynamic forces put pressure on the vessel wall (Rubanyi et al., 1986) (Figure 2). This rapid and dynamic shear stress-induced activation of eNOS is mediated by PIEZO1 in endothelial cells (Wang et al., 2016). Activation of this mechanosensitive anion channel triggers ATP release and activation of the Gq/11/ P2Y2 receptor complex (Wang et al., 2015) to initiate an intracellular cascade of events involving activation of Akt and another kinase PKN2 to phosphorylate eNOS at two sites (Jin et al., 2021). A recent report suggests that endothelial PIEZO1 is important also for normal expression‎ of eNOS and in sustaining muscle capillary density (Bartoli et al., 2022). An illustrative example of rapid shear stress-induced NO signaling in vivo is flow-mediated dilatation, a method used in clinical research to eval‎uate endothelial function where the diameter of an artery is measured with ultrasound before and after a brief period of occlusion. The normal increase in vessel diameter in response to release of the occlusion is attenuated after pretreating with a NOS inhibitor in humans (Joannides et al., 1995) and in global as well as in endothelium-specific eNOS KO mice (Leo et al., 2021).

The term constitutive is used frequently for eNOS and nNOS as transcriptional regulation was initially thought to be of minor significance. Gene expression‎ of eNOS can however be induced in various ways of which sustained vascular shear stress likely is of considerable importance physiologically (Sessa et al., 1994). Under these conditions, eNOS is involved in control of adaptive vascular and cardiac remodeling responses (Rudic et al., 1998). Other signaling mediators shown to induce eNOS include TGFB, VEGF-A, and hydrogen peroxide, whereas proinflammatory agents, such as TNFα and LPS, can downregulate eNOS expression‎ (Garcia and Sessa, 2019) but simultaneously induce expression‎ of the third NOS isoform, inducible NOS (iNOS). The subcellular localization of eNOS is important for its activity and control of signaling. It can undergo fatty acylation at the N-terminal site by myristic and palmitic acid, which helps to anchor the enzyme to biological membranes (Busconi and Michel, 1993; Feron et al., 1998) and possibly allowing for more targeted release of NO. A prominent localization of eNOS is inside caveolae, which are typical small invaginations of the endothelial cell membrane. These invaginations are critically dependent on Cav-1, a protein shown to be co-localized with eNOS (Feron et al., 1996). Overall, this eNOS/Cav-1 connection serves to dampen eNOS responses as illustrated in Cav-1 deficient mice whose vessels display enhanced endothelium-dependent relaxations (Drab et al., 2001).

다른 인산화 부위에 대해서는

생체 내 생리학적으로 관련된 역할에 대한 명확한 증거가 아직 없습니다.

중요한 것은,

eNOS 인산화 현상의 존재가

반드시 sGC 활동 또는 혈관 활동의 조절에 의해 평가되는

eNOS 활동의 변화와 반드시 연결되어 있지 않다는 것입니다.

예를 들면,

인슐린과 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 있는데,

이들은 내피 세포에서 S1177의 강력한 Akt 의존적 인산화를 유도하지만,

눈에 띄는 cGMP 형성이나 혈관 확장은 유도하지 않습니다(Eroglu et al., 2019; Fleming et al., 2003).

혈관 내피세포 내 eNOS 활성화의 주요 생리적 유발 요인은

혈류 역학적 힘이 혈관벽에 압력을 가할 때입니다(Rubanyi et al., 1986) (그림 2).

이러한

eNOS의 신속하고 동적인 전단 응력 유발 활성화는

내피세포의 PIEZO1에 의해 매개됩니다(Wang et al., 2016).

이 기계적 민감성 음이온 채널의 활성화는

ATP 방출과 Gq/11/P2Y2 수용체 복합체의 활성화를 촉발하여(Wang et al., 2015)

Akt와 다른 키나아제 PKN2의 활성화를 포함하는

세포 내 일련의 사건을 시작하여 두 위치에서 eNOS를 인산화합니다(Jin et al., 2021).

최근의 보고에 따르면

내피 PIEZO1은

eNOS의 정상적인 발현과 근육 모세혈관 밀도의 유지에도 중요하다고 합니다(Bartoli et al., 2022).

생체 내 빠른 전단 응력 유발 NO 신호 전달의 예시적인 사례는

혈류 매개 팽창입니다.

이 방법은 내피 기능을 평가하기 위해 임상 연구에서 사용되며, 짧은 시간 동안 혈관을 막은 후 초음파를 통해 동맥의 직경을 측정합니다. 폐색이 해제됨에 따라 혈관 직경이 정상적으로 증가하는 현상은 NOS 억제제를 투여한 인간(Joannides et al., 1995)과 전신 및 내피 특이적 eNOS KO 마우스(Leo et al., 2021)에서 전처리 후 감소합니다.

전사 조절이

처음에는 중요성이 작다고 여겨졌기 때문에

eNOS와 nNOS에 대해 구성적이라는 용어가 자주 사용되었습니다.

그러나

eNOS의 유전자 발현은

다양한 방식으로 유도될 수 있으며,

그 중에서도 지속적인 혈관 전단 응력이 생리학적으로 상당히 중요한 것으로 여겨집니다(Sessa et al., 1994).

이러한 조건에서 eNOS는

적응성 혈관 및 심장 리모델링 반응의 조절에 관여합니다(Rudic et al., 1998).

eNOS를 유도하는 것으로 밝혀진 다른 신호 전달 매개체로는

TGFB, VEGF-A, 과산화수소가 있으며,

TNFα와 LPS 같은 전염증성 물질은

eNOS 발현을 하향 조절할 수 있지만(Garcia and Sessa, 2019),

동시에 세 번째 NOS 이소폼인 유도성 NOS(iNOS)의 발현을 유도할 수 있습니다.

eNOS의 세포 내 국소화는

그 활동과 신호 전달의 조절에 중요합니다.

미리스틱산과 팔미트산에 의해 N-말단 부위에서 지방 아실화 반응을 겪을 수 있으며,

이는 효소를 생물학적 막에 고정시키는 데 도움이 됩니다(Busconi and Michel, 1993; Feron et al., 1998).

그리고 아마도

NO의 보다 표적화된 방출을 가능하게 할 수 있습니다.

eNOS의 두드러진 국소화는

내피 세포막의 전형적인 작은 돌출부인 소포체 내부에 있습니다.

이러한 침윤은

eNOS와 함께 국소화되는 것으로

밝혀진 단백질인 Cav-1에 크게 의존합니다(Feron et al., 1996).

전반적으로,

이 eNOS/Cav-1 연결은

Cav-1이 결핍된 마우스에서 혈관이 내피 의존성 이완을 강화하는 것으로 나타난 것처럼

eNOS 반응을 약화시키는 역할을 합니다(Drab et al., 2001).

A central dogma in NO signaling is that NO, being a tiny uncharged lipophilic gas, readily diffuses over cell membranes from one cell to another to reach its main target, soluble gyanylyl cyclase (sGC). NO then binds to the heme iron of sGC resulting in activation of the enzyme and generation of cGMP (A). Although widely accepted, there are still some outstanding questions surrounding this paradigm. How is the NO released from the heme iron of NOS where it is generated? How is specificity of NO signaling obtained given that NO diffuses randomly in all directions and should have many potential targets? How does the reactive NO radical survive scavenging by other reactive species on its journey to sGC in another cell?

A new paradigm for NOS signaling has been suggested recently. According to this hypothesis, free NO is not even needed because signaling is mediated by release of the entire mobile/exchangeable heme-NO complex from NOS rather than NO itself (B). While this concept still remains to be proven, there are indications both from early studies and from very recent work to support it. Studies from 1978 show that heme-NO activates sGC while heme inhibits the Apo (heme-free) enzyme. Also heme-NO binding to sGC is much stronger than for heme implying that this species can easily replace heme at sGC. Moreover, a recent study shows that NO binds to cytosolic heme attached to GAPDH and then with the help of Hsp90, this heme-NO complex is incorporated into heme-free sGC to activate it (Dai, 2022). In aggregate, heme-NO, a powerful activator of sGC, is formed already at NOS. Why would nature then choose to first decompose it into reactive NO and then reform it again at sGC if instead the entire complex could travel and bind to sGC? In contrast to free NO, the mobile NO-heme complex may be delivered more safely to its target and in a coordinated manner. Such NO-heme could contribute also to additional NOS/NO-related signaling including S-nitrosation.

NO 신호의 핵심 교리는

NO가 작은 무전하 친지방질성 기체이기 때문에

세포막을 통해 한 세포에서 다른 세포로 쉽게 확산되어

주요 표적인 수용성 사이클라제(sGC)에 도달한다는 것입니다.

tiny uncharged lipophilic gas

그런 다음 NO는

sGC의 헴 철에 결합하여 효소를 활성화하고

cGMP(A)를 생성합니다.

널리 받아들여지고 있지만, 이 패러다임에 대한 몇 가지 중요한 질문이 여전히 남아 있습니다.

NO는 NOS의 헴철에서 어떻게 생성되는 것일까요?

NO가 모든 방향으로 무작위로 확산되고 많은 잠재적 표적에 도달해야 한다는 점을 감안할 때,

NO 신호 전달의 특이성은 어떻게 확보될까요?

반응성 NO 라디칼은

다른 세포의 sGC로 이동하는 과정에서 다른 반응성 물질에 의해 소거되는 것을 어떻게 견뎌낼까요?

최근

NOS 신호 전달에 대한

새로운 패러다임이 제시되었습니다.

이 가설에 따르면,

신호 전달은

NOS가 아닌 NOS로부터 전체 이동성/교환 가능한 헴-NO 복합체의 방출을 통해 이루어지기 때문에

자유 NO가 필요하지 않습니다(B).

이 개념이 아직 입증되지 않았지만, 초기 연구와 최근 연구에서 이를 뒷받침하는 징후가 있습니다. 1978년의 연구에 따르면, 헴-NO는 sGC를 활성화시키는 반면, 헴은 Apo(헴이 없는) 효소를 억제합니다. 또한, 헴-NO가 sGC에 결합하는 것은 헴에 결합하는 것보다 훨씬 강하기 때문에, 이 종이 sGC에서 헴을 쉽게 대체할 수 있음을 의미합니다.

게다가,

최근의 연구에 따르면

NO는 GAPDH에 부착된 세포질 헤모글로빈에 결합한 다음,

Hsp90의 도움으로 이 헤모글로빈-NO 복합체가

헤모글로빈이 없는 sGC에 통합되어 활성화된다는 사실이 밝혀졌습니다(Dai, 2022).

종합해 보면,

sGC의 강력한 활성화제인 헤모글로빈-NO는

이미 NOS에서 형성됩니다.

그렇다면

자연은 왜 전체 복합체가 이동하여 sGC에 결합할 수 있는데도

먼저 반응성 NO로 분해한 다음 sGC에서 다시 형성하도록 선택했을까요?

자유 NO와는 달리,

이동 가능한 NO-헴 복합체는 목표물에 더 안전하게 전달될 수 있으며,

협응력도 더 높을 수 있습니다.

이러한

NO-헴은

S-니트로화 등 추가적인 NOS/NO 관련 신호 전달에도 기여할 수 있습니다.

Uncoupling refers to a situation when NOS activity is not coupled to NO synthesis but instead to the release of superoxide or hydrogen peroxide (Pritchard et al., 1995). This negatively affects NO bioavailability in two ways; apart from less NO being generated, the superoxide released may react with and destroy NO generated elsewhere. Two major reasons for uncoupling are shortage of L-arginine or BH4; in these cases, the superoxide release takes place at the heme in the oxygenase domain. Failure of NOS dimerization, on the other hand, seems less important as a mechanism of eNOS uncoupling (Gebhart et al., 2019). Another cause of uncoupling is glutathionylation, which targets two cysteines in the reductase domain, thereby hindering proper shuttling of electrons through this part of NOS (Chen et al., 2010). Various conditions can lead to deficiency of NOS substrates and co-factors, thereby fueling uncoupling. Cellular levels of L-arginine are usually plentiful, but excessive metabolism of this amino acid by other enzymes, e.g., arginase, can lead to a relative shortage. BH4 deficiency can arise from excessive oxidation by reactive oxygen species (ROS) or reactive nitrogen species such as peroxynitrite (Kuzkaya et al., 2003) or possibly from competition with iNOS if co-expressed in the same cell (Gunnett et al., 2005). This can create a vicious cycle where ROS from other cellular sources first promote uncoupling of NOS, which in turn starts to generate even more ROS. The methylated and nitrated forms of L-arginine mentioned earlier (e.g., L-NAME and L-NMMA) are used extensively in the NO field as they act as competitive inhibitors of NOS activity. Asymmetric dimethylarginine (ADMA) is another methylated form of L-arginine, which is generated endogenously (Vallance et al., 1992). Over the years, considerable efforts have been made to explore a pathogenic role of ADMA in blocking NO formation, thereby contributing the progression of cardiovascular disease. However, although numerous studies show positive correlations between plasma levels of ADMA and cardiovascular and renal disorders (Schwedhelm and Böger, 2011), its role in physiological regulation of NO signaling remains unclear.

분리(Uncoupling)는

NOS 활동이 NO 합성과 연결되지 않고,

대신에 슈퍼옥사이드 또는 과산화수소의 방출과 연결되는 상황을 의미합니다(Pritchard et al., 1995).

이것은 두 가지 방식으로

NO 생체 이용률에 부정적인 영향을 미칩니다.

생성되는 NO의 양이 적을 뿐 아니라,

방출된 슈퍼옥사이드가 다른 곳에서 생성된 NO와 반응하여 파괴할 수 있기 때문입니다.

결합 해제의 두 가지 주요 원인은

L-아르기닌 또는 BH4의 부족입니다.

이러한 경우,

산소화 효소 영역의 헴에서 슈퍼옥사이드가 방출됩니다.

반면에 NOS 이량체화의 실패는 eNOS 결합 해제의 메커니즘으로서는 덜 중요한 것으로 보입니다(Gebhart et al., 2019).

결합 해제의 또 다른 원인은

글루타티온화인데,

이것은 환원효소 도메인에 있는 두 개의 시스테인을 표적으로 삼아

NOS의 이 부분을 통해 전자가 적절하게 이동하는 것을 방해합니다(Chen et al., 2010).

여러 가지 조건이 결합되어 NOS 기질과 보조 인자의 결핍을 초래할 수 있으며,

이로 인해 결합 해제가 촉진될 수 있습니다.

세포 수준에서 L-아르기닌은

일반적으로 풍부하지만,

아르기나제 같은 다른 효소에 의한 이 아미노산의 과도한 대사는

상대적으로 부족을 초래할 수 있습니다.

BH4 결핍은

과도한 활성 산소(ROS) 또는 과산화질소(peroxynitrite)와 같은

활성 질소(reactive nitrogen species)에 의한 과도한 산화 또는

동일한 세포에서 공동 발현되는 iNOS와의 경쟁으로 인해 발생할 수 있습니다(Gunnett et al., 2005).

이로 인해 다른 세포 소스에서 발생하는 ROS가

먼저 NOS의 결합 해제를 촉진하는 악순환이 발생할 수 있으며,

이로 인해 더 많은 ROS가 생성되기 시작합니다.

앞서 언급한

L-아르기닌의 메틸화 및 질화 형태(예: L-NAME 및 L-NMMA)는

NOS 활성을 경쟁적으로 억제하는 작용을 하기 때문에

NO 분야에서 광범위하게 사용됩니다.

비대칭 디메틸아르기닌(ADMA)은

또 다른 L-아르기닌의 메틸화 형태로서,

체내에서 생성됩니다(Vallance et al., 1992).

수년 동안,

ADMA가 NO 형성을 차단함으로써

심혈관 질환의 진행에 기여하는 병원성 역할을 연구하기 위해 상당한 노력을 기울여 왔습니다.

그러나,

수많은 연구에서

ADMA의 혈장 농도와 심혈관 및 신장 질환 사이에

긍정적인 상관관계가 있다는 사실이 밝혀졌지만(Schwedhelm and Böger, 2011),

NO 신호 전달의 생리적 조절에 있어서

ADMA의 역할은 아직 명확하지 않습니다.

The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway

Oxidation of NO into inorganic nitrate (NO3) and nitrite (NO2−) represents a major route for rapid inactivation of this potent biological messenger. For long, these anions were of biological interest mainly as measurable end oxidation products of NO, but research in the mid-90s demonstrated the existence of a reverse pathway where nitrate and nitrite are reduced back to NO again (Benjamin et al., 1994; Lundberg et al., 1994b; Zweier et al., 1995) (Figure 3). Intriguingly, the first step in bioactivation of nitrate is bacteria dependent. Circulating nitrate is actively taken up by the salivary glands and concentrated in saliva (Qin et al., 2012). In the mouth, oral commensal bacteria reduce nitrate to form the more reactive intermediate nitrite (Duncan et al., 1995). Nitrite in turn is swallowed and generates NO and other reactive nitrogen oxides through nonenzymatic disproportionation in the acidic stomach (Lundberg and Weitzberg, 2013). In addition to this, there are a multitude of enzymatic and nonenzymatic mechanisms systemically by which nitrite can be reduced to NO and other bioactive nitrogen oxides in blood and tissues (Lundberg et al., 2008) (Figure 3). Interestingly, these are all greatly accelerated under hypoxic and acidic conditions, i.e., when the oxygen-dependent NOSs may be dysfunctional.

Therefore, the nitrate-nitrite-NO pathway has been viewed as a backup system ensuring NO bioactivity also when NO output from NOS is low. Because nitrate and nitrite are abundant constituents of our everyday diet, much interest has been on the dietary aspects of this pathway, which are discussed in more detail below (Weitzberg and Lundberg, 2013). There is some evidence that not only exogenous dietary nitrate but also endogenous NOS-derived nitrate and nitrite plays a physiologically relevant role in NO signaling. Kapil and colleagues treated healthy subjects with an antiseptic mouthwash twice daily for a week to eliminate bioactivation of nitrate. This procedure caused a stop in oral nitrate conversion to nitrite, a drop in circulating nitrite and intriguingly an increase in blood pressure, which correlated with the decrease in plasma nitrite (Kapil et al., 2013). These findings are partly supported also by epidemiological data indicating that chronic mouthwash use is associated with negative health effects (Blot, 2021; Joshipura et al., 2020).

질산염-아질산염-산화질소 경로

Nitrate 질산염

nitrite 아질산염

질소산화물(NO)이

무기질인 질산염(NO3)과 아질산염(NO2-)으로 산화되는 것은

이 강력한 생물학적 전달물질을 신속하게 비활성화하는 주요 경로입니다.

오랫동안 이 음이온은

주로 NO의 측정 가능한 최종 산화 생성물로서 생물학적으로 관심이 있었지만,

90년대 중반의 연구에 따르면 질산염과 아질산염이

다시 NO로 환원되는 역방향 경로가 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다

(Benjamin et al., 1994; Lundberg et al., 1994b; Zweier et al., 1995) (그림 3).

흥미롭게도,

질산염의 생체 활성화의 첫 번째 단계는 박테리아에 의존합니다.

the first step in bioactivation of nitrate is bacteria dependent

순환하는 질산염은

침샘에 의해 적극적으로 흡수되어 타액에 농축됩니다(Qin et al., 2012).

입안에서 구강 공생 박테리아는

질산염을 환원시켜 반응성이 더 높은 중간 물질인 아질산염을 형성합니다(Duncan et al., 1995).

질산염은

삼켜지고, 위산의 비효소적 불균형 분해를 통해

NO와 다른 반응성 질소 산화물을 생성합니다(Lundberg and Weitzberg, 2013).

이 외에도,

질산염이 혈액과 조직에서 NO와 다른 생체 활성 질소 산화물로 환원될 수 있는

다양한 효소적, 비효소적 메커니즘이 있습니다(Lundberg et al., 2008) (그림 3).

흥미롭게도,

이러한 과정은

산소 의존성 NOS가 기능 장애를 일으킬 수 있는

저산소 및 산성 조건에서 크게 가속화됩니다.

따라서,

질산염-아질산염-NO 경로는

NOS로부터의 NO 생산량이 적을 때에도

NO의 생체 활성을 보장하는 백업 시스템으로 간주되어 왔습니다.

질산염과 아질산염은

일상적인 식단에서 풍부한 성분이기 때문에,

이 경로의 식이 측면에 많은 관심이 집중되어 왔으며,

이에 대해서는 아래에서 더 자세히 논의될 것입니다(Weitzberg and Lundberg, 2013).

외인성 식이 질산염뿐만 아니라 내인성 NOS 유래 질산염과 아질산염도

생리학적으로 관련이 있는 역할을 한다는 증거가 있습니다.

Kapil과 동료 연구자들은

질산염의 생체 활성화를 제거하기 위해

일주일 동안 하루에 두 번씩 건강한 피험자에게

방부성 구강 세정제를 투여했습니다.

이 절차는

구강 내 질산염이 아질산염으로 전환되는 것을 중단시키고,

순환하는 아질산염의 양을 감소시키며,

흥미롭게도 혈압을 상승시켰는데,

이는 혈장 내 아질산염의 감소와 상관관계가 있었습니다(Kapil et al., 2013).

이러한 결과는

만성 구강 세정제 사용이 건강에 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타내는

역학 데이터에 의해 부분적으로 뒷받침됩니다(Blot, 2021; Joshipura et al., 2020).

Figure 3. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway

Dietary-derived and endogenously generated nitrate recirculates in vivo to again form NO and other bioactive nitrogen oxides. NO generation from nitrate and nitrite is greatly enhanced during acidic and hypoxic conditions and can be viewed as a backup system to ensure NO bioactivity also when the oxygen-dependent NO synthases may be dysfunctional. Ingestion of nitrate has a number of NO-like effects in humans, some of which may prove to be useful in treatment and prevention of disease and to enhance exercise performance.

그림 3. 질산염-아질산염-산화질소 경로

식이에서 유래하거나 체내에서 생성된 질산염은 

체내에서 재순환되어 

다시 NO와 다른 생체 활성 질소 산화물을 형성합니다. 

산성 및 저산소 조건에서는 

질산염과 아질산염으로부터 NO가 생성되는 것이 크게 향상되며, 

이 과정은 산소 의존성 NO 합성효소가 기능 장애를 일으킬 때에도

 NO의 생체 활성을 보장하는 백업 시스템으로 볼 수 있습니다. 

질산염 섭취는 

인간에게 여러 가지 NO와 유사한 효과를 발휘하는데, 

그 중 일부는 질병의 치료와 예방에 도움이 되고 운동 능력을 향상시키는 것으로 입증될 수 있습니다.

--> 질산염이 많은 음식 '비트, 마늘, 시금치'

Cellular NO signaling and inactivation

NO signaling is transduced through diffusion from its production site to the target, which may be in the same cell or in an adjacent cell. Paracrine signaling is possible because NO is tiny, uncharged and partly lipophilic, allowing it to freely pass biological membranes. In the target cell, NO canonically activates sGC by nitrosylation of the iron in its heme moiety, which in turn increases the synthesis of cGMP from cellular GTP. Nitrosylation is the direct binding of the NO radical to a transition metal, in this case Fe2+ (Heinrich et al., 2013). This activates downstream kinases including cGMP-regulated protein kinases and ion channels, to regulate a variety of physiological processes (Figures 1 and 4). Mechanistically, NO binds to a non-catalytic heme in the N-terminal part of the sGC, with a resulting conformational change in the enzyme (Kang et al., 2019) causing a several 100-fold increase in activity in the C-terminal cyclase domain (Arnold et al., 1977; Katsuki et al., 1977). The enzyme is a heterodimer composed of one α subunit and one β subunit. Although the α1 and β1 subunits are widely expressed in many tissues, expression‎ of α2 is tissue-specific and β2 is possibly not even translated (Koesling et al., 2016). Thus, the physiologically relevant isoforms of sGC are NO-GC1 (α1/β1) and NO-GC2 (α2/β1), whose functions have been characterized in isoform-specific knockouts (Koesling et al., 2016). Overall, these enzymes display similar functions in the cardiovascular system and most other tissues with the exception of the central nervous system where NO-GC1 is expressed presynaptically and NO-GC2 is found postsynaptically. A major overall control mechanism for this pathway is breakdown of the cGMP formed, a reaction catalyzed by various phosphodiesterases (PDE) of which PDE 5, 6, and 9 show the greatest specificity toward cGMP (Bischoff, 2004). Additional control of sGC activity is mediated by the matricellular protein trombospondin-1 (Isenberg et al., 2005). Binding of trombospondin-1 to the cell-surface receptor CD47 causes alterations in intracellular calcium fluxes that lead to inhibition of sGC activity and also negatively affects several other components of the NO signaling cascade, including eNOS and PKG (Rogers et al., 2014). Conversely, very low levels of NO have been shown to down regulate trombospondin-1 expression‎ (Ridnour et al., 2005).

Cellular NO signaling 및 비활성화

NO 신호는

생산지에서 표적(같은 세포 또는 인접한 세포일 수 있음)으로 확산되어 전달됩니다.

--> autocrine& paracrine

NO는 작고, 전하가 없고,

부분적으로 친지방질이기 때문에 생물학적 막을 자유롭게 통과할 수 있기 때문에

파라크린 신호가 가능합니다.

표적 세포에서 NO는

헴 부분의 철에 니트로실화를 일으켜 sGC를 활성화시키고,

이로 인해 세포 내 GTP로부터 cGMP의 합성이 증가합니다.

질소산화는

NO 라디칼이 전이금속(이 경우 Fe2+)에 직접 결합하는 현상입니다(Heinrich et al., 2013).

이 현상은

cGMP 조절 단백질 키나아제와 이온 채널을 포함한 다운스트림 키나아제를 활성화시켜

다양한 생리학적 과정을 조절합니다(그림 1, 그림 4).

The current perspective holds that the generation of secondary signaling mediators from nitrite (NO 2 − ) requires acidification to nitrous acid (HNO 2 ) or metal catalysis. Herein, the use of stable isotope–labeled NO 2 −  and LC-MS/MS analysis of products reveals that NO 2 −  also participates in fatty acid nitration and thiol S-nitrosation at neutral pH. These reactions occur in the absence of metal centers and are stimulated by autoxidation of nitric oxide ( • NO) via the formation of symmetrical dinitrogen trioxide (nitrous anhydride,  sym N 2 O 3 ). Although theoretical models have predicted physiological  sym N 2 O 3  formation, its generation is now demonstrated in aqueous reaction systems, cell models and  in vivo , with the concerted reactions of  • NO and NO 2 −  shown to be critical for  sym N 2 O 3  formation. These results reveal new mechanisms underlying the NO 2 −  propagation of  • NO signaling and the regulation of both biomolecule function and signaling network activity via NO 2 − -dependent nitrosation and nitration reactions. 현재의 관점은 아질산(NO2−)으로부터 2차 신호 매개체를 생성하려면 아질산(HNO2)으로의 산성화 또는 금속 촉매 작용이 필요하다는 것입니다. 여기에서, 안정 동위원소 표지된 NO2−의 사용과 제품의 LC-MS/MS 분석은 NO2−가 중성 pH에서 지방산 질화 및 티올 S-니트로화에 관여한다는 것을 보여줍니다. 이러한 반응은 금속 중심이 없는 상태에서 발생하며, 대칭적인 이산화질소(질소 무수물, symN2O3)의 형성을 통한 산화질소(•NO)의 자가 산화에 의해 촉진됩니다. 이론적 모델이 생리적 symN2O3 형성을 예측했지만, 현재는 수성 반응 시스템, 세포 모델, 생체 내에서 •NO와 NO2−의 협동 반응이 symN2O3 형성에 중요한 것으로 밝혀지면서 그 생성이 입증되고 있습니다. 이러한 결과는 NO2−의 •NO 신호 전달과 NO2− 의존성 니트로화 및 니트로화 반응을 통한 생체 분자 기능과 신호 전달 네트워크 활동의 조절에 기초한 새로운 메커니즘을 보여줍니다.

기계적으로,

NO는 sGC의 N-말단 부분에 있는 비촉매성 헴에 결합하여 효소의 형태 변화를 일으키고(Kang et al., 2019),

C-말단 사이클라제 영역에서 100배 이상의 활성 증가를 일으킵니다(Arnold et al., 1977; Katsuki et al., 1977).

효소는 α1과 β1의 두 가지 서브유닛으로 구성된 이량체입니다.

α1과 β1 서브유닛은 많은 조직에서 광범위하게 발현되지만,

α2의 발현은 조직 특이적이며,

β2는 번역되지 않을 수도 있습니다(Koesling et al., 2016).

따라서,

sGC의 생리학적으로 관련된 이소형은

NO-GC1(α1/β1)과 NO-GC2(α2/β1)이며,

이들의 기능은 이소형 특이적 결손(Koesling et al., 2016)으로 특성화되었습니다.

전반적으로, 이 효소들은 심혈관계와 대부분의 다른 조직에서 유사한 기능을 나타내지만, NO-GC1이 시냅스 전에서 발현되고 NO-GC2가 시냅스 후에서 발견되는 중추신경계를 제외한 대부분의 다른 조직에서는 유사한 기능을 나타냅니다. 이 경로의 주요한 전반적인 제어 메커니즘은 cGMP의 분해입니다. cGMP의 분해는 다양한 포스포디에스터라아제(PDE)에 의해 촉매 작용을 받는 반응으로, 그 중에서도 PDE 5, 6, 9가 cGMP에 대해 가장 높은 특이성을 보입니다(Bischoff, 2004). sGC 활동에 대한 추가적인 제어는 매트릭스 단백질인 트롬보스폰딘-1(trombospondin-1)에 의해 매개됩니다(Isenberg et al., 2005). 트롬보스폰딘-1이 세포 표면 수용체 CD47에 결합하면 세포 내 칼슘 플럭스가 변화하여 sGC 활동이 억제되고, eNOS 및 PKG를 포함한 여러 다른 NO 신호 전달 경로의 구성 요소에 부정적인 영향을 미칩니다(Rogers et al., 2014). 반대로, 매우 낮은 수준의 NO가 트롬보스폰딘-1 발현을 하향 조절하는 것으로 나타났습니다(Ridnour et al., 2005).

NO signaling is also effectively terminated by its direct oxidation into higher oxides of nitrogen. Nitrate is by far the dominating end oxidation product with levels in human plasma in the 10–50 μM range, whereas nitrite is generally below 1 μM (Lundberg and Govoni, 2004). Two quantitatively important oxidation pathways include reaction of NO with oxy-Hb and reaction with another radical, ultimately forming nitrate. The effectiveness of Hb in scavenging NO in vivo is illustrated by the predominant dilatation of pulmonary vessels in response to inhaled NO, with minimal acute effects on systemic hemodynamics (Frostell et al., 1991). The reaction between NO and superoxide forms peroxynitrite (Beckman et al., 1990), which can act as an oxidant and nitrating agent after protonation as discussed below. However, in vivo peroxynitrite can also isomerize to form inert nitrate. In this sense, NO can practically function as an antioxidant.

Questions remain as to how specificity is obtained by a signaling molecule similar to NO that easily passes biological membranes and diffuses randomly in all directions. Specific subcellular localization of NOS to caveolae (García-Cardeña et al., 1996) or in the direct vicinity of a target (Iwakiri et al., 2006) represent two possible mechanisms to achieve this. For NO signaling between the endothelium and vascular smooth muscle cells another mechanism has been proposed. Hemoglobin-alpha (Hb-α), a potent NO scavenger, is strategically expressed in the myoendothelial junction of small arteries and arteriole and acts as a “gate keeper,” controlling the diffusion of NO between these cells. The oxidation state of the heme iron in Hb-α determines its NO scavenging ability, and this is regulated by a cytochrome b5 reductase 3 localized to the same area (Straub et al., 2012) (Figure 2). Most of the NO diffusing in the other direction, i.e., toward the luminal side is rapidly scavenged by the blood.

Some cross talk exists in the NO signaling between the three NOS isoforms and between NOS-dependent and NOS-independent pathways. Mice lacking eNOS have lifelong hypertension and develop metabolic disturbances but other than that the phenotype is not very severe and life span is near normal (Duplain et al., 2001; Huang et al., 1995). For life span, the same is partly true also for single gene knockdown of nNOS or iNOS (Morishita et al., 2005). In contrast, if all three NOSs are deleted, a severe cardiovascular and metabolic phenotype develops rapidly with mice dying predominantly from myocardial infarction before 1 year of age (Nakata et al., 2008). Such mice also display exceptionally low circulating levels of nitrate and nitrite. In aged eNOS deficient mice, the metabolic phenotype could be partly reversed by dietary inorganic nitrate (Carlström et al., 2010) and conversely, long-term dietary nitrate deficiency causes metabolic syndrome, endothelial dysfunction, and increased cardiovascular death in normal mice (Kina-Tanada et al., 2017). Lastly, dietary supplementation with nitrate at higher doses in normal rats causes down regulation of eNOS activity and signaling (Carlström et al., 2015). Altogether, this suggests that NOS-dependent and NOS-independent NO-signaling pathways overlap and can partly substitute for each other.

NO 신호 전달은

또한 질소의 더 높은 산화물로 직접 산화됨으로써

효과적으로 종결됩니다.

NO signaling is also effectively terminated by its direct oxidation into higher oxides of nitrogen

질산염은

인간 혈장 내 10-50 μM 범위의 수준에서 가장 많이 존재하는 최종 산화 산물이며,

아질산염은 일반적으로 1 μM 미만입니다(Lundberg and Govoni, 2004).

두 가지 양적으로 중요한 산화 경로는

NO와 옥시헤모글로빈의 반응과 다른 라디칼과의 반응으로,

궁극적으로 질산염을 형성합니다.

생체 내 NO 제거에 대한 Hb의 효과는

흡입된 NO에 대한 반응으로 폐 혈관이 크게 확장되는 것으로 설명할 수 있으며,

전신 혈역학에 미치는 급성 영향은 미미합니다(Frostell et al., 1991).

NO와 슈퍼옥사이드 사이의 반응은

과산화질소(Beckman et al., 1990)를 형성하는데,

이는 아래에서 논의되는 바와 같이 양성자화 후 산화제 및 질화제로 작용할 수 있습니다.

그러나

생체 내 과산화질소는 또한 이성질체화되어

불활성 질산염을 형성할 수 있습니다.

이런 의미에서,

NO는

실질적으로 항산화제 역할을 할 수 있습니다.

혈관 긴장도 유지, 시냅스 전달, 세포 방어에 있어서 산화질소(NO)의 생리적 역할은 이제 확고하게 입증되었습니다. 최근의 증거에 따르면, NO는 미토콘드리아 기능에도 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서는, NO가 전자 수송 사슬의 구성 요소와의 상호 작용을 통해 세포 호흡의 생리적 조절자로서 기능할 뿐만 아니라, 미토콘드리아에 의한 활성 산소 종의 생성을 증가시켜 세포 생존 또는 사멸 메커니즘을 유발할 수 있다는 연구 결과를 검토합니다.

NO와 유사한 신호 전달 분자가 생물학적 막을 쉽게 통과하고

모든 방향으로 무작위로 확산되면서 특이성을 얻는 방법에 대한 의문이 남아 있습니다.

NOS의 특정 세포 내 국소화는 카베올라(García-Cardeña et al., 1996) 또는

표적의 직접적인 주변(Iwakiri et al., 2006)에 위치하는 두 가지 가능한 메커니즘을 나타냅니다.

내피세포와 혈관 평활근세포 사이의 NO 신호 전달을 위한

또 다른 메커니즘이 제안되었습니다.

강력한 NO 제거제인 헤모글로빈-알파(Hb-α)는

작은 동맥과 세동맥의 근내피 접합부에서 전략적으로 발현되며,

이 세포들 사이의 NO 확산을 제어하는 “게이트 키퍼” 역할을 합니다.

헤모글로빈 α의 헴 철의 산화 상태는

NO 제거 능력을 결정하며,

이는 같은 부위에 위치한 사이토크롬 b5 환원효소 3에 의해 조절됩니다(Straub et al., 2012) (그림 2).

다른 방향,

즉 내강 쪽으로 확산되는 대부분의 NO는

혈액에 의해 빠르게 제거됩니다.

세 가지 NOS 이소형체 사이, 그리고 NOS 의존 경로와 NOS 독립 경로 사이에는 약간의 교차 신호가 존재합니다.

eNOS가 결핍된 생쥐는 평생 고혈압을 앓고 대사 장애가 발생하지만,

그 외에는 표현형이 그다지 심각하지 않고

수명도 거의 정상 수준입니다(Duplain et al., 2001; Huang et al., 1995).

수명 기간에 있어서도,

nNOS 또는 iNOS의 단일 유전자 결핍(Morishita et al., 2005)의 경우

부분적으로 동일한 결과가 나타납니다.

반대로,

세 가지 NOS가 모두 결핍된 경우,

심혈관 및 대사 관련 심각한 표현형이 빠르게 나타나며,

생후 1년 이내에 심근경색으로 주로 사망합니다(Nakata et al., 2008).

이러한 마우스는 또한

순환하는 질산염과 아질산염의 수준이 매우 낮습니다.

노화한 eNOS 결핍 마우스에서,

무기질 질산염을 식단에 추가함으로써

대사 표현형이 부분적으로 회복될 수 있습니다(Carlström 외., 2010).

반대로,

장기적인 질산염 결핍 식단은

정상 마우스에서 대사 증후군, 내피 기능 장애, 심혈관 질환 사망률을 증가시킵니다(Kina-Tanada 외., 2017).

마지막으로,

정상 쥐에게 더 많은 양의 질산염을 식이 보충제로 투여하면

eNOS 활동과 신호 전달이 감소합니다(Carlström et al., 2015).

종합해 보면,

이 결과는

NOS 의존적 및 NOS 독립적 NO 신호 전달 경로가 겹치며

부분적으로 서로를 대체할 수 있음을 시사합니다.

S-nitrosation and nitration

S-nitrosation refers to the covalent addition of a nitrogen monoxide group (formally NO+) to a thiol group (-SH) (Heinrich et al., 2013). Low molecular weight S-nitrosothiols such as S-nitroso cysteine (Cys-NO) or S-nitroso glutathione (GS-NO) are highly bioactive and are as potent vasodilators as NO itself, acting via the sGC-cGMP pathway (Ignarro et al., 1980). Besides being used as NO donor drugs in research, endogenously formed small S-nitrosothiols are also thought to be involved in cellular and inter-cellular physiological signaling e.g., in vascular regulation (Lima et al., 2010) and in transnitrosation reactions, i.e., when a S-nitrosothiol is transferred between two entities. S-nitrosation also occurs at cysteine residues in proteins similarly to other oxidative modifications of this redox-sensitive amino acid including disulfide formation, glutathionylation, sulphenylation, and more. These reactions are all attributed to the high nucleophilic property of cysteine (Chung et al., 2013). S-nitrosation of cysteine thiol groups in proteins can affect their activity (Park, 1988), and this reaction has emerged as a second major pathway for physiological NO signaling in addition to the sGC/cGMP-pathway (Figure 4). A multitude of proteins are suggested to be regulated by S-nitrosation (Stamler, 1994) both under physiological conditions as well as in pathologies (Liu et al., 2004), e.g., inflammation or cancer when nitrosative stress can be considerable. All rapid physiological signaling pathways require tightly controlled dynamic switches in activity at multiple levels.

S-니트로화 및 니트로화

S-니트로화는

일산화질소(공식적으로 NO+)가

티올기(-SH)에 공유 결합하는 것을 의미합니다(Heinrich et al., 2013).

S-니트로소 시스테인(Cys-NO) 또는

S-니트로소 글루타티온(GS-NO)과 같은 저분자량 S-니트로소티올은

생체활성이 매우 높고,

sGC-cGMP 경로를 통해 작용하는 NO 자체만큼 강력한 혈관 확장제입니다(Ignarro et al., 1980).

연구에서 NO 기증 약물로서 사용되는 것 외에도,

체내에서 형성되는 작은 S-니트로소티올은 혈관 조절(Lima et al., 2010)과

트랜스니트로소화 반응(즉, 두 개체 간에 S-니트로소티올이 전달되는 경우)과 같은

세포 및 세포 간 생리학적 신호 전달에 관여하는 것으로 여겨집니다.

S-니트로화도

이 산화 환원 민감성 아미노산의 다른 산화적 변형과 유사하게,

디설파이드 형성,

글루타티온화,

설펜일화 등을 포함하는

단백질의 시스테인 잔기에서 발생합니다.

이러한 반응은 모두 시스테인의 높은 친핵성에 기인합니다(Chung et al., 2013).

단백질 내 시스테인 티올 그룹의 S-니트로화(S-nitrosation)는 그 활성에 영향을 미칠 수 있습니다(Park, 1988). 이 반응은 sGC/cGMP 경로(그림 4)에 더해 생리적 NO 신호 전달을 위한 두 번째 주요 경로로 부상했습니다.

많은 단백질들이 생리적 조건과 병리학적 조건(Stamler, 1994) 모두에서 S-니트로화(nitrosation)에 의해 조절되는 것으로 알려져 있습니다(예: 염증이나 암과 같은 니트로화 스트레스가 상당한 경우). 모든 신속한 생리적 신호 전달 경로는 여러 수준에서 활동의 동적 스위치를 엄격하게 제어해야 합니다.

So, how then is S-nitrosation regulated in vivo? Several enzymes capable of removing the NO moiety from the cysteine have been identified. These are often referred to as denitrosylases and include S-nitrosoglutathione reducatse (formally glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase) (Liu et al., 2004), thioredoxin (Benhar et al., 2008), thioredoxin-related protein of 14 kDa (Pader et al., 2014), glutaredoxin (Ren et al., 2019), and more. However, the mechanism by which S-nitrosothiols are formed in vivo is much less clear (Keszler et al., 2010). The sources of nitrosating nitrogen oxides are the three NOSs but also circulating nitrite, derived from oxidation of NO or from dietary nitrate. NO itself is incapable of S-nitrosation (besides a possible reaction with a thiyl radical); so, it must first be converted to a nitrosating agent. There may be multiple mechanisms to achieve this including reaction with oxygen, which is second order in NO and, therefore, slow, or intermediate formation of nitrosyl groups in heme- or non-heme iron (Vanin, 2019). In contrast to phosphorylation, which is exclusively enzymatic, most S-nitrosation observed in vivo in mammals is thought to be of a nonenzymatic origin although enzymatic pathways were recently reported in bacteria (Seth et al., 2018). The true physiological regulatory role of S-nitrosation is still a matter of debate. A simple observation of the gross phenotypes associated with deletion of different components of the NO signaling pathways can be quite illustrative. If cGMP/sGC-independent signaling via NOS-dependent S-nitrosation regulates as many vital processes as claimed one would expect vastly different phenotypes in NOS-deficient mice versus mice lacking sGC activity. Thoonen and colleagues developed heme-deficient soluble guanylyl cyclase knock-in mice, which rendered them NO-unresponsive (Thoonen et al., 2015).

그렇다면

생체 내에서 S-니트로화 작용은

어떻게 조절될까요?

시스테인에서 NO 부분을 제거할 수 있는 여러 효소가 확인되었습니다. 이들은 종종 데니트로실라아제라고 불리며, S-니트로글루타티온 환원효소(공식적으로는 글루타티온 의존성 포름알데히드 탈수소효소) (Liu et al., 2004), 티오레독신(Benhar et al., 2008), 14kDa 티오레독신 관련 단백질(Pader et al., 2014), 글루타레독신(Ren et al., 2015)을 포함합니다. 019), 그리고 더 많은 것들이 있습니다. 그러나, S-니트로소티올이 생체 내에서 형성되는 메커니즘은 훨씬 덜 명확합니다(Keszler et al., 2010). 니트로소화 질소 산화물의 원천은 세 가지 NOS이지만, NO의 산화 또는 식이성 질산염에서 유래된 순환 아질산염도 있습니다. NO 자체는 S-니트로화(티일 라디칼과의 반응 가능성 제외)가 불가능하므로, 먼저 니트로화제로 전환해야 합니다. 이를 달성하기 위한 여러 가지 메커니즘이 있을 수 있는데, 여기에는 NO에서 2차 반응이고, 따라서 느린 산소와의 반응 또는 헴 또는 비헴 철에서 니트로실 그룹의 중간 형성(Vanin, 2019)이 포함될 수 있습니다. 효소 작용에 의해 독점적으로 일어나는 인산화와는 달리, 포유류 체내에서 관찰되는 대부분의 S-니트로화 작용은 비효소적 기원을 갖는 것으로 여겨지지만, 최근에 세균에서 효소 경로가 보고된 바 있습니다(Seth et al., 2018). S-니트로화의 진정한 생리적 조절 역할은 여전히 논쟁의 대상입니다. NO 신호 전달 경로의 다양한 구성 요소의 결핍과 관련된 총체적 표현형을 간단히 관찰하는 것만으로도 충분히 설명이 가능합니다. NOS 의존성 S-니트로화 경로를 통한 cGMP/sGC 독립적 신호가 주장된 것처럼 많은 생명 과정을 조절한다면, NOS 결핍 마우스와 sGC 활동이 결핍된 마우스 사이에서 현저하게 다른 표현형이 나타날 것으로 예상할 수 있습니다. Thoonen과 동료 연구자들은 헴 결핍 수용성 구아닐릴 사이클라제 넉인 마우스를 개발하여 NO에 반응하지 않는 마우스를 만들었습니다(Thoonen et al., 2015).

It seems that the classical physiological functions known to be regulated by NO, including blood pressure, platelet function, gastrointestinal motility, and penile erection (Decaluwé et al., 2017) are affected similarly in these mice compared with the various models of NOS-deficient mice. Life span is shorter (Thoonen et al., 2015) and correlates well to what is seen in mice lacking all three NOSs (Nakata et al., 2008). Overall, this may suggest that cGMP-signaling is in fact the major pathway for physiological transduction of NO bioactivity in mammals. Moreover, for S-nitrosation, questions still remain as to how stable the SNO bond is or whether rapid further oxidation to a disulfide instead is the final product of this reaction (Wolhuter et al., 2018). In fact, any study where a critical cysteine has been replaced with a non-nitrosable amino acid is inherently non-conclusive because the procedure also disables any other oxidative modification of the cysteine. Also, there are issues about specificity and the predicted slow predominantly nonenzymatic in vivo kinetics of S-nitrosation. In contrast to phosphorylation, S-nitrosation is quite promiscuous, in particular at high NO fluxes such as after induction of iNOS or following treatment with in vivo nitrosating agents such as nitrite (Chouchani et al., 2017; Quesnelle et al., 2020). Such massive S-nitrosation may be involved in pathophysiological events but also possibly in therapeutic effects of drugs with NO-like bioactivity.

NO에 의해 조절되는 것으로 알려진 고전적인 생리적 기능, 즉 혈압, 혈소판 기능, 위장 운동성, 음경 발기(Decaluwé et al., 2017)가 NOS 결핍 마우스의 다양한 모델과 비교했을 때 이 마우스에서도 유사하게 영향을 받는 것으로 보입니다. 수명이 짧고(Thoonen et al., 2015), NOS가 모두 결핍된 생쥐에서 보이는 것과 잘 연관되어 있습니다(Nakata et al., 2008). 전반적으로, 이것은 cGMP 신호가 실제로 포유류에서 NO 생리 활성의 생리적 전달을 위한 주요 경로임을 시사합니다. 게다가 S-니트로화 반응의 경우, SNO 결합이 얼마나 안정적인지, 아니면 이 반응의 최종 산물이 이황화물로 빠르게 산화되는지 여부에 대한 의문이 남아 있습니다(Wolhuter et al., 2018). 사실, 중요한 시스테인을 비-니트로화 아미노산으로 대체하는 연구는 본질적으로 결론을 내릴 수 없습니다. 왜냐하면 이 과정에서 시스테인의 다른 산화적 변형도 불가능하게 되기 때문입니다. 또한, 특이성과 S-니트로화 반응의 느린 생체 내 비효소적 동역학에 대한 예측 가능성 문제도 있습니다. 인산화 반응과는 달리, S-니트로화 반응은 특히 iNOS 유도 후 또는 아질산염과 같은 생체 내 니트로화제 처리 후와 같이 높은 NO 플럭스에서 매우 무차별적입니다(Chouchani et al., 2017; Quesnelle et al., 2020). 이러한 대규모 S-니트로화 반응은 병태 생리학적 사건에 관여할 수 있지만, NO와 유사한 생체 활성을 가진 약물의 치료 효과에도 관여할 수 있습니다.

Figure 4. The chemical biology of NO signaling NO generated by NOS can signal via different mechanisms.

Nitrosylation refers to the direct binding of the NO radical to a transition metal, e.g., heme-iron (Fe). This reaction underlies the canonical activation of sGC by NO and the inhibition of cytochrome c oxidase (CCO) in mitochondria. There are a number of additional targets for nitrosylation including iron-sulfur clusters in proteins and nonheme iron. Nitrosation is the covalent binding of an NO+ moiety to a sulfydryl group (-SH) to form an Snitrosothiol (S-NO). Such post-translational modification is suggested to regulate the activity of a multitude of proteins. Low molecular weight thiols such as cysteine and glutathione may also be nitrosated and these compounds may serve as transducers of NO bioactivity or act to nitrosate other targets. Nitration refers to the introduction of a nitro group (-NO2) into an organic compound and requires intermediate formation of the nitrogen dioxide radical. Nitration of tyrosine residues in proteins can alter their function, whereas nitration of unsaturated fatty acids or nucleotides may give rise to novel species with signaling properties.

니트로실화(nitrosylation)는 NO 라디칼이 전이 금속, 예를 들어 헴철(heme-iron, Fe)에 직접 결합하는 것을 말합니다. 이 반응은 NO에 의한 sGC의 표준 활성화와 미토콘드리아의 시토크롬 C 산화효소(cytochrome c oxidase, CCO)의 억제를 뒷받침합니다. 단백질에 있는 철-황 클러스터와 비헴철을 포함하여 니트로실화를 위한 추가 표적들이 많이 있습니다. 질산화는 NO+ 부분과 설피딜기(-SH)의 공유 결합을 통해 S-니트로티올(S-NO)을 형성하는 것입니다. 이러한 번역 후 변형은 다양한 단백질의 활동을 조절하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시스테인이나 글루타티온과 같은 저분자량 티올도 질산화될 수 있으며, 이러한 화합물은 NO 생체 활성의 변환기 역할을 하거나 다른 표적의 질산화 작용을 할 수 있습니다. 질화(nitration)는 유기 화합물에 니트로기(-NO2)를 도입하는 것을 말하며, 이산화질소 라디칼의 중간 생성물을 필요로 합니다. 단백질 내 티로신 잔여물의 질화는 그 기능을 변화시킬 수 있는 반면, 불포화 지방산이나 뉴클레오티드의 질화는 신호 전달 특성을 가진 새로운 종을 생성할 수 있습니다.

Nitration is a reaction where a nitro group (-NO2) is introduced into an organic compound (Heinrich et al., 2013). It is utilized in industry, e.g., in the production of explosives; however, interestingly, it also seems to be a relevant reaction in NO biology (Figure 4). In biological systems, nitration is typically mediated by the nitrogen dioxide radical (NO2.), which in turn is formed together with the hydroxyl radical by the spontaneous decomposition of protonated peroxynitrite, by reaction of peroxynitrite with carbon dioxide, oxidation of nitrite, e.g., by a peroxidase or from disproportionation of nitrite in the highly acidic gastric environment (Radi, 2018; Rocha et al., 2011; Tsikas, 2011) Thus, in tissues, nitration likely is most abundant where iNOS is upregulated and a source of superoxide is present to form peroxynitrite. Nitration was initially believed to be an overall harmful reaction causing alterations in protein function. Tyrosine residues in proteins can be nitrated, and detection of this species has been used extensively as a marker of peroxynitrite formation and nitrosative stress in general (Kooy et al., 1997). Interestingly, however, nitration reactions can give rise to other compounds, altering their bioactivity and possibly even forming novel signaling species. Unsaturated fatty acids (FAs) including oleic and linoleic acid can be nitrated to form nitro-lipids (NO2-FAs), which render them electrophilic, allowing reaction mainly with cysteines through Michael addition reactions (Coles et al., 2002).

Through this mechanism, NO2-FAs potently antagonize NF-κB and activate Nrf2 signaling, two major effects explaining their broad anti-inflammatory and antioxidant activity (Cui et al., 2006). The role of endogenously formed NO2-FAs in regulation of physiological signaling is still unknown, and the site and extent of their formation under normal conditions is unclear. Nevertheless, when given exogenously, protective anti-inflammatory effects have been observed in numerous preclinical animal models of disease, including cardiovascular, pulmonary, and renal fibrosis (Khoo and Schopfer, 2019). Nucleotides, such as GTP, can also be nitrated by NO reaction products. When such GTP is further metabolized by sGC, the result is formation of 8-nitro-cGMP (Sawa et al., 2007). Studies in Akaikes lab have shown that in addition to classical activation of cGMP-dependent protein kinases, 8-nitro-cGMP also reacts with cysteine residues in various proteins to form S-guanylated proteins, a kind of post-translational modification that induces modification of protein functions (Akaike et al., 2013). Nitro-cGMP also differs from cGMP in that its degradation by PDEs is delayed due to intermediate reactions with persulfide species. Similarly to NO2-FAs, questions still remain regarding control of formation and activity of nitro-cGMP and its role in physiological signaling. The gastric environment offers favorable conditions for nitration in humans as nitrogen dioxide (NO2.) is readily formed from the reaction of salivary nitrite and gastric acid (Benjamin et al., 1994; Lundberg et al., 1994b). Studies have shown that pepsin is nitrated and inactivated in the rat stomach, preventing the progression of gastric ulcers. Moreover, gastric nitration is likely a major route for generation of NO2-FAs found systemically (Buchan et al., 2018).

질화 반응은 유기 화합물에 니트로기(-NO2)가 도입되는 반응입니다(Heinrich et al., 2013). 이 반응은 산업에서 폭약 생산 등에 활용되지만, 흥미롭게도 NO 생물학에서도 관련 반응으로 여겨집니다(그림 4). 생물학적 시스템에서 질화는 일반적으로 이산화질소 라디칼(NO2.)에 의해 매개되는데, 이산화질소 라디칼은 과산화질산이 양성자화되어 과산화질산과 이산화탄소의 반응, 아질산염의 산화(예: 과산화효소에 의한 산화 또는 매우 산성인 위 환경에서 아질산염의 불균형에 의한 산화)에 의해 자발적으로 분해되어 수산화 라디칼과 함께 형성됩니다(Radi, 2018; Rocha et al., 2011; Ts ikas, 2011) 따라서 조직에서 질화는 iNOS가 상향 조절되고 과산화수소가 존재하여 과산화질소를 형성하는 곳에서 가장 많이 발생합니다. 질화는 처음에는 단백질 기능에 변화를 일으키는 전반적으로 해로운 반응으로 여겨졌습니다. 단백질의 티로신 잔기는 질화될 수 있으며, 이 종의 검출은 과산화질소 형성 및 일반적인 니트로사이드 스트레스의 지표로 광범위하게 사용되어 왔습니다(Kooy et al., 1997). 그러나 흥미롭게도, 질화 반응은 다른 화합물을 생성하여 생체 활성을 변화시키고 새로운 신호 전달 종을 형성할 수도 있습니다. 올레산과 리놀레산을 포함한 불포화 지방산(FA)은 질화되어 니트로지질(NO2-FA)을 형성할 수 있으며, 이로 인해 친전자성을 가지게 되어 마이클 첨가 반응을 통해 주로 시스테인과 반응할 수 있습니다(Coles et al., 2002).

이 메커니즘을 통해 NO2-FA는 NF-κB를 강력하게 길항하고 Nrf2 신호를 활성화하는데, 이 두 가지 주요 효과는 광범위한 항염증 및 항산화 작용을 설명합니다(Cui et al., 2006). 생체 내에서 형성된 NO2-FA가 생리적 신호 조절에 미치는 역할은 아직 밝혀지지 않았으며, 정상적인 조건에서 NO2-FA가 형성되는 위치와 정도는 불분명합니다. 그럼에도 불구하고, 외인적으로 투여되었을 때, 심혈관, 폐, 신장 섬유증 등 수많은 전임상 동물 질병 모델에서 보호적인 항염증 효과가 관찰되었습니다(Khoo and Schopfer, 2019). GTP와 같은 뉴클레오티드도 NO 반응 산물에 의해 질화될 수 있습니다. 이러한 GTP가 sGC에 의해 더 대사되면, 그 결과 8-니트로-cGMP가 형성됩니다(Sawa et al., 2007). 아카이케 연구실의 연구에 따르면, 8-니트로-cGMP는 cGMP 의존성 단백질 키나아제의 고전적 활성화 외에도 다양한 단백질의 시스테인 잔기와 반응하여 단백질 기능의 변형을 유도하는 일종의 번역 후 변형인 S-구아닐화 단백질을 형성합니다(Akaike et al., 2013). 또한 니트로-cGMP는 퍼설파이드 종과의 중간 반응으로 인해 PDE에 의한 분해가 지연된다는 점에서 cGMP와 다릅니다. NO2-FA와 마찬가지로, 니트로-cGMP의 형성 및 활성 조절과 생리적 신호 전달에서의 역할에 관한 질문이 여전히 남아 있습니다. 위 환경은 인간에서 질화를 위한 유리한 조건을 제공합니다. 왜냐하면 타액의 아질산염과 위산이 반응하여 이산화질소(NO2)가 쉽게 형성되기 때문입니다(Benjamin et al., 1994; Lundberg et al., 1994b). 연구에 따르면 펩신은 쥐의 위장에서 질화되어 비활성화되어 위궤양의 진행을 방지하는 것으로 나타났습니다. 또한, 위장 질화는 전신적으로 발견되는 NO2-FA 생성의 주요 경로일 가능성이 높습니다(Buchan et al., 2018).

NO in physiology and diseaseCardiovascular function

The cardiovascular system may be viewed as “the canonical NO system” because the discovery of NO was enabled by experiments using the vascular endothelium, and the first therapeutic NO donor ever used was nitroglycerine to treat angina pectoris. In the vasculature, it is evident that eNOS-derived NO plays an important homeostatic role by regulating tissue blood flow, controlling vascular remodeling, and protecting the endothelium against platelet aggregation and leukocyte adhesion (Daiber et al., 2019). The clearest illustration of NO’s physiological role in vascular control is the vasoconstriction and increase in blood pressure seen after acute administration of a NOS inhibitor (Rees et al., 1989). The essential role of endothelially expressed eNOS in vascular control was finally confirmed recently in endothelial cell-specific eNOS deficient mice whose vascular phenotype is similar to what is seen in the global eNOS knockout (Leo et al., 2021). In most cardiovascular diseases, an impairment of endothelial function is observed, mainly driven by lower bioavailability of NO (Lundberg et al., 2015); however, we are yet to explore whether a correction of this abnormality would delay or prevent disease. There has been a wide interest in investigating if genetic predisposition related to NO signaling is associated with various common diseases. Several studies have found associations between genetic variants related to NOS-sGC signaling and increased risk of cardiovascular disease (Erdmann et al., 2013; Malik et al., 2018). Conversely, genetic predisposition to enhance NO signaling has been associated with reduced risk of coronary heart disease and stroke (Emdin et al., 2018). Future studies will determine the benefit and clinical utility of these findings.

NO 생리학 및 질병 심혈관 기능

NO의 발견은 혈관 내피를 이용한 실험을 통해 가능해졌으며, 최초의 치료용 NO 공급제는 협심증 치료를 위한 니트로글리세린이었기 때문에, 심혈관계는 “표준적인 NO 시스템”으로 간주될 수 있습니다. 혈관 조직에서 eNOS에서 유래된 NO는 조직의 혈류를 조절하고, 혈관 리모델링을 제어하며, 혈소판 응집과 백혈구 부착으로부터 내피를 보호함으로써 중요한 항상성 역할을 하는 것이 분명합니다(Daiber et al., 2019). 혈관 조절에서 NO의 생리적 역할을 가장 잘 보여주는 것은 NOS 억제제를 급성 투여한 후 나타나는 혈관 수축과 혈압 상승입니다(Rees et al., 1989). 최근에 내피 세포 특이적 eNOS 결핍 마우스에서 내피 세포에서 발현되는 eNOS가 혈관 조절에 필수적인 역할을 한다는 사실이 최종적으로 확인되었습니다. 이 마우스의 혈관 표현형은 전신 eNOS 결핍 마우스에서 보이는 것과 유사합니다(Leo et al., 2021). 대부분의 심혈관 질환에서 내피 기능의 손상이 관찰되는데, 이는 주로 NO의 낮은 생체 이용률에 의해 유발됩니다(Lundberg et al., 2015). 그러나 이러한 이상 현상을 교정하면 질병의 진행을 지연시키거나 예방할 수 있는지는 아직 밝혀지지 않았습니다. NO 신호 전달과 관련된 유전적 소인이 다양한 일반 질병과 관련이 있는지 조사하는 데 많은 관심이 집중되어 왔습니다. 여러 연구에서 NOS-sGC 신호 전달과 관련된 유전자 변이체와 심혈관 질환의 위험 증가 사이의 연관성을 발견했습니다(Erdmann et al., 2013; Malik et al., 2018). 반대로, NO 신호 전달을 강화하는 유전적 소인은 관상 동맥 심장 질환과 뇌졸중의 위험 감소와 관련이 있습니다(Emdin et al., 2018). 향후 연구에서 이러한 발견의 이점과 임상적 유용성을 확인할 수 있을 것입니다.

Although the role of NO in vascular control is now well established, its function in the heart is less clear. The finding of specific subcellular localization of eNOS and nNOS isoforms in cardiomyocytes indicate different roles of these enzymes in cardiac function (Barouch et al., 2002). These spatial constraints suggest effects coupled to nearby specific effector proteins because diffusion of NO is likely limited by the high amount of myoglobin in cardiac myocytes with NO scavenging properties. However, cardiac myoglobin may have an opposite role in regulating cardiac NO bioavailability, by its nitrite-reducing capacity (Hendgen-Cotta et al., 2008). Activation of eNOS in vitro and in vivo leads to increased cardiomyocyte and ventricular relaxation, which has been attributed to reduced intracellular Ca2+ via inhibition of L-type calcium channels and enhanced Ca2+ reuptake into the SR as well as by PKG-mediated phosphorylation of troponin I and subsequent reduction in myofilament Ca2+ sensitivity (Farah et al., 2018; Shah et al., 1994). The role of NO on contractility and response to B-adrenergic stimulation is more complex with contradicting results. In vivo studies mainly suggest that eNOS localized to caveolae, in vicinity to L-type Ca2+ channels and β-adrenergic receptors (Balijepalli et al., 2006), has been shown to have an inhibitory role on β-adrenergic stimulation (Gödecke et al., 2001; Massion et al., 2004), whereas in vitro studies using cardiomyocytes or muscle preparations give opposite results. This inconsistency may be explained by in vivo paracrine NO signaling from vascular eNOS in regulation of cardiac contractility. Moreover, the vasodilator action of eNOS-derived NO in the coronary vasculature may promote contractility in the in vivo situation (Rassaf et al., 2006). nNOS located at the sarcoplasmic reticulum stimulates Ca2+ release via the ryanodine receptor (RyR) and enhances contractility, possibly by S-nitrosation of thiol groups on the RyR (Barouch et al., 2002; Wang et al., 2010; Xu et al., 1998). Other important roles of NO in cardiac function include regulation of O2 consumption by affecting mitochondrial respiration (Trochu et al., 2000), anti-arrhythmic properties (Reilly et al., 2016), and modulation of autonomic nerve signaling (Schwarz et al., 1995).

Dysregulated NOS activity has been implicated in the pathophysiology of heart failure (HF), but the role of different NOS isoforms is complex. Both increased and/or uncoupled NOS activity has been observed in heart failure and has been associated with dysfunctional Ca2+ handling and cardiac remodeling (Damy et al., 2004; Haywood et al., 1996; Takimoto et al., 2005). Experimental disruption of the nNOS gene aggravates the development of heart failure (Dawson et al., 2005), and conversely cardiomyocyte-specific overexpression‎ of nNOS leads to some protection in animal models (Loyer et al., 2008). Translocation of nNOS away from the sarcoplasmic reticulum to the sarcolemma has been described, leading to altered nNOS-mediated regulation on Ca2+ handling, which by some investigators has been interpreted as an adaptive mechanism to limit effects of chronic β-adrenergic stimulation seen in HF (Damy et al., 2004). Reduced expression‎ of caveolin 3 and eNOS uncoupling have been observed in HF and has been suggested to contribute to hypertrophy and remodeling (Takimoto et al., 2005) (Feiner et al., 2011), whereas overexpression‎ of eNOS has been protective (Jones et al., 2003). In addition, the increased oxidative stress seen in heart failure can negatively affect several steps of the NOS-NO-cGMP-sGC pathway, including oxidation of BH4 and NOS uncoupling, scavenging of NO, and oxidation of sGC (Daiber et al., 2019). In addition, nitrosative stress generated by iNOS induction has also been implicated in HF (Haywood et al., 1996; Schiattarella et al., 2019). This knowledge has stimulated numerous trials targeting the NOS-NO-cGMP-sGC pathway in patients with HF, but, as of today, only the sCG stimulator vericiguat has shown enough efficacy to be approved for clinical use (Armstrong et al., 2020; Borlaug et al., 2018) (Figure 5). In the future, we will most likely see other sGC stimulators and activators emerging in the clinic for a variety of indications.

NO가 혈관 조절에 중요한 역할을 한다는 사실은 잘 알려져 있지만, 심장에서의 기능은 명확하지 않습니다. 심근세포에서 eNOS와 nNOS 이소효소의 특정 세포내 위치가 밝혀짐에 따라, 이 효소들이 심장 기능에 다른 역할을 한다는 사실이 밝혀졌습니다(Barouch et al., 2002). 이러한 공간적 제약은 NO가 NO 제거 특성을 가진 심근세포에 다량의 미오글로빈이 존재하기 때문에 확산이 제한될 가능성이 높기 때문에, 근처의 특정 이펙터 단백질과 결합된 효과를 시사합니다. 그러나 심장 미오글로빈은 아질산염 환원 능력에 의해 심장 NO 생체 이용률을 조절하는 데 반대 역할을 할 수 있습니다(Hendgen-Cotta et al., 2008). 체외 및 체내에서 eNOS의 활성화는 심근세포와 심실 이완을 증가시킵니다. 이는 L형 칼슘 채널의 억제를 통한 세포 내 Ca2+ 감소와 SR로의 Ca2+ 재흡수 증가, 그리고 트로포닌 I의 PKG 매개 인산화 및 그로 인한 근섬유 Ca2+ 민감도의 감소에 기인합니다(Farah et al., 2018; Shah et al., 1994). NO가 수축과 B-아드레날린 자극에 미치는 영향은 더 복잡하고, 그 결과도 서로 상충합니다. 생체 내 연구에 따르면, 주로 L형 Ca2+ 채널과 β-아드레날린 수용체 근처의 소포체에 국한된 eNOS(Balijepalli 외. 2006)가 β-아드레날린 자극에 대한 억제 역할을 하는 것으로 나타났습니다(Gödecke 외. 2001; Massion 외. 2004). 반면, 심근세포 또는 근육 조직을 이용한 체외 연구에서는 반대 결과가 나왔습니다. 이러한 불일치는 심장 수축 조절에 관여하는 혈관 내 eNOS의 생체 내 파라크린 NO 신호에 의해 설명될 수 있습니다. 또한, 관상동맥 혈관계에서 eNOS에서 유래된 NO의 혈관 확장 작용은 생체 내 상황에서 수축을 촉진할 수 있습니다(Rassaf et al., 2006). 유세포근에 위치한 nNOS는 라이노딘 수용체(RyR)를 통해 Ca2+ 방출을 자극하고, RyR의 티올 그룹의 S-니트로화 작용을 통해 수축을 강화할 수 있습니다(Barouch et al., 2002; Wang et al., 2010; Xu et al., 1998). NO가 심장 기능에 미치는 다른 중요한 역할로는 미토콘드리아 호흡에 영향을 미쳐 산소 소비를 조절하는 것(Trochu et al., 2000), 부정맥 방지 특성(Reilly et al., 2016), 자율 신경 신호 조절(Schwarz et al., 1995) 등이 있습니다.

조절되지 않은 NOS 활동은 심부전(HF)의 병태 생리학에 관여하는 것으로 밝혀졌지만, 다양한 NOS 이소효소의 역할은 복잡합니다. 심부전에서 NOS 활동의 증가 및/또는 분리 현상이 관찰되었으며, 이는 기능 장애가 있는 Ca2+ 처리 및 심장 리모델링과 관련이 있습니다(Damy et al., 2004; Haywood et al., 1996; Takimoto et al., 2005). nNOS 유전자의 실험적 파괴는 심부전 발병을 악화시킨다(Dawson et al., 2005). 반대로, 심근세포 특이적 nNOS 과발현은 동물 모델에서 어느 정도 보호 효과를 가져온다(Loyer et al., 2008). nNOS가 근질봉소체에서 근세포막으로 이동하는 현상이 보고된 바 있는데, 이 현상은 nNOS가 매개하는 Ca2+ 조절의 변화를 초래합니다. 일부 연구자들은 이를 심부전(HF)에서 나타나는 만성 β-아드레날린 자극의 영향을 제한하는 적응 메커니즘으로 해석했습니다(Damy et al., 2004). HF에서 카베올린 3의 발현 감소와 eNOS의 결합 해제가 관찰되었으며, 이는 비대와 리모델링에 기여하는 것으로 추정되었습니다(Takimoto et al., 2005) (Feiner et al., 2011), 반면 eNOS의 과발현은 보호 효과가 있는 것으로 나타났습니다(Jones et al., 2003). 또한, 심부전에서 나타나는 산화 스트레스의 증가는 BH4의 산화, NOS의 결합 해제, NO의 제거, sGC의 산화 등 NOS-NO-cGMP-sGC 경로의 여러 단계에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다(Daiber et al., 2019). 또한, iNOS 유도에 의해 생성된 니트로사티브 스트레스도 HF와 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다(Haywood et al., 1996; Schiattarella et al., 2019). 이 지식은 심부전 환자에서 NOS-NO-cGMP-sGC 경로를 표적으로 하는 수많은 실험을 자극했지만, 현재까지 임상 사용을 승인받을 만큼 충분한 효능을 보인 것은 sCG 자극제 베리시구아트뿐입니다(Armstrong et al., 2020; Borlaug et al., 2018) (그림 5). 앞으로 다양한 적응증에 대한 다른 sGC 자극제와 활성화제가 병원에서 등장할 가능성이 높습니다.

Figure 5. Approved NO-related therapies and diagnostic procedures

Treatment with organic nitrates including nitroglycerine has been used clinically for over 150 years, i.e., long before we knew that NO was a signaling molecule in mammals. These drugs act through the release of NO bioactivity and formation of cGMP to reduce cardiac pre- and afterload and dilate coronary vessels, thereby relieving angina pectoris. Inhalation of authentic NO gas is approved for clinical use in newborn babies with respiratory distress syndrome and pulmonary hypertension. The beauty of inhaled NO is its ‘‘double selectivity.’’ First, because it is administered via inhalation it dilates only vessels supplying well-ventilated parts of the lungs, which increases ventilation-perfusion matching. Secondly, NO is more or less selective to the lung and systemic vasodilatation is minimized due to the rapid scavenging of NO in blood. A hybrid compound linking the glaucoma drug latanoprost with an organic nitrate was recently approved and is used topically. The NO moiety is said to increase the overall efficiency of this drug via improved drainage of aqueous humor. Airway formation of NO is altered in inflammatory airway disease and measurements of exhaled NO in a single breath is an approved method used to diagnose and monitor treatment of allergic asthma. In primary ciliary dyskinesia (PCD), airway levels of NO are markedly reduced, and this test is used in the diagnostic workup for this genetic airway disease. Drugs that stimulate sGC have been approved for use in patients with heart failure as well as in pulmonary artery hypertension. Finally, PDE5 inhibitors inhibit the breakdown of cGMP and are used clinically for erectile dysfunction and benign prostate hyperplasia and have also been approved for pulmonary artery hypertension. The generic names of example drugs are given in the right column.

그림 5. NO 관련 치료 및 진단 절차 승인
니트로글리세린을 포함한 유기 질산염을 이용한 치료는 임상적으로 150년 이상 사용되어 왔습니다. 즉, NO가 포유류에서 신호 전달 분자라는 사실이 밝혀지기 훨씬 전부터 사용되어 왔습니다. 이러한 약물은 NO 생체 활성의 방출과 cGMP의 형성을 통해 작용하여 심장 전하중과 후하중을 줄이고 관상동맥을 확장함으로써 협심증을 완화합니다. 진정한 NO 가스의 흡입은 호흡곤란증후군과 폐고혈압을 앓고 있는 신생아에게 임상적으로 사용하도록 승인되었습니다. 흡입된 NO 가스의 장점은 바로 '이중 선택성'입니다. 첫째, 흡입을 통해 투여되기 때문에, 폐의 환기가 잘 되는 부위에 공급되는 혈관만 확장시켜서, 환기-관류 일치도를 높입니다. 둘째, NO는 폐에 어느 정도 선택적으로 작용하며, 혈액에서 NO가 빠르게 소거되기 때문에 전신 혈관 확장이 최소화됩니다. 녹내장 치료제인 라타노프로스트와 유기 질산염을 결합한 복합제가 최근 승인되어 국소적으로 사용되고 있습니다. NO 분자는 방수 분비물의 배출을 개선함으로써 이 약의 전반적인 효율성을 높인다고 알려져 있습니다. NO의 기도 형성 과정은 염증성 기도 질환에서 변화되며, 한 번의 호흡에서 내뿜는 NO의 측정은 알레르기성 천식의 진단과 치료 모니터링에 사용되는 승인된 방법입니다. 원발성 섬모 운동 이상증(PCD)에서는 기도 내 NO 수치가 현저하게 감소하며, 이 검사는 이 유전성 기도 질환의 진단을 위한 검진에 사용됩니다. sGC를 자극하는 약물은 심부전 환자뿐만 아니라 폐동맥 고혈압 환자들에게도 사용이 승인되었습니다. 마지막으로, PDE5 억제제는 cGMP의 분해를 억제하고 발기부전 및 양성 전립선 비대증에 임상적으로 사용되며, 폐동맥 고혈압에 대해서도 사용이 승인되었습니다. 예시된 약물의 일반명은 오른쪽 열에 나와 있습니다.

Numerous studies in models of myocardial ischemia-reperfusion (IR) injury strongly suggest NO-mediated protection. Transgenic overexpression‎ of eNOS (Elrod et al., 2006; Janssens et al., 2004) and NO donors (Bice et al., 2016) show protection, whereas NOS inhibition aggravates injury (Schulz et al., 2004). However, results from various strains of eNOS KO mice show different effects on myocardial injury (Sharp et al., 2002). Mitochondria have been suggested to be central targets by which NO can ameliorate cardiac IR injury. Via opening of KATP channels, NO may reduce Ca2+ overload (Sasaki et al., 2000), by inhibiting opening of mitochondrial permeability transition pores it can prevent cytochrome c release and apoptosis (Shiva et al., 2007), and NO may also limit ROS generation through S-nitrosation of complex I (Burwell et al., 2006; Chouchani et al., 2013). In addition, the inhibitory effect of NO on cytochrome c oxidase has been suggested to positively regulate myocardial O2 consumption (Trochu et al., 2000). Other well-described effects of NO may also contribute to protection including dilation of coronary blood vessels, scavenging of superoxide, inhibition of platelet, and leukocyte aggregation and arginase inhibition (Omar et al., 2016). The impressive preclinical data highlighting the beneficial role of NO in IR injury have unfortunately not been followed by positive outcomes in human studies so far. Randomized clinical trials in human cardiac IR injury with organic nitrates (Morris et al., 1995), inhaled NO (Janssens et al., 2018), inorganic nitrite (Jones et al., 2015; Kim et al., 2021; Siddiqi et al., 2014), or nitrate (Eriksson et al., 2021) do not show major positive effects.

심근 허혈-재관류(IR) 손상 모델에 대한 수많은 연구에서 NO 매개 보호가 강력하게 제시되고 있습니다. eNOS(Elrod et al., 2006; Janssens et al., 2004)와 NO 기증자(Bice et al., 2016)의 트랜스제닉 과발현은 보호 효과를 나타내는 반면, NOS 억제는 손상을 악화시킵니다(Schulz et al., 2004). 그러나, eNOS KO 마우스의 다양한 변종에 대한 결과는 심근 손상에 대한 다른 효과를 보여줍니다(Sharp et al., 2002). 미토콘드리아는 NO가 심장 IR 손상을 개선할 수 있는 중심 표적이라고 제안되었습니다. NO는 KATP 채널의 개방을 통해 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개방을 억제함으로써 Ca2+ 과부하를 감소시킬 수 있으며(Sasaki et al., 2000), 사이토크롬 c 방출과 세포자멸사(Shiva et al., 2007)를 방지할 수 있습니다. 또한 NO는 복합체 I의 S-니트로화를 통해 ROS 생성을 제한할 수 있습니다(Burwell et al., 2006; Chouchani et al., 2013). 또한, NO가 사이토크롬 C 산화효소에 미치는 억제 효과가 심근의 산소 소비를 긍정적으로 조절한다고 제안되었습니다(Trochu et al., 2000). NO의 다른 잘 알려진 효과들 또한 보호에 기여할 수 있습니다. 여기에는 관상동맥 혈관 확장, 슈퍼옥사이드 소거, 혈소판 억제, 백혈구 응집 억제, 아르기나제 억제 등이 포함됩니다(Omar et al., 2016). IR 손상에 대한 NO의 유익한 역할을 강조하는 인상적인 전임상 데이터가 불행히도 지금까지 인간 연구에서 긍정적인 결과를 얻지 못했습니다. 인간 심장 IR 손상에 대한 유기 질산염(Morris et al., 1995), 흡입된 NO(Janssens et al., 2018), 무기 질산염(Jones et al., 2015; Kim et al., 2021; Siddiqi et al., 2014), 또는 질산염(Eriksson et al., 2021)을 사용한 무작위 임상 시험에서는 큰 긍정적인 효과가 나타나지 않았습니다.

The red blood cell and platelets

The red blood cell (RBC) has a unique role in NO biology, both as a major inactivation pathway and, at the same time, a transducer of NO bioactivity (Cosby et al., 2003; Pawloski and Stamler, 2002; Yang et al., 2013). RBCs contain hemoglobin at 5–10 mM, and, when oxygenated, this protein functions as an extremely effective dioxygenase, rapidly metabolizing NO to form nitrate and Met-Hb (Fe3+) (Doyle and Hoekstra, 1981). By this mechanism, RBCs inactivate NO diffusing from the endothelium into the vessel lumen so that free NO is practically non-existent in the blood. Stamler and colleagues originally proposed that RBCs are in fact also capable of generating and exporting NO bioactivity to elicit vasodilation (Jia et al., 1996). Intriguingly, such release is said to be dynamically controlled by the degree of blood oxygenation, with more NO bioactivity exported under hypoxic conditions, thereby enabling exact matching of blood flow and tissue oxygen demand. Mechanistically, in the arterial oxygenated blood, an NO+ moiety is transferred from nitrosyl-Hb to a highly conserved cysteine residue at position 93 of the β chain of Hb (β93C) to form S-nitroso (SNO)-Hb. In turn, on subsequent deoxygenation, SNO-Hb exports NO bioactivity from the RBC to cause vasorelaxation (Premont et al., 2022). An alternative means of RBC generation and export of NO bioactivity was suggested by Gladwin, Rifkind, and their coworkers, who described enzymatic reduction of nitrite to NO by deoxy-Hb, a reaction also enabling maximal NO export when vasodilatation is most needed (Cosby et al., 2003; Nagababu et al., 2003). Nitrite is an oxidation product of NO; so, this would represent an intriguing mechanism for the recycling or reactivation of this biological messenger and is discussed in further detail below (Gladwin et al., 2000; Modin et al., 2001). The general ability of RBCs to generate and export NO bioactivity has been heavily debated over the years, mainly because NO is not believed to be able to escape rapid destruction by the Hb reaction. However, more recent studies do in fact confirm‎ that export of NO bioactivity can occur albeit not in the form of free NO. Building on the surprising demonstration of a catalytically active eNOS in RBCs (Kleinbongard et al., 2006), Yang and colleagues went on to show that this eNOS controls the release of cardioprotective NO bioactivity in a process regulated by arginase 1 (Yang et al., 2013). Isolated mouse hearts exposed to IR injury were protected if the coronary circulation was perfused with isolated RBCs prior to the onset of ischemia, and the protection was lost if RBCs from eNOS deficient mice were used. Interestingly, the cardioprotective effect is entirely independent on the presence of eNOS in the heart itself because hearts from global eNOS knockouts were protected if perfused with WT RBCs. In a recent publication, Cortese-Krott and coworkers describe the generation of RBC-specific eNOS knockout mice and show increased infarct size and aggravated left ventricular dysfunction after in vivo myocardial infarction, compared to wild-type controls (Cortese-Krott et al., 2022). Moreover, in vitro studies where RBCs and platelets are co-incubated suggest that NO bioactivity can be released upon deoxygenation to affect platelet function (Srihirun et al., 2012). To further dissect the mechanisms behind RBC export of NO bioactivity, mice in which the β93 cysteine of Hb has been replaced with alanine (β93A) were developed. Multiple different experiments both in vivo and in vitro now show that NO bioactivity export from RBCs does not require the presence of a β93 cysteine in Hb, leaving the exact mechanism of the RBC-derived vasodilatation and tissue protection unresolved (Isbell et al., 2008; Sun et al., 2019). Although these mice clearly have a phenotype with pulmonary hypertension and premature death when kept in a low oxygen environment (Zhang et al., 2022), there is no evidence that this is selectively caused by abrogated SNO-Hb signaling. Notably, the Hb β93 cysteine might in fact have an alternative role for example in protecting the heme iron against oxidation as suggested in early studies (Winterbourn and Carrell, 1977). Cortese-Krott and colleagues recently developed tissue-specific eNOS knockout mice lacking this enzyme either in endothelial cells or in RBCs (Leo et al., 2021). Their study nicely confirm‎s the central role for eNOS in the endothelium in control of vascular function and blood pressure and additionally suggest a surprising role also for RBC eNOS in blood pressure control. Indeed, blood pressure was increased in both mutant strains and could be normalized by reintroducing the eNOS gene in the endothelium or in RBCs, respectively. RBCs are currently being established as exporters of NO bioactivity to elicit vasodilatation and tissue protection. Interestingly, the opposite also seems to be true. Thus, under certain circumstances RBCs can mediate oxidative stress, endothelial dysfunction and increased susceptibility toward IR injury (Pernow et al., 2019). RBCs collected from type-2 diabetics induce endothelial dysfunction if co-incubated with healthy vessels (Zhou et al., 2018) and aggravate myocardial injury when perfused in an ex vivo rodent heart model before exposed to global hypoxia (Yang et al., 2018). These effects seem ROS dependent and mediated by increased arginase-1 activity coupled to reduced NOS activity and signaling in the RBC.

적혈구와 혈소판

적혈구(RBC)는 NO 생물학에서 주요 비활성화 경로이자 동시에 NO 생체활성의 전달자로서 독특한 역할을 합니다(Cosby et al., 2003; Pawloski and Stamler, 2002; Yang et al., 2013). 적혈구에는 5-10mM의 헤모글로빈이 포함되어 있으며, 산소가 공급되면 이 단백질은 매우 효과적인 디옥시게나제(dioxygenase)로 작용하여 NO를 빠르게 대사하여 질산염과 메트헤모글로빈(Met-Hb, Fe3+)을 형성합니다(Doyle and Hoekstra, 1981). 이러한 메커니즘을 통해 적혈구는 내피에서 혈관 내강으로 확산되는 NO를 비활성화하여 혈액에 유리 NO가 거의 존재하지 않도록 합니다. Stamler와 동료들은 원래 RBC가 실제로도 혈관 확장을 유도하기 위해 NO 생체활성을 생성하고 수출할 수 있다고 제안했습니다(Jia et al., 1996). 흥미롭게도, 이러한 방출은 혈액 산소화 정도에 의해 동적으로 제어된다고 알려져 있으며, 저산소 상태에서 더 많은 NO 생체활성이 수출되어 혈류와 조직 산소 요구량의 정확한 일치를 가능하게 합니다. 기계적으로, 동맥혈의 산소화된 혈액에서, NO+ 부분이 니트로실-헤모글로빈(nitrosyl-Hb)에서 헤모글로빈의 β 사슬의 93번 위치(β93C)에 있는 고도로 보존된 시스테인 잔기로 옮겨져 S-니트로소(SNO)-헤모글로빈을 형성합니다. 그 다음, 이후의 탈산소화 과정에서, SNO-헤모글로빈은 NO 생체활성을 적혈구에서 내보내어 혈관 이완을 유발합니다(Premont et al., 2022). NO 생성과 RBC 수출의 대안적인 수단은 Gladwin, Rifkind, 그리고 그들의 동료들에 의해 제시되었습니다. 그들은 혈관 확장이 가장 필요한 경우 NO 수출을 극대화할 수 있는 반응인 deoxy-Hb에 의한 아질산염의 효소적 환원을 설명했습니다(Cosby et al., 2003; Nagababu et al., 2003). 아질산염은 NO의 산화 생성물입니다. 따라서 이것은 생물학적 메신저의 재활용 또는 재활성화에 대한 흥미로운 메커니즘을 나타내며, 아래에서 자세히 설명합니다(Gladwin et al., 2000; Modin et al., 2001). NO 생체 활성을 생성하고 수출하는 적혈구의 일반적인 능력은 수년 동안 많은 논쟁을 불러일으켰습니다. 주로 NO가 Hb 반응에 의해 빠르게 파괴되는 것을 피할 수 없다고 믿었기 때문입니다. 그러나 최근의 연구에 따르면, 자유 NO의 형태는 아니지만 NO 생체 활성의 수출이 실제로 일어날 수 있다는 사실이 확인되었습니다. 적혈구에서 촉매 활성 eNOS의 놀라운 발견(Kleinbongard et al., 2006)을 바탕으로, Yang과 동료 연구자들은 이 eNOS가 아르기나제 1에 의해 조절되는 과정에서 심장 보호 NO 생체 활성의 방출을 제어한다는 것을 보여주었습니다(Yang et al., 2013). 허혈이 시작되기 전에 고립된 적혈구로 관상동맥 순환을 관류시키면, IR 손상에 노출된 고립된 마우스 심장이 보호되었고, eNOS 결핍 마우스의 적혈구를 사용하면 보호 효과가 사라졌습니다. 흥미롭게도, 심장의 eNOS 존재 여부는 심장 보호 효과와 전혀 무관합니다. 왜냐하면, 전신 eNOS 결핍 마우스의 심장은 WT 적혈구로 관류시키면 보호되었기 때문입니다. 최근 출판물에서, Cortese-Krott와 동료 연구자들은 RBC 특이적 eNOS 결손 마우스의 생성을 설명하고, 야생형 대조군과 비교했을 때, 생체 내 심근 경색 후 경색 크기가 증가하고 좌심실 기능 장애가 악화된다는 것을 보여줍니다(Cortese-Krott et al., 2022). 또한, 적혈구와 혈소판을 함께 배양하는 체외 연구에 따르면, 탈산소 시 NO 생체활성이 방출되어 혈소판 기능에 영향을 미칠 수 있다고 합니다(Srihirun et al., 2012). NO 생체활성의 적혈구 수출 메커니즘을 더 자세히 분석하기 위해, Hb의 β93 시스테인이 알라닌(β93A)으로 대체된 생쥐가 개발되었습니다. 생체 내와 생체 외에서 여러 가지 실험을 통해 적혈구에서 NO 생체 활성이 Hb에 β93 시스테인이 존재하지 않아도 가능하다는 사실이 밝혀졌지만, 적혈구에서 유래된 혈관 확장 및 조직 보호의 정확한 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다(Isbell et al., 2008; Sun et al., 2019). 이 생쥐들은 저산소 환경에 노출되었을 때 폐 고혈압과 조기 사망을 유발하는 표현형을 분명히 가지고 있지만(Zhang et al., 2022), 이것이 SNO-Hb 신호 전달의 중단에 의해 선택적으로 유발된다는 증거는 없습니다. 특히, Hb β93 시스테인은 초기 연구에서 제안된 바와 같이 실제로 산화로부터 헴 철을 보호하는 것과 같은 대체 역할을 할 수 있습니다(Winterbourn and Carrell, 1977). Cortese-Krott와 동료 연구자들은 최근에 내피 세포나 적혈구에서 이 효소가 결핍된 조직 특이적 eNOS 결손 생쥐를 개발했습니다(Leo et al., 2021). 이 연구는 혈관 기능과 혈압 조절에 있어서 내피에서 eNOS가 중심적인 역할을 한다는 것을 잘 보여주고 있으며, 또한 혈압 조절에 있어서 적혈구 eNOS가 놀랍게도 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 실제로, 돌연변이 균주 모두에서 혈압이 증가했으며, 내피 또는 적혈구에서 각각 eNOS 유전자를 재도입함으로써 정상화될 수 있었습니다. 적혈구는 현재 혈관 확장 및 조직 보호를 유도하기 위한 NO 생체 활성의 수출자로 자리매김하고 있습니다. 흥미롭게도, 그 반대도 사실인 것 같습니다. 따라서 특정 상황에서 적혈구는 산화 스트레스, 내피 기능 장애, 그리고 IR 손상에 대한 민감성 증가를 중재할 수 있습니다(Pernow et al., 2019). 제2형 당뇨병 환자로부터 채취한 적혈구는 건강한 혈관과 함께 배양될 경우 내피 기능 장애를 유발합니다(Zhou et al., 2018). 그리고 전신 저산소증에 노출되기 전에 생체 외 설치류 심장 모델에서 관류될 경우 심근 손상을 악화시킵니다(Yang et al., 2018). 이러한 효과는 ROS에 의존적이며, 적혈구 내 NOS 활성 감소 및 신호 전달과 함께 증가된 아르기나제-1 활성에 의해 매개되는 것으로 보입니다.

Platelets were shown early to be affected by NO (Radomski et al., 1987). These cells harbor their own eNOS (Sase and Michel, 1995) and may also import NO bioactivity, with the main effect being to inhibit platelet activation in a cGMP-dependent fashion (Freedman et al., 1999). This is illustrated by the shortened bleeding time observed after inhibition of NOS (Remuzzi et al., 1990) and in eNOS deficient mice (Freedman et al., 1999), and enhanced experimental thrombus formation also seen in these animals (Shultz and Raij, 1992). Later studies revealed a more complex regulatory role of platelet NO/cGMP-signaling involving its downstream target PKG. The events consist of an early stimulatory response that promotes platelet activation followed by a delayed platelet inhibition that serves to limit the size of platelet aggregates (Li et al., 2003).

혈소판은 일찍부터 NO의 영향을 받는 것으로 나타났습니다(Radomski et al., 1987). 이 세포는 자체 eNOS(Sase and Michel, 1995)를 보유하고 있으며, NO의 생체 활성을 도입할 수도 있습니다. 주요 효과는 cGMP 의존적 방식으로 혈소판 활성화를 억제하는 것입니다(Freedman et al., 1999). 이는 NOS 억제 후 관찰되는 출혈 시간의 단축(Remuzzi et al., 1990)과 eNOS 결핍 마우스(Freedman et al., 1999)에서 관찰되는 출혈 시간의 단축, 그리고 이들 동물에서 관찰되는 실험적 혈전 형성 강화(Shultz and Raij, 1992)를 통해 알 수 있습니다. 이후의 연구에 따르면 혈소판 NO/cGMP 신호가 혈소판의 하류 표적 PKG를 포함하는 보다 복잡한 조절 역할을 한다는 사실이 밝혀졌습니다. 이 과정은 혈소판 활성화를 촉진하는 초기 자극 반응과 혈소판 응집체의 크기를 제한하는 지연된 혈소판 억제로 구성됩니다(Li et al., 2003).

Metabolic regulation

NO is a physiological regulator of mitochondrial respiration by inhibition of cytochrome c oxidase (CCO) at its binuclear heme/copper site (Brown and Cooper, 1994; Carr and Ferguson, 1990; Cleeter et al., 1994). The reaction with reduced heme is competitive with oxygen and is predominantly occurring at high electron fluxes. At lower electron fluxes and oxidized copper, the reaction with NO generates a cupric-nitrite complex, which cannot react with oxygen and is, therefore, not truly competitive. The inhibitory effect of NO is higher at low PO2 meaning that during hypoxic conditions lower levels of NO are needed, but at the same time under such conditions NOS activity would be reduced due to less available oxygen (Erusalimsky and Moncada, 2007). Experimental data show that low nanomolar concentrations of NO, resembling physiological concentrations, raise Km for oxygen substantially, thereby affecting respiration (Brown and Cooper, 1994). Components of the electron transport chain (complex III, cytochrome c, and CCO) can generate NO by reduction of inorganic nitrite that may contribute to regulation of mitochondrial respiration (Basu et al., 2008; Castello et al., 2006; Kozlov et al., 1999). However, the regulatory role of NO in vivo has been more difficult to establish. Animal experiments show that systemic administration of NOS inhibitors increase oxygen consumption in various tissues as well as whole-body oxygen consumption (Shen et al., 1994). In humans, however, the effects of systemic NOS inhibition on oxygen consumption show conflicting results (Heinonen et al., 2011; Schrage et al., 2010). Interestingly, human studies show that inorganic nitrate reduces oxygen cost during rest (Larsen et al., 2014) and exercise (Larsen et al., 2007) and has been shown to increase skeletal muscle mitochondrial efficiency (P/O ratio) due to down regulation of uncoupling protein 3 and ATP/ADP translocase, leading to less uncoupling (Larsen et al., 2011).

There are several theories aiming to explain the physiological rationale for NO-mediated CCO inhibition. One suggestion is that inhibition by NO leads to redistribution of intracellular oxygen to other enzymes with higher Km for oxygen, exemplified by NO-dependent increase in prolyl hydroxylase-degradation of HIF-1α (Hagen et al., 2003; Trimmer et al., 2001). Conversely, the incomplete reduction of O2 at the electron transport chain promotes generation of superoxide and hydrogen peroxide that can participate in physiological signaling to reduce prolyl hydroxylase-degradation and activate HIF-1a-dependent downstream signaling (Sarkela et al., 2001). The same mechanism has been proposed to affect redox-sensitive transcription factors, such as NFκB and Nrf2. Other interpretations suggest that NO-mediated CCO inhibition extends the O2 gradient from capillary to more distant cells (Thomas et al., 2001) and regulates cardiac O2 consumption (Trochu et al., 2000). However, higher levels of NO generation, which is seen after iNOS induction may lead to irreversible CCO inhibition, increased ROS and reactive nitrogen species (RNS) formation and mitochondrial damage, which has been a proposed mechanism partly explaining mitochondrial dysfunction in sepsis (Brealey et al., 2002).

대사 조절

NO는 이핵 헤모/구리 부위(Brown and Cooper, 1994; Carr and Ferguson, 1990; Cleeter et al., 1994)에서 사이토크롬 c 산화효소(CCO)를 억제함으로써 미토콘드리아 호흡을 조절하는 생리적 물질입니다. 환원된 헤모와의 반응은 산소와 경쟁적이며, 높은 전자 플럭스에서 주로 발생합니다. 낮은 전자 플럭스와 산화된 구리에서 NO와의 반응은 산소와 반응할 수 없는 아질산구리 복합체를 생성하므로, 경쟁적이라고 할 수 없습니다. 낮은 PO2에서 NO의 억제 효과가 더 높다는 것은 저산소 조건에서는 낮은 수준의 NO가 필요하다는 것을 의미하지만, 동시에 이러한 조건에서는 이용 가능한 산소가 적기 때문에 NOS 활동이 감소할 것입니다(Erusalimsky and Moncada, 2007). 실험 데이터에 따르면 생리적 농도와 유사한 낮은 나노몰 농도의 NO가 산소 K_m을 상당히 높여 호흡에 영향을 미친다고 합니다(Brown and Cooper, 1994). 전자 수송 사슬의 구성 요소(복합체 III, 시토크롬 c, CCO)는 미토콘드리아 호흡 조절에 기여할 수 있는 무기 아질산염의 환원을 통해 NO를 생성할 수 있습니다(Basu et al., 2008; Castello et al., 2006; Kozlov et al., 1999). 그러나 생체 내 NO의 조절 역할은 확립하기가 더 어려웠습니다. 동물 실험에 따르면 NOS 억제제의 전신 투여는 다양한 조직의 산소 소비량뿐만 아니라 전신 산소 소비량도 증가시킵니다(Shen et al., 1994). 그러나 인간에게 있어 전신 NOS 억제가 산소 소비량에 미치는 영향은 상반된 결과를 보여줍니다(Heinonen et al., 2011; Schrage et al., 2010). 흥미롭게도, 인간 대상 연구에 따르면 무기질 질산염은 휴식(Larsen et al., 2014)과 운동(Larsen et al., 2007) 중 산소 소모량을 줄이고, 미토콘드리아의 효율(P/O 비율)을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 이는 결합 해제 단백질 3과 ATP/ADP 트랜스포라제의 하향 조절로 인해 결합 해제가 감소하기 때문입니다(Larsen et al., 2011).

NO에 의한 CCO 억제의 생리학적 근거를 설명하려는 몇 가지 이론이 있습니다. 그 중 하나는 NO에 의한 억제가 산소 분해효소(oxygen-dependent enzyme)의 Km이 더 높은 다른 효소로 세포 내 산소를 재분배하게 만든다는 것입니다. 예를 들어, NO에 의존하는 HIF-1α의 프롤릴 하이드록실라제 분해(Hagen et al., 2003; Trimmer et al., 2001)가 그 예입니다. 반대로, 전자 수송 사슬에서 O2의 불완전한 환원은 생리적 신호 전달에 관여할 수 있는 과산화수소와 과산화수소 생성을 촉진하여 프로릴 하이드록실라제의 분해를 감소시키고 HIF-1a 의존성 하류 신호 전달을 활성화합니다(Sarkela et al., 2001). 동일한 메커니즘이 NF-κB 및 Nrf2와 같은 산화 환원 민감성 전사 인자에 영향을 미치는 것으로 제안되었습니다. 다른 해석에 따르면, NO에 의한 CCO 억제는 모세혈관에서 더 먼 세포까지 O2 구배를 확장하고(Thomas et al., 2001), 심장 O2 소비를 조절합니다(Trochu et al., 2000). 그러나 iNOS 유도에 따른 NO 생성 수준이 높아지면 돌이킬 수 없는 CCO 억제, ROS 및 반응성 질소 종(RNS) 형성 증가, 미토콘드리아 손상이 발생할 수 있으며, 이는 패혈증에서 미토콘드리아 기능 장애를 부분적으로 설명하는 메커니즘으로 제안되었습니다(Brealey et al., 2002).

Mitochondrial biogenesis is an adaptive response to several stimuli, most importantly exercise (Egan and Zierath, 2013) and caloric restriction (Civitarese et al., 2007). Early in vitro studies by Nisoli and coworkers could show eNOS-cGMP-dependent mitochondrial biogenesis mediated by PGC1-α in mammalian cells (Nisoli et al., 2003) and later during caloric restriction in mice (Nisoli et al., 2005). However, subsequent studies in transgenic mice or with NOS inhibition show varying results related to tissue and type of NOS isoform to the importance of NO for mitochondrial biogenesis (Schild et al., 2006; Wadley and McConell, 2007). Moreover, the importance of NO in this context seems different between rest and after exercise (Wadley et al., 2007).

The described effects of NO on mitochondrial function and redox reactions are of importance for metabolic homeostasis. This is exemplified by the development of metabolic dysfunction with dyslipidemia, impaired glucose tolerance and deficient mitochondrial β-oxidation in mice lacking eNOS (Carlström et al., 2010; Le Gouill et al., 2007) and the association between eNOS polymorphisms and diabetes (Monti et al., 2003). Physiological NO signaling is involved in several pathways related to carbohydrate and lipid metabolism and has been shown to modulate insulin secretion and glucose uptake (Bahadoran et al., 2020). The role of NO in insulin secretion upon glucose stimulation is complex with both stimulatory and inhibitory effects, the latter suggested by some investigators to reduce excessive insulin secretion to protect the β cells (Henningsson et al., 2002; Laffranchi et al., 1995; Lajoix et al., 2001). The different roles of eNOS and nNOS in enhancing glucose uptake in skeletal muscle, liver, and adipose tissue are not fully elucidated, but a common mechanism is by increasing glucose transporter 4 (GLUT 4) expression‎ and its translocation to the membrane, which partly involves AMPK phosphorylation (Li et al., 2004; Lira et al., 2007). Glucose uptake is also facilitated by the vasodilatory action of eNOS-derived NO. In addition to the peripheral effects of NO described above, data suggest involvement also in central regulation and sensing of glucose homeostasis (Fioramonti et al., 2010). Although these mechanisms are still unclear, NO-dependent modulation of release of hypothalamic-pituitary hormones as well as vagal nitrergic signaling have been suggested (Murphy et al., 2009).

Reduced NO bioavailability due to a combination of diminished synthesis, eNOS uncoupling, and increased oxidative stress has been described in obesity and diabetes and has been implicated in metabolic and cardiovascular dysfunction (Bahadoran et al., 2020). However, iNOS induction has been observed in diabetes and obesity and even if the role of iNOS is unclear, high NO levels seem to negatively affect β cell function (Corbett et al., 1993) and induce insulin resistance in peripheral tissues (Perreault and Marette, 2001). This raises questions regarding dosing, timing, and other aspects when exploring beneficial effects of NO donating substances to improve metabolic function.

미토콘드리아 생성은 여러 자극에 대한 적응 반응으로, 그중에서도 가장 중요한 것은 운동(Egan and Zierath, 2013)과 칼로리 제한(Civitarese et al., 2007)입니다. 니솔리(Nisoli)와 동료 연구자들의 초기 체외 연구에서는 포유류 세포에서 PGC1-α에 의해 매개되는 eNOS-cGMP 의존성 미토콘드리아 생성이 관찰될 수 있었습니다(Nisoli et al., 2003). 그리고 나중에 쥐의 열량 제한 기간 동안에도 관찰되었습니다(Nisoli et al., 2005). 그러나, 이후의 트랜스제닉 마우스나 NOS 억제 연구에서는 미토콘드리아 생성에 대한 NO의 중요성과 관련하여 조직과 NOS 이소폼의 유형에 따라 다양한 결과가 나타났습니다(Schild et al., 2006; Wadley and McConell, 2007). 또한, 이 맥락에서 NO의 중요성은 휴식 상태와 운동 후 상태에 따라 다른 것으로 보입니다(Wadley et al., 2007).

미토콘드리아 기능과 산화 환원 반응에 대한 NO의 영향은 대사 항상성에 중요한 의미를 갖습니다. 이는 eNOS가 결핍된 생쥐에서 이상지질혈증, 내당능 장애, 미토콘드리아 β-산화 기능 장애와 같은 대사 기능 장애가 발생하는 사례(Carlström et al., 2010; Le Gouill et al., 2007)와 eNOS 다형성과 당뇨병의 연관성(Monti et al., 2003)을 통해 잘 알 수 있습니다. 생리학적 NO 신호는 탄수화물과 지질 대사와 관련된 여러 경로에 관여하며, 인슐린 분비와 포도당 흡수를 조절하는 것으로 나타났습니다(Bahadoran et al., 2020). 포도당 자극에 따른 인슐린 분비에 있어서 NO의 역할은 자극과 억제 효과가 복합적으로 작용하는 것으로, 일부 연구자들은 후자의 효과가 β세포를 보호하기 위해 과도한 인슐린 분비를 줄이는 것이라고 주장합니다(Henningsson et al., 2002; Laffranchi et al., 1995; Lajoix et al., 2001). 골격근, 간, 지방 조직에서 포도당 흡수를 촉진하는 eNOS와 nNOS의 역할은 완전히 밝혀지지 않았지만, 공통적인 메커니즘은 포도당 수송체 4(GLUT 4)의 발현과 막으로의 전좌를 증가시키는 것으로, 부분적으로는 AMPK 인산화가 관여합니다(Li et al., 2004; Lira et al., 2007). 또한, eNOS에서 생성된 NO의 혈관 확장 작용에 의해 포도당 흡수가 촉진됩니다. 위에서 설명한 NO의 말초 효과 외에도, 데이터에 따르면 포도당 항상성의 중심 조절과 감지에도 관여한다는 사실이 밝혀졌습니다(Fioramonti et al., 2010). 이러한 메커니즘은 아직 명확하지 않지만, 시상하부-뇌하수체 호르몬의 방출과 미주 신경의 질산염 신호 전달에 대한 NO 의존적 조절이 제안되었습니다(Murphy et al., 2009).

비만과 당뇨병에서 감소된 합성, eNOS 분리, 증가된 산화 스트레스의 조합으로 인한 NO 생체 이용률 감소가 설명되었으며, 이는 대사 및 심혈관 기능 장애와 관련이 있습니다(Bahadoran et al., 2020). 그러나, iNOS 유도는 당뇨병과 비만에서 관찰되었으며, iNOS의 역할이 명확하지 않더라도 높은 NO 수치가 β 세포 기능에 부정적인 영향을 미치고 말초 조직에서 인슐린 저항성을 유발하는 것으로 보입니다(Corbett et al., 1993). 이것은 대사 기능을 개선하기 위해 NO를 제공하는 물질의 유익한 효과를 탐구할 때 투여량, 투여 시기 및 기타 측면에 관한 질문을 제기합니다.

Neurotransmission

Nitric oxide is profoundly involved in central and peripheral neuronal signaling, regulating a multitude of modalities including control of movement, energy homeostasis, learning, memory, sleep, feeding, anxiety, reproduction, and regulation of cerebral blood flow (Garthwaite, 2019). nNOS is the most abundant isoform in the central nervous system (CNS), distributed in most regions of the brain but with some histological dominance in cerebellar cortex, the olfactory bulb, the striatum, the hypothalamus, and the hippocampus and found mostly in GABAergic and glutaminergic neurons (Chachlaki and Prevot, 2020). The expression‎ in both excitatory and inhibitory neurons can explain the multiple roles of NO in neuronal communication, supported by data from several studies using nNOS gene disrupted mice (Tanda et al., 2009; Weitzdoerfer et al., 2004). In addition, the three-dimensional release of NO and the ability to diffuse through cell membranes allows multimodal signaling and synaptic crosstalk via retrograde transsynaptic activity, as well as neurone-astrocyte communication (Figure 1). Complexity is further compounded by the fact that vascular eNOS in proximity to neurons can modulate nerve transmission and that NO also signals to heterogeneous non-neuronal NO targets such as blood vessels (Garthwaite, 2019). The most common nNOS splice variant in the CNS is nNOSα, which contains a PDZ domain that allows for physical interaction with N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAr) in complex with postsynaptic density protein 95 (PSD95) (Brenman et al., 1996). Glutamate activation of the NMDAr leads to influx of intracellular Ca2+ and subsequent nNOS activation, which can be further enhanced by phosphorylaytion of serine 1412 by AKT (Adak et al., 2001). The main signaling mode in the CNS is via the NO-sGC-cGMP axis with subsequent phosphorylation of several possible molecular targets. However, excessive glutaminergic NMDAr activation and increased NO generation, contributes to several pathological processes such as stroke, epilepsy, and neurodegenerative disorders (Zhou and Sheng, 2013). It is obvious that regulation of NMDAr activity is critical for normal brain function and avoidance of brain damage and an inhibitory feedback role of NO has been suggested by S-nitrosation of NMDAr-associated ion channels (Choi et al., 2000; Raju et al., 2015)

One central role of NO in the brain is its role in control of presynaptic function, which has bearing on synaptic plasticity and long-term potentiation related to memory function (Hardingham et al., 2013). From work mainly in glutaminergic and GABAergic neurons, it is evident that NO generated postsynaptically signals retrogradely by diffusion across the synaptic cleft, resulting in increased presynaptic function. This may be achieved by several concerting mechanisms including direct stimulation of neurotransmitter release, vesicle recycling, effects on the releasable pool of vesicles and presynaptic growth with both short- and long-term effects on neuronal signaling (Arancio et al., 1996).

An important role for NO in cerebral function involves regulation of cerebral blood flow. The vasodilatory response of cerebral vessels to hypercarbia, hypoxia, and alterations in systemic blood pressure (autoregulation) involves NO generated from vascular eNOS (Carter et al., 2021). However, NO is not the sole mediator in these responses, and there is still some controversy on the relative importance of NO in these processes. The physiological mechanism that couples nutritional blood flow to brain neuronal activity and metabolism is termed neurovascular coupling (NVC). Full mechanistic insight into how NVC works is still lacking, but experimental data strongly indicate that NO is a key intermediate mediator (Lourenço and Laranjinha, 2021). Although other substances are involved such as prostanoids, purines, and K+, experiments using NOS inhibition reduce the NVC response by approximately 60% (Hosford and Gourine, 2019). Recent publications using systemic administration of the NOS inhibitor L-NMMA confirm‎ the role of NO in human NVC (Hoiland et al., 2020). Both glutamatergic and GABAergic neurons have been implicated in NVC, but recent findings also show the ability of endothelial cells to directly sense neuronal activity via NMDAr expressed on the basolateral endothelial membranes, thereby regulating functional hyperemia via eNOS (Hogan-Cann et al., 2019). Abnormalities in NVC have been suggested as a preclinical manifestation of dementia, which is reasonable because functional hyperemia is not only providing nutrients but also enhance clearance of neuronal waste products (Ruitenberg et al., 2005).

신경 전달

산화질소는 중추 및 말초 신경 신호 전달에 깊이 관여하며, 운동 조절, 에너지 항상성, 학습, 기억, 수면, 섭식, 불안, 생식, 대뇌 혈류 조절 등 다양한 양상을 조절합니다(Garthwaite, 2019). nNOS는 중추신경계(CNS)에서 가장 풍부한 이소형으로, 뇌의 대부분의 영역에 분포되어 있지만 소뇌 피질, 후각구, 선조체에 조직학적으로 우세한 부분이 있습니다. , 시상하부, 해마에서 주로 발견되며, GABAergic 및 glutaminergic 뉴런에서 주로 발견됩니다(Chachlaki and Prevot, 2020). 흥분성 및 억제성 뉴런 모두에서 발현되는 것은 nNOS 유전자 결손 생쥐를 이용한 여러 연구의 데이터에 의해 뒷받침되는 뉴런 통신에서 NO의 다양한 역할을 설명할 수 있습니다(Tanda et al., 2009; Weitzdoerfer et al., 2004). 또한, NO의 3차원 방출과 세포막을 통한 확산 능력은 역행성 시냅스 간 활동을 통한 다중 모드 신호 전달과 시냅스 간 혼선, 그리고 신경세포-성상교세포 통신을 가능하게 합니다(그림 1). 신경세포 근처에 있는 혈관 내피세포의 eNOS가 신경 전달을 조절할 수 있고, NO가 혈관과 같은 비신경세포 NO 표적에도 신호를 보낼 수 있다는 사실은 복잡성을 더욱 가중시킵니다(Garthwaite, 2019). CNS에서 가장 흔한 nNOS 스플라이스 변이체는 nNOSα인데, 이 변이체는 시냅스 후 밀도 단백질 95(PSD95)와 복합체를 이루는 N-메틸-D-아스파라긴산 수용체(NMDAr)와 물리적 상호작용을 가능하게 하는 PDZ 도메인을 포함하고 있습니다(Brenman et al., 1996). NMDAr의 글루타메이트 활성화는 세포 내 Ca2+의 유입과 그에 따른 nNOS 활성화를 유도하며, 이는 AKT(Adak et al., 2001)에 의한 세린 1412의 인산화 작용에 의해 더욱 강화될 수 있습니다. CNS의 주요 신호 전달 방식은 NO-sGC-cGMP 축을 통한 후속 인산화 작용을 통해 여러 가지 분자 표적에 작용하는 것입니다. 그러나 과도한 글루타민성 NMDAr 활성화와 NO 생성 증가는 뇌졸중, 간질, 신경 퇴행성 장애와 같은 여러 병리학적 과정에 기여합니다(Zhou and Sheng, 2013). NMDAr 활성의 조절이 정상적인 뇌 기능과 뇌 손상을 피하는 데 중요하다는 것은 분명하며, NO의 억제적 피드백 역할은 NMDAr 관련 이온 채널의 S-니트로화(Choi et al., 2000; Raju et al., 2015)에 의해 제안되었습니다.

뇌에서 NO의 중심적인 역할 중 하나는 시냅스 가소성과 장기 강화와 관련된 기억 기능과 관련이 있는 시냅스 전 기능의 조절에 대한 역할입니다(Hardingham et al., 2013). 주로 글루타민과 GABA 신경세포에 대한 연구에 따르면, 시냅스 후에서 생성된 NO가 시냅스 틈을 가로질러 확산함으로써 역행성 신호를 보내고, 그 결과 시냅스 전 기능이 증가한다는 것이 분명해졌습니다. 이는 신경 전달 물질의 직접적인 방출 자극, 소포 재활용, 방출 가능한 소포 풀에 대한 영향, 신경 신호에 대한 단기 및 장기 효과를 모두 갖춘 시냅스 전 성장 등 여러 가지 협력 메커니즘을 통해 달성될 수 있습니다(Arancio et al., 1996).

뇌 기능에서 NO가 담당하는 중요한 역할은 뇌 혈류 조절입니다. 고혈당, 저산소증, 전신 혈압 변화(자가 조절)에 대한 뇌 혈관의 혈관 확장 반응은 혈관 내 eNOS에서 생성된 NO를 포함합니다(Carter et al., 2021). 그러나 NO가 이러한 반응의 유일한 매개체는 아니며, 이러한 과정에서 NO의 상대적 중요성에 대해서는 여전히 논란이 있습니다. 영양분이 풍부한 혈류를 뇌의 신경세포 활동과 신진대사와 연결하는 생리학적 메커니즘을 신경혈관 연결(NVC)이라고 합니다. NVC가 어떻게 작용하는지에 대한 완전한 메커니즘에 대한 통찰력은 아직 부족하지만, 실험 데이터는 NO가 핵심적인 중간 매개체임을 강력하게 시사합니다(Lourenço and Laranjinha, 2021). 프로스타노이드, 퓨린, K+와 같은 다른 물질도 관여하지만, NOS 억제를 이용한 실험에서는 NVC 반응이 약 60% 감소합니다(Hosford and Gourine, 2019). 최근 NOS 억제제 L-NMMA의 전신 투여를 이용한 연구에서는 인간 NVC에서 NO의 역할을 확인했습니다(Hoiland et al., 2020). 글루타메이트 신경세포와 GABA 신경세포 모두 NVC에 관여하는 것으로 밝혀졌지만, 최근 연구 결과에 따르면 내피세포가 기저외부 내피막에 발현된 NMDAr을 통해 신경세포의 활동을 직접 감지하여 eNOS를 통해 기능적 충혈을 조절하는 능력도 있는 것으로 밝혀졌습니다(Hogan-Cann et al., 2019). NVC의 이상은 치매의 전임상 증상으로 제시되어 왔는데, 이는 기능적 충혈이 영양분을 공급할 뿐만 아니라 신경 세포의 노폐물 제거를 촉진하기 때문이라는 점에서 타당합니다(Ruitenberg et al., 2005).

As mentioned above, altered NO homeostasis has been coupled to several cerebral pathologies ranging from acute traumatic brain injury and stroke to psychiatric disorders and progression of dementia. Both excessive NO generation due to iNOS induction as well as reduced NO bioavailability due to oxidative stress have been implicated. However, the initially high expectations that modulation of NO signaling would be of therapeutic value has unfortunately weaned, partly due to the lack of clinically useful specific NOS inhibitors, especially for nNOS and iNOS, or failure to show effect of NO donors (Bath et al., 2017; ENOS Trial Investigators, 2015; RIGHT-2 Investigators, 2019; Krishnan et al., 2016).

In the peripheral nervous system (PNS), non-adrenergic, non-cholinergic (NANC) inhibitory and excitatory nerves participate in regulation of smooth muscle tone in the gastrointestinal, respiratory, and urinary tracts and in the corpus cavernosum (Sanders and Ward, 1992). Together with nNOS-derived NO, various candidates have been implicated in NANC signaling including vasoactive intestinal polypeptide (VIP), substance P, calcitonin gene-related polypeptide (CGRP), ATP, and carbon monoxide (Xue et al., 2000). In the gastrointestinal tract, the so called nitrergic signaling is involved in gastric adaptive relaxation in response to food intake and gastric emptying (Desai et al., 1991), and targeted disruption of nNOS leads to stomach enlargement, hypertrophy of the pyloric sphincter, and dysfunctional gastric motility (Huang et al., 1993) with similar findings in sGCα1 KO mice (Vanneste et al., 2007). Moreover, in the small and large intestine, NANC signaling modulates motility and peristalsis (Sanders and Ward, 2019). The post junctional cells in the gut responding to nitrergic signals are smooth muscle cells, interstitial cells of Cajal (ICC), and PDGFRα+ cells, together often referred to as the SIP syncytium (Groneberg et al., 2013).

Early findings by Ignarro and coworkers suggested NO-sGC-cGMP-dependent relaxation of rabbit corpus cavernosum and hypothesized that NO was involved in penile erection evoked by NANC inhibitory nerves (Ignarro et al., 1990). Later, it was shown that nNOS-derived NO is the main nitrergic transmitter behind this effect, although some evidence suggests co-participation of eNOS located the sinusoidal endothelium (Trigo-Rocha et al., 1993). Both are activated by calcium influx leading to subsequent activation of the sGC-cGMP axis and relaxation. Another mode of action has been suggested, involving an inhibitory role of NO on the vasoconstrictive effects of the RhoA/Rho-kinase pathway (Mills et al., 2002). Erectile dysfunction is caused by a variety of pathogenic factors, involving impaired formation and action of NO and animal experiments suggest androgen dependency of nNOS mRNA levels and activity (Penson et al., 1996). The use of PDE 5 inhibitors to stabilize cGMP levels to treat erectile dysfunction is since long an established therapy and one of few directly related to NO signaling (Figure 5).

위에서 언급한 바와 같이, NO 항상성의 변화는 급성 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 정신 질환, 치매의 진행 등 여러 가지 뇌 질환과 관련이 있습니다. iNOS의 유도 작용으로 인한 과도한 NO 생성뿐만 아니라 산화 스트레스로 인한 NO 생체 이용률 감소도 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나, 처음에는 NO 신호 조절이 치료적 가치가 있을 것이라는 높은 기대가 있었지만, 안타깝게도 임상적으로 유용한 특정 NOS 억제제, 특히 nNOS와 iNOS에 대한 억제제가 부족하거나 NO 전달체의 효과를 입증하지 못했기 때문에(Bath et al., 2017; ENOS Trial Investigators, 2015; RIGHT-2 Investigators, 2019; Krishnan et al., 2016) 이러한 기대는 사라졌습니다.

말초신경계(PNS)에서 비아드레날린성, 비콜린성(NANC) 억제성 및 흥분성 신경은 위장, 호흡기, 요로 및 해면체의 평활근 긴장 조절에 관여합니다(Sanders and Ward, 1992). nNOS에서 유래된 NO와 함께, 혈관활성 장 폴리펩티드(VIP), 물질 P, 칼시토닌 유전자 관련 폴리펩티드(CGRP), ATP, 일산화탄소(Xue et al., 2000) 등 다양한 후보 물질이 NANC 신호 전달에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 위장관에서, 소위 니트로신호 전달은 음식 섭취와 위 배출에 대한 반응으로 위장의 적응적 이완에 관여합니다(Desai et al., 1991). nNOS를 표적으로 파괴하면 위가 커지고, 유문 괄약근이 비대해지며, 위 운동 기능 장애가 발생합니다(Huang et al., 1993). sGCα1 KO 마우스에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다(Vanneste et al., 200 7). 또한, 소장과 대장에서는 NANC 신호가 운동성과 연동 운동을 조절합니다(Sanders and Ward, 2019). 장에서 니트로신 신호에 반응하는 접합 후 세포는 평활근 세포, 카잘의 간질 세포(ICC), 그리고 PDGFRα+ 세포이며, 이들은 종종 SIP syncytium이라고도 불립니다(Groneberg et al., 2013).

Ignarro와 동료 연구자들의 초기 연구 결과에 따르면, NO-sGC-cGMP-dependent relaxation of rabbit corpus cavernosum이 있으며, NO가 NANC 억제 신경에 의해 유발되는 음경 발기에 관여한다는 가설이 제기되었습니다(Ignarro et al., 1990). 나중에, nNOS에서 유래된 NO가 이 효과의 주요한 질소 전달 물질이라는 사실이 밝혀졌지만, 일부 증거에 따르면 정현파 내피에 위치한 eNOS의 공동 참여가 이 효과의 주요한 질소 전달 물질이라는 사실도 밝혀졌습니다(Trigo-Rocha et al., 1993). 둘 다 칼슘 유입에 의해 활성화되어 sGC-cGMP 축의 활성화와 이완을 유도합니다. RhoA/Rho-kinase 경로의 혈관 수축 효과에 대한 NO의 억제 역할을 포함하는 또 다른 작용 방식이 제안되었습니다(Mills et al., 2002). 발기부전은 다양한 병원성 요인에 의해 발생하며, NO의 형성 및 작용 장애와 관련이 있습니다. 동물 실험에 따르면 nNOS mRNA 수준과 활동은 안드로겐 의존적이라고 합니다(Penson et al., 1996). 발기부전 치료를 위해 cGMP 수준을 안정화하기 위해 PDE 5 억제제를 사용하는 것은 오래 전부터 확립된 치료법이며, NO 신호와 직접적으로 관련된 몇 안 되는 치료법 중 하나입니다(그림 5).

NO in host defense and inflammation

The discovery of iNOS occurred independently and in parallel with the identification of EDRF as NO. Building on studies showing endogenous generation of nitrate in germ free mice (Green et al., 1981), Stuehr and Marletta described the formation of nitrate and nitrite by LPS-activated murine macrophages (Stuehr and Marletta, 1985). Hibbs and colleagues went on to show that the cytotoxicity of these cells required L-arginine (Hibbs et al., 1987), and, soon after, NO was identified as an intermediate in the process of L-arginine oxidation to nitrate and nitrite (Marletta et al., 1988). The subsequent purification, characterization (Stuehr et al., 1991), and cloning (Xie et al., 1992) of iNOS revealed that this enzyme differs considerably from the constitutive NOSs, in particular in terms of NO output and regulation of activity and expression‎. Because iNOS binds calmodulin (CaM) more tightly than eNOS and nNOS, less calcium is needed for its activation, making it practically calcium-independent. Instead, a major regulation of iNOS occurs at the expression‎al level. This means that once iNOS is expressed and sufficient amounts of co-factors and substrates are present, it continues to generate large NO fluxes over prolonged periods of times (Nathan and Xie, 1994).

Expression‎ of iNOS can occur in any nucleated cell, but much focus has been placed on the immune cells where it was first discovered. Macrophages, T cells, and other immune competent cells express iNOS and generate NO in response to bacterial products, such as LPS or proinflammatory cytokines, including interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor α (TNF-α), and IFN-γ (Nathan and Xie, 1994). These bind to cell-surface receptors and activate kinases, leading to the activation of transcription factors, including nuclear factor κB (NF-κB) and nuclear factor 1 transducer and activator of transcription 1a (STAT-1a), which translocate into the nucleus, where they bind to the promoter region of the iNOS gene and induce iNOS expression‎ (Kleinert et al., 2003). A general problem in research on iNOS is translating findings from rodents to humans. Rodents readily express a highly active iNOS in macrophages and other immune cells after activation, but it has been notoriously difficult to detect appreciable iNOS activity in these cells in humans (Schneemann et al., 1993). Epithelial cells, on the other hand, are readily capable of iNOS expression‎ and NO formation also in humans, as shown, for example, in the airways and the large intestine during inflammation or infection (Alving et al., 1993; Lundberg et al., 1994a). In the healthy human paranasal epithelium, iNOS is constitutively expressed and generates high fluxes of NO (Lundberg et al., 1995), a very surprising finding given that the general belief was that iNOS would only be induced after proinflammatory stimuli (Nathan and Xie, 1994). There is evidence to suggest that iNOS in the upper airways is a part of innate immunity and defense against pathogens. Patient groups prone to chronic sinus infections have low or even absent NO in the nasal airways (Deja et al., 2003; Lundberg et al., 1996b; Lundberg et al., 1994c), and instillation of an NOS inhibitor in the nose can trigger acute sinusitis (Lundberg, 2005). A puzzling observation is that nasal airway iNOS in humans seems resistant to corticosteroids (Lundberg et al., 1996c), a class of drugs known to down regulate iNOS in various models.

호스트 방어 및 염증에서 NO의 역할

iNOS의 발견은 EDRF가 NO로 확인된 것과 동시에 독립적으로 이루어졌습니다. 무균 생쥐에서 질산염의 내인성 생성을 보여주는 연구(Green et al., 1981)를 바탕으로, Stuehr와 Marletta는 LPS에 의해 활성화된 쥐 대식세포에 의한 질산염과 아질산염의 형성에 대해 설명했습니다(Stuehr and Marletta, 1985). 힉스와 동료들은 이 세포의 세포 독성이 L-아르기닌을 필요로 한다는 것을 보여 주었고(Hibbs et al., 1987), 얼마 지나지 않아 NO가 L-아르기닌이 질산염과 아질산염으로 산화되는 과정에서 중간 물질로 확인되었습니다(Marletta et al., 1988). 이후 iNOS의 정제, 특성 분석(Stuehr et al., 1991), 복제(Xie et al., 1992)를 통해 이 효소가 특히 NO 산출과 활성 및 발현 조절 측면에서 기존의 NOS와 상당히 다르다는 사실이 밝혀졌습니다. iNOS는 eNOS와 nNOS보다 칼모둘린(CaM)에 더 강하게 결합하기 때문에 활성화에 필요한 칼슘의 양이 적어 실질적으로 칼슘에 독립적입니다. 대신, iNOS의 주요 조절은 발현 수준에서 이루어집니다. 즉, 일단 iNOS가 발현되고 충분한 양의 보조 인자와 기질이 존재하면, 장기간에 걸쳐 큰 NO 플럭스를 계속 생성합니다(Nathan and Xie, 1994).

iNOS의 발현은 모든 핵 세포에서 일어날 수 있지만, 처음 발견된 면역 세포에 많은 관심이 집중되어 있습니다. 대식세포, T 세포, 그리고 다른 면역 관련 세포들은 LPS나 인터루킨-1(IL-1), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터페론-γ(IFN-γ)를 포함한 전염증성 사이토카인과 같은 박테리아 생성물에 반응하여 iNOS를 발현하고 NO를 생성합니다(Nathan and Xie, 1994). 이들은 세포 표면 수용체에 결합하여 키나아제를 활성화하고, 핵 인자 κB(NF-κB)와 핵 인자 1 트랜스듀서 및 활성화 인자 1a(STAT-1a)를 포함한 전사 인자의 활성화를 유도합니다. 이 인자들은 핵으로 이동하여 iNOS 유전자의 프로모터 영역에 결합하고 iNOS 발현을 유도합니다(Kleinert et al., 2003). iNOS에 대한 연구에서 일반적인 문제는 설치류에서 인간으로의 연구 결과의 번역입니다. 설치류는 활성화 후 대식세포와 다른 면역 세포에서 매우 활동적인 iNOS를 쉽게 발현하지만, 인간에서 이러한 세포에서 상당한 iNOS 활동을 감지하는 것은 매우 어려운 것으로 알려져 있습니다(Schneemann et al., 1993). 반면에 상피세포는 염증이나 감염이 일어날 때, 예를 들어, 기도와 대장 등에서 볼 수 있듯이, 인간에게도 iNOS 발현과 NO 생성이 쉽게 일어날 수 있습니다(Alving et al., 1993; Lundberg et al., 1994a). 건강한 사람의 부비강 상피에서는 iNOS가 항상 발현되어 있으며, 높은 수준의 NO(Lundberg et al., 1995)를 생성합니다. 이는 일반적인 통념에 따르면 iNOS는 전염증성 자극 후에만 유도된다는 점을 고려할 때 매우 놀라운 발견입니다(Nathan and Xie, 1994). 상기도의 iNOS가 선천성 면역과 병원체 방어의 일부라는 증거가 있습니다. 만성 부비강염에 걸리기 쉬운 환자 그룹은 비강 내의 NO가 낮거나 아예 없는 경우가 많습니다(Deja et al., 2003; Lundberg et al., 1996b; Lundberg et al., 1994c). 그리고 코에 NOS 억제제를 주입하면 급성 부비강염을 유발할 수 있습니다(Lundberg, 2005). 의아한 관찰 결과는 코의 기도 iNOS가 다양한 모델에서 iNOS를 하향 조절하는 것으로 알려진 약물 종류인 코르티코스테로이드에 내성이 있는 것으로 보인다는 것입니다(Lundberg et al., 1996c).

Inhibition of bacterial growth by NO and its reaction products in vitro was known before the discovery of mammalian NO synthesis and iNOS. NO gas inhibits the growth of aerobic bacteria (Mancinelli and McKay, 1983), and nitrite added to meat prevents the growth of Clostridiae (Reddy et al., 1983). In vivo support for the role of NO in mammalian host defense came from early studies in iNOS-deficient mice, which failed to restrain the replication of the intracellular pathogen Listeria monocytogenes (MacMicking et al., 1995). Antiviral effects of NO have also been reported (Croen, 1993). In general, when discussing NO effects on pathogens, it is more relevant to use the term RNS, as the majority of effects observed are likely not caused by NO alone but one or several reaction products. If iNOS is co-localized with a source of reactive oxygen species, e.g., NADPH oxidase, a concerted burst of antibacterial compounds may result. RNSs directly interfere with redox-sensitive cysteine residues or metal centers of key enzymes involved in DNA replication and repair, metabolism, and more (Fang, 1997) (Figure 1). Aerobic bacteria seem more sensitive as cytochromes of the electron transport chain are particularly vulnerable to nitrosylation by RNSs, thereby blocking respiration. Anaerobes, on the other hand, frequently respire on nitrate and nitrite and are, therefore, heavily exposed to RNSs through their own metabolism. In fact, the enzymes involved in such denitrification, including nitrite- and NO-reductases, represent important parts of defense against exogenous RNIs (Lundberg et al., 2004). This is illustrated during anaerobic growth of the denitrifier Pseudomonas strutzeri, which thrives in nitrite-rich medium, whereas a mutant lacking the NO reductase gene is killed due to the buildup of NO (Braun and Zumft, 1991). A broad antibacterial activity is created when nitrite is acidified due to the spontaneous formation HNO2 and other RNIs under these conditions (Lundberg et al., 2004). Intriguingly, this chemistry is happening in vivo when nitrite-rich saliva meets the acidic gastric milieu (Benjamin et al., 1994; Lundberg et al., 1994b) and also in infected nitrite-containing urine if acidified (Lundberg et al., 1997a). Studies suggest that this gastric system forms a part of our first line defense against swallowed pathogens (Björne et al., 2006; Dykhuizen et al., 1996).

NO participates in host defense also by modulating immunity. iNOS is protective for the host during experimental infection with Tuberculosis, but the primary role of NO was found to be anti-inflammatory and not related to any direct antimicrobial activity (Mishra et al., 2017). Lack of iNOS increased susceptibility through increased neutrophil recruitment to provide a growth-permissive milieu for the pathogen. The authors suggested that the mycobacterium exploits the increased accessibility of nutrients in granulocyte-rich lesions. In contrast, the opposite is true for infection with S. Aureus, where iNOS promotes accumulation of granulocytes in the lungs, in this case to enhance host defense (Urbano et al., 2018). Not surprisingly, bacteria have developed means of protection against nitrosative stress. This occurs via upregulation of various enzymes that scavenge or metabolize RNSs and includes nitrite- and NO-reductases described above, the hmp-encoded flavohemoglobin as well as cytochrome bd (Bang et al., 2006; Davis et al., 2015; Jones-Carson et al., 2016). Some pathogens including salmonellae, mycobacteria, and fransicella can downregulate host iNOS expression‎ via various mechanisms including RNA interference or suppression of IFNγ-induced STAT-1 signaling (Fang and Vázquez-Torres, 2019; Parsa et al., 2008). In still other situations, the potential gut pathogen E. coli may utilize the nitrate generated by iNOS in the host mucosa for their own respiration to outcompete other gut commensals (Winter et al., 2013). Besides iNOS, a role for eNOS in regulation of immunity has also been suggested. In T cells, eNOS is rapidly activated upon antigen presentation to modulate the synthesis of cytokines including IFN-γ and IL-2 (Ibiza et al., 2006).

The overall role of iNOS in inflammation is still very unclear, and its impact on pathophysiological processes likely depend on the timing and duration of iNOS induction, where it is expressed and other factors including the local redox environment. A role for iNOS in wound healing was suggested early, and iNOS-deficient mice display a delayed would closure (Yamasaki et al., 1998). The same authors managed to reverse this by application of an adenoviral vector containing human iNOS cDNA. In septic shock, which is characterized by systemic inflammation and severe hypotension, a pathogenic role of iNOS (MacMicking et al., 1995) was suggested. The belief was that massive amounts of NO are generated by iNOS in the vascular wall during systemic inflammation with an overwhelming sGC activation and resulting vascular collapse. However, already at this time, other studies indicated no impact of iNOS on survival in a septic shock model (Laubach et al., 1995) and potential deleterious effects of systemic NOS inhibition related to cardiac failure and disturbances in the microcirculation (Weitzberg et al., 1995). Nevertheless, a non-specific NOS inhibitor was eventually tested in a clinical phase III trial. Disappointingly, this trial had to be terminated prematurely due to excess mortality in the treatment arm (López et al., 2004). A multitude of more specific iNOS inhibitors have been developed and used successfully in preclinical models of chronic inflammation where iNOS plays a proposed deleterious role. Some of these inhibitors have been tested in clinical trials (Cinelli et al., 2020) with focus on inflammatory pain and different forms of arthritis, but, overall, the results have been disappointing and to date no iNOS-inhibitor has been approved for clinical use.

Although therapeutic attempts to dampen the increased iNOS activity in inflammatory diseases have failed, the diagnostic use of measuring such activity has been successful. It started with the discovery of NO gas in exhaled breath (Gustafsson et al., 1991) of humans. Soon after, it was shown that the levels of exhaled NO are increased in asthmatics (Alving et al., 1993) and reduced following treatment with anti-inflammatory corticosteroids (Lundberg et al., 1996b). Studies in allergic asthma show that iNOS is upregulated in bronchial epithelial cells following challenges with allergens with a concomitant increase in exhaled NO (Roos et al., 2014). Today, measurements of exhaled NO have become clinical routine in the management of allergic asthma (Dweik et al., 2011) (Figure 5). Moreover, it was found that the levels of NO in the nasal airways were near absent in patients with primary ciliary dyskinesia (Lundberg et al., 1994c), and this test is now used at specialized centers in the diagnostic workup for this rare disease (Manna et al., 2015). The principle of measuring mucosal release of NO gas to detect inflammation in a hollow organ (Lundberg et al., 1997b) has been applied also in the gastrointestinal tract in inflammatory bowel disease (Lundberg et al., 1994a) as well as in the urogenital tract in cystitis (Lundberg et al., 1996a) and vaginitis (Sioutas et al., 2008). These methods, however, are yet to reach the clinic.

체외에서 NO와 그 반응 생성물에 의한 세균 성장 억제는 포유류 NO 합성과 iNOS가 발견되기 전에 알려져 있었습니다. NO 가스는 호기성 세균의 성장을 억제합니다(Mancinelli and McKay, 1983), 그리고 육류에 첨가된 아질산염은 클로스트리듐(Reddy et al., 1983)의 성장을 방지합니다. 포유류 숙주 방어에서 NO의 역할에 대한 생체 내 지원은 iNOS 결핍 마우스에 대한 초기 연구에서 비롯되었으며, 이 연구는 세포 내 병원균 리스테리아 모노사이토제네스(MacMicking et al., 1995)의 복제를 억제하지 못했습니다. NO의 항바이러스 효과도 보고된 바 있습니다(Croen, 1993). 일반적으로 병원체에 대한 NO의 효과를 논의할 때는 RNS라는 용어를 사용하는 것이 더 적절합니다. 관찰된 대부분의 효과는 NO 단독이 아니라 하나 또는 여러 반응 생성물에 의해 발생하는 것으로 보이기 때문입니다. iNOS가 반응성 산소 종의 공급원과 함께 존재하는 경우(예: NADPH 산화효소), 항균 화합물이 동시에 폭발적으로 생성될 수 있습니다. RNS는 DNA 복제 및 복구, 신진대사 등에 관여하는 주요 효소의 산화 환원 민감성 시스테인 잔기 또는 금속 중심을 직접적으로 방해합니다(Fang, 1997) (그림 1). 호기성 박테리아는 전자 수송 사슬의 시토크롬이 RNS에 의한 니트로사일화 작용에 특히 취약하여 호흡을 차단하기 때문에 더 민감한 것으로 보입니다. 반면에 혐기성 세균은 질산염과 아질산염을 자주 호흡하기 때문에 자체 대사를 통해 RNS에 많이 노출됩니다. 실제로 아질산염과 NO 환원효소를 포함한 이러한 탈질화에 관여하는 효소는 외인성 RNI에 대한 방어의 중요한 부분을 나타냅니다(Lundberg et al., 2004). 이것은 아질산염이 풍부한 배지에서 번성하는 탈질화 세균 Pseudomonas strutzeri의 혐기성 성장 과정에서 잘 드러나는데, NO 환원효소 유전자가 결핍된 돌연변이는 NO의 축적 때문에 죽게 됩니다(Braun and Zumft, 1991). 이러한 조건에서 자발적으로 형성된 HNO2 및 기타 RNIs로 인해 아질산염이 산성화되면 광범위한 항균 작용이 생성됩니다(Lundberg et al., 2004). 흥미롭게도, 아질산염이 풍부한 타액이 산성 위 환경과 만나면 생체 내에서 이러한 화학 반응이 일어납니다(Benjamin et al., 1994; Lundberg et al., 1994b). 또한, 감염된 아질산염 함유 소변이 산성화되면(Lundberg et al., 1997a) 이러한 화학 반응이 일어납니다. 연구에 따르면 위장 시스템은 삼킨 병원균에 대한 첫 번째 방어선 역할을 한다고 합니다(Björne et al., 2006; Dykhuizen et al., 1996).

NO는 면역 조절을 통해 숙주 방어에 참여합니다. iNOS는 결핵 실험 감염 동안 숙주를 보호하지만, NO의 주요 역할은 항염증 작용이며 직접적인 항균 작용과는 관련이 없는 것으로 밝혀졌습니다(Mishra et al., 2017). iNOS의 부족은 병원균의 성장을 촉진하는 환경을 제공하기 위해 호중구 모집을 증가시켜 병원균에 대한 감수성을 증가시킵니다. 저자들은 마이코박테리아가 과립구(granulocyte)가 풍부한 병변에서 영양분의 접근성을 높이는 것을 이용한다고 제안했습니다. 이와는 반대로, 황색포도상구균(S. Aureus) 감염의 경우, iNOS가 폐에 과립구의 축적을 촉진하여 숙주의 방어력을 강화한다는 사실이 밝혀졌습니다(Urbano et al., 2018). 당연히 박테리아는 니트로사이드 스트레스에 대한 보호 수단을 개발했습니다. 이는 RNS를 제거하거나 대사하는 다양한 효소의 상향 조절을 통해 발생하며, 위에서 설명한 아질산염 및 NO 환원효소, hmp 암호화 플라보헤모글로빈, 사이토크롬 bd(Bang et al., 2006; Davis et al., 2015; Jones-Carson et al., 2016)를 포함합니다. 살모넬라, 마이코박테리아, 프랜시셀라를 포함한 일부 병원체는 RNA 간섭 또는 IFNγ-유도 STAT-1 신호 전달 억제 등 다양한 메커니즘을 통해 숙주 iNOS 발현을 하향 조절할 수 있습니다(Fang and Vázquez-Torres, 2019; Parsa et al., 2008). 또 다른 상황에서는 잠재적인 장내 병원균인 대장균이 숙주 점막에서 iNOS에 의해 생성된 질산염을 자신의 호흡을 위해 활용하여 다른 장내 공생균을 능가할 수 있습니다(Winter et al., 2013). iNOS 외에도 eNOS가 면역 조절에 중요한 역할을 한다는 사실도 밝혀졌습니다. T 세포에서 eNOS는 항원 제시 시 빠르게 활성화되어 IFN-γ와 IL-2를 포함한 사이토카인의 합성을 조절합니다(Ibiza et al., 2006).

iNOS가 염증에 미치는 전반적인 역할은 아직 명확하지 않으며, 병태생리학적 과정에 미치는 영향은 iNOS 유도의 타이밍과 지속 기간, 발현 위치, 그리고 국소적 산화 환원 환경과 같은 기타 요인에 따라 달라질 수 있습니다. iNOS가 상처 치유에 관여한다는 사실은 일찍부터 제시되어 왔으며, iNOS가 결핍된 생쥐는 상처가 잘 아물지 않는다는 사실이 밝혀졌습니다(Yamasaki et al., 1998). 같은 저자들은 인간 iNOS cDNA를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 적용함으로써 이 현상을 역전시키는 데 성공했습니다. 전신 염증과 심한 저혈압이 특징인 패혈성 쇼크에서 iNOS의 병원성 역할이 제시되었습니다(MacMicking et al., 1995). 전신 염증 시 혈관벽의 iNOS가 엄청난 양의 NO를 생성하여 sGC를 과도하게 활성화시키고, 그 결과 혈관이 붕괴된다는 믿음이 있었습니다. 그러나 이미 이 시기에 다른 연구에서는 패혈성 쇼크 모델에서 iNOS가 생존에 영향을 미치지 않는다는 사실(Laubach et al., 1995)과 전신 NOS 억제가 심부전과 미세순환 장애와 관련되어 잠재적으로 해로운 영향을 미칠 수 있다는 사실(Weitzberg et al., 1995)을 지적했습니다. 그럼에도 불구하고, 비특이적 NOS 억제제는 임상 3상 시험에서 시험되었습니다. 안타깝게도, 이 시험은 치료군에서 사망률이 너무 높아서 조기에 종료되어야 했습니다(López et al., 2004). iNOS가 해로운 역할을 하는 것으로 알려진 만성 염증의 전임상 모델에서 iNOS 억제제가 성공적으로 개발되어 사용되고 있습니다. 이러한 억제제 중 일부는 염증성 통증과 다양한 형태의 관절염에 초점을 맞춘 임상 시험(Cinelli et al., 2020)에서 테스트되었지만, 전반적으로 그 결과는 실망스러웠고 현재까지 임상용으로 승인된 iNOS 억제제는 없습니다.

염증성 질환에서 증가된 iNOS 활동을 억제하려는 치료적 시도는 실패했지만, 이러한 활동을 측정하는 진단적 사용은 성공적이었습니다. 그것은 인간의 내쉬는 숨에서 NO 가스가 발견된 것에서 시작되었습니다(Gustafsson et al., 1991). 그 후, 천식 환자에서 내쉬는 NO 가스의 양이 증가한다는 것이 밝혀졌습니다(Alving et al., 1993). 그리고 항염증성 코르티코스테로이드를 투여한 후에는 감소한다는 것이 밝혀졌습니다(Lundberg et al., 1996b). 알레르기성 천식에 대한 연구에 따르면, iNOS는 알레르기 항원에 노출된 후 기관지 상피 세포에서 발현이 증가하며, 동시에 호기 NO가 증가합니다(Roos et al., 2014). 오늘날, 호기 NO 측정은 알레르기성 천식 관리에 있어 임상적 루틴이 되었습니다(그림 5) (Dweik et al., 2011). 또한, 일차 섬모 운동 이상증 환자의 비강 내 NO 수치가 거의 없는 것으로 밝혀졌습니다(Lundberg et al., 1994c). 이 검사는 현재 이 희귀 질환의 진단을 위한 전문 센터에서 사용되고 있습니다(Manna et al., 2015). NO 가스의 점막 방출을 측정하여 중공 기관의 염증을 감지하는 원리(Lundberg et al., 1997b)는 염증성 장 질환의 위장관(Lundberg et al., 1994a)과 방광염(Lundberg et al., 1996a) 및 질염(Sioutas et al., 2008)의 비뇨생식기에도 적용되었습니다. ). 그러나 이러한 방법은 아직 병원에 적용되지 않고 있습니다.

Cancer

It is not surprising that a molecule that dilates vessels and stimulates angiogenesis, while at the same time is having cytotoxic and immune-modulatory properties, will have a complex role in cancer. Most researchers would agree that the role NO is playing in cancer will depend on where and when it is generated, by which cells, its cellular concentration, the redox milieu, the abundance of NO target elements, as well as the tumor microenvironment. With a small reactive molecule, such as NO, an additional level of complexity is added. Not only do effects differ with varying concentrations as classically seen with signaling molecules, but NO can also react to form entirely new bioactive species. Wink and colleagues created a simplified model to explain the diverse effects of NO throughout its physiological concentration ranges (Miranda et al., 2021; Wink et al., 1998). Low fluxes of NO, similar to those generated by the constitutive NOSs, mainly signal via nitrosylation of sGC to increase cGMP. Besides vasodilation, cGMP also mediates angiogenesis and neovascularization mainly through activation of HIF1α and VEGF signaling (Papapetropoulos et al., 1997), both of which may promote tumor growth and spread. In support of this, Schenk and colleagues recently demonstrated upregulation of sGC during progression of small cell lung cancer that correlated with acquired chemotherapy resistance in vivo (Schenk et al., 2021). At higher concentrations, for example, when generated by iNOS, NO or its reaction products can interact with nonheme-iron or critical thiols in proteins to modulate their activity and also directly interfere with cellular respiration through inhibition of cytochrome c oxidase (Sen et al., 2013) and nitrosation of complex 1 (Moncada, 2015), which in turn affects HIF1α-dependent pathways. Overall, this can lead to activation of major oncogenic pathways that enhance survival, proliferation, and metastasis in aggressive tumors. Eyler and colleagues found that iNOS expression‎ is increased in glioma stem cells (GSCs), which correlated with decreased survival in glioma patients. Inhibition of iNOS slowed glioma growth in mice and growth and tumorigenicity of GSCs in vitro were decreased with pharmacological iNOS inhibition, iNOS knockdown, or with scavenging of NO. The authors suggested suppression of the cell cycle inhibitor CDA1 along with pro-angiogenic effects of NO as the mechanisms underlying these effects (Eyler et al., 2011). In some cancers, the growth accelerating effects of iNOS are further enhanced by the prostaglandin-generating enzyme COX2 (Basudhar et al., 2017), suggesting that combined use of an iNOS-inhibitor and an NSAID might be of therapeutic value. Another strategy that is gaining interest is to attempt to normalize tumor vasculature to improve tumor oxygenation and enhance the delivery and efficacy of anti-tumor drugs (Jain, 2005). Studies suggest that this can be achieved by modulating endogenous and exogenous NO signaling (Kashiwagi et al., 2008). The cellular source of NO synthase seems to be of importance in relation to cancer. Studies suggest that when tumor infiltrating immune cells express iNOS and generate NO, they contribute to tumor killing (Klug et al., 2013; Marigo et al., 2016), whereas iNOS expression‎ within the tumor cells is coupled to enhanced tumor growth, metastasis, and poor survival in a variety of cancer forms (Basudhar et al., 2017; Glynn et al., 2010; Heinecke et al., 2014). In a small clinical phase1/2 trial, Chung and colleagues recently examined effects of L-NMMA, a non-specific NOS inhibitor, in combination with docetaxel in women with chemoresistant triple-negative breast cancer. They found that the drug combination was well tolerated and noted indications of an enhanced chemotherapy response as assessed by reduction in tumor size and a decrease in phenotypically tumor-promoting neutrophils (N2) (Chung et al., 2021). When NO fluxes are very high, a variety of reactive nitrogen oxides with promiscuous nitrosating and nitrating capacity are generated. This can occur, e.g., during chronic inflammation and promote mutagenesis through deamination (Wink et al., 1991) or oxidation of DNA bases, strand breaks, or cross-linking (Khan et al., 2020). A classic example of a nitrosation product is N-nitrosamines, which are formed after prolonged iNOS upregulation or with chronic exposure to exogenous nitrogen oxides from cigarette smoke, pollution, or consumption of processed meat (Lundberg and Weitzberg, 2013). These can be metabolized to strong alkylating electrophiles with mutagenic effects. Moreover, nitration of guanine bases by NO-derived NO2 can lead to depurination and cause transversion mutations (Ramezanian et al., 1996). If RNIs are instead generated by activated immune cells invading an already established tumor, the very same species may instead be directed toward the cancer cells to cause apoptosis and cell death. Drugs that release NO or NO-like bioactivity have been tested experimentally with the purpose of directly affecting tumor growth or by enhancing delivery and anti-tumor activity of other therapies (Huang et al., 2017; Mintz et al., 2021). Barsoum and colleagues showed that hypoxia-induced expression‎ of the immune inhibitory molecule programmed cell death ligand-1 (PD-L1) in cancer cells was inhibited by glyceryl trinitrate, and, when administered transdermally to mice, this drug also attenuated tumor growth (Barsoum et al., 2014). Numerous challenges remain when attempting to modulate NO signaling events in the treatment of cancer. Given the central role of NO in almost all parts of human physiology, any drug interfering with this system should be precisely targeted both spatially, temporarily, and concentration wise. To this end, Sung and colleagues recently created a nanodelivery system enabling steady state-targeted release of NO in mice with experimental hepatocellular carcinoma (Sung et al., 2019). Treatment with this system normalized tumor vessels, which improved the delivery and efficacy of various treatment modalities while also reprograming the immunosuppressive tumor microenvironment toward an immunostimulatory phenotype. It is important to appreciate that compounds typically classified as “NO donors” differ vasty in their pharmacokinetics and signaling properties. In fact, for some compounds, including the di-nitrosyl iron complexes (DNICs) used in the study cited above, it is not clear if their main bioactivity is transduced through release of free NO.

암

혈관을 확장하고 혈관 신생을 촉진하는 동시에 세포 독성 및 면역 조절 특성을 갖는 분자가 암에 복합적인 역할을 한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 대부분의 연구자들은 NO가 암에서 수행하는 역할이 생성되는 위치와 시기, 생성하는 세포, 세포 내 농도, 산화 환원 환경, NO 표적 요소의 풍부함, 종양 미세 환경에 따라 달라진다는 데 동의합니다. NO와 같은 작은 반응성 분자는 추가적인 복잡성을 더합니다. 신호 분자에서 일반적으로 볼 수 있는 것처럼 농도에 따라 효과가 달라질 뿐만 아니라, NO는 완전히 새로운 생체 활성 종을 형성하기 위해 반응할 수도 있습니다. 윙크와 동료들은 생리학적 농도 범위 전반에 걸쳐 NO의 다양한 효과를 설명하기 위해 단순화된 모델을 만들었습니다(Miranda et al., 2021; Wink et al., 1998). 구성적 NOS에 의해 생성되는 것과 유사한 낮은 수준의 NO는 주로 sGC의 니트로실화를 통해 cGMP를 증가시키는 신호를 보냅니다. 혈관 확장과 더불어, cGMP는 주로 HIF1α와 VEGF 신호 전달의 활성화를 통해 혈관 신생과 신생 혈관 형성을 조절합니다(Papapetropoulos et al., 1997). 이 두 가지 신호 전달은 모두 종양의 성장과 확산을 촉진할 수 있습니다. 이를 뒷받침하는 연구로, Schenk과 동료 연구자들은 최근에 소세포 폐암의 진행 과정에서 sGC의 상향 조절이 생체 내 획득된 화학요법 저항성과 상관관계가 있음을 입증했습니다(Schenk et al., 2021). 예를 들어, iNOS에 의해 생성될 때, NO 또는 그 반응 생성물은 비헴철 또는 단백질의 중요한 티올과 상호 작용하여 그 활성을 조절할 수 있으며, 또한 시토크롬 c 산화효소(Sen et al., 2013)의 억제와 복합체 1의 니트로화(Moncada, 2015)를 통해 세포 호흡을 직접적으로 방해할 수 있으며, 이는 차례로 HIF1α 의존 경로에 영향을 미칩니다. 전반적으로, 이것은 공격적인 종양에서 생존, 증식, 전이를 촉진하는 주요 발암 경로를 활성화시킬 수 있습니다. Eyler와 동료 연구자들은 iNOS 발현이 신경교종 줄기세포(GSC)에서 증가한다는 것을 발견했는데, 이는 신경교종 환자의 생존율 감소와 관련이 있었습니다. iNOS의 억제는 생쥐에서 신경교종의 성장을 늦추었고, 체외에서 GSC의 성장과 종양 형성이 약리학적 iNOS 억제, iNOS 저하, 또는 NO 제거를 통해 감소되었습니다. 저자들은 이러한 효과의 기저 메커니즘으로 NO의 혈관신생 촉진 효과와 함께 세포주기 억제제 CDA1의 억제를 제안했습니다(Eyler et al., 2011). 일부 암의 경우, iNOS의 성장 촉진 효과는 프로스타글란딘 생성 효소 COX2에 의해 더욱 강화됩니다(Basudhar et al., 2017). 따라서 iNOS 억제제와 NSAID를 병용하면 치료 효과가 있을 수 있습니다. 관심을 모으고 있는 또 다른 전략은 종양 혈관 구조를 정상화하여 종양 산소 공급을 개선하고 항암제의 전달과 효과를 향상시키는 것입니다(Jain, 2005). 연구에 따르면, 이것은 내인성 및 외인성 NO 신호를 조절함으로써 달성될 수 있다고 합니다(Kashiwagi et al., 2008). NO 신타제의 세포 기원은 암과 관련하여 중요한 것으로 보입니다. 연구에 따르면 종양에 침투한 면역세포가 iNOS를 발현하고 NO를 생성하면 종양 사멸에 기여하는 것으로 나타났습니다(Klug et al., 2013; Marigo et al., 2016). 반면, 종양 세포 내 iNOS 발현은 다양한 형태의 암에서 종양 성장, 전이, 생존율 저하를 촉진하는 것으로 나타났습니다(Basudhar et al., 2017; Glynn et al., 2010; Heinecke et al., 2014년). 최근 Chung과 동료 연구자들은 소규모 임상 1/2상 시험을 통해 화학요법에 내성이 있는 삼중음성 유방암 여성 환자를 대상으로 도세탁셀과 함께 비특이적 NOS 억제제인 L-NMMA의 효과를 조사했습니다. 그들은 이 약물 조합이 내약성이 좋고, 종양 크기의 감소와 표현형적으로 종양 촉진성 호중구(N2)의 감소로 평가되는 화학요법 반응의 개선을 나타낸다는 것을 발견했습니다(Chung et al., 2021). NO 플럭스가 매우 높으면, 무차별적인 니트로사이드화 및 니트로화 능력을 가진 다양한 반응성 질소산화물이 생성됩니다. 예를 들어, 만성 염증 중에 발생할 수 있으며, 탈아미노화(Wink et al., 1991) 또는 DNA 염기 산화, 가닥 파손 또는 교차 결합(Khan et al., 2020)을 통해 돌연변이 유발을 촉진할 수 있습니다. 니트로사민은 iNOS의 장기적인 과발현 또는 담배 연기, 오염, 가공육 섭취로 인한 외인성 질소산화물에 만성적으로 노출된 후에 형성되는 N-니트로사민이 대표적인 니트로사민 생성물입니다(Lundberg and Weitzberg, 2013). 이들은 돌연변이 유발 효과가 있는 강력한 알킬화성 친전자성 물질로 대사될 수 있습니다. 게다가, NO에서 유래된 NO2에 의한 구아닌 염기의 질화는 탈염화를 유발하고 전위 돌연변이를 일으킬 수 있습니다(Ramezanian et al., 1996). 만약 RNIs가 이미 확립된 종양에 침입한 활성화된 면역 세포에 의해 생성된다면, 동일한 종이 암세포를 향해 이동하여 세포 사멸과 세포 죽음을 유발할 수 있습니다. NO 또는 NO와 유사한 생체활성을 방출하는 약물은 종양 성장에 직접적인 영향을 미치거나 다른 치료법의 전달 및 항종양 활성을 향상시키기 위한 목적으로 실험적으로 테스트되었습니다(황 외., 2017; 민츠 외., 2021). 바르수움과 동료 연구자들은 저산소증으로 인해 암세포에서 면역 억제 분자인 프로그램된 세포사멸 리간드-1(PD-L1)의 발현이 글리세릴 트리니트레이트에 의해 억제된다는 것을 보여 주었고, 이 약물을 쥐에게 경피 투여했을 때 종양 성장을 완화시키는 효과도 있었다(Barsoum et al., 2014). 암 치료에서 NO 신호 전달 과정을 조절하는 데는 여전히 많은 어려움이 있습니다. NO가 인간 생리학의 거의 모든 부분에서 중심적인 역할을 한다는 점을 감안할 때, 이 시스템을 방해하는 약물은 공간적, 일시적, 농도적으로 정확하게 표적화되어야 합니다. 이를 위해 성 교수와 동료 연구원들은 최근 실험적 간세포암종 쥐에서 NO의 정상 상태 표적 방출을 가능하게 하는 나노 전달 시스템을 개발했습니다(Sung et al., 2019). 이 시스템으로 치료하면 종양 혈관이 정상화되어 다양한 치료 방식의 전달과 효능이 향상되는 동시에 면역 억제성 종양 미세환경을 면역 자극성 표현형으로 재프로그래밍합니다. 일반적으로 “NO 기증자”로 분류되는 화합물은 약물 동태학과 신호 특성이 크게 다르다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 실제로, 위에서 인용한 연구에서 사용된 디니트로실철 복합체(DNICs)를 포함한 일부 화합물의 경우, 주요 생체 활성이 유리 NO의 방출을 통해 전달되는지 여부가 명확하지 않습니다.

Dietary aspects

There are several dietary aspects related to the generation of NO and other nitrogen oxides in the body. Before the discovery of endogenous NO signaling, the focus was mainly on the potentially harmful role of dietary nitrate and nitrite as precursors of carcinogenic N-nitrosamines (Tannenbaum et al., 1974). In the acidic stomach, salivary nitrite is protonated and generates nitrogen oxides that can nitrosate dietary secondary amines. Mainly from early animal research, these N-nitrosamines were associated with various types of cancer and this led to recommended restrictions in human exposure to nitrate and nitrite that are still present. However, recent statements from international agencies do not find an association between dietary nitrate in vegetables and cancer and that association of high intake of nitrite with cancer is equivocal (EFSA, 2008; Speijers and van den Barandt, 2003). Other constituents in vegetables such as vitamin C and E and polyphenols may counteract gastric N-nitrosamine formation from salivary nitrite, which could explain the lack of association between dietary nitrate and human cancer.

The discovery of L-arginine as a substrate for NO generation (Palmer et al., 1988) naturally triggered the idea of using this amino acid to enhance NOS signaling in various CVDs. Theoretically, L-arginine substitution would not work because plasma levels are 20- to 30-fold higher than its Km for eNOS, but several studies show enhanced NO generation (Lundberg et al., 1996c) and improved endothelial function after L-arginine substitution (Gambardella et al., 2020; Imaizumi et al., 1992). The mechanism(s) underlying this “L-arginine paradox” has not been unraveled but cellular compartmentalization of L-arginine, substitution overriding increased arginase activity, or counteracting increased asymmetrical dimethylarginine (ADMA) have been proposed. The latter explanation has promoted eval‎uation of plasma L-arginine/ADMA ratio to identify subjects that would benefit from L-arginine substitution (Bode-Böger et al., 2007). It has been suggested that administration of L-citrulline instead of L-arginine to increase systemic L-arginine levels might be advantageous because it escapes metabolism by gut bacteria and liver arginase (Solomonson et al., 2003). Clinical trials in CVD have shown diverging results, and there is currently not enough evidence to support L-arginine substitution (Bednarz et al., 2005; Hadi et al., 2019). Other dietary means to support NOS output in CVD have been proposed, where administration of the BH4 precursors folate or sepiapterin has been tested in small clinical trials, but data are inconclusive and larger trials are needed to clarify any beneficial role of BH4 analogs (De Maria et al., 2014; Gori et al., 2001).

The discovery of the nitrate-nitrite-NO pathway in mammals ignited an interest in using dietary nitrate to increase systemic NO bioactivity (Figure 3). The dietary implications were obvious because green leafy vegetables and beetroot contain high amounts of this anion. Beetroot juice has been used in numerous studies because it is a convenient natural source to provide nitrate and because a nitrate-depleted beetroot juice has been available as placebo (Gilchrist et al., 2014). Early human studies in this field could show vasodilation and blood pressure reducing properties of nitrate in healthy subjects (Larsen et al., 2006; Webb et al., 2008) and later in hypertensives (Kapil et al., 2015). In addition to vasodilation, other mechanisms may contribute to the vasorelaxant effects, such as central and peripheral sympatholysis (Guimarães et al., 2019; Notay et al., 2017), reduction of NADPH oxidase activity (Gao et al., 2015; Montenegro et al., 2011), and modulation of angiotensin II receptor signaling (Hezel et al., 2016). Other effects of dietary nitrate in human studies with relevance to CVD include improved endothelial function (Kapil et al., 2013; Rodriguez-Mateos et al., 2015), reduced arterial stiffness (Rammos et al., 2014), inhibition of platelet aggregation (Webb et al., 2008), and mobilization of circulating angiogenic cells (Heiss et al., 2012). Within these entities, there are varying results that may depend on several factors, such as study populations, dosing, and temporal aspects of administration. Because oral bacteria are central in reducing nitrate to nitrite, variations in the human oral microbiome could also influence the outcome (Kapil et al., 2018). Moreover, stomach acidity has been shown to be of importance in the blood pressure-lowering effects (Montenegro et al., 2017; Pinheiro et al., 2015). In animal models of myocardial IR injury, inorganic nitrate and nitrite have been generally beneficial, which has prompted a few human phase II trials with dietary nitrate or nitrite (Eriksson et al., 2021; Jones et al., 2015; Siddiqi et al., 2014). The results from these have shown neutral or limited beneficial effects but newer trials are ongoing (clinicaltrials.gov), which will shed more light on the role of these anions in ameliorating IR injury.

Another field of major interest related to dietary nitrate is the ergogenic effects of inorganic nitrate, where both acute and chronic intake in humans has been shown to reduce oxygen cost (Larsen et al., 2007) and enhance performance (Jones et al., 2018; Maughan et al., 2018). There are most likely parallel mechanisms contributing to the oxygen sparing and performance enhancing effects, including improved mitochondrial efficiency (Larsen et al., 2011), enhanced blood flow to the working muscle (Lee et al., 2015), and increased muscle contractile efficiency (Bailey et al., 2010). Interestingly, fast twitch type II muscle type seems to be especially responsive to the blood flow and contractile effects of dietary nitrate (Ferguson et al., 2013; Hernández et al., 2012). Translation of these effects into diseases with reduced exercise capacity, such as heart failure (Eggebeen et al., 2016), peripheral artery disease (Kenjale et al., 2011), and COPD (Pavitt et al., 2020) has shown varying results and larger clinical trials are clearly needed to confirm‎ a relevance for nitrate supplementation in these conditions.

Promising preclinical data show benefit of dietary nitrate in genetic or diet-induced animal models of the metabolic syndrome or type 2 diabetes. In these models, several features of metabolic disturbance have been positively affected by dietary nitrate, including glucose tolerance, insulin sensitivity, dyslipidemia, hepatic lipid accumulation, and inflammation (Lundberg et al., 2018). There are several proposed molecular targets where the nitrate-nitrite-NO pathway may signal, converging at the central metabolic regulator AMPK (Cordero-Herrera et al., 2019; Lai et al., 2016). Inhibition of mitochondrial respiration and reduced generation of reactive oxygen species via inhibition of mitochondrial complex I as well as NADPH oxidases have been proposed to activate/phosphorylate AMPK. This will lead to reduced fatty acid synthesis, increased fatty acid oxidation, and GLUT 4 translocation with increased glucose uptake. Interestingly, some of these molecular events are also suggested to underlie the effect of biguanides, such as metformin (Cordero-Herrera et al., 2020). In addition to this signaling pathway, nitrate and nitrite have been suggested to increase insulin secretion (Nyström et al., 2012) and induce browning of fat (Roberts et al., 2015). Human studies have, to date, not been able to show convincing salutary effects of dietary nitrate in patients with type 2 diabetes, and the reasons are still unclear (Bahadoran et al., 2021; Gilchrist et al., 2013).

These above-mentioned features of dietary nitrate have raised the question of whether inorganic nitrate is responsible, at least in part, for the described health effects of certain diets, such as the DASH, Mediterranean, and traditional Japanese diets (Appel et al., 1997; de Lorgeril et al., 1999). Large epidemiological investigations specifically associate green leafy vegetables with a reduced risk of CVD (Hung et al., 2004; Joshipura et al., 1999) and type 2 diabetes (Carter et al., 2010). However, studies more specifically designed to pinpoint nitrate as a beneficial constituent in a green diet have not been conclusive and the question is still out for debate (Siervo et al., 2020; Sundqvist et al., 2020).

식이 측면

체내에서 NO와 기타 질소산화물이 생성되는 것과 관련된 몇 가지 식이 측면이 있습니다. 내인성 NO 신호 전달이 발견되기 전에는 발암성 N-니트로사민의 전구물질로서 식이 질산염과 아질산염의 잠재적인 유해성에 주로 초점을 맞추었습니다(Tannenbaum et al., 1974). 산성 위장에서 침 속의 아질산염은 양성자화되어 식이 이차 아민을 니트로사민화할 수 있는 질소산화물을 생성합니다. 주로 초기 동물 연구에서, 이러한 N-니트로사민은 다양한 유형의 암과 관련이 있었고, 이로 인해 여전히 존재하는 질산염과 아질산염에 대한 인체 노출을 제한하는 것이 권장되었습니다. 그러나 최근 국제 기관의 성명서는 채소에 함유된 식이성 질산염과 암의 연관성을 발견하지 못했으며, 아질산염의 다량 섭취와 암의 연관성은 모호합니다(EFSA, 2008; Speijers and van den Barandt, 2003). 비타민 C, E, 폴리페놀과 같은 다른 성분들은 타액의 아질산염으로부터 위 N-니트로사민 형성을 억제할 수 있으며, 이는 식이성 질산염과 인간 암의 연관성이 없는 이유를 설명할 수 있습니다.

NO 생성의 기질로서 L-아르기닌의 발견(Palmer et al., 1988)은 자연스럽게 다양한 심혈관 질환에서 NOS 신호를 강화하기 위해 이 아미노산을 사용하는 아이디어를 촉발시켰습니다. 이론적으로, L-아르기닌 대체는 효과가 없을 것입니다. 왜냐하면 혈장 농도가 eNOS의 Km보다 20~30배 더 높기 때문입니다. 그러나 여러 연구에서 L-아르기닌 대체 후 NO 생성(Lundberg et al., 1996c)과 내피 기능 개선(Gambardella et al., 2020; Imaizumi et al., 1992)이 나타났습니다. 이 “L-아르기닌 역설”의 기전은 밝혀지지 않았지만, L-아르기닌의 세포 내 분포, 증가된 아르기나제 활성을 대체하는 작용, 또는 증가된 비대칭 디메틸아르기닌(ADMA)의 역작용이 제안되었습니다. 후자의 설명은 혈장 L-아르기닌/ADMA 비율의 평가를 촉진하여 L-아르기닌 대체로 혜택을 볼 수 있는 대상을 식별하는 데 도움이 되었습니다(Bode-Böger et al., 2007). L-아르기닌 대신 L-시트룰린을 투여하여 전신 L-아르기닌 수치를 높이는 것이 장내 세균과 간 아르기나제의 대사를 피할 수 있기 때문에 유리할 수 있다는 것이 제안되었습니다(Solomonson et al., 2003). 심혈관 질환에 대한 임상 시험은 상반된 결과를 보여왔고, 현재 L-아르기닌 대체 요법을 뒷받침할 만한 충분한 증거가 없습니다(Bednarz et al., 2005; Hadi et al., 2019). CVD에서 NOS 산출을 지원하는 다른 식이 요법이 제안되어 왔으며, BH4 전구체인 엽산 또는 세피아테린의 투여가 소규모 임상 시험에서 시험되었지만, 데이터가 결정적이지 않고 BH4 유사체의 유익한 역할을 명확히 하기 위해 대규모 시험이 필요합니다(De Maria et al., 2014; Gori et al., 2001).

포유류에서 질산염-아질산염-NO 경로의 발견은 식이성 질산염을 사용하여 전신 NO 생체 활성을 증가시키는 것에 대한 관심을 불러일으켰습니다(그림 3). 녹색 잎채소와 비트 뿌리에는 이 음이온이 다량 함유되어 있기 때문에 식이성 영향은 분명했습니다. 비트 뿌리 주스는 질산염을 제공하는 편리한 천연 공급원이기 때문에 수많은 연구에서 사용되어 왔으며, 질산염이 고갈된 비트 뿌리 주스는 위약으로 사용되어 왔습니다(Gilchrist et al., 2014). 이 분야에 대한 초기 인간 연구에서는 건강한 피실험자(Larsen et al., 2006; Webb et al., 2008)와 고혈압 환자(Kapil et al., 2015)에서 질산염의 혈관 확장 및 혈압 감소 특성을 보여줄 수 있었습니다. 혈관 확장과 더불어, 중추 및 말초 교감신경 분해(Guimarães et al., 2019; Notay et al., 2017), NADPH 산화효소 활성 감소(Gao et al., 2015; Montenegro et al., 2011), 안지오텐신 II 수용체 신호 조절(Hezel et al., 2016)과 같은 다른 메커니즘이 혈관 이완 효과에 기여할 수 있습니다. ). CVD와 관련된 인간 연구에서 식이성 질산염의 다른 효과로는 내피 기능 개선(Kapil 외, 2013; Rodriguez-Mateos 외, 2015), 동맥 경직 감소(Rammos 외, 2014), 혈소판 응집 억제(Webb 외, 2008), 순환하는 혈관 형성 세포의 동원(Heiss 외, 2012) 등이 있습니다. 이러한 개체들 안에는 연구 집단, 투여량, 투여의 시간적 측면 등 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있는 다양한 결과가 있습니다. 구강 내 세균이 질산염을 아질산염으로 환원하는 데 핵심적인 역할을 하기 때문에, 구강 미생물 군집의 변화도 결과에 영향을 미칠 수 있습니다(Kapil et al., 2018). 또한, 위산도는 혈압을 낮추는 효과에 중요한 것으로 나타났습니다(Montenegro et al., 2017; Pinheiro et al., 2015). 심근 IR 손상의 동물 모델에서 무기질 질산염과 아질산염은 일반적으로 유익한 것으로 나타났습니다. 이로 인해 식이성 질산염 또는 아질산염을 사용한 몇 가지 인간 2상 시험이 진행되었습니다(Eriksson et al., 2021; Jones et al., 2015; Siddiqi et al., 2014). 이것들의 결과는 중립적이거나 제한적인 유익한 효과를 보여 주었지만, 새로운 임상시험(clinicaltrials.gov)이 진행 중이며, 이로 인해 IR 손상을 개선하는 데 있어서 음이온의 역할에 대한 더 많은 정보가 밝혀질 것입니다.

식이 질산염과 관련된 또 다른 주요 관심 분야는 무기질 질산염의 인체 강화 효과입니다. 급성 및 만성 섭취 모두 산소 소모량을 줄이고(Larsen et al., 2007) 성능을 향상시키는 것으로 나타났습니다(Jones et al., 2018; Maughan et al., 2018). 산소 보존 및 성능 향상 효과에 기여하는 병행 메커니즘이 있을 가능성이 높습니다. 여기에는 미토콘드리아 효율성 향상(Larsen 외., 2011), 작업 근육으로의 혈류량 증가(Lee 외., 2015), 근육 수축 효율성 증가(Bailey 외., 2010) 등이 포함됩니다. 흥미롭게도, 빠른 트위치 타입 II 근육 유형은 식이성 질산염의 혈류와 수축 효과에 특히 민감한 것으로 보입니다(Ferguson et al., 2013; Hernández et al., 2012). 이러한 효과가 운동 능력이 감소한 질병(심부전(Eggebeen et al., 2016), 말초동맥질환(Kenjale et al., 2011), 만성폐쇄성폐질환(Pavitt et al., 2020)으로 해석되는 경우, 다양한 결과가 나타났습니다. 따라서 이러한 질환에서 질산염 보충제의 관련성을 확인하기 위해서는 더 큰 규모의 임상 시험이 분명히 필요합니다.

유망한 전임상 데이터는 대사증후군 또는 제2형 당뇨병의 유전적 또는 식이 유발 동물 모델에서 식이 질산염의 이점을 보여줍니다. 이러한 모델에서, 포도당 내성, 인슐린 민감성, 이상지질혈증, 간 지질 축적 및 염증(Lundberg et al., 2018)을 포함한 대사 장애의 여러 특징이 식이 질산염에 의해 긍정적인 영향을 받았습니다. 질산염-아질산염-NO 경로가 신호할 수 있는 몇 가지 분자 표적 후보가 있으며, 이들은 중심 대사 조절인자 AMPK에 수렴합니다(Cordero-Herrera et al., 2019; Lai et al., 2016). 미토콘드리아 호흡 억제 및 미토콘드리아 복합체 I 및 NADPH 산화효소 억제를 통한 활성 산소 생성 감소가 AMPK를 활성화/인산화하는 것으로 제안되었습니다. 이것은 지방산 합성 감소, 지방산 산화 증가, 포도당 섭취 증가와 함께 GLUT 4 전좌로 이어집니다. 흥미롭게도, 이러한 분자적 사건 중 일부는 메트포르민(Cordero-Herrera et al., 2020)과 같은 비구아니드 계열 약물의 효과를 뒷받침하는 것으로도 제시되고 있습니다. 이 신호 전달 경로 외에도 질산염과 아질산염은 인슐린 분비를 증가시키고(Nyström et al., 2012) 지방의 갈변을 유도하는 것으로 알려져 있습니다(Roberts et al., 2015). 지금까지 인간 대상 연구에서 제2형 당뇨병 환자들에게서 식이성 질산염의 유익한 효과를 입증하지 못했으며, 그 이유는 아직 명확하지 않습니다(Bahadoran et al., 2021; Gilchrist et al., 2013).

위에서 언급한 식이성 질산염의 특징은 무기질성 질산염이 DASH, 지중해식, 전통 일본식 식단과 같은 특정 식단의 건강 효과에 적어도 부분적으로 책임이 있는지에 대한 의문을 불러일으켰습니다(Appel et al., 1997; de Lorgeril et al., 1999). 대규모 역학 조사에 따르면 녹색 잎채소는 특히 CVD(심혈관 질환) 위험 감소와 관련이 있습니다(Hung et al., 2004; Joshipura et al., 1999) 및 제2형 당뇨병(Carter et al., 2010). 그러나, 녹색 식단의 유익한 성분으로 질산염을 정확히 가리키기 위해 특별히 고안된 연구는 아직 결정적이지 않으며, 이 문제는 여전히 논쟁의 대상입니다(Siervo et al., 2020; Sundqvist et al., 2020).

Perspectives

After the discovery of EDRF by Robert Furchgott in 1980, it took 6 more years until this mysterious mediator was finally identified as NO. A major reason for this delay was that it just seemed too unlikely that a gas merely known as an environmental pollutant could be generated in our bodies to control vital cellular functions. Nevertheless, after this highly unexpected discovery, the field virtually exploded, much aided by the immediate availability of pharmacological NO synthase inhibitors. NO also opened the door to research on endogenous carbon monoxide (CO) and hydrogen sulfide (H2S) creating a family of novel signaling molecules commonly referred to as gasotransmitters. How these systems interact is currently an area of active research. In many ways, the early discoveries in the NO field still hold true today; eNOS in the endothelium is a major regulator of cardiovascular function and many of NO’s effects are mediated through the sGC/cGMP pathway. Other NO-derived products generated by nitrosation and nitration reactions are also involved in physiological and pathophysiological signaling, but, even today, questions remain about how these species are formed and how signaling is conveyed. The output in terms of novel therapeutic modalities has been somewhat disappointing given the enormous efforts put down. Early trials with NOS inhibitors in sepsis failed, as did trials using selective iNOS inhibitors for various inflammatory conditions. Nevertheless, iNOS is now instead emerging as a promising target in cancer and larger trials are in the pipeline. The development of sGC-stimulating drugs has been a success, and new indications can be foreseen besides pulmonary hypertension and heart failure, for which they are already approved. Finally, boosting of NO-like signaling by dietary means is emerging as a viable strategy to improve cardiovascular and metabolic function in health and disease.

관점

1980년 로버트 퍼치갓(Robert Furchgott)이

 EDRF를 발견한 후, 

이 신비한 매개체가 마침내 NO로 확인되기까지 6년이 더 걸렸습니다. 

이 지연의 주된 이유는 

환경 오염 물질로만 알려진 가스가 

우리 몸에서 생성되어 중요한 세포 기능을 제어할 수 있다는 것이 

너무 불가능해 보였기 때문입니다. 

그럼에도 불구하고, 

이 예상치 못했던 발견 이후, 

약리학적인 NO 합성 억제제의 즉각적인 가용성에 힘입어 

이 분야는 사실상 폭발적으로 성장했습니다. 

또한

 NO는 

일종의 가스 전달 물질로 

통상적으로 불리는 새로운 신호 전달 분자 계열을 만들어 내는 

내인성 일산화탄소(CO)와 황화수소(H2S)에 대한 연구의 문을 열었습니다. 

이러한 시스템이 상호 작용하는 방식은 

현재 활발한 연구가 진행되고 있는 분야입니다. 

여러 면에서, 

NO 분야에서 초기에 발견된 사실은 

오늘날에도 여전히 유효합니다. 

내피의 eNOS는 

심혈관 기능을 조절하는 주요 요소이며, 

NO의 많은 효과는 sGC/cGMP 경로를 통해 매개됩니다. 

질산화 및 질화 반응에 의해 생성된 다른 NO 유도체 제품들도 

생리학적 및 병리생리학적 신호 전달에 관여하지만, 

오늘날까지도 이러한 물질이 어떻게 형성되고 신호가 전달되는지에 대한 의문이 남아 있습니다. 

막대한 노력을 기울였음에도 불구하고, 

새로운 치료 방식의 출현이라는 측면에서 보면 다소 실망스러운 결과입니다. 

패혈증에 대한 NOS 억제제의 초기 시험은 실패했고, 

다양한 염증 상태에 대한 선택적 iNOS 억제제를 사용한 시험도 실패했습니다. 

그럼에도 불구하고, 

iNOS는 

현재 암 치료의 유망한 표적 물질로 부상하고 있으며, 

대규모 임상시험이 진행되고 있습니다. 

sGC 자극 약물의 개발은 성공적이었으며, 

이미 승인된 폐고혈압과 심부전 외에 새로운 적응증이 예상됩니다. 

마지막으로, 

식이 요법을 통한 NO 유사 신호 전달의 증진은 

건강과 질병에서 심혈관 및 대사 기능을 개선하는 

실행 가능한 전략으로 부상하고 있습니다.