인간 섬유육종 HT1080에서 D1 및 D2(PLD1/PLD2)의 역할

[dhleepaul]

• 검색

• PDF 보기
• 전체 문제 다운로드

생명 과학 분야의 업적

Volume 10, Issue 2 (제10권, 2호), 2016년 12월, 125-135페이지

인간 섬유육종 HT1080 암 세포주에서 기포 형성은 지질 신호 전달 포스포리파제 D2(PLD2)에 의해 긍정적으로 조절됩니다

작성자 링크 오버레이 패널 열기고드윈 A. 포누웨이, 필 R. 대시 1

더 보기

Outline

Mendeley에 추가

공유

인용하다

https://doi.org/10.1016/j.als.2016.11.001권리 및 콘텐츠 가져오기

크리에이티브 커먼즈(Creative Commons) 면허

오픈 액세스

추상적인

블렙(bleb)은 세포질에서 액토미오신 수축력(actomyosin contractility)에 의한 정수압 증가의 결과로 막이 기본 피질에서 분리될 때 형성되는 구형 원형질막 돌출부입니다. 서로 다른 종양 세포는 세포외 기질(ECM)의 기존 기공을 통해 압착하여 출혈을 대체 이동 모드로 사용하여 전이됩니다. 이 연구는 세포외 기질에서 인간 섬유육종 HT1080 세포주에서 bleb 형성에서 지질 신호 전달 포스포리파제 D1 및 D2(PLD1/PLD2)의 역할을 조사했으며, 강력한 범용 PLD 억제제를 사용한 PLD1 및 PLD2의 약리학적 억제가 3차원(3D) matrigel 매트릭스에 내장된 HT1080 세포에서 기포 형성을 강력하게 억제했다고 보고했습니다. 4개의 서로 다른 염기서열에서 PLD1 및 PLD2 동형을 표적으로 하는 smartpool small interfering RNA(siRNA)를 사용한 결과, PLD1이 아닌 PLD2가 HT1080 세포의 블리빙에 관여하는 것으로 나타났습니다. 또한 PLD2 매개 bleb 형성이 PA-LPAR-Rho-ROCK 신호 전달 경로를 통해 이루어짐을 입증합니다. 따라서 PLD2는 섬유성 결합 조직의 암 전이를 방지하는 유망한 치료 표적입니다.

•  이전 기사
• 기사 발행

키워드

Blebs

Cancer

Cortex

수축성

막

포스포리파제 D

소개

기포는 구형의 물집 모양의 원형질막 돌출부로, 액틴 필라멘트가 있는 미오신 모터의 슬라이딩 활동으로 인해 일정한 변형을 받는 기본 피질에서 막이 분리되는 악토미오신 추진 피질 수축력에 의해 형성됩니다(Tinevez et al., 2009). 짧은 시간 간격으로 나타났다가 사라지는 이러한 물집 모양의 돌출부는 피질 자체의 국소 파손에 의해서도 발생합니다(Charras and Paluch, 2008). 다양한 세포 유형에서 매우 오랜 시간 동안 관찰되었지만(Kubota, 1981, Trinkaus, 1973), 암세포가 원형질막 출혈을 대체 이동 방식으로 사용하여 세포외 기질(ECM)의 기존 기공을 통해 전이된다는 충분한 증거가 있습니다(Ridley, 2011, Wolf et al., 2003).

세포 기절부의 수명주기는 핵 형성, 확장 (기제 성장) 및 수축의 세 단계로 나뉩니다. 기슭 핵형성은 피질의 이광자 레이저 절제와 관련된 실험 기술과 같은 세포외 자극에 의해 촉발되어 피질-막 상호 작용을 약화시키며(Goudarzi et al., 2012) 결과적으로 피질에서 막이 부풀어 오릅니다. 5초에서 30초 사이에 지속되는 성장 단계는 악토미오신 수축성에 의한 세포질의 정수압 생성에 의해 발생합니다. 기샜은 세포질액과 지질이 기젼 목을 통해 기젭으로 흘러 들어가 기젼의 표면적이 증가함에 따라 부피가 커집니다(Charras and Paluch, 2008). 블렙 확장은 악토미오신 수축성 의존성 체액 및 지질 유입 속도가 지속적인 성장을 유지하기에 부적절해짐에 따라 점차 가라앉습니다(Charras et al., 2006). 따라서, 팽창하는 블렙은 후퇴가 시작되기 전에 짧은 정상 상태(블렙 안정화)에 도달한다. 수축은 가장 긴 단계이며 최대 2분 동안 지속될 수 있습니다(Charras et al., 2008). 먼저 블렙 막에서 액틴 필라멘트를 재조립하기 전에 블렙 막 내에서 막-피질 링커 단백질(ezrin, radixin 및 moesin)을 모집합니다. 그 다음에는 운동 단백질, 특히 미오신 II(myosin II)가 동원됩니다(Charras et al., 2006). 그런 다음 블레브는 새로 형성된 피질에 의해 세포체 쪽으로 수축됩니다(Norman et al., 2010).

지질 신호 전달 포스포리파제 D(PLD)는 PLD1 및 PLD2의 두 가지 이성질체 형태로 존재하며, 막 인지질 포스파티딜콜린(PC)의 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉매하여 포스파티드산(PA)과 유리 콜린을 생성합니다(Su et al., 2009a). 유리 콜린은 막에서 멀리 확산되는 반면, 다재다능한 지질 두 번째 메신저 PA는 막에 남아 신호 전달(Zhao et al., 2007), 세포 증식(Oude Weernink et al., 2007), 막 소포 이동(Shen et al., 2001), 지질 대사(Wagner and Brezesinski, 2007), 액틴 세포골격 재편성(Du and Frohman, 2009), 식세포작용 및 엑소사이토시스(Exocytosis)(Corrotte et al., 2006, Shen et al., 2001), 세포 생존(Foster, 2009) 및 세포 이동(Scott et al., 2009, Su et al., 2009b). 따라서 PLD 활성의 손상은 암, 신경 퇴행, 당뇨병 및 염증과 같은 병리학적 상태와 상관관계가 있습니다(Selvy et al., 2011).

이 연구에서 우리는 이전에 단백질 분해 및 매트릭스 분해 억제 시 출혈이 많은 것으로 보고된 인간 섬유육종 HT1080 세포주에서 막 기포 형성에서 PLD의 역할을 조사했습니다(Wolf et al., 2003). 따라서 HT1080 세포주는 체외 환경에서 막 블렙 형성을 연구하는 데 탁월한 모델이며, 이는 이 연구를 위해 이 세포주를 선택하는 데 영향을 미쳤습니다. 3D 마트리겔 매트릭스에서 배양된 HT1080 세포에서 PLD2는 PA를 통해 PLD1 신호를 보내지 않고 LPA-LPAR-ROCK(리소포스파티드산/리소포스파티드산 수용체/Rho-associated kinase) 신호 전달 경로가 필요한 메커니즘에서 블레브 형성을 매개한다는 것을 입증합니다. 따라서 새로운 PLD2 특이적 억제제의 개발은 암과 싸우는 유망한 치료 전략입니다.

재료 및 방법세포 배양 및 시약

인간 섬유육종 HT1080 세포주는 영국 솔즈베리의 HPA 배양 컬렉션에서 수득하였다. 세포는 37°C에서 가습된 5%(v/v) CO에서 10%(v/v) 소 태아 혈청, 1%(2mM) l-글루타민, 1%(100μg/ml) 스트렙토마이신, 및 1%(100단위/ml) 페니실린이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지(DMEM)에서 배양되었습니다2 대기 공기. 세포는 48시간마다 유지되고 통과되었습니다. Smartpool human PLD1 및 PLD2 siRNA는 영국 러프버러에 있는 Fisher Scientific에서 구입했습니다. PLD1 및 PLD2에 대한 항체는 영국 케임브리지에 있는 Abcam Plc에서 수득하였다. Batimastat (BB-94), FIPI (5-fluoro-2-Indolyly des-chlorohalopemide), Go6976, LY294002, PIC set VI (protease inhibitor cocktail VI), U73122 및 Y27632는 영국 노팅엄의 Calbiochem에서 구입하였다. VPC-32138은 케탄 파텔(Ketan Patel) 교수(영국 레딩 대학교)의 친절한 선물이었습니다. dH에서 재구성한 PIC를 제외한 모든 억제제2O는 DMSO에 용해되었다.

siRNA 트랜스펙션(transfection)

HT1080 세포주의 transfection은 제조업체의 지침에 따라 DharmaFECT transfection reagent set 4(T-2004-02)를 사용하여 수행되었습니다. 간단히 말해서, 세포는 2 × 10의 밀도로 6-웰 플레이트에 파종되었습니다5 세포/웰 및 37°C에서 5% CO로 배양2 형질주입 전 24시간 동안. 20μM 스톡 siRNA로부터 5μM siRNA 용액을 1× siRNA 완충액(20mM KCl, 6mM HEPES(pH 7.5) 및 0.2mM MgCl)에 준비했습니다2), 5 × siRNA 완충액(300 mM KCl, 30 mM HEPES(pH 7.5), 1.0 mM MgCl)로부터 제조하였다2) 및 RNase가 없는 물을 1:4의 비율로 사용합니다. 두 개의 튜브가 설치되었습니다. 첫 번째 및 두 번째 튜브에는 적절한 부피의 5μM siRNA 용액과 DharmaFECT transfection 시약을 각각 도입했습니다. L-글루타민(항생제 및 무혈청 배지)만 보충한 배지를 각 튜브에 주입하고 두 튜브를 후드에서 5분 동안 배양했습니다. 배양 후, 제1 튜브의 내용물을 제2 튜브에 첨가하고, 생성된 혼합물을 재현탁시키고, 혼합물에 무항생제 배지를 첨가하기 전에 20분 동안 복합하게 하였다. 6-웰 플레이트에 있는 세포로부터의 배양 배지를 24시간 및 48시간 동안 배양하기 전에 총 형질주입 배지의 2ml로 교체하였다. 사용된 최종 siRNA 농도는 25nM이었고, 단백질의 knockdown은 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인되었습니다.

블레빙 어세이

블레빙 분석은 이전에 설계된 3D 세포 이동 분석법을 수정한 것입니다(Wolf et al., 2003). 이 연구에서 Wolf와 동료들은 인간 HT1080 세포주가 가소성, 즉 길쭉한 중간엽 형태에서 둥근 아메바이드 이동 모드로의 상호 전환, 즉 중간엽 아메바이드 전이(MAT)라고 하는 과정을 나타낼 뿐만 아니라 세포가 매트릭스 금속단백분해효소(MMP) 및 기타 프로테아제의 단백질 분해 활성을 억제할 때 막 기절을 풍부하게 형성한다고 보고했습니다(Wolf et al., 2003). 따라서 세포주는 막 블렙 형성을 연구하기 위한 좋은 모델입니다. 간단히 말해서, 성장 인자 환원 마트리겔(BD Biosciences, UK)을 4°C에서 밤새 해동하고 얼음 위에 보관하였다. 팁, 피펫, 플레이트, 유리 커버슬립, μ-접시 및 튜브를 -20°C에서 1시간 동안 냉각했습니다. 융합 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구고, 트립신화한 후 차가운 무혈청 배지에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 얼음 상에 마트리겔에 등가 비율로 조심스럽게 첨가하고 적절하게 혼합하였다. 200μl의 세포-마트리겔 현탁액을 6-웰 플레이트의 유리 커버슬립 상에, 그리고 35 mm 유리 바닥 접시 위에 도말하고, 이어서 37°C에서 30분 동안 배양하여 마트리겔이 굳도록 하였다. 완전한 세포 배양 배지를 첨가하고 세포사멸 기제 형성을 억제하는 카스파제 억제제 세트 VI(10μM)의 존재 하에 각각 바티마스타트, BB-94(1μM) 및 프로테아제 억제제 칵테일, PIC(1:100)로 (MMP) 및 표면 프로테아제의 단백질 분해 활성을 차단하여 세포를 블레브하도록 유도했습니다. 이어서 플레이트를 37°C에서 18시간 동안 배양하였다.

세포의 고정과 위상차 현미경

BB-94 및 PIC로 블레브 유도 후, 배지를 흡인하고 세포를 사전 냉각된 PBS로 두 번 헹구은 다음 2.5%(v/v) 글루타르알데히드로 30분 동안 고정했습니다. 고정액을 제거하고 30분 동안 0.2%(v/v) 트리톤 X-100으로 세포를 투과시켰습니다. 이미지는 Zeiss A1 도립 현미경의 40× 위상차 대물 렌즈를 사용하여 획득했습니다.

Bleb 크기 결정

각 개별 셀의 블렙 크기(둘레)는 ImageJ의 '다각형 도구'로 전체 둘레에 가는 원형 선을 수동으로 그려 측정했습니다. 그 다음에는 '측정값 분석'> 이어졌고, 드롭다운 결과 목록에서 둘레 값을 픽셀 단위로 기록했습니다. 픽셀 단위의 값은 0.11μm의 사전 보정된 계수(1픽셀에 해당하며 40× 대물 렌즈를 계수선으로 보정했을 때 얻은 계수)를 곱하여 정규화되었습니다.

백분율 Blebbing 세포의 정량화

블리빙 세포의 비율을 정량화하기 위해 플레이트와 μ접시를 위상차 Zeiss A1 도립 현미경의 스테이지에 적절하게 장착하고 40개의 × 대물 렌즈를 사용하여 총 세포 수(블리빙 및 비블리빙 세포)를 시각화하고 수동으로 계수했습니다. 출혈 세포의 비율은 출혈 세포의 수를 출혈 세포와 비출혈 세포의 합으로 나눈 다음 그 결과에 100을 곱하여 아래와 같이 구했습니다.%블레빙셀=아니요블레빙셀합계아니요세포×1001.

웨스턴 블로팅(Western Blotting)

HT1080 세포를 하룻밤 동안 6웰 플레이트에 파종하고 PLD1 및 PLD2 siRNA로 처리했습니다. 세포를 수거하여 프로테아제 억제제 칵테일(1:100)의 존재 하에 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액에서 용해시켰습니다. 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기기 전에 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고, 0.1% TBS-트윈에서 5% 무지방 우유로 차단하였다. 멤브레인을 인간 항-PLD1 및 PLD2 항체(Abcam, ab10583 및 ab123663)(1:1000)로 4°C에서 밤새 배양했습니다. 항 튜불린 항체 (Sigma; T9026)이 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 사용된 2차 항체는 항-토끼 및 항-마우스 IgG-HRP (1:2000)였다. 멤브레인을 ECL(enhanced chemiluminescence) 시약 A 및 B로 처리한 후 ImageQuant LAS 4000 기계(GE Healthcare Life Sciences)로 개발했습니다.

통계 분석

통계적 유의성은 3개 이상의 변수에 대해 Tukey의 사후 다중 비교 후 일원 분산 분석을 수행했으며, 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t 검정은 2개 변수에 대해 수행되었습니다. 모든 비교를 수행하기 위해 GraphPad prism 5 소프트웨어(GraphPad 소프트웨어, 캘리포니아주 샌디에이고)를 사용했습니다. 모든 데이터는 3회(n=3)의 최소 3개의 독립적인 실험에서 생성되었으며, 0.05< P값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과Phospholipase D(PLD) 활성의 약리학적 억제

세포외 기질(ECM)에서 HT1080 세포의 블리빙에서 PLD1 및 PLD2에 의해 매개되는 지질 신호전달의 역할을 조사하기 위해 먼저 카스파제 억제제(10μM)가 있는 상태에서 각각 BB-94(1μM) 및 프로테아제 억제제 칵테일 PIC(1:100)로 MMP와 프로테아제의 활성을 차단하여 세포를 블리브하도록 유도했습니다. 그런 다음 PLD1 및 PLD2의 활성을 시험관 내 및 생체 내 모두에서 두 PLD 동형의 강력한 범용 억제제인 5-플루오로-2-인돌릴 데스클로로할로페미드(FIPI)로 억제했습니다(Su et al., 2009b). 그림 1A(상단 패널)에서 볼 수 있듯이 PIC 및 BB-94를 사용한 매트릭스 단백질 분해 억제는 세포를 길쭉한 중간엽 모드에서 막 기포(중간 패널)로 채워진 둥근 아메바이드 모드로 효과적으로 전환했습니다. 그러나 30분 동안 750nM FIPI로 세포를 전처리한 결과 HT1080 세포(하단 패널)에서 기포 형성이 충분히 억제되었으며, 이는 PLD1 또는 PLD2 또는 둘 다 이 세포주에서 기포 형성을 매개한다는 것을 시사합니다. 정량화 결과, FIPI 처리는 출혈 세포의 비율을 83%에서 12%로 유의하게 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 1B). PLD 억제제로 세포를 처리하면 세포당 기숄 수(그림 1C)와 기슭의 크기(그림 1D)도 크게 감소했습니다.

1. 다운로드 : 고해상도 이미지 다운로드 (영문) (569KB)
2. 다운로드 : 전체 크기 이미지 다운로드

그림 1. 포스포리파제 D(PLD) 활성의 약리학적 억제. A: 매트릭스 단백질 분해를 억제하지 않고 3D 마트리겔에서 배양된 HT1080 세포는 방추체 모양의 길쭉한 중간엽 모드(상단 패널)에서 분해됩니다. 카스파아제 억제제 세트 VI가 있는 상태에서 BB-94(1μM) 및 PIC(1:100)로 매트릭스 분해를 억제하면 세포가 둥근 블리빙 모드(중간 패널)로 전환됩니다. 750nM PLD 범용 억제제, FIPI 억제 기포 형성(하단 패널)을 사용한 세포 전처리. 데이터는 75개의 세포에 점수가 매겨진 세 번에 걸쳐 수행된 세 가지 개별 실험을 대표합니다. B: 기절 유도제(PIC 및 BB94) 및 FIPI 처리로 처리된 HT1080 세포의 백분율 정량화; C: PIC/BB94 및 FIPI 처리된 HT1080 세포 각각의 블렙 수 분석; D: PIC/BB94 및 FIPI 처리된 HT1080 세포의 기포 크기. 데이터는 세 가지 개별 실험에 대한 SEM± 평균입니다. : P < 0.001, 양측 쌍을 이루지 않은 학생 t 검정 사용.

PLD2의 siRNA 매개 손상, PLD1 억제 Bleb 형성 아님

FIPI에 의한 출혈 억제가 PLD1 또는 PLD2의 억제 때문인지 조사하기 위해 4가지 다른 염기서열에서 PLD1 및 PLD2를 표적으로 하는 특이적 smartpool siRNA를 사용했습니다. PLD1 및 PLD2의 knockdown은 Western blotting에 의해 확인된 바와 같이 siRNA transfection 후 24시간 후에 관찰되었습니다(그림 2A 및 B). PLD1 및 PLD2 knock down 세포와 스크램블된 siRNA 처리 세포를 3D matrigel 매트릭스에서 배양하고 카스파제 억제제(10μM)가 있는 상태에서 BB-94(1μM) 및 PIC(1:100)로 챌린지했습니다. 도 2E에서 볼 수 있듯이, PLD1의 knockdown은 기제 형성에 영향을 미치지 않은 반면, FIPI 처리와 유사한 방식으로, PLD2 RNA 간섭은 HT1080 세포에서 기젭의 형성을 억제하였다(도 2F). 기수 및 크기 분석 결과 PLD2 siRNA는 기수 수와 크기가 모두 유의하게 감소한 반면, PLD1 siRNA는 기수 수와 크기 모두에서 기존 기미 세포와 비교했을 때 차이가 없는 것으로 나타났습니다(그림 2G 및 H).

1. 다운로드 : 고해상도 이미지 다운로드 (875KB)
2. 다운로드 : 전체 크기 이미지 다운로드

그림 2. PLD1이 아닌 PLD2는 HT1080 세포에서 기포 형성을 매개합니다. A 및 B: HT1080 세포를 6웰 플레이트에서 합류하도록 성장시키고 Dharmafect transfect 시약(세트 4)을 사용하여 4개의 서로 다른 염기서열에서 각각 PLD1 및 PLD2를 표적으로 하는 smartpool siRNA로 transfection했습니다. PIC가 있는 상태에서 RIPA 완충액을 사용하여 세포를 용해했습니다(1:100). 단백질은 10% SDS 겔에서 분해되고 인간 항-PLD1 및 PLD2 항체(1:1000)로 면역블롯트되었습니다. 튜불린은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. C 및 D: 튜불린 로딩 제어로 정규화한 후 HT1080 세포에서 각각 PLD1 및 PLD2 수준의 밀도 정량화; E: siRNA에 의한 PLD1 knockdown은 bleb 형성에 영향을 미치지 않습니다. F: PLD2 억제 bleb 형성의 siRNA 매개 knockdown; G: 스크램블, PLD1 및 PLD2 녹다운 세포에서 블렙 수/세포 분석; H: 스크램블, PLD1 및 PLD2 녹다운 세포의 블렙 크기 분석. 각 케이스에 대해 150개의 세포를 정량화하였다. 데이터는 세 가지 개별 실험에 대한 SEM± 평균입니다. : P < 0.001, 양측 쌍을 이루지 않은 학생 t 검정(그림 C 및 D의 경우)과 일원 분산 분석 후 Tukey의 다중 비교 검정(그림 G 및 H의 경우)을 사용합니다.

PLD1 및 PLD2 siRNA의 동형 특이성

siRNA는 off-target effect를 일으켜 다른 동형에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 먼저 PLD1 knock-down cell lysate를 anti-PLD2 항체로 조사하고, PLD2 siRNA 세포 용해물은 anti-PLD1 항체로 면역블롯션하여 각 siRNA의 특이성을 테스트했습니다. 도 3A 및 B에서 볼 수 있듯이, PLD1 siRNA는 PLD2에 영향을 미치지 않았다. 마찬가지로, PLD2 siRNA는 PLD1 활성에 부정적인 영향을 미치지 않았으며(그림 3C 및 D), 사용된 siRNA가 표적에 특이적임을 시사합니다. 이를 통해 PLD1이 아닌 PLD2가 HT1080 세포에서 기포 형성을 긍정적으로 조절한다는 것을 추가로 확인할 수 있습니다.

1. 다운로드 : 고해상도 이미지 다운로드 (402KB)
2. 다운로드 : 전체 크기 이미지 다운로드

그림 3. PLD1 및 PLD2 siRNA의 특이성. A 및 C: 인간 PLD1 및 PLD2 siRNA로 transfection된 HT1080 세포 용해물을 각각 인간 항-PLD2 및 PLD1 항체로 조사했습니다. B: PLD1에서 PLD2 수준의 밀도 정량화는 튜불린 로딩 제어로 정규화 후 HT1080 세포 용해물을 녹다운시켰습니다. D: PLD2에서 PLD1 수준의 밀도 정량화는 튜불린 로딩 제어로 정규화 후 HT1080 세포 용해물을 녹다운시켰습니다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타냅니다. : P < 0.001, 양측 쌍을 이루지 않은 학생 t 검정 사용.

PLD2는 포스파티드산(PA)을 통해 신호를 보내 블렙 형성을 촉진합니다.

PLD 효소에 의한 대부분의 생물학적 과정은 지질 제2 메신저인 포스파티드산(PA)에 의해 매개되기 때문에 PLD2 매개 세포 출혈이 PA 생산을 통해 이루어지는지 여부를 조사하는 것이 필수적이었습니다. 대부분의 생물학적 과정에서 PLD의 관여는 PA 형성을 차단하기 위해 트랜스포스파티딜화 반응을 겪을 수 있는 1차 알코올을 사용하여 테스트됩니다(Zouwail et al., 2005). 실제로, 5분 동안 블레빙 HT1080 세포에 1% 부탄-1-올을 첨가하면 기포 형성이 거의 완전히 제거된 반면(그림 4A, 하단 중간 패널), 1% 3차 부탄올을 첨가하면 유의한 효과가 없었습니다(그림 4A, 하단 패널). butan-1-ol을 사용한 처리는 출혈 세포의 비율을 5%로 크게 감소시키고 세포당 기혈 수를 1로 크게 감소시켰습니다(그림 4B 및 C).

1. 다운로드 : 고해상도 이미지 다운로드 (영문) (721KB)
2. 다운로드 : 전체 크기 이미지 다운로드

그림 4. PLD2는 포스파티드산(PA)을 통해 신호를 보내 기갑 형성을 촉진합니다. A. 억제되지 않은 HT1080 세포(상단 패널). PIC 및 BB94를 사용한 매트릭스 단백질 분해 억제는 세포를 둥근 출혈 모드(상단 중간 패널)로 변환합니다. 1% butan-1-ol abrogated bleb 형성(하단 중간 패널)이 있는 세포의 배양. tert-부탄올(하단 패널)로 5분 동안 배양; B. PIC/BB94 처리 세포, 부탄-1-올 및 tert-부탄올 처리된 HT1080 세포에서 블리빙 세포의 백분율 정량화; C. PIC/BB94 처리-, 부탄-1-ol 및 tert-부탄올 처리 세포의 블렙/세포 수. 데이터는 세 개의 독립적인 실험에 대한 SEM± 평균입니다. : P < 0.001, Tukey의 다중 비교 검정 후 일원 분산 분석 사용.

LPA(Lysophosphatidic Acid)를 통한 PA 신호를 통해 LPAR-Rho-ROCK 경로 활성화

PA가 기제 형성을 중재하기 위해 신호를 보내는 메커니즘을 더 밝히기 위해 PA는 일반적으로 원형질막에서 수용체(LPAR)와 결합하는 생성물인 리소포스파티드산(LPA)을 통해 기내 기포 형성을 촉진할 수 있을 것으로 예상되었습니다. LPAR은 이전에 파골세포의 출혈을 조절하기 위해 Rho-ROCK 경로의 상류에서 기능하는 것으로 보고되었으며(Panupinthu et al., 2007), 일반적으로 세포의 출혈은 ROCK 신호전달에 의해 매개되는 대뇌피질 액틴의 수축에 기인하는 것으로 보고되었습니다(Charras et al., 2008, Paluch and Raz, 2013). 실제로, 각각 1μM VPC-32183 및 5μM Y27632로 LPAR과 ROCK을 억제하면 기포성 형성이 억제되었습니다(그림 5B 및 C). 세포당 블렙 수를 상세히 분석한 결과, LPAR과 ROCK 억제가 각각 3과 1로 기절수를 현저히 감소시켰으며, 이는 HT1080 세포의 블렙에 PA-LPAR-Rho-ROCK 신호전달 축이 관여하는 것을 시사한다.

1. 다운로드 : 고해상도 이미지 다운로드 (영문) (541KB)
2. 다운로드 : 전체 크기 이미지 다운로드

그림 5. PA는 LPA(lysophosphatidic acid)를 통해 신호를 보내 LPAR-Rho-ROCK을 활성화합니다. A. HT1080 세포는 매트릭스 분해 억제 없이(상단 패널) 3D 마트리겔에서 배양되었으며, PIC 및 BB94 유도 세포 출혈(하단 패널)을 사용하여 매트릭스 분해 억제를 수행했습니다. B. 30분 동안 LPAR 억제제, VPC-32183으로 bleb 유도 세포의 전처리; C. ROCK 억제제, Y27632를 37°C에서 30분 동안 전처리; D. LPAR 및 ROCK 억제 시 HT1080 세포주에서 bleb 수/세포의 정량화. 데이터는 세 번에 걸쳐 수행된 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냅니다. : P < 0.001, Tukey의 다중 비교 검정 후 일원 분산 분석 사용.

주요 신호전달 경로 억제가 Bleb 형성에 미치는 영향

또한 HT1080 세포를 억제하는 것으로 알려진 다양한 약리학적 제제를 사용하여 HT1080 세포의 블리빙에 대한 주요 지질 신호 전달 경로의 기여도를 확인했습니다. 포스포리파제 C(PLC)의 관여는 다른 세포주에서 PLC 활성을 억제하는 것으로 보고된 약물인 U73122를 사용하여 테스트되었습니다(Ward et al., 2003). 20μM의 U73122를 사용하면 블렙 수의 큰 변화 없이 블렙의 크기가 크게 줄었습니다(그림 6B). PLC의 참여는 PLC에서 생성된 디아실글리세롤(DAG)에 의해 자극되는 단백질 키나아제 C(PKC)의 분석으로 이어졌습니다. 따라서, PKC 억제제인 Go6976 5μM을 사용하자 기수 수에 영향을 주지 않으면서 기수 크기가 현저히 감소하였다(그림 6C 및 E). 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K) 억제제는 HT1080 세포의 블리빙에서 이 경로의 요구 사항을 테스트하기 위해 LY294002 사용되었습니다. 다시 말하지만, PI3K 억제제 5μM을 사용하면 원래 출혈 세포와 비교할 때 기포 수(그림 6F)에 큰 차이가 없이 기포 형성을 억제했습니다(그림 6D).

1. 다운로드 : 고해상도 이미지 다운로드 (영문) (718KB)
2. 다운로드 : 전체 크기 이미지 다운로드

그림 6. 주요 신호 전달 경로의 억제. A. HT1080 세포는 억제제가 없는 3D 물질에 내장되어 있고(상단 패널), 카스파제 억제제가 있는 상태에서 BB-94 및 PIC가 있는 세포(하단 패널); B. 30분 동안 20μM PLC 억제제, U73122를 사용한 블리빙 세포의 전처리; C. 5μM PKC 억제제인 Go6976을 사용한 세포의 전처리; D. 5μM LY294002로 PI3K 경로 억제; E. 억제제로 처리된 세포에서 bleb 크기의 정량화; F. 억제제 처리된 HT1080 세포의 blebs/세포 수 정량화. 데이터는 세 번에 걸쳐 수행된 세 가지 개별 실험의 SEM± 평균입니다. : P< 0.001 단방향 분산 분석 후 Tukey의 다중 비교 검정을 사용합니다. 억제제와 PIC/BB94 처리 세포를 비교합니다.

토론

다른 세포주에서, 지질 신호 전달 포스포리파제 D(PLD) 효소는 세포 또는 세포내 막의 구조적 무결성을 보존할 뿐만 아니라 세 가지 메커니즘 중 하나를 통해 과다한 생물학적 과정을 매개하는 것으로 알려져 있습니다. 단백질-단백질 상호 작용을 통해 또는 PLD2의 경우 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF) 활성을 통해(Gomez-Cambronero, 2014). 예를 들어, 액틴 재구성, 막 이동, 세포 부착, 종양 성장 및 전이는 포유류 PLD1의 활성에 기인하는 반면(Chen et al., 2012, Selvy et al., 2011, Zouwail et al., 2005), PLD2는 RhoA 및 Rac1에 대한 GEF로 작용하여 세포 확산, 세포내이입, 세포 성장, 세포 이동을 매개하는 것으로 나타났습니다. 림프종 세포의 침습 및 전이(Du et al., 2004, Henkels et al., 2013, Jeon et al., 2011, Mahankali et al., 2011b, Zheng et al., 2006). PLD1은 외부 자극에 따라 증가하는 낮은 기초 활성을 가지며 핵 주위 구조, 골지체 및 소포체에 국한되는 반면, PLD2는 높은 기초 활성을 가지며 원형질막에만 국한되는 것으로 알려져 있습니다(Chen and Exton, 2004).

본 연구에서는 세포외 기질(ECM)에서 인간 섬유육종 HT1080 세포주의 출혈에서 PLD의 역할을 조사했습니다. 이 세포주는 이전에 길쭉한 중간엽 이동 모드에서 풍부한 원형질막 블렙과 관련된 둥근 아메바이드 모드로 상호 전환되는 가소성을 나타내는 것으로 보고되었으며, 매트릭스 분해를 억제할 때 3차원(3D) 구조의 기존 기공을 통해 전이됩니다(Wolf et al., 2003). 따라서 이 세포주는 이 연구에서 선호되는 선택입니다. 실제로, 바티마스타트(BB-94), 광범위 매트릭스 금속단백분해효소(MMP) 억제제 및 프로테아제 억제제(PIC)의 칵테일의 조합에 의한 매트릭스 단백질 분해의 억제는 기포 형성을 충분히 유도하였다(도 1, 4A, 5A 및 6A). 이전에 시험관 내 및 생체 내에서 PLD1 및 PLD2의 활성을 억제하는 것으로 나타난 저분자 억제제인 5-플루오로-2-인돌릴 데스클로로할로페미드(FIPI)를 사용하여 포유류 포스포리파제 D, PLD1 및 PLD2의 두 동형의 활성을 먼저 차단함으로써 HT080 세포의 블리빙에 PLD가 관여하는 것에 대한 조사(Zouwail et al., 2005), 기내 기수 및 크기를 크게 줄이고, 기미 유발 세포의 비율이 83%였던 원래의 기수 유도 세포에 비해 기미 세포의 비율을 12%로 급감시켰다(그림 1B). 이는 PLD1 또는 PLD2 또는 두 동형이 HT1080 세포에서 블레브 형성을 촉진한다는 것을 시사합니다. FIPI가 PLD1 및 PLD2의 억제를 통해 세포의 출혈을 억제하는 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 그러나 약물이 PLD1 및 PLD2 모두의 포스포디에스테라아제 활성을 직접 억제하는 것으로 이전에 보고되었습니다(Su et al., 2009b).

FIPI는 두 PLD 동형의 강력한 억제제이기 때문에 다음으로 RNA 간섭 기술을 사용하여 knockdown 실험을 수행했습니다. 이 연구에 사용된 스마트풀링된 siRNA는 4개의 서로 다른 염기서열에서 단백질을 표적으로 하여 off-target effect를 최소화하거나 전혀 하지 않으면서 보다 효과적인 유전자 침묵을 보장합니다. FIPI 처리와 유사한 방식으로, PLD2의 siRNA 매개 knockdown은 기수 형성을 강력하게 억제한 반면, PLD1 knockdown은 기포 형성에 유의한 영향을 미치지 않았습니다(그림 2A–H). 두 PLD siRNA가 서로 간섭하여 off-target effect를 나타내지 않는다는 것을 추가로 확인하기 위해 PLD1 knock down cell lysate를 anti-PLD2 항체로 면역블로팅하고 PLD2 knock down 샘플은 anti-PLD1 항체로 웨스턴 블롯하여 특이성을 측정했습니다. 실제로, PLD1의 knockdown이 PLD2 활성에 부정적인 영향을 미치지 않았기 때문에 siRNA는 표적에 특이적이었습니다(그림 3A 및 B). 유사하게, PLD2 knockdown은 PLD1 활성에 영향을 미치지 않았으며(그림 3C 및 D), HT1080 세포의 bleb 형성에 관여하는 것은 PLD1이 아니라 실제로 PLD2임을 추가로 입증합니다.

PLD2와 다른 어댑터 단백질의 상호 작용은 원형질막 돌출을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 예를 들어, 성장 인자 수용체 결합 단백질 2(Grb2)에 대한 PLD2 결합은 판상족 형성 및 세포 이동 및 화학주성 강화에 선행하는 사건인 원형질막 주름 형성과 관련이 있습니다(Gomez-Cambronero, 2011, Mahankali et al., 2011a). PLD2는 Grb2가 PLD2와 Wiscott-Aldrich 증후군 단백질(WASP) 사이의 도킹 단백질로 작용하는 상호 작용을 통해 식균작용을 촉진합니다(Kantonen et al., 2011). 유사하게, 미세소관 의존적 방식으로, v-Src-형질전환된 섬유아세포에서 막 돌출부의 형성은 PLD2에 기인한다(Shen et al., 2002). 블레브 형성은 라멜리포디아, 필로포디아, 침엽수 및 기타 막 돌출부의 형성과 달리 액틴 중합과 무관하기 때문에 PLD2가 악토미오신 수축성을 자극하는 신호를 보낼 수 있습니다.

PLD2가 HT1080 세포에서 기포 형성을 촉진하는 메커니즘을 설명하려는 시도는 PLD2의 리파아제 반응의 촉매 생성물이자 PLD2가 세포 출혈을 매개할 수 있는 신호 분자로서 세포 내 두 번째 메신저 역할을 하는 포스파티드산(PA)과 관련이 있습니다. 일반적으로 대부분의 생물학적 시스템에서 PA의 세포 내 수준은 PLD 활성에 대한 판독값으로 사용되며, 포유류 PLD2는 단백질-단백질 상호 작용 또는 고유한 GEF 활성을 통해 신호를 전달하여 생리적 기능을 발휘할 수 있는 것으로 알려져 있습니다(Gomez-Cambronero, 2014). 반면에, 대부분의 생물학적 과정에서 PLD의 관여는 PA와 달리 디아실글리세롤(DAG) 및 리소포스파티드산(LPA)을 생성할 수 없는 안정적인 포스파티딜알코올을 생성하기 위해 PLD에 의해 물 대신 우선적으로 사용되는 1차 알코올을 사용하여 검출되며, 또한 다운스트림 표적 단백질을 모집하고 활성화할 수 없습니다(Oude Weernink et al., 2007). 따라서, 부탄-1-올과 같은 1차 알코올의 존재 하에서, PA 생산은 차단될 뿐만 아니라, 다른 다운스트림 신호전달 이벤트도 중단된다. 실제로, HT1080 세포를 1%(v/v) 부탄-1-올로 전처리한 결과, 막 기포가 거의 완전히 손실되었고(그림 4A, 하단 중간 패널), 5% 세포만 막 기포를 형성한 반면(그림 4B), 동일한 농도의 3차 부탄올을 사용한 전처리는 기포 형성에 영향을 미치지 않았습니다(그림 4하단 패널 및 B). PA의 Butan-1-ol-mediated 고갈은 또한 세포주에 나타나는 bleb의 수를 현저하게 억제하였다(도 4C). 이는 PLD2 매개 세포 출혈이 PA를 통해 이루어진다는 것을 시사하며, 흥미롭게도 PA는 이전에 층상 구조 및 막 주름 조절을 통한 백혈구 세포 이동과 관련이 있었습니다(Gomez-Cambronero, 2014).

또한, PLD2 유래 PA가 세포 출혈을 촉진하는 메커니즘과 다운스트림 신호 전달 경로를 조사했습니다. 한 가지 가능한 메커니즘은 포스포리파제 A의 가수분해 활성을 통해서일 수 있습니다1 또는 A2 (PLA1/PLA2)를 PA에서 유비쿼터스로 발현된 리소포스파티드산(LPA)을 생성하여 원형질막에서 수용체(LPAR)와 결합하여 다운스트림 이펙터를 트리거합니다(Stoddard and Chun, 2015). LPAR은 ROCK을 활성화하기 위한 Rho 활성의 자극을 통해 MMP 활성, 세포 증식, 종양 진행 및 다양한 암의 전이를 상향 조절함으로써 매트릭스 분해에 관여하는 것으로 보고되었습니다(Gotoh et al., 2012, Jeong et al., 2012, Jeong et al., 2013). 중요한 것은 LPAR이 ROCK 신호전달 경로를 통해 파골세포에서 막 블리빙을 유도하는 것으로 나타났다는 것입니다(Panupinthu et al., 2007). 실제로, 강력한 LPAR 억제제인 VPC-32183을 사용한 LPAR의 억제는 HT1080 세포주에서 기포성 형성을 제거했습니다(그림 5B). LPA는 PLA에 의해 포스파티딜콜린(PC)에서 자체적으로 생성되는 리소포스파티딜콜린(LPC)에 대한 리소포스포리파제 D(오토탁신)의 작용에 의해서도 생성될 수 있다는 점을 언급할 가치가 있습니다2. 이 경로가 HT1080 세포의 블리빙에 관여하는지 여부는 확인되지 않았지만, 오토택신이 부탄-1-올에 의해 억제되지 않기 때문에 이 경로가 ATP에 의해 유도된 파골세포의 블리빙에 관여할 가능성이 낮다는 것이 이전에 보고되었습니다(Panupinthu et al., 2007).

HT1080 세포의 블리빙에 대한 지질 신호전달의 기여도는 주요 지질 신호전달 분자를 조사하여 추가로 평가되었습니다. 세포 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(PIP2) 풀은 디아실글리세롤(DAG) 및 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3단백질 키나아제 C(PKC)와 세포내 Ca를 활성화하는 )2 + 각각 릴리스합니다. 마찬가지로 PIP2 또한 포스파티딜이노시타이드 3-키나아제(PI3K)의 활성에 의해 조절되어 PIP를 생성할 수 있습니다.3. 핍2 수준은 일반적으로 원형질막과 세포골격 사이의 상호 작용을 강화하고 ERM(ezrin, radixin, moesin) 단백질의 활성을 강화합니다(Zhao et al., 2014). 이와 일치하게, PIP의 고갈2 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 고정 유도 출혈을 강화했습니다(Zhao et al., 2014). 본 연구에서 세포 PIP의 축적2 U73122 및 LY294002를 사용하여 PLC 및 PI3K 활성을 각각 억제함으로써 HT1080 세포에 형성된 bleb의 크기를 크게 억제했지만 bleb 수에는 큰 영향을 미치지 않았습니다. 알려진 억제제 Go6976을 사용한 PKC의 억제는 U73122 및 LY294002의 사용과 유사한 효과를 보였으며, 이는 세포 출혈이 세포의 구조적 무결성을 유지하는 수많은 원형질막 지질 및 신호 전달 경로의 대부분에 의해 조절되는 복잡한 사건의 연쇄를 포함한다는 것을 시사합니다.

결론

결론적으로, 이 연구는 인간 섬유육종 HT1080 세포주에서 원형질막 블렙 조절에서 PLD2의 새로운 역할을 처음으로 입증했습니다. 구체적으로, PLD1이 아닌 PLD2가 PA-LPAR-Rho-ROCK 신호전달 경로를 필요로 하는 메커니즘에서 HT1080 세포주의 bleb 형성에 관여한다는 것을 입증했습니다. 이것은 결합 조직의 다른 암의 전이를 억제하기 위해 특정 치료제의 개발에 활용될 수 있습니다. 마찬가지로, PLD2 및 세포막의 다른 지질 신호 분자를 표적으로 하는 병용 치료 접근법은 섬유육종 및 기타 인간 암과의 싸움에서 더 효과적인 결과를 얻을 수 있습니다.

상충되는 이해관계

저자들은 상충되는 이해관계가 없다고 선언했다.

자금 조달 정보

이 연구는 공공, 상업 또는 비영리 부문의 자금 지원 기관으로부터 특정 보조금을 받지 않았습니다.

승인

본 연구에 유리한 환경을 제공해주신 영국 영국 레딩대학교 생명과학부 생명과학부 의생명과학과에 감사드립니다.

참조

1. Charras 및 Paluch, 2008

   G. 차라스, E. 팔루치

   Blebs가 길을 인도합니다 : lamellipodia없이 마이그레이션하는 방법

   Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9 (2008), pp. 730-736

   View at publisher 

   교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

2. Charras 외, 2006

   G.T.(지티) 차라스, C.K. 후, M. 코플린, T.J. 미치슨

   세포 블렙에서 수축성 액틴 피질의 재조립

   J. Cell Biol., 175 (2006), pp. 477-490

    View at publisher 

   교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

3. Charras 외, 2008

   G.T.(지티) 차라스, M. 코플린, T.J. 미치슨, L. 마하데반

   세포 블렙의 수명과 시간

   Biophys. J., 94 (2008), pp. 1836-1853

   View PDFView articleView in ScopusGoogle Scholar

4. Chen and Exton, 2004

   J.S. Chen, J.H. Exton

   Regulation of phospholipase D2 activity by protein kinase C alpha

   J. Biol. Chem., 279 (2004), pp. 22076-22083

   View PDFView articleView in ScopusGoogle Scholar

5. Chen et al., 2012

   Q. Chen, T. Hongu, T. Sato, Y. Zhang, W. Ali, J.A. Cavallo, A. van der Velden, H. Tian, G. Di Paolo, B. Nieswandt, et al.

   Key roles for the lipid signaling enzyme phospholipase d1 in the tumor microenvironment during tumor angiogenesis and metastasis

   Sci. Signal., 5 (2012), p. ra79

   View in ScopusGoogle Scholar

6. Corrotte et al., 2006

   M. Corrotte, S. Chasserot-Golaz, P. Huang, G. Du, N.T. Ktistakis, M.A. Frohman, N. Vitale, M.F. Bader, N.J. Grant

   Dynamics and function of phospholipase D and phosphatidic acid during phagocytosis

   Traffic, 7 (2006), pp. 365-377

    View at publisher 

   CrossRefView in ScopusGoogle Scholar

7. Du and Frohman, 2009

   G. Du, M.A. Frohman

   A lipid-signaled myosin phosphatase surge disperses cortical contractile force early in cell spreading

   Mol. Biol. Cell, 20 (2009), pp. 200-208

   View in ScopusGoogle Scholar

8. Du et al., 2004

   G. Du, P. Huang, B.T. Liang, M.A. Frohman

   Phospholipase D2 localizes to the plasma membrane and regulates angiotensin II receptor endocytosis

   Mol. Biol. Cell, 15 (2004), pp. 1024-1030

   View at publisher 

   교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

9. 포스터, 2009

   D.A.(박사) 기르다

   mTOR에 대한 포스파티드산 신호: 인간 암세포의 생존을 위한 신호

   바이오침. 생체물리학. Acta, 1791 (2009), pp. 949-955

   PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

10. 고메즈-캄브로네로, 2011

    J. 고메즈-캄브로네로

    S6K, Grb2, Sos, WASp 및 Rac2와 같은 풍부한 상호 작용 단백질에 의한 PLD2의 절묘한 조절(놀라운 발견: PLD2는 GEF임)

    세포. 신호., 23 (2011), pp. 1885-1895

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

11. 고메즈-캄브로네로, 2014

    J. 고메즈-캄브로네로

    세포 신호전달의 포스포리파아제 D: 무수한 세포 기능에서 암 성장 및 전이까지

    J. Biol. Chem., 289 (2014), pp. 22557-22566

     View at publisher 

    Scopus에서 보기Google 학술검색

12. Gotoh 외, 2012

    M. 고토, Y. 후지와라, J. 유에, J. 리우, S. 리, J. 펠스, A. 우치야마, K. 무라카미 무로후시, S. 켄넬, J. Wall, et al.

    autotaxin-lysophosphatidic acid receptor 축을 통한 암 조절

    바이오켐. Soc. Trans., 40 (2012), pp. 31-36

    Scopus에서 보기Google 학술검색

13. Goudarzi 외, 2012

    M. Goudarzi, T.U. 바니쉬, M.B. 모빈, N. 마겔리, K. 타르바셰비치, I. 스트레이트, J. 반 덴 베르크, H. 블레이저, S. 밴데머, E. Paluch, et al.

    bleb-based cell motility를 위한 분자 모듈의 식별 및 조절

    Dev. Cell, 23 (2012), pp. 210-218

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

14. Henkels 외, 2013

    케이엠 헨켈스, M. 마한칼리, J. 고메즈-캄브로네로

    Ras에 빠르게 작용하는 새로운 리파아제-GEF(포스포리파제 D2)로 인한 세포 성장 증가

    세포. 신호., 25 (2013), pp. 198-205

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

15. Jeon et al., 2011

    H. 전, D. 곽재이(Kwak, J.) 노, M.N. 리, C.S. 이, P.G. 서, S.H. 류(Ryu)

    포스포리파제 D2는 RhoA에 대한 뉴클레오티드 교환을 매개하여 스트레스 섬유 형성을 유도합니다.

    세포. 신호., 23 (2011), pp. 1320-1326

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

16. Jeong et al., 2012

    케이제이 정S.Y. (Jeong, S.Y.) 박K.H. Park 조조(Cho, J.S.) 손, J. Lee, Y.K. 김제이 강, C.G. Park, J.W. Han, H.Y. 리

    리소포스파티드산 유도 단백질 분해 효소 발현 및 난소암 세포 침범을 위한 Rho/ROCK 경로

    종양유전자, 31 (2012), pp. 4279-4289

    View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

17. 정 외, 2013

    케이제이 정K.H. (Jeong, K.H.) 조, N. 파누핀투, H. 김제이 강, C.G. 박G.B. Park 밀스, H.Y. 리

    EGFR은 LPA 유도 단백질 분해 효소 발현과 난소암 침습을 매개합니다: 레스베라트롤에 의한 억제

    Mol. Oncol., 7 (2013), pp. 121-129

    PDF 보기글 보기교차 참조Google 학술검색

18. Kantonen 외, 2011

    S. 칸토넨, N. 해튼, M. 마한칼리, K.M. 헨켈스, H. 박, D. 콕스, J. 고메즈-캄브로네로

    새로운 포스포리파제 D2-Grb2-WASp 헤테로트라이머는 2단계 메커니즘으로 백혈구 식균작용을 조절합니다.

    몰. 세포. Biol., 31 (2011), pp. 4524-4537

    Scopus에서 보기Google 학술검색

19. Kubota, 1981년

    H.Y.(하이) 쿠보타

    내배엽 세포의 기어가는 운동은 일본 뉴트의 gastrulae에서 해리, Cynops pyrrhogaster

    Exp. Cell Res., 133 (1981), pp. 137-148 (특급 셀 Res., 133 (1981), pp. 137-148

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

20. Mahankali 외, 2011a

    M. 마한칼리, H.J. 펭, D. 콕스, J. 고메즈-캄브로네로

    세포막 주름의 메커니즘은 포스포리파제 D2(PLD2), Grb2 및 Rac2 결합에 의존합니다

    세포. 신호., 23 (2011), pp. 1291-1298

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

21. Mahankali 외, 2011b

    M. 마한칼리, H.J. 펭, K.M. 헨켈스, M.C. 디나우어, J. 고메즈-캄브로네로

    포스포리파제 D2(PLD2)는 GTPase Rac2에 대한 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)입니다

    Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 108 (2011), pp. 19617-19622

    View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

22. Norman 외, 2010

    엘엘 노먼, J. 브뤼게스, K. 센굽타, P. 센스, H. 아란다-에스피노자

    세포 확산 및 수축 세포의 세포 출혈 및 막 영역 항상성

    생체물리학. J., 99 (2010), pp. 1726-1733

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

23. Oude Weernink 외, 2007

    아빠 Oude Weernink, M. 로페즈 데 예수, M. 슈미트

    포스포리파아제 D 신호전달: PIP2 및 소형 GTPase에 의한 오케스트레이션

    Naunyn Schmiedeberg의 Arch. Pharmacol., 374 (2007), pp. 399-411

     View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

24. Paluch 및 Raz, 2013

    E.K.(예) 팔루치, E. 라즈

    세포 이동에서 bleb의 역할과 조절

    커. 오핀. Cell Biol., 25 (2013), pp. 1-9 (셀 Biol., 25 (2013), pp. 1-9)

    Google 학술검색

25. Panupinthu 외, 2007

    N. 파누핀투, L. 자오, F. 포스마이어, H.Z. 케, S.M. 심즈, S.J. 딕슨

    P2X7 뉴클레오티드 수용체는 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid)과 관련된 경로를 통해 조골세포의 출혈을 매개합니다

    J. Biol. Chem., 282 (2007), pp. 3403-3412

    PDF 보기글 보기교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

26. 리들리, 2011

    A.J.(에이제이 리들리

    최첨단의 삶

    셀, 145 (2011), pp. 1012-1022

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

27. Scott 외, 2009

    에스에이 스콧, 체육 셀비, J.R. 벅, H.P. 조, T.L. 크리스웰, AL 토마스, 의학박사 암스트롱, CL 아르테아가, C.W. 린슬리, H.A. 갈색

    암세포 침습성을 조절하는 동형 선택적 포스포리파제 D 억제제 설계

    Nat. Chem. Biol., 5 (2009), pp. 108-117

    View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

28. Selvy 외, 2011

    체육 셀비, R.R. 라비에리, C.W. 린슬리, H.A. 갈색

    포스포리파아제 D: 효소학, 기능성 및 화학적 조절

    화학 개정판, 111 (2011), pp. 6064-6119

    View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

29. Shen 외, 2001

    Y. 쉔, L. 쑤, D.A. 기르다

    수용체 매개 세포내이입에서 포스포리파제 D의 역할

    몰. 세포. Biol., 21 (2001), pp. 595-602

    Scopus에서 보기Google 학술검색

30. Shen 외, 2002

    Y. 쉔, Y. 쩡, D.A. 기르다

    포스포리파아제 D2는 v-Src 형질전환된 세포에서 세포 돌출을 자극합니다.

    바이오켐. 생체물리학. Res. Commun., 293 (2002), pp. 201-206

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

31. Stoddard and Chun, 2015년

    노스캐롤라이나 스토다드, J. 천

    리소포스파티드산 신호전달의 세계에서 유망한 약리학적 방향

    바이오몰. Ther., 23 (2015), pp. 1-11

    View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

32. Su 외, 2009a

    W. Su, Q. 첸, 석사 프로만

    암 전이에 대한 잠재적 치료 접근법으로 저분자 억제제로 포스포리파제 D를 표적으로 삼습니다.

    Future Oncol., 5 (2009), pp. 1477-1486 (미래 종양, 5 (2009), pp. 1477-1486)

    View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

33. Su 외, 2009b

    W. 수, O. 예쿠, S. 올레푸, A. 겐나, J.S. 박에이치(Park, H.) 렌, G. 두, M.H. 겔브, A.J. 모리스, 석사 프로만

    5-플루오로-2-인돌릴 데스클로로할로페미드(FIPI), 세포 확산을 변화시키고 화학주성을 억제하는 포스포리파제 D 약리학적 억제제

    Mol. Pharmacol., 75 (2009), pp. 437-446

    View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

34. Tinevez 외, 2009

    J.Y.(제이와이) 티네베즈, U. 슐츠, G. 살브뢰, J. 뢴쉬, JF 조아니, E. 팔루치

    bleb 성장에서 피질 긴장의 역할

    Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 106 (2009), pp. 18581-18586

    View at publisher 

    교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

35. 트링카우스, 1973년

    J.P.(제이피) 트링카우스

    blastula 및 gastrula 단계 동안 Fundulus deep cells의 표면 활동 및 운동

    Dev. Biol., 30 (1973년), pp. 69-103

    Google 학술검색

36. 바그너와 Brezesinski, 2007

    K. 바그너, G. 브레제신스키

    포스포리파아제 D 활성은 생성물 분리 및 모델 멤브레인 내 포스파티드산의 구조 형성에 의해 조절됩니다

    생체물리학. J., 93 (2007), pp. 2373-2383

    PDF 보기글 보기교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

37. Ward 외, 2003

    증권 시세 표시기 워드, H. 어우양, DR 타커

    상피 밀착 접합 투과성 조절에서 포스포리파제 C-베타의 역할

    J. 파마콜. Exp. Ther., 304 (2003), pp. 689-698 참조)

    Scopus에서 보기Google 학술검색

38. Wolf 외, 2003

    K. 늑대, 나. 마조, H. 렁, K. 엥겔케, U.H. 폰 안드리안, E.I. 데류기나, AY 스트롱킨, E.B. 브로커, P. 프리들

    종양 세포 이동의 보상 메커니즘: 세포주위 단백질 분해 차단 후 중간엽-아메바이드 전이

    J. Cell Biol., 160 (2003), pp. 267-277 (J. 세포 Biol., 160 (2003), pp. 267-277)

     View at publisher 

    Scopus에서 보기Google 학술검색

39. Zhao 외, 2007

    C. 자오, G. 두, K. 스코우로넥, 석사 프로만, D. 바르 사기

    포스포리파아제 D2 생성 포스파티드산은 EGFR 자극을 Sos에 의한 Ras 활성화에 결합시킵니다.

    Nat. 세포 Biol., 9 (2007), pp. 706-712

     View at publisher 

    교차 참조Google 학술검색

40. Zhao 외, 2014

    S. 자오, H. 랴오, M. 아오, L. 우, X. 장, Y. 첸

    확산 세포에 대한 고정 유도 세포 출혈은 원형질막의 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 수준과 반비례합니다

    FEBS 오픈 바이오, 4 (2014), pp. 190-199

    PDF 보기글 보기교차 참조Scopus에서 보기Google 학술검색

41. Zheng 외, 2006

    Y. 젱, V. 로드릭, A. 토스키, M. 시, L. 후이, Y. 쉔, D.A. 기르다

    포스포리파제 D는 인간 암세포의 스트레스 반응에서 생존 신호와 이동 신호를 결합합니다.

    J. Biol. Chem., 281 (2006), pp. 15862-15868

    PDF 보기글 보기Scopus에서 보기Google 학술검색

42. Zouwail 외, 2005

    S. 주와일, T.R. 페티트, S.K. 비둘기, M.V. 치발리나, D.J. Powner, L. 헤인즈, M.J. 웨이클람, RH 인솔

    포스포리파아제 D 활성은 딕티오스텔리움(Dictyostelium)의 액틴 국소화 및 액틴 기반 운동성에 필수적입니다

    바이오켐. J., 389 (2005), pp. 207-214

    Scopus에서 보기Google 학술검색

인용 (0)

1

University of Reading, 세포 이동 실험실, 분자 및 세포 의학 부서, 생물 의학 부서, 생물 과학 대학, Hopkins Building, Whiteknights, Berkshire, England, United Kingdom.

© <thinsp>2016 극동연방대학교를 대신하여 엘스비어(Elsevier B.V.)가 주최.

추천 기사

• Fatores preditivos da recorrência vesical do carcinoma urotelial do trato urinário superior após nefroureterectomia radical

  Acta Urológica Portuguesa, 33권, 2016년 2호, 43-50면

  다이아나 실바, ..., 주앙 실바

  PDF 보기

• 20세기 초 폴란드어 절제 출판물에 비추어 철도 노동자들의 알코올 중독 퇴치

  알코올 중독과 약물 중독, 29권, 4호, 2016, pp. 237-252

  이자벨라 크라신스카

  PDF 보기

• 청화물로서의 식물성 기름

  생명과학의 성과, 제10권, 제1호, 2016, pp. 1-4

  아이엠 아데니이, ..., O.J. 알라오

  PDF 보기

기사 3개 더 보기

아티클 지표

캡처합니다

• 독자:75

언급

• 참조:2

소셜 미디어

• 공유, 좋아요 & 코멘트 :1

세부 정보보기

• 사이언스다이렉트(ScienceDirect) 소개
• 원격 액세스
• 쇼핑 카트
• 광고
• 연락처 및 지원
• 약관 및 조건
• 개인정보처리방침

이 사이트에서는 쿠키를 사용합니다. 쿠키 설정

이 사이트의 모든 콘텐츠: Copyright © 2024 Elsevier B.V., 라이선스 제공자 및 기여자. 텍스트 및 데이터 마이닝, AI 교육 및 이와 유사한 기술에 대한 권리를 포함한 모든 권리는 유보됩니다. 모든 오픈 액세스 콘텐츠에는 Creative Commons 라이선스 조건이 적용됩니다.