Re: NO + superoxide radical --＞ peroxynitrite... 에 대한 이해

[문형철]

Review

The superoxide radical switch in the biology of nitric oxide and peroxynitrite

Lucía Piacenza,

Ari Zeida,

Madia Trujillo, and

Rafael Radi

19 Aug 2022https://doi.org/10.1152/physrev.00005.2022

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Abstract

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The free radical nitric oxide (·NO) is a key mediator in different physiological processes such as vasodilation, neurotransmission, inflammation, and cellular immune responses, and thus preserving its bioavailability is essential. In several disease conditions, superoxide radical (O2·−) production increases and leads to the rapid “inactivation” of ·NO by a diffusion-controlled radical termination reaction that yields a potent and short-lived oxidant, peroxynitrite. This reaction not only limits ·NO bioavailability for physiological signal transduction but also can divert and switch the biochemistry of ·NO toward nitrooxidative processes.

Indeed, since the early 1990s peroxynitrite (and its secondary derived species) has been linked to the establishment and progression of different acute and chronic human diseases and also to the normal aging process.

Here, we revisit an earlier and classical review on the role of peroxynitrite in human physiology and pathology (Pacher P, Beckman J, Liaudet L. Physiol Rev 87: 315–424, 2007) and further integrate, update, and interpret the accumulated evidence over 30 years of research. Innovative tools and approaches for the detection, quantitation, and sub- or extracellular mapping of peroxynitrite and its secondary products (e.g., protein 3-nitrotyrosine) have allowed us to unambiguously connect the complex biochemistry of peroxynitrite with numerous biological outcomes at the physiological and pathological levels.

Furthermore, our current knowledge of the ·NO/O2·− and peroxynitrite interplay at the cell, tissue, and organ levels is assisting in the discovery of therapeutic interventions for a variety of human diseases.

free radical 산화질소(-NO)는

혈관 확장, 신경 전달, 염증 및 세포 면역 반응과 같은

다양한 생리적 과정에서 중요한 매개체이므로

생체 이용률을 보존하는 것이 필수적입니다.

여러 질병 상태에서

슈퍼옥사이드 라디칼(O2--) 생성이 증가하고

확산 제어 라디칼 종결 반응에 의해

-NO가 빠르게 '비활성화'되어

강력하고 수명이 짧은 산화제인 퍼옥시니트라이트가 생성됩니다.

In several disease conditions, superoxide radical (O2·−) production increases and leads to the rapid “inactivation” of ·NO by a diffusion-controlled radical termination reaction that yields a potent and short-lived oxidant, peroxynitrite

이 반응은

생리적 신호 전달을 위한 -NO 생체 이용률을 제한할 뿐만 아니라

-NO의 생화학을 니트로산화 과정으로 전환하여

switch할 수 있습니다.

This reaction not only limits ·NO bioavailability for physiological signal transduction but also can divert and switch the biochemistry of ·NO toward nitrooxidative processes.

실제로 1990년대 초부터

퍼옥시니트라이트(및 그 2차 파생종)는

다양한 급성 및 만성 인간 질병의 발병과 진행,

그리고 정상적인 노화 과정과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다.

여기에서는

인체 생리와 병리에서

퍼옥시니트라이트의 역할에 대한 고전적인 초기 연구를 다시 살펴보고

(Pacher P, Beckman J, Liaudet L. Physiol Rev 87: 315-424, 2007),

30년 동안 축적된 증거를 통합, 업데이트, 해석합니다.

퍼옥시니트라이트와

그 이차 생성물(예: 단백질 3-니트로티로신)의 검출, 정량,

세포 내 또는 세포 외 매핑을 위한 혁신적인 도구와 접근법을 통해

퍼옥시니트라이트의 복잡한 생화학을 생리적 및 병리학 수준에서

수많은 생물학적 결과와 명확하게 연결할 수 있게 되었습니다.

또한

세포, 조직 및 장기 수준에서

-NO/O2와 퍼옥시니트라이트의 상호 작용에 대한 현재 지식은

다양한 인간 질병에 대한 치료적 개입을 발견하는 데 도움이 되고 있습니다.

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• Excess superoxide radical  (O2--) 생성은 강력하고 수명이 짧은 산화제인 퍼옥시니트라이트(ONOO-/ONOOH)를 생성하는 빠른 반응에 의해 산화질소(-NO)를 빠르게 “비활성화”시킵니다.
• 이 반응은 생리적 신호 전달을 위한 -NO의 생체 이용률을 제한할 뿐만 아니라 -NO의 생물학적 작용을 니트로산화 과정으로 전환할 수도 있습니다.
• Peroxynitrite 은 다양한 급성 및 만성 인체 질환의 발병과 진행, 그리고 노화 과정과 관련이 있습니다.
• 퍼옥시니트라이트의 발자국 중 하나는 인간 샘플에서 면역화학 또는 분석 방법으로 추적할 수 있는 산화적 번역 후 변형인 단백질 3-니트로티로신의 형성입니다. 질화된 단백질(nitrated protein)은 미토콘드리아 기능 장애와 세포 사멸에 관여합니다.
• 이제 세포, 생체 외, 생체 내에서 Peroxynitrite의 검출, 정량화, 세포 내 또는 세포 외 매핑을 위한 혁신적인 프로브를 사용할 수 있습니다.
• 세포, 조직 및 장기 수준에서 -NO/O2--와 퍼옥시니트라이트의 상호 작용을 이해하면 산화 환원 기반 치료 개입을 발견하는 데 도움이 되며, 이는 억제제, 분해 촉매 및 환원제의 직접적인 작용 또는 Mn-슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 퍼옥시레독신 같은 항산화 효소 시스템의 상향 조절을 통해 체외 및 생체 내에서 달성할 수 있습니다.

1. INTRODUCTION

In the early 1990s a series of papers proposed the biological and pathological relevance of peroxynitrite (the sum of peroxynitrite anion, ONOO−, and peroxynitrous acid, ONOOH, pKa = 6.8) as a redox mediator in oxidative stress conditions that connect the nitric oxide (·NO) and oxygen radical pathways (1–3). The primary observations were mainly of a biochemical nature. At these early times the initial reactions in the physiology community were of skepticism and there was reluctance to accept that the proposed chemistries were of any biological relevance. Indeed, it seemed to be paradoxical that ·NO, a relatively stable free radical just revealed to participate in subtle signaling actions such as vasodilation (4, 5) and neurotransmission (6), could be converted into a cytotoxic product by “just” its fast reaction with superoxide radical (O2·−). Until then, O2·− was viewed as an intermediate that could control the half-life of ·NO via the so-called “oxidative inactivation” (7), but without appreciating the formation of a transient and potent oxidant such as peroxynitrite (ONOO−/ONOOH). It is fair to say also that seminal studies in immunostimulated macrophages (8, 9) were indicative that large levels of ·NO could be cytotoxic, although the proposed mechanisms of cytotoxicity did not invoke the formation of peroxynitrite. It took another decade, at least until the 2000s, to gather enough data from cell, animal, and human studies to unambiguously confirm‎ that the reaction of O2·− with ·NO can “switch” from signal transduction to oxidative damage and that peroxynitrite is a pathogenic mediator in acute and chronic human diseases and also in the normal aging process. Of course, the actual magnitude and impact of the switch are largely dependent on the relative levels of O2·− and ·NO (summarized in FIGURE 1 and analyzed throughout the text) (10).1 

1. 소개

1990년대 초에 일련의 논문이 산화 스트레스 조건에서 산화 질소(-NO)와 산소 라디칼 경로(1~3)를 연결하는 산화 환원 매개체로서 퍼옥시니트라이트(퍼옥시니트라이트 음이온, ONOO-와 퍼옥시니트러스산, ONOOH, pKa = 6.8의 합)의 생물학적 및 병리학적인 관련성을 제안했습니다. 주요 관찰은 주로 생화학적 특성이었습니다.

초기에 생리학계의 초기 반응은 회의적이었고,

제안된 화학 물질이 생물학적 관련성이 있다는 것을 받아들이는 것을 꺼려했습니다.

실제로

혈관 확장(4, 5) 및 신경 전달(6)과 같은 미묘한 신호 전달 작용에 관여하는 것으로 밝혀진

비교적 안정적인 자유 라디칼인 -NO가

슈퍼옥사이드 라디칼(O2--)과 '단지' 빠르게 반응하여

세포 독성 생성물로 전환될 수 있다는 것은 역설적인 것처럼 보였습니다.

그때까지만 해도

O2--는 소위 “산화적 비활성화”(7)를 통해

-NO의 반감기를 조절할 수 있는 중간체로 여겨졌지만,

Peroxynitrite (ONOO-/ONOOH)과 같은 일시적이고 강력한 산화제의 형성은 인식하지 못했습니다.

면역 자극 대식세포를 대상으로 한 연구(8, 9)에서도

제안된 세포 독성 메커니즘이 peroxynitrite의 형성을 유발하지는 않았지만

다량의 -NO가 세포 독성을 나타낼 수 있음을 시사했습니다.

Until then, O2·− was viewed as an intermediate that could control the half-life of ·NO via the so-called “oxidative inactivation” (7), but without appreciating the formation of a transient and potent oxidant such as peroxynitrite (ONOO−/ONOOH). It is fair to say also that seminal studies in immunostimulated macrophages (8, 9) were indicative that large levels of ·NO could be cytotoxic, although the proposed mechanisms of cytotoxicity did not invoke the formation of peroxynitrite.

세포, 동물 및 인간 연구에서 충분한 데이터를 수집하여

O2--와 -NO의 반응이 신호 전달에서

산화적 손상으로 “전환”될 수 있으며,

급성 및 만성 인간 질병과 정상적인 노화 과정에서

peroxynitrater이 병원성 매개체라는 것을 명확하게 확인하는 데 적어도

2000년대까지 10년이 더 걸렸습니다.

물론

스위치의 실제 크기와 영향은

O2--와 -NO의 상대적 수준에 따라 크게 달라집니다( 그림 1에 요약되어 있으며 본문 전체에서 분석됨).10).1

FIGURE 1.Nitric oxide (·NO), superoxide radical (O2·−), and peroxynitrite (ONOO−): the radical switch in context. The figure explores different biologically relevant conditions under which ·NO and O2·− are simultaneously generated and may result in both control of the half-life of ·NO and the consequent formation of ONOO−. Under basal conditions (Basal), low concentrations of ·NO exert its normal physiological effects [e.g., activation of soluble guanylate cyclase (sGC)] in the context of homeostatic fluxes of O2·− (d[O2·−]/dt); this condition results in low-level formation of ONOO−, which is mainly catabolized by peroxiredoxins (Prx), leaving marginal levels of oxidative modifications in target biomolecules. Under stronger physiological stimulation conditions for ·NO synthesis (Medium), heme-dependent signaling increases and a fraction of ·NO evolves to ONOO− to a level that can exert redox signaling actions. These first 2 situations operate under physiological conditions and can be also considered as associated with the process of normal aging. However, if under normal ·NO output conditions the O2·− flux increases significantly (e.g., NADPH-oxidase activation, xenobiotic redox cycling, disruption of mitochondrial metabolism; High I), then the putative “switch” becomes fully operative, simultaneously turning “off” the ·NO-mediated reversible signaling and “on” the full-fledged oxidative biochemistry mediated by peroxynitrite (e.g., inactivation of Cys-based redox relays). Finally, in a scenario of simultaneous high-level production of both ·NO and O2·− [e.g., inducible nitric oxide synthase (iNOS) induction and NADPH-oxidase hyperactivation during inflammation; High II], ·NO signaling may not be blunted (and may even be excessive) but large ONOO− levels are concomitantly formed and lead to significant oxidative modifications and damage. The last two biochemical conditions apply to pathologically relevant situations such as hypertension and inflammation, respectively, and serve to rationalize the impact of the ·NO, O2·−, and ONOO− interplay in several other disease conditions. Thus, strictu sensu, only special conditions apply to a definite switch, under which ·NO and O2·− reaction is such that it causes the “off” of the heme-dependent ·NO-mediated signaling and the “on” of the oxidative reactions mediated by peroxynitrite, including nitration and Prx oxidation and hyperoxidation.

그림 1.산화 질소(-NO), 수퍼옥사이드 라디칼(O2--), peroxynitrite  (ONOO-): 맥락에서의 라디칼 스위치.

이 그림은 -NO와 O2--가 동시에 생성되는 생물학적으로 관련된 다양한 조건을 살펴보고 -NO의 반감기와 그에 따른 ONOO-의 형성을 모두 제어할 수 있는 결과를 보여줍니다. 기저 조건(Basal) 하에서 낮은 농도의 -NO는 O2--의 항상성 플럭스(d[O2--]/dt)의 맥락에서 정상적인 생리학적 효과[예: 가용성 구닐레이트 시클라제(sGC)의 활성화]를 발휘하며, 이 조건은 주로 퍼옥시레독신(Prx)에 의해 산화되는 ONOO-를 낮은 수준으로 형성하여 목표 생체 분자에서 한계 수준의 산화적 변형을 남깁니다. NO 합성을 위한 더 강한 생리적 자극 조건(중간)에서는 헴 의존적 신호가 증가하고 -NO의 일부가 산화 환원 신호 작용을 발휘할 수 있는 수준까지 ONOO-로 진화합니다. 이 처음 두 상황은 생리적 조건에서 작동하며 정상적인 노화 과정과 연관된 것으로 간주할 수도 있습니다. 그러나 정상적인 -NO 출력 조건에서 O2-- 플럭스가 크게 증가하면(예: NADPH-산화효소 활성화, 이종 생물학적 산화 환원 순환, 미토콘드리아 대사 장애, 높은 I), 추정 “스위치”가 완전히 작동하여 -NO 매개 가역적 신호가 “꺼지고” 동시에 퍼옥시니트라이트가 매개하는 본격적인 산화 생화학이 “켜지는”(예: Cys 기반 산화 환원 릴레이의 비활성화) 것으로 간주됩니다. 마지막으로, -NO와 O2--가 동시에 높은 수준으로 생성되는 시나리오에서[예: 염증 중 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 유도 및 NADPH-산화효소 과활성화, 높음 II], -NO 신호는 둔화되지 않을 수 있지만(심지어 과도할 수도 있음), 큰 ONOO- 수준이 동시에 형성되어 심각한 산화적 변형과 손상을 초래할 수 있습니다. 마지막 두 가지 생화학적 조건은 각각 고혈압과 염증과 같은 병리학적으로 관련된 상황에 적용되며, 다른 여러 질병 조건에서 -NO, O2-- 및 ONOO- 상호 작용의 영향을 합리화하는 데 도움이 됩니다. 따라서 엄밀히 말하면, -NO 및 O2-- 반응이 헴 의존성 -NO 매개 신호의 “오프”와 질산화 및 Prx 산화 및 과산화를 포함하여 과산화 아질산염이 매개하는 산화 반응의 “온”을 유발하는 명확한 스위치에는 특별한 조건만 적용됩니다.

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In this early context, much of the evidence accumulated during the first 15 years of peroxynitrite research in physiology and pathology was covered in a comprehensive and highly cited review article by Pál Pacher, Joseph S. Beckman, and Lucas Liaudet published in Physiological Reviews in 2007 (11). Now, 15 years after that review, we propose to revisit that classical article with the goal of reassessing those ideas and explicitly recognizing key advances that have maintained this field as a vibrant area of biological and biochemical research. Some of the innovations that have developed since 2007 include 1) the participation of superoxide dismutases (SODs) and peroxiredoxins (Prxs) in the control of the biological half-life of ·NO together with the formation and actions of peroxynitrite; 2) structural biology studies on peroxynitrite-modified proteins and how the posttranslational oxidative modifications (i.e., tyrosine nitration, thiol oxidation) affect structure, function, and biological pathways; 3) subcellular and extracellular peroxynitrite sources and compartmentalization; 4) the impact of peroxynitrite on cell signaling pathways; 5) the turnover of peroxynitrite-modified proteins and its consequences in cell proteostasis; 6) methods for the detection and quantitation of peroxynitrite in biological systems (in vitro, in cellula, ex vivo, and in vivo); and 7) redox-based therapeutics to neutralize peroxynitrite.

Although a recent and complementary review has covered key elements related to the chemical biology of peroxynitrite (10), in this review we both “revisit” concepts and deliver advances on the physiological and pathological angles of peroxynitrite.

이러한 초기의 맥락에서, 생리학 및 병리학에서 과산화질소 연구의 첫 15년 동안 축적된 많은 증거는 2007년에 피지컬 리뷰 (11)에 게재된 폴 파처, 조셉 베크만, 루카스 리우데의 포괄적이고 많이 인용된 리뷰 논문에서 다루어졌습니다(Pál Pacher, Joseph S. Beckman, Lucas Liaudet).

그 리뷰가 발표된 지 15년이 지난 지금, 우리는 그 아이디어를 재평가하고 이 분야를 생물학 및 생화학 연구의 활기찬 영역으로 유지해 온 주요 발전을 명시적으로 인정하기 위해 이 고전적인 논문을 다시 살펴볼 것을 제안합니다.

2007년 이후 발전한 혁신에는

1) 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)와 퍼옥시레독신(Prx)이

    -NO의 생물학적 반감기 조절과 함께 퍼옥시니트라이트의 형성 및 작용에 참여,

2) 퍼옥시니트라이트 변형 단백질에 대한 구조 생물학 연구 및 번역 후 산화적 변형(즉,, 티로신 질화, 티올 산화)가

   구조, 기능 및 생물학적 경로에 미치는 영향,

3) 세포 내 및 세포 외 퍼옥시니트라이트 공급원 및 구획화,

4) 세포 신호 경로에 대한 퍼옥시니트라이트의 영향;

5) 퍼옥시니트라이트 변형 단백질의 회전율과 세포 단백질 정체에서 그 결과,

6) 생물학적 시스템(시험관 내, 세포 내, 생체 외, 생체 내)에서 퍼옥시니트라이트의 검출 및 정량화 방법,

7) 퍼옥시니트라이트 중화를 위한 산화 환원 기반 치료법.

최근의 보완적인 리뷰에서

peroxynitrite의 화학 생물학과 관련된 핵심 요소를 다루었지만(10),

이 리뷰에서는 개념을 '재검토'하고

peroxynitrite 의 생리적 및 병리학적인 측면에 대한 발전된 내용을 전달합니다.

2. SUPEROXIDE CONTROL OF ·NO HALF-LIFE AND PEROXYNITRITE GENERATION

It was in the mid to late 1980s that the chemical nature of the endothelium-derived relaxing factor (EDRF) was revealed as ·NO thanks in part to the observation that EDRF was rapidly inactivated by O2·− (4, 5, 7). In the following years, the significance of this reaction was established, appreciating that O2·− not only diminishes ·NO bioavailability but also generates a potent biologically active oxidant, peroxynitrite (1). Since its discovery, peroxynitrite and its derived oxidants have been linked to different pathologies including inflammatory disorders, atherosclerosis, hypertension, diabetes, pulmonary and neurodegenerative diseases, cancer, and the process of aging (11). Also, peroxynitrite was visualized early as a cytotoxic effector molecule generated by macrophages and neutrophils against invading pathogens including bacteria and parasites (12–17).

Peroxynitrite is a potent one- or two-electron oxidant with a short biological half-life (<10 ms) that can directly react with several biological targets such as metal centers, thiols, and carbon dioxide (CO2). The latter leads to the formation of nitrogen dioxide and carbonate radicals (·NO2 and CO3·−, respectively) that participate in one-electron oxidation and nitration reactions. The in vivo formation of peroxynitrite from O2·− and ·NO is favored by a high kinetic constant (k ∼1010 M−1s−1; FIGURE 2) (19), and thus it will be formed at significant rates even when the concentration of its radical precursors is low (reaction 1) (1, 20–22).

O2•−+•NO→ONOO−H+⇌ ONOOH (p⁢𝐾a=6.8)O2•−+•NO→ONOO−⇌ H+ONOOH (p⁢Ka=6.8)(reaction 1)

2. SUPEROXIDE CONTROL OF ·NO HALF-LIFE AND PEROXYNITRITE GENERATION

1980년대 중후반에

내피 유래 이완 인자(EDRF)의 화학적 특성이

-NO로 밝혀진 것은

부분적으로 EDRF가 O2--에 의해 빠르게 비활성화된다는 관찰 덕분입니다(4, 5, 7).

그 후 몇 년 동안

이 반응의 중요성이 밝혀지면서

O2--가 -NO 생체 이용률을 감소시킬 뿐만 아니라

강력한 생물학적 활성 산화제인

퍼옥시니트라이트(1)를 생성한다는 사실이 밝혀졌습니다.

퍼옥시니트라이트와 그 파생 산화제는 발견 이후

염증성 질환, 죽상동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 폐 및 신경 퇴행성 질환, 암, 노화 과정 등

다양한 병리와 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다(11).

또한,

박테리아 및 기생충을 포함한 침입 병원체에 대항하여

대식세포와 호중구가 생성하는 세포 독성 효과 분자로서

peroxynitrite이 일찍이 시각화되었습니다(12-17).

퍼옥시니트라이트는

금속 중심, 티올, 이산화탄소(CO2) 등

여러 생물학적 표적과 직접 반응할 수 있는 짧은 생물학적 반감기(10ms 미만)를 가진

강력한 1전자 또는 2전자 산화제입니다.

후자는

1전자 산화 및 질화 반응에 참여하는

nitrogen dioxide and carbonate radicals(각각 -NO2 및 CO3--)의 형성으로 이어집니다.

The latter leads to the formation of nitrogen dioxide and carbonate radicals (·NO2 and CO3·−, respectively) that participate in one-electron oxidation and nitration reactions

생체 내에서 O2-- 및 -NO로부터의 peroxynitrite 형성은

높은 운동 상수(k ∼1010 M-1s-1; 그림 2)(19)에 의해 선호되므로

라디칼 전구체의 농도가 낮은 경우에도 상당한 속도로 형성됩니다(반응 1)(1, 20-22).

O2--+-NO→ONOO-H+⇌ ONOOH (p𝐾a=6.8)O2--+-NO→ONOO-⇌ H+ONOOH (pKa=6.8)(반응 1)

FIGURE 2. Main fates of superoxide radical (O2·−) in biological systems.

The rate constants (k) of O2·− dismutation by superoxide dismutase (SOD) and radical recombination with nitric oxide (·NO) yielding peroxynitrite (ONOO−) are compared. Image is modified from Ref. 18, with permission from Proceedings of the National Academy of Sciences USA.

그림 2. 생물학적 시스템에서 슈퍼옥사이드 라디칼(O2--)의 주요 운명.

수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)에 의한 O2--의 돌연변이 속도 상수(k)와 산화질소(-NO)와의 라디칼 재결합으로 생성되는 peroxynitrite ONOO-)을 비교합니다. 이미지는 Ref. 18 에서 미국 국립과학원 회보의 허가를 받아 수정한 것입니다.

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At physiological pH (7.4), O2·− is a negatively charged species (pKa = 4.8) and thus can cross biological membranes mainly by anion channels limiting the site of reaction. Because of the neutral character and hydrophobicity of ·NO it can diffuse and freely permeate membranes, reacting with O2·− at the site of its formation. The steady-state levels of O2·− in cells will mainly depend on its rate of production but also on its dismutation rate, determined by the presence of superoxide dismutases (SODs). SODs catalyze the fast dismutation reaction (k ∼109 M−1s−1; FIGURE 2) of O2·− to yield hydrogen peroxide (H2O2) and O2, a reaction requiring one proton per O2·− reacted (23). H2O2 is further metabolized by the action of different peroxidases (catalase, peroxiredoxins, and glutathione peroxidases). The rate constant of the reaction of O2·− with ·NO is larger than with SOD (1 × 1010 vs. 1–2 × 109 M−1s−1), and thus the relative rates of O2·− and ·NO formation and peroxynitrite generation at any given location will be tuned by the local SOD concentration (FIGURE 2).

SODs are present at micromolar concentrations in the mitochondrial matrix (MnSOD, 1–30 µM), cytosol (CuZnSOD, 4–40 µM), and extracellular space (EcSOD), and their expression‎ can be enhanced during oxidative stress conditions. Despite the presence of SODs, the site-specific generation of variable levels of peroxynitrite is basically inevitable, as indicated by the basal protein tyrosine nitration (which is considered a hallmark of peroxynitrite formation2) detected in healthy tissues (28–30). One of the most prominent antioxidant defenses toward peroxynitrite are peroxiredoxins (Prx, k ∼ 106–108 M−1s−1), which are ubiquitous thiol-dependent peroxidases (31–33). The reaction of ONOOH with the peroxidatic cysteine yields N⁢O−2N⁢O2− and the corresponding sulfenic acid that is typically restored back to the thiol state by the action of a resolving cysteine and reducing substrates [such as thioredoxin (Trx)]. Sulfenic acid in Prx can be further oxidized to sulfinic acid in a process known as hyperoxidation that can be reverted by the action of sulfiredoxins (34, 35). Peroxiredoxins are abundant and distributed across various cellular compartments, with concentrations in the micromolar range under physiological conditions. Under oxidative stress conditions, Prx expression‎ can be increased severalfold, raising the antioxidant capacity at each subcellular compartment. As previously observed for H2O2, the reaction of ONOOH with the peroxidatic thiol in Prx may be involved in cell-signaling processes (FIGURE 1) (18, 34, 36).

Next, we describe the main sources of ·NO, O2·−, and peroxynitrite during physiological and pathological conditions.

생리적 pH(7.4)에서

O2--는 음전하를 띠는 종(pKa = 4.8)이므로

주로 반응 부위를 제한하는 음이온 채널에 의해 생체막을 통과할 수 있습니다.

NO의 중성 특성과 소수성으로 인해

막에 확산되어 자유롭게 투과하여 형성 부위에서

O2--와 반응할 수 있습니다.

세포 내 활성산소의 정상 상태 수치는

주로 활성산소의 생성 속도에 따라 달라지지만,

활성산소의 돌연변이 속도도 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)의 존재 여부에 따라 결정됩니다.

SOD는 O2--의 빠른 돌연변이 반응(k ∼109 M-1s-1; 그림 2)을 촉매하여

과산화수소(H2O2)와 O2를 생성하며,

이반응에는 반응하는 O2--당 하나의 양성자가 필요합니다(23).

H2O2는

다른 과산화효소(카탈라아제, 페록시레독신, 글루타치온 퍼옥시다아제)의 작용에 의해

추가로 대사됩니다.

O2--와 -NO의 반응 속도 상수는 SOD보다 크므로(1 × 1010 대 1-2 × 109 M-1s-1),

특정 위치에서 O2--와 -NO 형성 및 퍼옥시니트라이트 생성의 상대적 속도는

국소 SOD 농도에 따라 조정됩니다(그림 2).

SOD는

미토콘드리아 매트릭스(MnSOD, 1-30 µM), 세포질(CuZnSOD, 4-40 µM) 및

세포 외 공간(EcSOD)에 마이크로몰 농도로 존재하며

산화 스트레스 조건에서 그 발현이 강화될 수 있습니다.

SOD의 존재에도 불구하고,

건강한 조직에서 검출되는

기저 단백질 티로신 질화(퍼옥시니트라이트 형성의 특징으로 간주됨2)(28-30)에서 알 수 있듯이

다양한 수준의 퍼옥시니트라이트의 부위별 생성은

기본적으로 피할 수 없는 일입니다.

퍼옥시니트라이트에 대한 가장 두드러진 항산화 방어 중 하나는

유비쿼터스 티올 의존성 퍼옥시다제(31-33)인

페록시레독신(Prx, k ∼ 106-108 M-1s-1)입니다.

ONOOH와 과산화 시스테인의 반응은 NO-2NO2- 및 해당 설펜산을 생성하며,

이는 일반적으로 용해 시스테인 및 환원 기질[티오레독신(Trx) 등]의 작용에 의해

티올 상태로 다시 회복됩니다.

Prx의 설펜산은

과산화로 알려진 과정에서 설피레독신의 작용으로 되돌아갈 수 있는 설핀산으로

추가 산화될 수 있습니다(34, 35).

퍼옥시레독신은

생리적 조건에서 마이크로몰 범위의 농도로

다양한 세포 구획에 풍부하게 분포되어 있습니다.

산화 스트레스 조건에서 Prx 발현은

각 세포 소구획에서 항산화 능력을 증가시키며,

이는 세포 내 항산화 능력을 50배까지 증가시킬 수 있습니다.

앞서 H2O2에서 관찰된 바와 같이,

ONOOH와 Prx의 과산화 티올의 반응은 세포 신호 전달 과정에 관여할 수 있습니다(그림 1)(18, 34, 36).

다음으로,

생리적 및 병리학적 조건에서

-NO, O2-- 및 퍼옥시니트라이트의 주요 공급원에 대해 설명합니다.

3. BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY OF NITRIC OXIDE SYNTHASES

·NO is produced by the family of heme-containing metalloenzymes named nitric oxide synthases (NOS; EC 1.14.13.39). Three NOS isoforms exist, which differ in tissue distribution and activity regulation. Neuronal NOS (NOS1, nNOS) and endothelial NOS (NOS3, eNOS) are constitutively expressed and activated upon cytosolic Ca2+ influx, whereas inducible NOS (NOS2, iNOS) depends for its expression‎ on immune and pathogen mediators [tumor necrosis factor (TNF)-α; interferon (IFN)-γ; interleukin-1β, and bacterial lipopolysaccharide (LPS)] and is fully active at physiological Ca2+ concentrations (37).

In the central and peripheral nervous systems, ·NO has been implicated in modulating physiological functions such as synaptic plasticity, learning, memory, and neurogenesis. Besides its high expression‎ in the nervous system, nNOS is also expressed in other tissues such as kidney, skeletal muscle, and bronchus among others (38) Moreover, translational splice variants of nNOS have been identified (α, β, γ, α, and µ) with different expression‎ patterns in the brain (39).

iNOS is principally expressed in professional phagocytes, and its role is largely associated with the control of invading pathogens and the regulation and establishment of a suitable adaptative immune response. iNOS can also be expressed in microglia and astrocytes as well as in other nonimmune cells (although to lesser extents) such as endothelial cells and cardiomyocytes (38). In the cardiovascular system, ·NO is mainly produced by eNOS, being the chief mediator of endothelium-dependent vasodilation (40). Ca2+-calmodulin (CaM)-activated NOS catalyzes the oxygen-dependent, five-electron oxidation of l-arginine via N-hydroxy-l-arginine (NHA) to citrulline and ·NO in a complex oxidoreductase reaction using the reducing power of NADPH. The catalytically active NOS is dimeric, with each subunit containing an oxidase and a reductase domain. The interface of the oxidase domains contains a Zn2+-tetrathiolate that comprises two cysteines from each subunit. The NOS reductase domain contains binding sites for the redox cofactors NADPH, FMN, FAD, and CaM. The oxidase domain tightly binds reduced tetrahydrobiopterin (BH4) that accelerates the reaction. Besides its Ca2+-CaM-dependent activation, eNOS is also regulated by different reversible posttranscriptional modifications including phosphorylation, glutathionylation, and S-nitrosylation (41–43).

3. 산화질소 합성효소의 생화학 및 생리학

-NO는

산화질소 합성효소(NOS; EC 1.14.13.39)라는

헴 함유 금속 효소 계열에 의해

생성됩니다.

·NO is produced by the family of heme-containing metalloenzymes named nitric oxide synthases (NOS; EC 1.14.13.39).

조직 분포와 활성 조절이 다른

세 가지 NOS 동형체가 존재합니다.

신경 NOS(NOS1, nNOS)와 내피 NOS(NOS3, eNOS)는

세포질 Ca2+ 유입 시 구성적으로 발현되고 활성화되는 반면,

유도성 NOS(NOS2, iNOS)는

면역 및 병원체 매개체[종양 괴사 인자(TNF)-α; 인터페론(IFN)-γ, 인터루킨-1β, 박테리아 지질 다당류(LPS)] 및

생리적 Ca2+ 농도에서 완전히 활성화됩니다(37).

중추 및 말초 신경계에서 -NO는

시냅스 가소성, 학습, 기억, 신경 생성과 같은

생리적 기능을 조절하는 데 관여합니다.

신경계에서 발현이 높은 것 외에도

nNOS는 신장, 골격근, 기관지 등 다른 조직에서도 발현됩니다(38)

또한 뇌에서 발현 패턴이 다른

nNOS의 번역 스플라이스 변이체(α, β, γ, α 및 µ)가 확인되었습니다(39).

iNOS는

주로 전문 식세포에서 발현되며,

그 역할은 주로 침입 병원체의 제어 및 적절한 적응 면역 반응의 조절 및 확립과 관련이 있으며,

미세아교세포와 성상세포뿐만 아니라

내피 세포 및 심근 세포와 같은 다른 비면역 세포에서도 발현될 수 있습니다 (38).

심혈관계에서 -NO는

주로 내피 의존성 혈관 확장의 주요 매개체인

eNOS에 의해 생성됩니다(40).

Ca2+-칼모둘린(CaM)으로 활성화된 NOS는

NADPH의 환원력을 사용하는 복잡한 산화 환원 효소 반응에서

N-하이드록시-엘-아르기닌(NHA)을 통해

시트룰린과 -NO로 산소 의존적인 5전자 산화를 촉매합니다.

촉매 활성 NOS는

이량체이며,

각 서브유닛은 산화효소와 환원효소 도메인을 포함하고 있습니다.

산화효소 도메인의 인터페이스에는

각 서브유닛의 시스테인 2개로 구성된 Zn2+-테트라티올산염이 포함되어 있습니다.

NOS 환원효소 도메인에는

산화 환원 보조 인자인 NADPH, FMN, FAD 및 CaM의 결합 부위가 포함되어 있습니다.

산화 효소 도메인은 환원된 테트라하이드로비옵테린(BH4)과

단단히 결합하여 반응을 가속화합니다.

Ca2+-CaM 의존적 활성화 외에도

eNOS는

인산화, 글루타치오닐화, S-니트로실화(41-43)를 포함한

다양한 가역적 전사 후 변형에 의해 조절됩니다.

Moreover, eNOS activity is also regulated by its interaction with caveolins (Cavs), membrane structural proteins present at specialized regions of the plasma membrane, the caveolae. The binding of eNOS to Cav-1 leads the enzyme to a resting inactive state. Ca2+-bound calmodulin disrupts the Cav-1-eNOS interaction by directly binding to the enzyme, leading to its activation. Various external stimuli, including vascular endothelial growth factor (VEGF), acetylcholine, and insulin, lead to the activation of eNOS by mediating its release from Cav-1/caveolae into the cytosol (44). Additionally, caveolae accommodate a variety of other proteins including the transient receptor potential cation channels (TRPCs), heat shock protein 90 (Hsp90), G proteins, and protein kinases (PKA and PKC) that allow an efficient eNOS regulation and cell signaling (42, 45, 46).

·NO can diffuse out of the endothelial cell, reacting with different cell targets. One of the most recognizable, for its vasodilating actions, is the soluble guanylate cyclase (sGC) present in the adjacent vascular smooth muscle cells (VSMCs) (4, 40). The interaction of ·NO with the heme in sGC leads to its activation and production of the second messenger guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate (cGMP) from GTP and the activation of specific kinases [cGMP-dependent kinases (PKGs)] (47). ·NO/cGMP signaling is stopped by the action of cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs) that degrades cGMP. Pharmacological inhibition of PDE activity has been shown to be useful in the clinical treatment of erectile dysfunction, pulmonary hypertension, and neurological disorders (48, 49).

또한,

eNOS 활성은

혈장막의 특수한 영역인 섬모에 존재하는 막 구조 단백질인

카베올린(Cav)과의 상호작용에 의해서도 조절됩니다.

eNOS가 Cav-1에 결합하면

효소가 비활성 상태로 전환됩니다.

Ca2+ 결합 칼모둘린은

효소에 직접 결합하여 Cav-1-eNOS 상호 작용을 방해하여

효소를 활성화시킵니다.

혈관 내피 성장 인자(VEGF), 아세틸콜린, 인슐린을 포함한 다양한 외부 자극은

Cav-1/소포체에서 세포질로의 방출을 매개하여

eNOS의 활성화로 이어집니다(44).

또한,

Caveolae는

일시적 수용체 전위 양이온 채널(TRPC),

열 충격 단백질 90(Hsp90),

G 단백질,

단백질 키나제(PKA 및 PKC) 등

다양한 단백질을 수용하여

효율적인 eNOS 조절 및 세포 신호를 가능하게 합니다(42, 45, 46).

-NO는

내피 세포 밖으로 확산되어

다양한 세포 표적과 반응할 수 있습니다.

혈관 확장 작용으로 가장 잘 알려진 것 중 하나는

인접한 혈관 평활근 세포(VSMC)에 존재하는 가용성 구아닐레이트 시클라제(sGC)입니다(4, 40).

sGC의 헴과 -NO의 상호작용은

GTP에서 두 번째 메신저 구아노신 3′,5′-사이클릭 모노포스페이트(cGMP)의 활성화 및

생산과 특정 키나제[cGMP 의존성 키나제(PKG)]의 활성화로 이어집니다(47).

cGMP를 분해하는 사이클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라아제(PDE)의 작용에 의해 -NO/cGMP 신호가 중단됩니다. PDE 활성의 약리학적인 억제는 발기부전, 폐 고혈압 및 신경 장애의 임상 치료에 유용한 것으로 나타났습니다(48, 49).

The activation of the sGC at the VSMC needs ·NO concentration in the low nanomolar rage (∼5–10 nM), whereas ·NO production by eNOS will depend on its functional status (see above) induced by processes such as phosphorylation and may fluctuate in the mid- to high nanomolar range (e.g., up to ∼100 nM) (50, 51). In the vasculature, most of the ·NO produced by eNOS is inactivated by its fast reaction with oxyhemoglobin (HbFe2+O2, k = 8 × 107 M−1s−1) present at high concentration (∼5 mM) in the red blood cells (52). Thus, for all tissues, the vasculature constitutes a major sink for ·NO, generating a concentration gradient from its site of production and the nearest vessel, preventing tissue ·NO accumulation. However, several mechanisms have been proposed by which hemoglobin may not only preserve but also generate ·NO (see below) (53). ·NO is involved in the maintenance of a healthy endothelium via the inhibition of platelet aggregation, modulating the expression‎ of adhesion molecules and regulating cell growth and differentiation of vascular cells. This pleiotropic function of ·NO depends on its ability to reach the cell targets, which in many cases are situated several cell diameters away from its production site. Thus, controlling ·NO half-life and preserving its bioavailability becomes essential and underscores its interplay with O2·− and the presence of SODs in the region where ·NO exerts its biological actions.

VSMC에서 sGC의 활성화에는

낮은 나노몰 범위(∼5-10 nM)의 -NO 농도가 필요한 반면,

eNOS에 의한 -NO 생성은

인산화와 같은 과정에 의해 유도되는 기능 상태(위 참조)에 따라 달라지며

중~고 나노몰 범위(예: 최대 ∼100 nM)에서 변동될 수 있습니다(50, 51).

혈관계에서 eNOS에 의해 생성된 대부분의 -NO는

적혈구에서 고농도(∼5 mM)로 존재하는 산소 헤모글로빈(HbFe2+O2, k= 8 × 107 M-1s-1)과의

빠른 반응에 의해 비활성화됩니다(52).

따라서

모든 조직에서 혈관계는

-NO의 주요 흡수원으로 작용하여

생성 부위와 가장 가까운 혈관 사이의 농도 구배를 생성하여

조직의 -NO 축적을 방지합니다.

그러나

헤모글로빈이 -NO를 보존할 뿐만 아니라

생성할 수 있는 몇 가지 메커니즘이 제안되었습니다(아래 참조)(53).

-NO는

혈소판 응집 억제,

접착 분자의 발현 조절,

혈관 세포의 세포 성장 및 분화 조절을 통해

건강한 내피 유지에 관여합니다.

이러한

-NO의 다발성 기능은

생산 부위에서 여러 세포 직경 떨어진 곳에 위치한

세포 표적에 도달하는 능력에 따라 달라집니다.

따라서

-NO 반감기를 조절하고 생체 이용률을 보존하는 것이 필수적이며,

-NO가 생물학적 작용을 하는 영역에서

산소와의 상호 작용 및 SOD의 존재를 강조합니다.

4. UNCOUPLED NOSs AS PEROXYNITRITE SYNTHASES

Under different conditions, the three NOS isoforms can become electron transfer uncoupled. This means that the electrons transferred from NADPH are delivered to O2 instead of to l-arginine, resulting in O2·− generation (54–56). The most accepted factor associated with this electron transfer uncoupling is deficiency in BH4 and/or a lower BH4-to-BH2 ratio (57). These pterins are structurally similar, and NOS can bind both of them. When binding BH2, the heme cannot hydroxylate l-arginine and thus ·NO synthesis is blocked and O2·− is generated. This is particularly relevant for eNOS, which binds BH4/BH2 with the same affinity and thus is extremely sensitive to the BH4/BH2 imbalance (58). It was recently shown that eNOS uncoupling by BH4 deficiency takes place at the heme, with virtually no contribution from the flavins of the reductase domain (59) (FIGURE 3).

4. 퍼옥시니트라이트 합성체로서의 결합되지 않은 NOS

서로 다른 조건에서

세 가지 NOS 동형체는

전자 전달이 결합되지 않은 상태가 될 수 있습니다.

즉,

NADPH에서 전달된 전자가

l-아르기닌 대신 O2로 전달되어

O2-- 생성(54-56)을 초래합니다.

이러한

전자 전달 언커플링과 관련된 가장 널리 알려진 요인은

BH4의 결핍 및/또는 낮은 BH4 대 BH2 비율입니다(57).

이러한 프테린은 구조적으로 유사하며 NOS는 이 두 가지를 모두 결합할 수 있습니다.

BH2와 결합할 때 헴은 l-아르기닌을 수산화할 수 없으므로

-NO 합성이 차단되고

O2--가 생성됩니다.

이는 특히

BH4/BH2와 동일한 친화력으로 결합하여

BH4/BH2 불균형에 매우 민감한 eNOS와 관련이 있습니다(58).

최근

BH4 결핍에 의한 eNOS 결합 해제는

환원효소 도메인의 플라빈의 기여가 거의 없이

헴에서 일어나는 것으로 나타났습니다(59)(그림 3).

FIGURE 3.Nitric oxide synthase (NOS) uncoupling.

In situations of substrate and ccofactor availability, particularly tetrahydrobiopterin (BH4), NOSs function as “coupled” dimeric enzymes, producing l-citrulline and nitric oxide (·NO) from l-arginine and O2 using NADPH as electron donor (left). Different conditions, such as BH4 deficiency, low l-arginine or heat shock protein 90 (Hsp90) chaperone levels, and different oxidative and nonoxidative posttranslational modifications uncouple NOSs (right). In these conditions, both ·NO and superoxide radical (O2·−) are produced by the uncoupled NOSs with the concomitant generation of peroxynitrite. CaM, calmodulin.

그림 3:산화 질소 합성 효소(NOS) 결합 해제.

기질 및 보조 인자, 특히 테트라하이드로비옵테린(BH4)이 존재하는 상황에서 NOS는 “결합된” 이량체 효소로 기능하여 전자 공여체로서 NADPH를 사용하여 l-아르기닌과 O2로부터 l-시트룰린과 산화질소(-NO)를 생성합니다(왼쪽).

BH4 결핍, 낮은 l-아르기닌 또는 열충격 단백질 90(Hsp90) 샤페론 수준, 다양한 산화적 및 비산화적 번역 후 변형과 같은 다양한 조건은 NOS의 결합을 해제합니다(오른쪽). 이러한 조건에서 -NO와 슈퍼옥사이드 라디칼(O2--)은 모두 결합되지 않은 NOS에 의해 생성되며 퍼옥시니트라이트가 수반됩니다. CaM, 칼모둘린.

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Other factors such as low l-arginine and Hsp90 availability (60, 61), phosphorylation at specific threonine site, redistribution from caveolae to cytosol, S-glutathionylation and S-nitrosation at specific cysteine residues, and increased production of asymmetric di-methyl arginine (ADMA, endogenous inhibitor) also contribute to the NOS electron transfer uncoupling (59, 62, 63). Both S-glutathionylation and phosphorylation lead to a decrease in the flow of electrons from the reductase to the oxidase domain, and thus electrons accumulate in the reductase domain, favoring O2·− generation, although to a lesser extent than when this occurs in the heme domain (43, 64). For nNOS it was shown that the isoform nNOSα is the most prone to be uncoupled and O2·− generation is enhanced by the S-guanylation of the reductase domain (55). Other modifications such as the S-nitrosation of the Zn-thiolate cluster affect the stability of the dimer, yielding a nonactive monomer. The cysteines involved in the Zn/S cluster are sensitive to peroxynitrite, and their oxidation also leads to enzyme monomerization (65). The rupture of the cluster is believed to be secondary to NOS uncoupling (43). Under this condition, both ·NO and O2·− will be generated by the uncoupled NOS, with the formation of peroxynitrite establishing a positive feedback loop that results in further NOS uncoupling and peroxynitrite production.

낮은 l-아르기닌 및 Hsp90 가용성(60, 61),

특정 트레오닌 부위에서의 인산화,

섬모에서 세포질로의 재분배,

특정 시스테인 잔기에서 S-글루타티온화 및 S-니트로화,

비대칭 디-메틸 아르기닌(ADMA, 내인성 억제제)의 생산 증가와 같은

다른 요인도 NOS 전자 전달 결합 해소에 기여합니다(59, 62, 63).

S-글루타티온화 및 인산화는

환원 효소에서 산화 효소 영역으로의 전자의 흐름을 감소시켜

환원 효소 영역에 전자가 축적되어 헴 영역에서 발생하는 경우보다 덜하지만

O2-- 생성을 선호합니다 (43, 64).

nNOS의 경우,

이소형 nNOSα가 가장 쉽게 결합 해제되고

환원효소 도메인의 S-구아닐화에 의해

O2-- 생성이 강화되는 것으로 나타났습니다(55).

Zn-티올산염 클러스터의 S-니트로화와 같은 다른 변형은 이량체의 안정성에 영향을 미쳐 비활성 단량체를 생성합니다. Zn/S 클러스터에 관여하는 시스테인은 퍼옥시니트라이트에 민감하며, 이들의 산화는 또한 효소 단량체화를 유도합니다(65). 클러스터의 파열은 NOS 결합 해소에 의한 이차적인 것으로 여겨집니다(43).

이 조건에서

-NO와 O2--는 모두 결합되지 않은 NOS에 의해 생성되며,

퍼옥시니트라이트의 형성은

긍정적 피드백 루프를 설정하여

추가적인 NOS 결합 해제와 퍼옥시니트라이트 생성을 초래합니다.

5. NONCANONICAL ·NO SOURCES

·NO can also be synthetized through reductive pathways that utilize nitrite (N⁢O−2N⁢O2−) as substrate. In plants, the main characterized route of ·NO synthesis involves N⁢O−2N⁢O2− reduction by molybdenum (Mo)-dependent nitrate reductases, enzymes that catalyze the rate-limiting step in ·NO assimilation (66, 67). In mammals, N⁢O−2N⁢O2− was first demonstrated to be a source of ·NO in the gastric lumen (acidic pHs), where it modulates mucosal blood flow and constitutes a first-line defense against pathogenic organisms (68, 69). Furthermore, ·NO can be produced from N⁢O−2N⁢O2− in circulation and tissues under hypoxic and acidic conditions (70–72), causing vasodilation in mammals (73–79). Indeed, exogenous administration of N⁢O−2N⁢O2− aiming to increase ·NO production is proposed as a therapeutic tool in cardiovascular diseases and infections (79–84). The concentration of N⁢O−2N⁢O2− in plasma is in the submicromolar range (79) and increases after ingestion of inorganic nitrate, because of reduction of the latter by oral bacteria (85). Furthermore, the concentration of N⁢O−2N⁢O2− in tissues is variable, reaching ∼1 µM levels in mouse heart, and increases during hypoxia or due to exogenous administration (86). Nevertheless, the reported physiological concentrations of N⁢O−2N⁢O2− are consistent with those required for biological effects, particularly under hypoxic and/or acidic conditions (87).

5. 비표준 -NO 소스

아질산염(NO-2NO2-)을 기질로 사용하는 환원 경로를 통해서도

-NO를 합성할 수 있습니다.

식물에서 -NO 합성의 주요 경로는

-NO 동화의 속도 제한 단계를 촉매하는 효소인

몰리브덴(Mo)-의존성 질산염 환원효소에 의한 NO-2NO2- 환원입니다(66, 67).

포유류에서 NO-2NO2-는

위 내강(산성 pH)에서 점막 혈류를 조절하고

병원성 유기체에 대한 일차 방어를 구성하는 -NO의 공급원임이 처음으로 입증되었습니다(68, 69).

또한,

-NO는

저산소 및 산성 조건(70-72)에서 순환계와 조직에서 NO-2NO2-로부터 생성되어

포유류의 혈관 확장을 유발할 수 있습니다(73-79).

실제로,

-NO 생성을 증가시키는 것을 목표로하는

NO-2NO2-의 외인성 투여는

심혈관 질환 및 감염의 치료 도구로 제안됩니다 (79-84).

혈장 내 NO-2NO2-의 농도는

미크로몰 미만 범위이며(79),

구강 박테리아에 의한 후자의 감소로 인해

무기 질산염 섭취 후 증가합니다(85).

또한

조직 내 NO-2NO2-의 농도는 가변적이며,

마우스 심장에서 ∼1 µM 수준에 도달하고

저산소증 동안 또는 외인성 투여로 인해 증가합니다 (86).

그럼에도 불구하고

보고된 NO-2NO2-의 생리적 농도는

특히 저산소 및/또는 산성 조건에서 생물학적 효과에 필요한 농도와 일치합니다(87).

In mammals, different metal-containing proteins catalyze the reduction of N⁢O−2N⁢O2− to ·NO. Among these we find the members of the molybdenum (Mo)-dependent enzyme family including sulfite oxidase (an enzyme localized in the mitochondria intermembrane space), mARC enzymes, xanthine oxidoreductase, and aldehyde oxidase, all of which show maximal activity at acidic pH (see Ref. 88 and references therein). Additionally, different deoxy-heme-containing globins reduce N⁢O−2N⁢O2− to ·NO under low oxygen tension and pH conditions (reaction 2). In mammals, these include hemoglobin, myoglobin, neuroglobin, and cytoglobin. In contrast, under aerobic conditions globins show a ·NO dioxygenase activity that leads to a rapid ·NO consumption and formation of N⁢O−3N⁢O3− (reaction 3) (reviewed in Refs. 43, 89).

FeII+ NO−2+ H+→ FeIII+•NO + OH−(hypoxic  conditions)FeII+ NO2−+ H+→ FeIII+•NO + OH−(hypoxic  conditions)(reaction 2)

FeII⁢O2+•NO → FeIII+ NO−3(normoxic  conditions)FeII⁢O2+•NO → FeIII+ NO3−(normoxic  conditions)reaction 3)

The ferrous heme form of human cystathionine beta synthase, an enzyme that catalyzes the first step in the transulfuration pathway, has been also proposed as a source of both O2·− and peroxynitrite (90).

포유류에서는 다양한 금속 함유 단백질이 NO-2NO2-를 -NO로 환원하는 촉매 역할을 합니다. 이 중 아황산염 산화효소(미토콘드리아 막간 공간에 국한된 효소), mARC 효소, 크산틴 산화환원효소 및 알데히드 산화효소를 포함한 몰리브덴(Mo) 의존성 효소 계열의 구성원들은 모두 산성 pH에서 최대 활성을 보입니다(참고 문헌 88 및 참조 문헌 참조). 또한, 다양한 데옥시헴 함유 글로빈은 낮은 산소 장력과 pH 조건(반응 2)에서 NO-2NO2-를 -NO로 환원합니다. 포유류의 경우 헤모글로빈, 미오글로빈, 뉴로글로빈, 시토글로빈이 여기에 포함됩니다. 이와 대조적으로, 호기성 조건에서 글로빈은 -NO 디옥시게나제 활성을 나타내어 -NO를 빠르게 소비하고 NO-3NO3-를 형성합니다(반응 3)(참고 문헌 43, 89에서 검토됨).

FeII+ NO-2+ H+→ FeIII+-NO + OH-(저산소 조건)FeII+ NO2-+ H+→ FeIII+-NO + OH-(저산소 조건)(반응 2)

FeIIO2+-NO → FeIII+ NO-3(정상산소 조건)FeIIO2+-NO → FeIII+ NO3-(정상산소 조건)반응 3)

황산화 경로의 첫 번째 단계를 촉매하

Finally, at acidic pHs (<5) the reaction between H2O2 and N⁢O−2N⁢O2− (the latter in the protonated form, HNO2, pKa ∼3.14) to yield ONOOH may take place (although at low rates), as was previously suggested because acidic solutions containing both reactants are bactericidal (91, 92). This reaction may occur at the macrophage (but not neutrophil) phagosome in the early process of phagocytosis where the pH drops [<5 (93)], although the real contribution of this reaction to pathogen killing remains elusive (94). In the stomach, the acidic pH and high dietary N⁢O−2N⁢O2− may favor this reaction, but the H2O2 concentrations in the stomach lumen may be extremely low. The reaction might take place at the damaged gastric epithelium, where NOX activation in the context of inflammation could generate sufficient O2·−/H2O2 concentrations to drive peroxynitrite generation.

마지막으로, 산성 pH (<5)에서 두 반응물을 모두 포함하는 산성 용액은 살균성이 있기 때문에 이전에 제안 된 것처럼 H2O2와 NO-2NO2- (후자는 양성자화 된 형태의 HNO2, pKa ∼ 3.14) 사이의 반응이 일어나서 (낮은 속도이지만) ONOOH를 생성 할 수 있습니다 (91, 92). 이 반응은 pH가 떨어지는 식균 작용의 초기 과정에서 대식세포(호중구는 아님) 식세포에서 발생할 수 있지만[<5 (93)], 병원체 사멸에 대한 이 반응의 실제 기여도는 여전히 파악하기 어렵습니다(94). 위에서는 산성 pH와 높은 식이 NO-2NO2-가 이 반응에 유리할 수 있지만 위 내강의 H2O2 농도는 매우 낮을 수 있습니다. 이 반응은 손상된 위 상피에서 일어날 수 있으며, 염증의 맥락에서 NOX 활성화는 퍼옥시니트라이트 생성을 유도하기에 충분한 O2-H2O2 농도를 생성할 수 있습니다.

6. MITOCHONDRIA: KEY SOURCES OF O2·− AND PEROXYNITRITE

One of the most important sources of O2·− is the mitochondria in a continuous process due to “electron leakage” to O2 from mainly complex I (NADH-dehydrogenase), complex III (ubiquinone oxidoreductase) of the electron transport chain (ETC), and other flavin-containing dehydrogenases [α-ketoglutarate dehydrogenase (α-KGDH) and glycerophosphate dehydrogenase (α-GPDH) complexes] (95). It was estimated that <0.2% of total oxygen consumed by mitochondria is reduced to O2·− (18). Mitochondrial O2·− production can be enhanced by the ·NO-dependent reversible inhibition of cell respiration acting at the cytochrome-c oxidase complex of the mitochondrial ETC (complex IV) (96, 97). Eventually, ·NO may be also formed under some circumstances in mitochondria via a NOS-like activity (sometimes referred as mtNOS) (98, 99), although the precise enzymology has remained elusive (100–102). A recent report further suggests the presence of both iNOS and nNOS in the cardiomyocyte mitochondria that are involved in peroxynitrite generation following mitochondrial Ca2+ overload (103).

·NO can diffuse to mitochondria and react with O2·−, leading to the site-specific generation of peroxynitrite. However, the presence of mitochondrial MnSOD maintains peroxynitrite generation at low rates. In this scenario, peroxynitrite may participate in signaling processes that involve reversible-redox relay mechanisms for oxidant sensing by mitochondrial peroxiredoxins (20, 36). Under different pathological conditions such as hyperglycemia, inflammation, cancer, and aging, mitochondrial O2·− generation is significantly increased (i.e., one order of magnitude) over basal levels, with an estimated flux on the order of ∼4–10 µM/s and steady-state concentration in the subnanomolar range (∼200–500 pM) (11, 104). At these higher steady-state concentrations, peroxynitrite levels will rise and both reversible and irreversible oxidative modifications to key mitochondrial proteins (oxidation and nitration) may occur (reviewed in Ref. 10). MnSOD is tetrameric in eukaryotes and becomes nitrated and inactivated in vivo (105, 106). The process involves peroxynitrite one-electron reduction to ·NO2 with the concomitant oxidation of the active site MnIII to MnIV=O, the oxidation of the neighboring phenolic group of Tyr34 to tyrosyl radical, and the recombination of the latter with ·NO2, yielding NO2-Tyr34 (106). Since the reaction of peroxynitrite with the active site MnIII occurs with a rate constant of 1 × 105 M−1s−1 per tetramer at pH 7.4 and 37°C (107), the enzyme does not represent a main target for peroxynitrite in mitochondria, particularly under physiological conditions, where most mitochondrial Prx are reduced (36). However, even under nonstressed conditions a small fraction of peroxynitrite (∼0.1%) is expected to react and promote MnSOD tyrosine nitration, leading to the accumulation of the inactive enzyme, depending on the availability and activity of repair/proteolysis systems (36). This fraction can increase under conditions of high hydroperoxide/peroxynitrite formation and/or decreased availability of Prx reducing systems, which lead to the accumulation of oxidized and hyperoxidized forms of peroxiredoxins (108–110). Thus, peroxynitrite promotes the nitration and inactivation of MnSOD, which decreases O2·− dismutation and thus increases peroxynitrite formation in mitochondria, ultimately promoting a vicious cycle that results in the disruption of mitochondrial redox homeostasis (18).

6. 미토콘드리아: 산소 이온과 퍼옥시니트라이트의 주요 공급원

O2·−의 가장 중요한 공급원 중 하나는

전자 수송 사슬(ETC)의 복합 I(NADH-dehydrogenase), 복합 III(ubiquinone oxidoreductase) 및

기타 플라빈 함유 탈수소효소[α-케토글루타레이트 탈수소효소(α-KGDH) 및

글리세로포스페이트 탈수소효소(α-GPDH) 복합체]로부터 O2로

“전자 누출”이 일어나는 지속적인 과정의 미토콘드리아입니다. (95).

미토콘드리아가 소비하는 총 산소의 0.2% 미만이

O2·−로 환원되는 것으로 추정됩니다(18).

미토콘드리아 O2·−의 생성은

미토콘드리아 ETC(복합체 IV)의 시토크롬-c 산화효소 복합체에서 작용하는

·NO 의존적 가역적 세포 호흡 억제에 의해 향상될 수 있습니다(96, 97).

결국,

미토콘드리아의 NOS 유사 활동(때로는 mtNOS라고도 함)을 통해

어떤 상황에서는 NO가 형성될 수도 있습니다(98, 99).

정확한 효소학은 아직 밝혀지지 않았지만(100-102).

최근의 보고에 따르면,

미토콘드리아 Ca2+ 과부하 이후에 퍼옥시니트라이트 생성에 관여하는

iNOS와 nNOS가

심근세포 미토콘드리아에 존재한다고 합니다(103).

·NO는

미토콘드리아로 확산되어 O2-와 반응하여

특정 부위에서 퍼옥시니트라이트가 생성될 수 있습니다.

그러나

미토콘드리아 MnSOD의 존재는

퍼옥시니트라이트 생성을 낮은 비율로 유지합니다.

이 시나리오에서 퍼옥시니트라이트는

미토콘드리아 퍼옥시리덕스에 의한 산화제 감지를 위한

가역적 산화 환원 전달 메커니즘을 포함하는 신호 전달 과정에 참여할 수 있습니다(20, 36).

고혈당증, 염증, 암, 노화와 같은 다양한 병리학적 조건 하에서

미토콘드리아 O2·− 생성은

기준치보다 상당히 증가합니다(즉, 10배 정도).

추정 플럭스는 약 4-10 µM/s이고,

정상 상태 농도는 200-500 pM(서브나노몰 범위)입니다(11, 104).

이러한 높은 정상 상태 농도에서

퍼옥시니트라이트 수준이 상승하고,

주요 미토콘드리아 단백질에 가역적 및 비가역적 산화적 변형(산화 및 니트로화)이

발생할 수 있습니다(참고 문헌 10 참조).

MnSOD는

진핵생물에서 4량체이며,

생체 내에서 니트로화되어 비활성화됩니다(105, 106).

이 과정은 퍼옥시니트라이트의 일전자 환원을 통해

·NO2를 생성하고, 활성 부위 MnIII를 MnIV=O로 산화시키고,

Tyr34의 인접 페놀기를 티로실 라디칼로 산화시키고,

후자를 ·NO2와 재결합시켜 NO2-Tyr34(106)를 생성하는 과정을 포함합니다.

퍼옥시니트라이트와 활성 부위 MnIII의 반응은

pH 7.4, 37°C에서 4량체당 1 × 105 M−1s−1의 속도 상수로 발생하므로(107),

이 효소는 특히 대부분의 미토콘드리아 Prx가 감소하는 생리학적 조건 하에서

미토콘드리아에서 퍼옥시니트라이트의 주요 표적이 되지 않습니다(36).

그러나,

비강세 조건에서도 퍼옥시니트라이트의 작은 부분(∼0.1%)이 반응하여

MnSOD 티로신 니트로화를 촉진하여,

복구/단백질 분해 시스템의 가용성과 활동에 따라 비활성 효소의 축적을 유발할 것으로 예상됩니다(36).

이 비율은

과산화수소/퍼옥시니트라이트의 형성량이 많고/또는

Prx 환원 시스템의 가용성이 감소하는 조건에서 증가할 수 있으며,

이로 인해 과산화 및 과산화 형태의 퍼옥시레독신이 축적됩니다(108-110).

따라서,

퍼옥시니트라이트는 MnSOD의 질화와 불활화를 촉진하여,

O2·−의 이화작용을 감소시키고,

미토콘드리아에서 퍼옥시니트라이트의 형성을 증가시킴으로써,

궁극적으로 미토콘드리아의 산화 환원 항상성의 붕괴를 초래하는 악순환을 촉진합니다(18).

7. NADPH OXIDASES AND OTHER O2·− SOURCES

The most prominent enzymatic sources of O2·− are the family of NAD(P)H oxidases. Seven NAD(P)H oxidases have been identified (Nox1–5 and Duox1 and 2) that catalyze the O2 reduction to yield mainly O2·− (Nox1, 2, 3, and 5) and H2O2 (Nox4 and Duox1 and 2) (111, 112). Each isoform consists of a catalytic core with a transmembrane domain and variable regulatory subunits, and thus differences in the activator proteins, localization, and function of the different isoforms exist. The mechanism by which O2·− is being formed is still elusive but involves the electron transfer from NADPH via FAD cofactor to the heme moieties in which O2 is reduced to O2·−. NOX isoforms are regulated by a large number of protein/protein interactions, and most isoforms are not functional without the assembly of the NOX core protein with several regulatory proteins (111). Phagocyte NOX2 (also known as gp91phox) is present in professional phagocytes (macrophages, neutrophils, and dendritic cells) and participates in innate immune response, being central for pathogen control before an adaptative immune response arises. The activation of NOX2 by pathogen recognition gives rise to the well-established “oxidative burst” with the production of sustained levels of O2·− radicals toward the internalized pathogen at the phagosome (113–116). NOX2 is also present (although at lower levels than phagocytes) in endothelial cells as a preassembled intracellular complex that is associated with the cytoskeleton and produces low but significant amounts of O2·− that may participate in the signaling for cellular proliferation (117, 118). In the VSMC the predominant isoform is NOX1, activated by different vasoactive and growth factors (angiotensin II, PDGF). Finally, in the blood vessels, NOX2 has been also reported in endothelial cells and adventitial fibroblasts (reviewed in Refs. 43, 111). The assembly and activation of these NOXs can be produced in different situations including inflammation (TNF-α), activation of Toll receptors, hypertension, hyperglycemia, shear stress, and hypoxia-reoxygenation (112). The colocalization of NOXs and NOS enzymes has been reported, representing a potential source for peroxynitrite generation.

Another source of reactive species is xanthine oxidase (XO), a multisubstrate enzyme found at high concentrations in mammalian milk and liver that can reduce O2 by one or two electrons, yielding O2·− and H2O2, respectively. XDH is produced primarily in the liver, but after different stressors it can be released to the circulation and rapidly converted to XO by plasma proteases binding to the endothelium via electrostatic interactions with glycosaminoglycans (119). In the endothelium, XO expression‎ is regulated by proinflammatory cytokines and O2 concentrations (120). As mentioned above, XO can lead to ·NO generation via N⁢O−2N⁢O2− reduction, and thus the enzyme can produce both peroxynitrite precursors. It has been shown that the simultaneous generation of ·NO and O2·− occurs over a range of oxygen concentrations, with the highest radical production around 70 µM O2, and thus XO becomes a peroxynitrite synthase (121). Circulating and cell-bound XO has been shown to be responsible for the development of endothelial dysfunction and is associated with the ischemia-reperfusion syndrome, hypertension, and other disease conditions. Aldehyde oxidase (AO) is another member of the Mo-hydroxylase family, but its physiological substrates and functions remain unclear. It is ubiquitously expressed and is always active as oxidase, although it is less active than XO (122).

The rise in the generation of O2·−, either by uncoupled NOS, NOX, XO, or mitochondria, promotes peroxynitrite production (FIGURE 4). Thus ·NO bioavailability is decreased by O2·−, simultaneously causing a shift from signal transduction to oxidative events, which can contribute to the development of different pathological conditions such as inflammation, atherosclerosis, hypertension, and neurodegeneration (as recently shown in Refs. 123–126). FIGURE 4 schematizes some possible routes for intra- and extracellular peroxynitrite generation.

7. NADPH 산화효소와 기타 O2·− 발생원

O2·−의 가장 두드러진 효소 발생원은

NAD(P)H 산화효소 계열입니다.

7개의 NAD(P)H 산화효소(Nox1-5, Duox1, Duox2)가 확인되었으며,

이들은 주로 O2·- (Nox1, 2, 3, 5)와 H2O2 (Nox4, Duox1, Duox2)를 생성하기 위해

O2 환원을 촉매합니다(111, 112).

각 이소폼은

막 횡단 도메인과 가변 조절 서브유닛을 가진 촉매 코어로 구성되어 있으며,

따라서 활성화 단백질, 국소화, 그리고 기능에 차이가 존재합니다.

O2·−가 형성되는 메커니즘은 아직 명확하지 않지만, FAD 보조 인자를 통해 NADPH에서 O2가 O2·−로 환원되는 헴 모이어티로 전자가 전달되는 과정이 관여합니다. NOX 이소폼은 많은 단백질/단백질 상호작용에 의해 조절되며, 대부분의 이소폼은 NOX 핵심 단백질과 여러 조절 단백질의 결합 없이는 기능하지 않습니다(111). 식세포 NOX2(gp91phox라고도 함)는 전문 식세포(대식세포, 호중구, 수지상 세포)에 존재하며 선천성 면역 반응에 관여하며, 적응성 면역 반응이 발생하기 전에 병원체 제어의 중심 역할을 합니다. 병원체 인식에 의한 NOX2의 활성화는 식세포에서 내재화된 병원체에 대한 지속적인 수준의 O2·− 라디칼 생성과 함께 잘 확립된 “산화적 폭발”을 일으킵니다(113-116). NOX2는 또한 내피 세포에 존재하며(식세포보다 낮은 수준이지만), 세포 골격과 관련된 사전 조립된 세포 내 복합체로, 세포 증식을 위한 신호 전달에 관여할 수 있는 낮은 수준이지만 상당한 양의 O2·−를 생성합니다(117, 118). VSMC에서 가장 우세한 이소형은 NOX1이며, 다양한 혈관 활성 및 성장 인자(안지오텐신 II, PDGF)에 의해 활성화됩니다. 마지막으로, 혈관 내피세포와 외피 섬유 아세포에서도 NOX2가 발견되었다(참고문헌 43, 111 참조). 이러한 NOX의 조립과 활성화는 염증(TNF-α), 톨 수용체의 활성화, 고혈압, 고혈당, 전단 응력, 저산소증-재산소화(112) 등 다양한 상황에서 발생할 수 있습니다. NOX와 NOS 효소의 공존이 보고되었으며, 이는 퍼옥시니트라이트 생성의 잠재적 원인이 될 수 있습니다.

반응성 종의 또 다른 원인은 잣틴 산화효소(XO)입니다. XO는 포유류 우유와 간에서 고농도로 발견되는 다중 기질 효소로, 산소 1~2개의 전자를 감소시켜 각각 O2-와 H2O2를 생성할 수 있습니다. XDH는 주로 간에서 생성되지만, 다양한 스트레스 요인에 노출된 후에는 순환계로 방출되어 글리코사미노글리칸(119)과의 정전기적 상호작용을 통해 내피에 결합하는 혈장 프로테아제에 의해 빠르게 XO로 전환될 수 있습니다. 내피에서 XO 발현은 전염증성 사이토카인과 O2 농도에 의해 조절됩니다(120). 위에서 언급한 바와 같이, XO는 N⁢O−2N⁢O2− 환원을 통해 ·NO 생성을 유도할 수 있으므로, 이 효소는 퍼옥시니트라이트 전구체를 모두 생성할 수 있습니다. ·NO와 O2·−의 동시 생성은 다양한 산소 농도에서 발생하며, 가장 높은 라디칼 생산량은 약 70 µM O2인 것으로 나타났습니다. 따라서 XO는 퍼옥시니트라이트 신타아제(121)가 됩니다. 순환 및 세포 내 XO는 내피 기능 장애의 발달에 책임이 있는 것으로 밝혀졌으며, 허혈-재관류 증후군, 고혈압 및 기타 질병 상태와 관련이 있습니다. 알데히드 산화효소(AO)는 모-하이드록실라제 계열의 또 다른 구성원이지만, 생리적 기질과 기능은 아직 명확하지 않습니다. AO는 XO보다 덜 활동적이지만, 어디에나 존재하며 항상 산화효소로 활동합니다(122).

NOS, NOX, XO 또는 미토콘드리아의 결합 해제에 의한 O2·− 생성의 증가는 퍼옥시니트라이트 생성을 촉진합니다(그림 4). 따라서 ·NO의 생체 이용률은 O2·−에 의해 감소되고, 동시에 신호 전달에서 산화 반응으로의 전환이 발생하여 염증, 죽상동맥경화증, 고혈압, 신경퇴행과 같은 다양한 병리학적 상태의 발생에 기여할 수 있습니다(최근에 참고 문헌 123-126에 설명되어 있음). 그림 4는 세포 내 및 세포 외 퍼옥시니트라이트 생성에 대한 몇 가지 가능한 경로를 도식화한 것입니다.

FIGURE 4.Examples of superoxide (O2·−), nitric oxide (·NO), and peroxynitrite formation in endothelial and red blood cells. O2 is required for the production of ·NO by nitric oxide synthases (NOSs) and of O2·− by NAD(P)H oxidases (NOXs). The latter can also be formed by electron leakage within the electron transport chain, among other sources. Hemoglobin at red blood cells and endothelial cell-bound xanthine oxidase (XO) are also significant sources of ·NO and O2·−. ·NO is highly diffusible, whereas because of its negative charge O2·− cannot diffuse through membranes unless they express specific anion channels. Thus, ONOO− is mostly formed in the compartment where O2·− is generated. ONOOH can diffuse through membranes, and ONOO− can cross them through anion channels reaching other cell compartments.

그림 4. 내피세포와 적혈구에서 발생하는 슈퍼옥사이드(O2·−), 산화질소(·NO), 그리고 퍼옥시니트라이트의 형성 예.

산화질소 합성효소(NOS)에 의한 ·NO와 NAD(P)H 산화효소(NOX)에 의한 O2·−의 생성에 O2가 필요합니다. 후자는 다른 원천들 중에서도 전자 수송 사슬 내의 전자 누출에 의해 형성될 수 있습니다. 적혈구 내의 헤모글로빈과 내피세포에 결합된 크산틴 산화효소(XO)도 ·NO와 O2·−의 중요한 원천입니다. ·NO는 확산성이 매우 높지만, 음전하를 띠고 있기 때문에 O2·−는 특정 음이온 채널을 발현하지 않는 한 막을 통과할 수 없습니다. 따라서 ONOO−는 주로 O2·−가 생성되는 구획에서 형성됩니다. ONOOH는 막을 통과할 수 있고, ONOO−는 음이온 채널을 통해 다른 세포 구획에 도달할 수 있습니다.

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8. BIOLOGICAL CHEMISTRY OF PEROXYNITRITE

Under most biological conditions, both species ONOO− and ONOOH coexist and their relative concentrations will be pH dependent. This is an important issue since the stability, reactivity, and capacity to permeate membranes are quite different for the two species (20, 127). In the absence of targets ONOOH homolyzes with the generation of two potent oxidants, ·OH and ·NO2 radicals, but in biological systems peroxynitrite directly performs either one- or two-electron oxidations (FIGURE 5).

8. 퍼옥시니트라이트의 생화학

대부분의 생물학적 조건에서,

ONOO-와 ONOOH 두 종은 공존하며,

이들의 상대적 농도는 pH에 따라 달라집니다.

이 두 종의 안정성, 반응성, 막 투과 능력은 상당히 다르기 때문에

이것은 중요한 문제입니다(20, 127).

표적의 부재 시,

ONOOH는 두 가지 강력한 산화제인

·OH와 ·NO2 라디칼을 생성하면서 동종분해되지만,

생물학적 시스템에서는 퍼옥시니트라이트가

직접적으로 1전자 또는 2전자 산화를 수행합니다(그림 5).

FIGURE 5.Main peroxynitrite reaction pathways: 1) protein cysteine residue 2-electron oxidation; 2) peroxynitrous acid homolysis; 3) nucleophilic addition to CO2 and evolution to ·NO2 and CO3·− radicals; 4) reaction with transition metal centers; and 5) hemoglobin-catalyzed ONOO− isomerization. Pathways 2, 3, and 4 lead to 1-electron oxidations, promoting tyrosine nitration in particular. The width of the arrows symbolizes the preferential routes of ONOO− consumption in biological systems.

그림 5. 퍼옥시니트라이트의 주요 반응 경로:

1) 단백질 시스테인 잔기의 2전자 산화; 2) 퍼옥시니트르산의 호모분해; 3) CO2에 친핵성 첨가 및 ·NO2와 CO3·− 라디칼로의 진화; 4) 전이 금속 중심과의 반응; 5) 헤모글로빈 촉매 작용에 의한 ONOO− 이성질체화. 경로 2, 3, 4는 1전자 산화 반응을 일으켜, 특히 티로신 니트로화를 촉진합니다. 화살표의 폭은 생물학적 시스템에서 ONOO− 소비의 우선 경로를 상징합니다.

RSH, thiols; RSOH, sulfenic acid. Modified from Ref. 22, with permission from Journal of Biological Chemistry.

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Thiols (RSH) are oxidized by peroxynitrite by a two-electron mechanism to its corresponding sulfenic acid (RSOH) (128, 129). Peroxynitrite can react with transition metals in metalloproteins [such as cytochrome c (Cyt c), Mn, and Fe-SODs) by different mechanisms, which may involve the generation of strongly oxidizing oxo-metal complexes and ·NO2 (reviewed in Ref. 10). Peroxynitrite anion can react with CO2 (∼1.2 mM, k = 5.8 × 104 M−1s−1) to yield a nitrosoperoxocarboxylate adduct (ONOOCO2−) that undergoes a fast homolysis into the potent oxidants ·NO2 and CO3·− (130). In addition to the direct reactions of peroxynitrite, the secondary-derived radicals arising from peroxynitrite (·OH, ·NO2, CO3·−, oxo-metal complex, and lipid peroxyl radicals) can promote protein tyrosine oxidation and nitration (10).

Typically, protein tyrosine nitration is a two-step radical process that involves the one-electron oxidation to yield tyrosyl radical that combines with ·NO2 at diffusion-controlled rates to yield 3-nitrotyrosine (131).3 Protein tyrosine nitration is a covalent and mostly irreversible posttranslational modification that occurs in vitro and in vivo. This modification affects protein structure and function and may result in the generation of new antigenic epitopes, changes in enzyme activity (loss- and/or gain-of-function), altered cytoskeletal organization, and impaired cell signaling transduction (for detailed information see Ref. 10). During inflammation, protein tyrosine nitration can also be performed by circulating myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO) (24, 133). Of particular relevance is the reaction of peroxynitrite anion with CO2 owing to its high concentration in tissues and its continuous metabolic generation. Mitochondria are the main sources of CO2, and its production may vary depending on the metabolic activity of decarboxylation reactions, urea synthesis, and carbonic anhydrase activity with the generation of a CO2 gradient from its site of production at the mitochondrial matrix to the cell cytosol. The reaction of ONOO− with CO2 accounts for a substantial portion of its biological fate and reactivity (20, 36, 130). Nevertheless, in crowded cellular settings (distances < 5 µm) such as inside the phagocyte phagosome, the diffusion process of peroxynitrite outcompetes the reaction with CO2 and mostly direct reactions with cellular targets take place (20, 134).

As mentioned above, Prxs are the most prominent antioxidant defenses toward peroxynitrite present in micromolar concentrations in most tissues and cells (20). Other peroxidases like glutathione peroxidases (GPxs) can also catalyze the reduction of peroxynitrite to N⁢O−2N⁢O2− resulting in the detoxification of the oxidant, but their concentrations are usually lower than those of Prxs (33, 135). Indeed, the biological relevance of GPxs in the context of peroxynitrite detoxification remains elusive (10). Although glutathione (GSH) reacts directly with peroxynitrite, the rate constant of the reaction at physiological pH is too low (GSH; k ∼ 103 M−1s−1) to compete with other intracellular targets. The effect of GSH in the modulation of peroxynitrite-dependent reactions most probably involves reduction of ·NO2 and tyrosyl and protein radicals (33). In addition to cysteine, peroxynitrite can react with other protein residues, but at much lower rates such as methionine and tryptophan, with rate constants of ∼400 M−1s−1 (136) and ∼40 M−1s−1 (137) at pH 7.4 and 37°C, respectively. Aspects concerning protein and amino acid target selectivity for peroxynitrite have recently been reviewed elsewhere (10).

Peroxynitrite is not an efficient nitrosating agent to generate, for example, S-nitrosothiols (RSNO). However, under conditions such as 1) simultaneous ·NO, O2·−, and peroxynitrite fluxes or 2) exposure to large levels of authentic peroxynitrite in the presence of oxidizable substrates (endogenous compounds, organic buffers), peroxynitrite-derived radicals such as ·OH, ·NO2, and CO3·− promote one-electron oxidation of target molecules that in the presence of ·NO yields nitrosated compounds some of which can be ·NO donors (138–142). By this general mechanism, RSNO can be formed (i.e., thiol oxidation to thiyl radical, RS·, followed by recombination with ·NO) as a very low-yield process biologically but may result in signaling under appropriate assay conditions (143–147).

In the last decade, a series of novel probes and genetically encoded sensors have been developed for the sensitive and specific detection of peroxynitrite. In the case of the probes, boronate-based compounds have been characterized as being state-of-the-art reagents in the fast detection of peroxynitrite, taking advantage of molecular designs that release “caged” fluorescent compounds secondary to probe oxidation. These compounds have proven useful for the detection and quantitation of peroxynitrite in vitro, in cellula, and ex vitro. Interestingly, knowledge of the reaction chemistry has been also successfully used for the development of genetically encoded probes. Specific protocols, applications, caveats, confounders, and usefulness have recently been critically analyzed (148–150).

티올(RSH)은 퍼옥시니트라이트에 의해 2전자 메커니즘에 의해 해당 황산(RSOH)으로 산화됩니다(128, 129). 퍼옥시니트라이트는 금속단백질(사이토크롬 c(Cyt c), Mn, Fe-SODs 등)의 전이금속과 다양한 메커니즘을 통해 반응할 수 있으며, 이 과정에서 강력한 산화 작용을 하는 옥소금속 복합체와 ·NO2가 생성될 수 있습니다(참고문헌 10 참조). 퍼옥시니트라이트 음이온은 CO2(∼1.2mM, k = 5.8 × 104 M−1s−1)와 반응하여 니트로소퍼옥소카르복실산(ONOOCO2−)을 생성할 수 있으며, 이 물질은 강력한 산화제인 ·NO2와 CO3−(130)로 빠르게 분해됩니다. 퍼옥시니트라이트의 직접적인 반응 외에도, 퍼옥시니트라이트에서 발생하는 2차 유도체 라디칼(·OH, ·NO2, CO3·−, 옥소금속 복합체, 지질 퍼옥실 라디칼)은 단백질 티로신 산화 및 니트로화(10)를 촉진할 수 있습니다.

일반적으로, 단백질 티로신 니트로화는 확산 제어 속도로 ·NO2와 결합하여 3-니트로티로신을 생성하는 티로실 라디칼을 생성하기 위한 1전자 산화를 포함하는 2단계 라디칼 과정입니다(131).3 단백질 티로신 니트로화는 생체 외 및 생체 내에서 발생하는 공유적이고 대부분 비가역적인 번역 후 변형입니다. 이 변형은 단백질의 구조와 기능에 영향을 미치며, 새로운 항원 결정기(antigenic epitope)의 생성, 효소 활성의 변화(기능 상실 및/또는 기능 증가), 세포 골격 조직의 변화, 세포 신호 전달 장애를 초래할 수 있습니다(자세한 정보는 참고문헌 10 참조). 염증 동안, 단백질 티로신 니트로화는 순환하는 미엘로퍼옥시다제(MPO)와 호산구 퍼옥시다제(EPO)에 의해 수행될 수도 있습니다(24, 133). 특히 조직에 고농도로 존재하고 지속적으로 대사 생성되기 때문에 퍼옥시니트라이트 음이온과 CO2의 반응이 중요합니다. 미토콘드리아는 CO2의 주요 공급원이며, 미토콘드리아 기질에서 생산되는 CO2의 생성 구배에 따른 탈카복실화 반응, 요소 합성, 탄산탈수효소 활성의 대사 활동에 따라 CO2의 생산량이 달라질 수 있습니다. ONOO−와 CO2의 반응은 생물학적 운명과 반응성의 상당 부분을 차지합니다(20, 36, 130). 그럼에도 불구하고, 식세포 소포체 내부와 같이 세포가 밀집된 환경(거리 5µm 미만)에서는 퍼옥시니트라이트의 확산 과정이 CO2와의 반응을 능가하고, 대부분 세포 표적과의 직접적인 반응이 일어납니다(20, 134).

위에서 언급한 바와 같이, Prxs는 대부분의 조직과 세포에 존재하는 마이크로몰 농도의 퍼옥시니트라이트에 대한 가장 두드러진 항산화 방어 기제입니다(20). 글루타티온 퍼옥시다제(GPx)와 같은 다른 퍼옥시다제는 퍼옥시니트라이트를 N⁢O−2N⁢O2−로 환원시켜 산화 물질을 해독할 수 있지만, 그 농도는 Prx의 농도보다 일반적으로 낮습니다(33, 135). 실제로, 퍼옥시니트라이트 해독과 관련하여 GPx의 생물학적 관련성은 아직 명확하지 않습니다(10). 글루타치온(GSH)이 퍼옥시니트라이트와 직접 반응하지만, 생리학적 pH에서의 반응 속도 상수는 너무 낮아서(GSH; k ∼ 103 M−1s−1) 다른 세포 내 표적과 경쟁할 수 없습니다. 퍼옥시니트라이트 의존 반응의 조절에 있어서 GSH의 효과는 아마도 ·NO2와 티로실 및 단백질 라디칼의 환원을 포함할 것입니다(33). 퍼옥시니트라이트는 시스테인 이외에도 다른 단백질 잔기와 반응할 수 있지만, 메티오닌과 트립토판과 같은 다른 단백질 잔기와 반응하는 속도는 훨씬 느립니다. pH 7.4, 37°C에서 각각 약 400 M−1s−1(136)과 약 40 M−1s−1(137)의 반응 속도를 보입니다. 퍼옥시니트라이트의 단백질과 아미노산 표적 선택성에 관한 측면은 최근 다른 곳에서 검토되었습니다(10).

퍼옥시니트라이트는 예를 들어 S-니트로소티올(RSNO)을 생성하는 효율적인 니트로사이드화제는 아닙니다. 그러나 1) NO, O2·−, 퍼옥시니트라이트의 동시 유입 또는 2) 산화 가능한 기질(내인성 화합물, 유기 완충제)이 존재하는 상태에서 다량의 진짜 퍼옥시니트라이트에 노출되면, ·OH, ·NO2, CO3·−와 같은 퍼옥시니트라이트 유래 라디칼이 표적 분자의 일전자 산화를 촉진합니다. 이 과정에서 ·NO가 생성되면, 일부는 ·NO 공여체(138-142)가 될 수 있는 니트로화 화합물이 생성됩니다. 이 일반적인 메커니즘에 의해, RSNO는 생물학적으로 매우 낮은 수율의 과정으로 형성될 수 있지만(즉, 티올의 티일 라디칼(RS·)로의 산화, 그리고 ·NO와의 재결합), 적절한 분석 조건 하에서는 신호 전달을 일으킬 수 있습니다(143-147).

지난 10년 동안, 퍼옥시니트라이트의 민감하고 구체적인 검출을 위한 일련의 새로운 탐침과 유전자 인코딩 센서가 개발되었습니다. 탐침의 경우, 보론산염 기반 화합물은 탐침의 산화 작용에 이차적으로 “감금된” 형광 화합물을 방출하는 분자 설계를 활용하여 퍼옥시니트라이트의 신속한 검출에 있어 최첨단 시약으로 특징지어졌습니다. 이러한 화합물은 체외, 세포 내, 체외에서 퍼옥시니트라이트의 검출과 정량화에 유용함이 입증되었습니다. 흥미롭게도, 반응 화학에 대한 지식은 유전자로 암호화된 프로브의 개발에도 성공적으로 사용되었습니다. 특정 프로토콜, 응용, 주의점, 혼동 요소, 유용성에 대한 최근의 비판적 분석이 이루어졌습니다(148-150).

9. TURNOVER OF OXIDIZED AND NITRATED PROTEINS

Proteostasis is the mechanism by which cells control protein synthesis, folding, conformational maintenance, and degradation ensuring cell homeostasis. This process minimizes protein misfolding and subsequent aggregation, hallmarks of age-associated proteinopathies such as those observed in aging (151), and Alzheimer’s and Parkinson’s diseases (152, 153).

The rapid removal of oxidized proteins is performed by the 20S proteosome by means of the recognition of hydrophobic amino acids exposed on the surface of the protein (154). If not removed, these oxidized proteins may suffer further oxidation and cross linking, and at this stage they are no longer accessible for proteolytic degradation, generating insoluble aggregates that accumulate in cells and extracellular matrix (154).

For nitrated proteins the scenario is more complex since it usually occurs in cells with other oxidative modifications and thus the relative contribution of the nitro group for proteosome degradation is difficult to determine. Recently, cyt c proteosomal degradation was studied with site-specific tyrosine nitrated proteoforms (NO2Y74-Cyt c and NO2Y97-Cyt c). Results indicated that these particular modifications did not alter the rate of degradation compared with native cyt c (155). Different is the case of CuZnSOD nitrated at Y108, where the modification enhances by twofold protein degradation by the proteosome (156), and thus the consequences of nitration of a single tyrosine in a protein may render different susceptibilities for proteosome degradation depending on the particular protein (157). For tyrosine-nitrated peptides the results coincide and show that the chymotrypsin activity of the 20S proteosome is largely inhibited (155, 156) and this may render an incomplete proteolysis of the nitrated protein altering cell proteostasis. Nitrated proteins accumulate in aging and inflammatory disorders, such as in the case of MnSOD (158), prostacyclin synthase (159, 160), CaATPase from the sarco(endo)plasmic reticulum (SERCA) (161), and actin (162) among others (151). Enzymatic routes of nitrotyrosine reduction in specific nitrated proteins have been described (163–165). Particularly, protein 3-nitrotyrosine levels in mitochondria, including those of NO2-MnSOD, rapidly decrease under hypoxic conditions, in a process that is independent of protein degradation by proteases and relies on a still-elusive denitrase activity (163). Mitochondria contain several proteases, including metalloproteases and serine and cysteine proteases that present different substrate specificities (166). Among them, LON protease seems to be mostly responsible for selectively degrading oxidized mitochondrial proteins, and its downregulation has been associated with aging and cell senescence whereas its upregulation is observed in cancer (167–169). LON can be inactivated by peroxynitrite, and thus a positive feedback loop is generated with the accumulation of damaged mitochondrial proteins (170) (FIGURE 6).

9. 산화 및 질화 단백질의 회전율

프로테오스타시스(Proteostasis)는 세포가 단백질 합성, 폴딩, 형태 유지, 분해를 조절하여 세포 항상성을 유지하는 메커니즘입니다. 이 과정은 단백질 오접힘과 그에 따른 응집을 최소화하여 노화(151), 알츠하이머병, 파킨슨병(152, 153)과 같은 노화와 관련된 단백질 병증의 특징을 최소화합니다.

산화된 단백질의 신속한 제거는 단백질 표면에 노출된 소수성 아미노산을 인식하는 20S 프로테오좀에 의해 수행됩니다(154). 제거되지 않으면, 이러한 산화된 단백질은 추가적인 산화 및 교차 결합을 겪을 수 있으며, 이 단계에서 단백질 분해 분해에 더 이상 접근할 수 없게 되어 세포와 세포 외 기질에 축적되는 불용성 응집체를 생성합니다(154).

질화 단백질의 경우,

다른 산화적 변형이 있는 세포에서 주로 발생하기 때문에 시나리오가 더 복잡하며,

따라서 프로테오좀 분해에 대한 질소기의 상대적 기여도를 결정하기가 어렵습니다.

최근에는

특정 위치의 티로신 질화 단백질 형태(NO2Y74-Cyt c 및 NO2Y97-Cyt c)를 통해

cyt c 프로테오좀 분해를 연구했습니다.

결과는

이러한 특정 변형이 천연 사이토크롬 c(155)와 비교했을 때

분해율을 변화시키지 않는다는 것을 보여줍니다.

Y108에서 질화된 CuZnSOD의 경우는 다릅니다.

이 경우,

단백질 분해효소(156)에 의한 단백질 분해율이 2배로 증가하므로,

단백질 내 단일 티로신의 질화 결과는

특정 단백질에 따라 단백질 분해효소 분해에 대한 민감도가 달라질 수 있습니다(157).

티로신-질화 펩티드의 경우, 결과는 일치하며,

20S 프로테오좀의 키모트립신 활성이 크게 억제됨을 보여줍니다(155, 156).

이로 인해

질화 단백질의 불완전한 단백질 분해가 일어나

세포의 단백질 항상성이 변화할 수 있습니다.

질산화된 단백질은

노화 및 염증성 질환에 축적되는데,

MnSOD(158), 프로스타사이클린 신타제(159, 160),

근(내)소포체(SERCA)의 CaATPase(161),

액틴(162) 등이 그 예입니다(151).

특정 질화 단백질에서

니트로티로신의 효소적 환원 경로가 설명되어 있습니다(163-165).

특히,

NO2-MnSOD를 포함한 미토콘드리아의 단백질 3-니트로티로신 수치는

저산소 조건에서 프로테아제에 의한 단백질 분해와는 무관하게

여전히 파악하기 어려운 탈질효소 활성에 의존하는 과정에서 급격히 감소합니다(163).

미토콘드리아에는

다양한 기질 특이성을 나타내는

메탈로프로테아제, 세린 및 시스테인 프로테아제를 포함한

여러 가지 프로테아제가 포함되어 있습니다(166).

그 중에서도

LON 프로테아제는 산화된 미토콘드리아 단백질을 선택적으로 분해하는 역할을 하는 것으로 보이며,

LON 프로테아제의 하향 조절은 노화와 세포 노화와 관련이 있는 반면,

상향 조절은 암에서 관찰됩니다(167-169).

LON은

퍼옥시니트라이트에 의해 비활성화될 수 있으며,

따라서 손상된 미토콘드리아 단백질의 축적과 함께 긍정적인 피드백 고리가 생성됩니다(170) (그림 6).

FIGURE 6.Peroxynitrite-mediated nitration of mitochondrial manganese superoxide dismutase (MnSOD). Under different pathological conditions, mitochondrial ONOO− levels are increased, favoring the nitration of different targets such as MnSOD, which is inactivated by the specific metal-mediated nitration of tyrosine 34. The degradation and turnover of these proteoforms is partially impaired by the oxidative inactivation of the LON protease by peroxynitrite, leading to an accumulation of oxidized mitochondrial proteins.

그림 6.퍼옥시니트라이트 매개 미토콘드리아 망간 과산화물 디스뮤타제(MnSOD)의 니트로화.

병리학적 조건이 다르면, 미토콘드리아의 ONOO- 수치가 증가하여, 티로신 34의 특정 금속 매개 니트로화에 의해 비활성화되는 MnSOD와 같은 다른 표적의 니트로화를 촉진합니다. 이러한 프로테오폼의 분해와 회전은 퍼옥시니트라이트에 의한 LON 프로테아제의 산화적 불활성화에 의해 부분적으로 손상되어, 산화된 미토콘드리아 단백질의 축적을 초래합니다.

10. PHYSIOLOGICAL AND PATHOLOGICAL EFFECTS OF PEROXYNITRITE: NEW EXAMPLES

Peroxynitrite can affect cellular metabolism by the modification of specific targets, mainly through tyrosine residue nitration and/or cysteine oxidation. Since the review by Pacher and coworkers (11), several new cell targets and pathways have been described for peroxynitrite under physiological and pathological conditions, with increasing evidence of the role of peroxynitrite as a signaling molecule in addition to its role as pathogenic mediator. Here we describe some new examples of peroxynitrite generation and protein tyrosine nitration in different conditions and the connections and implications for cell and human physiology and pathology.

10. 퍼옥시니트라이트의 생리적 및 병리학적 영향: 새로운 사례

퍼옥시니트라이트는

주로 티로신 잔기의 질화 및/또는

시스테인의 산화를 통해 특정 표적의 변형을 일으켜

세포 대사에 영향을 미칠 수 있습니다.

파처와 동료들의 연구(11) 이후,

생리학적 및 병리학적 조건 하에서 퍼옥시니트라이트에 대한 몇 가지

새로운 세포 표적과 경로가 설명되었으며,

퍼옥시니트라이트가 병원성 매개체로서의 역할 외에도

신호 전달 분자로서의 역할에 대한 증거가 증가하고 있습니다.

여기에서는

다양한 조건에서 퍼옥시니트라이트 생성 및 단백질 티로신 니트로화의 몇 가지 새로운 예와

세포 및 인간 생리학 및 병리학에 대한 연관성과 의미를 설명합니다.

10.1. Peroxynitrite in Cell Signaling

Peroxynitrite can act as a signaling molecule triggering and/or interfering with different signal transduction pathways that mostly depend in the modification of cysteine and tyrosine residues for their activity. Although peroxynitrite-dependent thiol oxidation in cell signaling may well be a reversible process (i.e., via reduction of disulfides, either intra- or intermolecular), the reversibility of tyrosine nitration in signaling processes has not been demonstrated; in fact, there is a paucity of data regarding the biological mechanisms of denitration. Thus, the influence of tyrosine nitration on signaling cascades at this time can be perceived more as a disruptive than a regulated signaling phenomenon, irrespective of the biological outcome.

Low peroxynitrite concentrations trigger the rapid activation of the pentose phosphate pathway with the accumulation of NADPH in neurons and astrocytes through a mechanism that involves the activation of glucose-6-phosphate dehydrogenase, improving the cell capacity to regenerate oxidized glutathione (171, 172). Moreover, signaling levels of peroxynitrite also confer neuroprotection by the inactivation of 3-phosphoinositide-3-phosphatase (PTEN) due to cysteine oxidation and thus activate the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt antiapoptotic signaling pathway (173).

Nitration of protein tyrosine residues alters nuclear factor κB (NF-κB)-dependent signaling activation cascades. NF-κB activation requires serine phosphorylation of its inhibitory protein IκBα, which promotes its dissociation from the complex and the translocation of the transcription factor to the nucleus. Signaling is stopped by the action of phosphatase A2 (PP2A) that dephosphorylates IκBα. It was shown that after cell exposure to ionizing radiation IκBα becomes nitrated at tyrosine 108, leading to the dissociation of the complex and to NF-κB activation (174). More recently, another mechanism by which protein nitration activates NF-κB was described, namely nitration of a selective tyrosine (Y289) in the B56δ, the regulatory subunit of protein PP2A, that renders the enzyme inactive. Inactivation of PP2A leads to sustained IκB phosphorylation and thus NF-κB activation (175, 176).

Another important effect of peroxynitrite in regard to cell signaling relates to the formation of nitrated guanine derivatives such as 8-nitro-cGMP, which were identified in tissues expressing iNOS and in organs from humans with cancer, degenerative diseases, pneumonia, and other inflammatory conditions (177–179). 8-Nitro-cGMP is more resistant than cGMP to PDE inactivation and is able to activate cGMP-protein kinases, extending the time of action of this second messenger. Moreover, 8-nitro-cGMP-dependent S-guanylation of Keap 1 leads to NFr2 activation, with the concomitant expression‎ of the targeted antioxidant enzymes playing a role in signal transduction during oxidative stress conditions (179, 180).

Evidence for the role of peroxynitrite in signaling of other cellular processes was shown with a specific kidney MnSOD-knockout (KO) model. The low levels and activities of MnSOD in this animal led to altered renal morphology and increased oxidant production but surprisingly showed no alteration of the renal function. Moreover, after ischemia-reperfusion, the MnSOD-KO mice showed renal injury similar to wild-type mice, suggesting that chronic oxidative stress may induce survival signals that protect the kidney against acute oxidative stress (181). Later, it was shown that peroxynitrite at low micromolar levels (0.5–1 µM) signals for mitochondrial biogenesis and autophagy in this model, and this was postulated as a compensatory and protective mechanism that contributes to the lack of renal failure following ischemia-reperfusion in these animals (182). Another model of MnSOD-specific KO mice was generated in adipocytes. In addition to the observed significant atrophy and loss of lipid stores in the fat tissue, the animals were protected from weight gain when fed with a high-fat diet in comparison to wild-type animals (183). Increased O2·− production, mitochondrial biogenesis, and enhanced expression‎ of uncoupled protein 1 (UCP-1) were detected. The adaptive mechanism observed in these MnSOD-KO adipocytes appears to be mediated by an inefficient substrate oxidation through uncoupling of oxidative phosphorylation together with enhanced mitochondrial biogenesis, the latter possibly due to peroxynitrite signaling (184).

10.1. 세포 신호 전달에 있어서의 퍼옥시니트라이트

퍼옥시니트라이트는

시스테인과 티로신의 잔류물을 그들의 활동에 맞게 변형하는 데 주로 의존하는

다양한 신호 전달 경로를 촉발하거나 방해하는 신호 전달 분자 역할을 할 수 있습니다.

퍼옥시니트라이트 의존성 티올 산화가 세포 신호 전달에서

가역적 과정(즉, 분자 내 또는 분자 간 이황화물의 환원을 통한)일 수 있지만,

신호 전달 과정에서 티로신 니트로화의 가역성은 입증되지 않았습니다.

사실, 탈질화의 생물학적 메커니즘에 관한 데이터는 거의 없습니다. 따라서, 이 시점에서 티로신 니트로화의 신호 전달 계통에 미치는 영향은 생물학적 결과에 관계없이 조절된 신호 전달 현상이라기보다는 오히려 파괴적인 것으로 인식될 수 있습니다.

낮은 농도의 퍼옥시니트라이트는 포도당-6-인산 탈수소효소의 활성화를 포함하는 메커니즘을 통해 뉴런과 성상교세포에 NADPH가 축적되면서 펩토스 포스페이트 경로의 급속한 활성화를 유발하여, 산화된 글루타티온을 재생하는 세포 능력을 향상시킵니다(171, 172). 또한, 퍼옥시니트라이트의 신호 전달 수준은 시스테인 산화로 인한 3-포스포이노시타이드-3-포스파타제(PTEN)의 불활성화에 의해 신경 보호를 부여하고, 따라서 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K)/Akt 항-세포자멸 신호 전달 경로(173)를 활성화합니다.

단백질 티로신 잔기의 질화는 핵 인자 κB(NF-κB) 의존 신호 활성화 캐스케이드를 변화시킵니다. NF-κB 활성화는 억제 단백질 IκBα의 세린 인산화를 필요로 하는데, 이 인산화는 복합체로부터의 분리 및 전사 인자의 핵으로의 전좌를 촉진합니다. 신호 전달은 IκBα를 탈인산화하는 포스파타제 A2(PP2A)의 작용에 의해 중단됩니다. 세포가 이온화 방사선에 노출된 후 IκBα가 티로신 108에서 질화되어 복합체의 해리와 NF-κB 활성화로 이어지는 것으로 나타났습니다(174). 최근에는 단백질 니트로화가 NF-κB를 활성화시키는 또 다른 메커니즘이 설명되었습니다. 즉, 단백질 PP2A의 조절 서브유닛인 B56δ의 선택적 티로신(Y289)의 니트로화가 효소를 비활성화시키는 것입니다. PP2A의 비활성화는 지속적인 IκB 인산화를 유발하여 NF-κB를 활성화시킵니다(175, 176).

세포 신호 전달과 관련하여 퍼옥시니트라이트의 또 다른 중요한 효과는 iNOS를 발현하는 조직과 암, 퇴행성 질환, 폐렴 및 기타 염증성 질환을 앓고 있는 인간의 장기에서 확인된 8-니트로-cGMP와 같은 질화 구아닌 유도체의 형성과 관련이 있습니다(177-179). 8-니트로-cGMP는 PDE 비활성화에 대한 저항성이 cGMP보다 더 강하며, cGMP-단백질 키나아제를 활성화할 수 있어 이 두 번째 메신저의 작용 시간을 연장할 수 있습니다. 게다가, 8-니트로-cGMP 의존성 S-구아니틸레이션은 Keap1의 Nfr2 활성화를 유도하고, 산화 스트레스 조건에서 신호 전달에 중요한 역할을 하는 표적 항산화 효소의 발현을 동반합니다(179, 180).

다른 세포 과정의 신호 전달에서 퍼옥시니트라이트의 역할에 대한 증거는 특정 신장 MnSOD-knockout(KO) 모델에서 나타났습니다. 이 동물에서 MnSOD의 낮은 수준과 활동은 신장 형태를 변화시키고 산화제 생산을 증가시켰지만, 놀랍게도 신장 기능에는 변화가 없었습니다. 또한, 허혈-재관류 후, MnSOD-KO 마우스는 야생형 마우스와 유사한 신장 손상을 보였는데, 이는 만성 산화 스트레스가 급성 산화 스트레스로부터 신장을 보호하는 생존 신호를 유발할 수 있음을 시사합니다(181). 나중에, 저마이크로몰 수준(0.5-1 µM)의 퍼옥시니트라이트가 이 모델에서 미토콘드리아 생성과 자가포식 작용을 나타내는 신호로 작용한다는 사실이 밝혀졌고, 이는 동물의 허혈-재관류 후 신부전 발생을 막는 보상 및 보호 메커니즘으로 추정되었습니다(182). MnSOD 특이적 KO 마우스의 또 다른 모델이 지방세포에서 생성되었습니다. 지방 조직에서 관찰된 현저한 위축과 지질 저장소의 손실 외에도, 이 동물들은 야생형 동물에 비해 고지방 식단을 섭취했을 때 체중 증가로부터 보호되었습니다(183). 증가된 O2·− 생산, 미토콘드리아 생성과 결합되지 않은 단백질 1(UCP-1)의 향상된 발현이 검출되었습니다. 이러한 MnSOD-KO 지방세포에서 관찰되는 적응 메커니즘은 미토콘드리아 생성과 관련된 산화적 인산화반응의 결합 해제와 함께 비효율적인 기질 산화를 매개하는 것으로 보이며, 후자는 아마도 퍼옥시니트라이트 신호 전달 때문일 것입니다(184).

10.2. Peroxynitrite in Pain Pathways

Peroxynitrite-mediated overactivation of signaling pathways can also disrupt physiological processes and tissue homeostasis. The increase in the generation of reactive oxygen and nitrogen species following infection or tissue injury can lead to tissue inflammation that initiates peripheral and central nervous sensitization, a process that underlies pathological pain (185). The participation of peroxynitrite in pain signaling has been studied in different inflammatory and neuropathic pain models, with antioxidant intervention ameliorating the symptoms (186–191).

As a paradigmatic example, peroxynitrite has been implicated in neuropathic pain pathways (185, 192) by mechanisms that include excess activation of transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 1 (TRPV1) and enhanced glutamatergic signaling in neurons via nitrooxidative modifications of both TRPV1 and the N-methyl-d-aspartate receptor (NMDAR) (185, 193, 194). Peroxynitrite was also shown to be involved in the maintenance of inflammatory pain and hyperalgesia following intraplantar administration of carrageenan (189) In this study, the nitration and inactivation of MnSOD was reported (with enhanced free radical production) together with the nitration and activation of the inducible cyclooxygenase-2 (COX-2) (with the generation of prostaglandins) playing key roles as proinflammatory and nociceptive agents in this pain model (189). COX-2 activation by relatively low doses of peroxynitrite was previously reported triggering the formation of proinflammatory mediators that may participate in pain cascades (195). In this sense, peroxynitrite and COX-mediated reactions are intertwined in the context of inflammatory pain and may act synergistically. Enhanced production of mitochondria reactive oxygen and nitrogen species was observed in neurons, microglia, and astrocytes in different neuropathic pain models with increased production of ·NO and thus peroxynitrite generation (185, 196–198). More recently, it was shown that inflammatory pain in the lumbar spinal cord under conditions that lead to peroxynitrite formation resulted in mitochondrial disfunction (199). Restoring mitochondrial function via metabolic modulation decreased microglia reactivity and alleviated both spinal cord neuroinflammation and pain behavior (199).

10.2. 통증 경로에서의 퍼옥시니트라이트

퍼옥시니트라이트에 의해 매개되는 신호 경로의 과잉 활성화는 생리적 과정과 조직 항상성을 방해할 수도 있습니다. 감염이나 조직 손상에 따른 활성 산소와 질소 종의 생성 증가는 말초 및 중추 신경 민감화를 유발하는 조직 염증을 유발할 수 있으며, 이는 병리학적 통증의 기초가 되는 과정입니다(185). 퍼옥시니트라이트가 통증 신호 전달에 관여하는 것은 다양한 염증성 및 신경병성 통증 모델에서 연구되었으며, 항산화제 개입으로 증상이 개선되었습니다(186-191).

전형적인 예로, 퍼옥시니트라이트는 과도한 활성화된 일시적 수용체 전위 양이온 채널을 포함하는 메커니즘을 통해 신경병성 통증 경로에 관여합니다(185, 192). V형 서브패밀리 1번 멤버(TRPV1)와 TRPV1과 N-메틸-d-아스파르트산 수용체(NMDAR)의 니트로옥사이드 변형을 통한 뉴런의 글루타메이트 신호 전달 강화(185, 193, 194). 퍼옥시니트라이트는 또한 카라기난의 발바닥 투여 후 염증성 통증과 통각과민을 유지하는 데 관여하는 것으로 나타났습니다(189). 이 연구에서 이 통증 모델에서 전염증 및 통각 수용체로서 중요한 역할을 하는 유도성 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 활성화(프로스타글란딘 생성)와 함께 MnSOD의 니트로화 및 비활성화(활성산소 생성 증가)가 보고되었다(189). 상대적으로 낮은 용량의 퍼옥시니트라이트에 의한 COX-2 활성화는 통증 연쇄 반응에 관여할 수 있는 전염증 매개체의 형성을 유발하는 것으로 이전에 보고된 바 있습니다(195). 이런 의미에서, 퍼옥시니트라이트와 COX 매개 반응은 염증성 통증의 맥락에서 서로 얽혀 있으며, 상승 작용을 할 수 있습니다. 다양한 신경병성 통증 모델에서 미토콘드리아의 활성 산소 및 질소 종의 생산이 증가하는 것이 관찰되었으며, 이는 ·NO의 생산 증가와 그에 따른 퍼옥시니트라이트 생성과 관련이 있습니다(185, 196-198). 최근에는 퍼옥시니트라이트가 형성되는 조건에서 요추 척수의 염증성 통증이 미토콘드리아 기능 장애를 유발한다는 사실이 밝혀졌습니다(199). 대사 조절을 통한 미토콘드리아 기능 회복은 미세아교세포의 반응성을 감소시키고 척수 신경염증과 통증 행동을 완화시켰다(199).

10.3. Peroxynitrite in the Phagosome: a Potent Microbicidal Agent

The generation of cytotoxic reactive species (i.e., free radicals and oxidants) by activated macrophages and neutrophils at the phagosome compartment is a crucial innate immune process for the control of intracellular pathogens. Bacterial and parasite phagocytosis leads to the assembly and activation of the macrophage NOX2 complex with sustained O2·− generation toward the internalized pathogen. When macrophage iNOS is active (after its induction by proinflammatory cytokines), ·NO is produced and thus peroxynitrite will be formed in the pathogen-containing phagosome (9, 15, 115). Taking advantage of the fast reaction of peroxynitrite with the new boron-based probes (150, 200) and using a fluorescein-based boronate-derived probe (FL-B), peroxynitrite generation toward phagocyted Trypanosoma cruzi was estimated to be of ∼1 µM s−1 over a period of 90 min, a sufficient oxidant amount to kill the parasite (15, 115, 200). Intra-T. cruzi peroxynitrite generation during the stay (2 h) in the phagosome was also measured with FL-B in immune-stimulated macrophages. The intraphagosomal peroxynitrite generation was highly inhibited in parasites overexpressing cytosolic Fe-SODB, an isoform that, besides its structural homology with MnSOD, is extremely resistant to the inactivation by peroxynitrite (93, 201). This result demonstrates that peroxynitrite is being generated at the phagosome compartment but also at the intracellular pathogen by means of ·NO/O2·− diffusion (93).

On the other hand, the early suggestion of formation of peroxynitrite in the phagosome of human neutrophils (16) is accumulating evidence (268, 269) and awaits further characterization.

10.3. 식세포 내의 퍼옥시니트라이트: 강력한 살균 작용을 하는 물질

식세포 내의 활성화된 대식세포와 호중구에 의해 생성되는 세포 독성 반응성 물질(즉, 자유 라디칼과 산화제)은 세포 내 병원균을 제어하는 데 중요한 선천적 면역 과정입니다. 박테리아와 기생충의 식세포 작용은 대식세포의 NOX2 복합체의 집합과 활성화를 유도하고, 이로 인해 내부화된 병원균을 향해 지속적인 O2·-가 생성됩니다. 대식세포 iNOS가 활성화되면(전염증성 사이토카인에 의해 유도된 후), ·NO가 생성되어 병원체가 들어 있는 식세포에서 퍼옥시니트라이트가 형성됩니다(9, 15, 115). 새로운 붕소 기반 탐침(150, 200)과 플루오레세인 기반 붕소산 유도 탐침(FL-B)을 사용하여 퍼옥시니트라이트의 빠른 반응을 활용합니다. 식세포화된 트리파노소마 크루지에 대한 퍼옥시니트라이트 생성은 90분 동안 약 1µM s-1로 추정되는데, 이는 기생충을 죽일 수 있는 충분한 양의 산화제입니다(15, 115, 200). 식세포에 머무르는 동안(2시간) T. 크루지 내부의 퍼옥시니트라이트 생성도 면역 자극 대식세포에서 FL-B를 사용하여 측정되었습니다. 세포질 Fe-SODB를 과발현하는 기생충에서는 퍼옥시니트라이트의 생성이 크게 억제되었습니다. 이 isoform은 MnSOD와 구조적 동질성을 가지고 있을 뿐 아니라, 퍼옥시니트라이트에 의한 불활성화에 매우 강합니다(93, 201). 이 결과는 퍼옥시니트라이트가 식세포 구획에서 생성될 뿐 아니라, 세포 내 병원체에서도 ·NO/O2·− 확산에 의해 생성된다는 것을 보여줍니다(93).

반면에, 인간 호중구의 식세포에서 퍼옥시니트라이트가 형성된다는 초기 제안(16)은 증거가 축적되고 있으며(268, 269), 추가적인 특성화가 기다리고 있습니다.

10.4. Peroxynitrite Synthesis in Cancer: Disruption of the Immune Response

The production of peroxynitrite in several human cancers is supported by the presence of high expression‎ of nitrated proteins. Leukocyte migration into inflamed tissue as well as in tumors is driven by chemokines, cytokines with chemoattractant properties (202). It was shown that intratumoral peroxynitrite generation induces CCL2 chemokine nitration inhibiting the recruitment of tumor-infiltrating specific T lymphocytes (203). Also, nitration of the lymphocyte TCR receptor impairs tumor-specific immunity by reducing T-lymphocyte responsiveness to tumor antigens (204). Deeper studies on the mechanisms by which NO2-CCL2 presents impaired function indicate that nitration of a specific tyrosine renders CCL2 in its monomeric state, decreasing the binding to endothelial glycosaminoglycan receptors (123). The lack of binding disrupts the chemokine gradient, impairing tumor lymphocyte migration.

10.4. 암에서 퍼옥시니트라이트 합성: 면역 반응의 붕괴

여러 인간 암에서 퍼옥시니트라이트의 생성은 질화된 단백질의 높은 발현에 의해 촉진됩니다. 백혈구는 종양뿐만 아니라 염증이 있는 조직으로 이동하는 과정에서 화학유인물질(chemotactic factor)을 가진 사이토카인인 케모카인(chemokine)에 의해 이동이 촉진됩니다(202). 종양 내 퍼옥시니트라이트 생성이 종양 침윤 특이적 T 림프구의 모집을 억제하는 CCL2 케모카인 니트로화를 유도한다는 사실이 밝혀졌습니다(203). 또한, 림프구 TCR 수용체의 니트로화는 종양 항원에 대한 T 림프구의 반응성을 감소시켜 종양 특이적 면역을 손상시킵니다(204). NO2-CCL2가 기능 장애를 일으키는 메커니즘에 대한 심층 연구에 따르면, 특정 티로신의 질화 작용이 CCL2를 단량체 상태로 만들어 내피 글리코사미노글리칸 수용체와의 결합을 감소시킨다고 합니다(123). 결합이 이루어지지 않으면 케모카인 구배가 파괴되어 종양 림프구의 이동이 방해받습니다.

10.5. Peroxynitrite in Neurodegenerative Diseases: the Role of Nitrated Hsp90

The selective death of motor neurons is a key hallmark in amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and their survival is dependent on trophic factor supply by surrounding astrocytes. At the cellular level, both mitochondrial dysfunction and increased reactive oxygen and nitrogen species contribute to motor neuron degeneration (205). Synthesis of ·NO by neuronal nNOS together with the mitochondrial generation of O2·− leads to peroxynitrite production and the induction of neuronal death by apoptosis (206). This death is further enhanced by reactive astrocytes expressing iNOS, commonly found nearby degenerating motor neurons, promoting neuronal apoptosis by increasing peroxynitrite production and thus contributing to the progressive death of motor neurons observed in ALS (207).

Familial forms of ALS are caused by mutations in the gene that codifies for SOD1(CuZn) (208–210).4 The mechanisms involved are still a matter of debate but go far beyond a loss of enzymatic activity and involve a gain of toxic functions (211, 212). In recent years, progress in understanding the role of nitrated Hsp90 in the pathogenesis of ALS has shed light on the process of motor neuron death. The endogenous generation of peroxynitrite and the induction of motor neuron apoptosis either after trophic factor deprivation or when cells express the ALS mutant SOD1G93A was shown previously (205, 206, 213). The nitration of a single tyrosine (Y33 or 56) on a small proportion (∼5%) of Hsp90 is sufficient to induce cell death by a mechanism that involves the P2X7 receptor-dependent activation of the Fas death pathway. P2X7 is an ATP-gated ion channel responsible for Ca2+ influx and upon activation can initiate the early events of exocytosis, mobilizing intracellular vesicles containing FasL to the plasma membrane with the activation of Fas-FasL cell death (214). Moreover, nitration of Hsp90 at Y33 leads to its translocation to mitochondria and downregulates mitochondrial activity, suggesting that, apart from its participation in the induction of cell death, this nitrated Hsp90 can regulate other aspects of cellular metabolism (215). Recently, the participation of mononitrated Hsp90 at Y56 in the induction of apoptosis in PC12 cells was revealed. The mechanism involves the activation of P2X receptor by the nitrated Hsp90 and calcium-dependent downstream activation of PTEN that inhibits the prosurvival PI3K/Akt pathway (216).

Extensive aggregation and nitration of α-synuclein has been detected in human brain lesions, with several neurological disorders associating nitroxidative stress to the onset and progression of neurodegenerative synucleinopathies (217). Recently, the neuronal expression‎ of myeloperoxidase (MPO) was found in the substantia nigra of brains of patients with Parkinson’s disease (218). MPO expression‎ colocalized with nitrated α-synuclein as well as with HOCl-modified protein epitopes, suggesting an important role of MPO in the nitroxidative stress observed in these pathologies, opening the possibility of an additional mechanism of nitration in the pathogenesis of Parkinson’s disease (218).

10.5. 신경 퇴행성 질환의 퍼옥시니트라이트: 질화 Hsp90의 역할

운동 뉴런의 선택적 사멸은 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 주요 특징이며, 이들의 생존은 주변 성상교세포에 의한 영양 인자 공급에 달려 있습니다. 세포 수준에서, 미토콘드리아 기능 장애와 활성 산소 및 질소 종의 증가는 모두 운동 뉴런 퇴화에 기여합니다(205). 신경세포의 nNOS에 의한 ·NO와 미토콘드리아의 O2·− 생성이 합쳐지면 퍼옥시니트라이트가 생성되고, 이로 인해 신경세포가 세포자살(apoptosis)을 통해 죽게 됩니다(206). 이 죽음의 과정은 퇴화 운동신경세포 근처에서 흔히 발견되는 iNOS를 발현하는 반응성 성상교세포에 의해 더욱 강화되는데, 이 성상교세포는 퍼옥시니트라이트 생성을 증가시켜 신경세포의 세포자살을 촉진함으로써 ALS에서 관찰되는 운동신경세포의 점진적 죽음을 촉진합니다(207).

가족성 ALS는 SOD1(CuZn)을 암호화하는 유전자의 돌연변이에 의해 발생합니다(208-210).4 관련된 메커니즘은 여전히 논쟁의 대상이지만, 효소 활성의 상실을 넘어 독성 기능의 증가를 수반합니다(211, 212). 최근 몇 년 동안, ALS의 병인에서 질화된 Hsp90의 역할에 대한 이해가 진전되면서 운동 신경 세포의 사멸 과정에 대한 이해가 깊어졌습니다. 영양 인자 결핍 또는 ALS 돌연변이 SOD1G93A를 발현하는 세포에서 퍼옥시니트라이트의 내인성 생성 및 운동 신경 세포 사멸의 유도는 이전에 밝혀졌습니다(205, 206, 213). Hsp90의 작은 비율(∼5%)에 있는 단일 티로신(Y33 또는 56)의 질화는 P2X7 수용체 의존적 Fas 죽음 경로의 활성화를 포함하는 기전에 의해 세포 사멸을 유도하기에 충분합니다. P2X7은 Ca2+ 유입을 담당하는 ATP-게이팅 이온 채널이며, 활성화되면 세포 외 분비의 초기 사건을 시작할 수 있으며, Fas-FasL 세포 사멸의 활성화와 함께 FasL을 포함하는 세포 내 소포를 세포막으로 이동시킬 수 있습니다(214). 또한, Y33에서 Hsp90의 질화는 미토콘드리아로의 전좌를 유도하고 미토콘드리아 활동을 하향 조절합니다. 이는 Hsp90의 질화가 세포 사멸 유도 이외에 세포 대사의 다른 측면을 조절할 수 있음을 시사합니다(215). 최근에는 Y56에서 Hsp90의 단일 질화가 PC12 세포의 세포 사멸 유도 과정에 관여한다는 사실이 밝혀졌습니다. 이 메커니즘은 질화된 Hsp90에 의한 P2X 수용체의 활성화와 생존을 위한 PI3K/Akt 경로를 억제하는 칼슘 의존성 PTEN의 하류 활성화(216)를 포함합니다.

인간의 뇌 병변에서 α-시누클레인의 광범위한 응집과 질화가 발견되었으며, 여러 신경학적 장애가 신경 퇴행성 시누클레노파티의 발병과 진행에 질산화 스트레스를 연관시키고 있습니다(217). 최근, 파킨슨병 환자의 뇌의 흑질에서 신경세포의 미엘로퍼옥시다제(MPO) 발현이 발견되었습니다(218). MPO 발현은 질화된 α-시누클레인과 HOCl-변형 단백질 에피토프와 함께 관찰되어, 이러한 병리학에서 관찰되는 니트로산화 스트레스에 MPO가 중요한 역할을 한다는 것을 시사하며, 파킨슨병의 병인에서 추가적인 니트로화 메커니즘의 가능성을 열어줍니다(218).

10.6. Peroxynitrite in the Vasculature: Endothelial Dysfunction and Disruption of Integrity

Recently, in a mouse model of pulmonary hypertension, the upregulation of both iNOS and NOX1 in endothelial cell caveolae has been reported, with the generation of peroxynitrite at this specialized region of the endothelial plasma membrane (126). To assess specifically the activity of endothelial cell TRPV4 channels, a specific inducible knockout mouse model was used together with endothelium-specific Cav-1-knockout mice. Peroxynitrite produced at the caveolae was shown to oxidize cysteine residues (Cys133 and 156) of the abovementioned scaffold protein Cav-1. This oxidation leads to a disruption of the Cav-1-TRPV4 channel signaling, decreasing channel activity (reducing Ca2+), lowering eNOS activation, and thus harming pulmonary vasodilation (126). Treatment of mice with the cell-permeable peptide NoxA1ds, a specific NOX1 inhibitor, restores the channel activity. Results confirm‎ the vital role for Cav-1-TRPV4 signaling in lowering pulmonary arterial pressure.

Another important observation for the pathogenic role of peroxynitrite in the vasculature was reported recently (108). The involvement of thioredoxin reductase 2 (TrxR2) in controlling the steady-state concentration of peroxynitrite in endothelial mitochondria via Trx-2, Prx 3/5, and NADPH was identified. With the use of the boron-based probe FL-B, it was shown that decreased TrxR2 activity led to enhanced mitochondrial peroxynitrite generation that, in turn, resulted in endothelial dysfunction and hypertrophy and disruption of the vascular cell wall in various organs.

10.7. Peroxynitrite in Lung Injury

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) are common lung manifestations of a variety of insults, including sepsis, endotoxemia, trauma, environmental pollution, and severe infection. Early work has implicated the production of O2·– and ·NO by lung epithelial and endothelial cells as well as by activated alveolar macrophages in the progression of ALI, suggesting the cytotoxicity of peroxynitrite to the alveolar epithelium with the disruption of the endothelial barrier (219–221). Indeed, increased levels of nitrotyrosine, nitrated proteins, and N⁢O−2N⁢O2−/N⁢O−3N⁢O3− were reported in lung sections and in the bronchoalveolar lavage (BAL) of patients with ALI and ARDS (219–223).

One main cause of ALI/ARDS is the excessive release of LPS during lung infection with gram-negative bacteria producing lung inflammation and edema (224). With a murine model of LPS-induced ALI, the implication of peroxynitrite-dependent protein nitration in the progression of the disease was evidenced (225). In subsequent studies, the activation of RhoA by the site-specific nitration of Y34 was shown. RhoA is a member of the small GTPase protein family, central regulators of endothelial barrier; its activation leads to the destabilization of the endothelial junctions and increase in the endothelial barrier permeability (226). Recently, another member of the GTPase protein family with activities opposite to that of RhoA (Rac1; facilitates the assembly and maintenance of endothelial adherent junctions) was also found site-specific nitrated at Y32 (227). In this scenario, the activation of RhoA and inactivation of Rac1 by nitration increase the endothelial barrier permeability and dysfunction in this LPS-challenged mouse model of ALI.

Finally, cAMP and cGMP, by activating PKA and PKG-Iα, respectively, can directly regulate the endothelial barrier by the phosphorylation of proteins responsible for cytoskeletal remodeling. Phosphodiesterase 3 (PDE-3) is a cGMP-cAMP-specific PDE that regulates cAMP-cGMP cross talk and is activated in chronic pathological lung conditions (228) Phosphorylation of PDE3 by PKG-Iα leads to enzyme inactivation preserving intracellular cAMP levels that are essential for the maintenance of a functional endothelial barrier (229). Recently, nitration at Y247 and inactivation of PKG-Iα by peroxynitrite in LPS-challenged mice was reported with an increase in PDE3 activity. The inhibition of PKG-Iα during ALI results in a decrease in cAMP levels leading to endothelial barrier dysfunction (230). Peroxynitrite generation was also implicated in chronic lung injury like chronic obstructive pulmonary disease (COPD). COPD is characterized by chronic airway inflammation and destruction of the lung parenchyma, resulting in emphysema and, in its severe forms, pulmonary hypertension (231). In a mouse model of induced emphysema by chronic tobacco smoke exposure the upregulation of iNOS at the vascular compartment was shown and that this overexpression‎ is essential for both smoke-induced pulmonary and lung emphysema development (232). Recently, the O2·− source for peroxynitrite generation in this model was demonstrated to be the upregulation of NOX organizer-1 protein (NOXO-1, essential for NOX1 activation) in epithelial type II cells but not in pulmonary arterial smooth muscle cells. NOXO-1 and iNOS colocalize at the vascular compartment in lung sections of smoke-exposed mice, and, more important, nitrotyrosine and NOXO-1 staining was also increased in human COPD lungs, consolidating the idea that peroxynitrite drives the development of smoke-induced emphysema and pulmonary hypertension (233).

11. REDOX-BASED THERAPIES TOWARD PEROXYNITRITE

Different redox-based approaches have been proposed to ameliorate cell/tissue injury caused by the increase in oxidant generation observed in different pathologies. Nevertheless, antioxidant therapy is often limited to inhibiting the disease progression in humans (see Ref. 234). Here, we focus on ongoing approaches to cope with pathogenic actions arising from the ·NO and O2·− reaction and the consequent formation of peroxynitrite.

The first line of redox-based intervention consists of the inhibition of formation of peroxynitrite by decreasing its precursors, ·NO and O2·−. Both NOS and NOX inhibitors have been shown to prevent peroxynitrite formation and attenuate oxidative damage (115, 235–238). A number of synthetic peptides and thioridazine derivatives have been reported for NOX inhibition. Among these, two pyrazolopyridine diones have been described as preferential inhibitors of NOX1 and NOX4 and may provide protective actions in a range of inflammatory and fibrotic disorders (239).

Nevertheless, a key redox-based strategy has been the use of agents that increase the expression‎ of specific enzymes and related molecules that enhance cell antioxidant capacity. Redox-sensitive transcription factors, including NF-κB, NRF2, and FOXO, are involved in the induction of antioxidant genes such as heme oxygenase 1 (HO1), SODs, glutamate-cysteine ligase (GCL), glutathione peroxidase 4 (GPx4), thioredoxin, and peroxiredoxins (240–242). Dietary polyphenols, selenium compounds, tea and cocoa extracts, and several vegetables and fruits can activate these transcription factors stimulating redox signaling, and some of these are in clinical trials (234). In the context of this review, the induction of SOD or peroxiredoxins will result in the decrease of peroxynitrite formation or actions, respectively.

One of the first selenium-containing compounds to be studied for redox-based therapies was ebselen [2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one], a GSH peroxidase mimetic that reacts fast with peroxynitrite catalyzing its reduction to N⁢O−2N⁢O2− and thus inhibits peroxynitrite-dependent oxidation and nitration reactions (243–245). Phenylselenol also reacts with peroxynitrite, and its oxidation product diphenyl diselenide can scavenge peroxynitrite-derived radicals (·OH, ·NO2, CO3·−) inhibiting protein tyrosine nitration (236, 246). Ebselen and other Se compounds, in addition to their direct reaction with peroxynitrite, also promote the induction of antioxidant enzymes such as peroxiredoxins and GPx through NRF2 and FOXO activation, representing a key mechanism for cellular peroxynitrite detoxification (245, 247). Other compounds able to catalyze the reduction of peroxynitrite to N⁢O−2N⁢O2− are the manganese porphyrins (MnPs) first reported as “SOD mimetics.” To promote the two-electron reduction of peroxynitrite to N⁢O−2N⁢O2−, these compounds need first to be reduced from Mn3+ to Mn2+, a reduction that can be achieved by complex I and II of the mitochondrial transport chain and different cellular reductants (248, 249). Importantly, MnPs showed high bioavailability in different cells and cellular organelles, reaching micromolar concentrations, and thus can compete reasonably well with other preferential peroxynitrite targets including CO2 (20, 250). Mitochondria can accumulate MnP, and the colocalization of the drug with mitochondrial reductants facilitates their function as catalytic antioxidants in the same compartment where peroxynitrite is being generated (251, 252). MnPs were found to exert strong protective effects against peroxynitrite-mediated cytotoxicity and have been successfully used in different pathophysiological conditions involving peroxynitrite generation such as models of vascular and neuronal degeneration, pain, inflammation, and sepsis (194, 205, 253, 254). The antioxidant capacity of MnPs depends not only on direct reactions with oxidants such as peroxynitrite but also on their ability to oxidatively modify protein thiols promoting reversible S-glutathionylation that can lead to the activation or inhibition of protein activities. In fact, this thiol signaling regulation has emerged as their major mechanism of action (250), underscoring the idea that redox-based pharmacology usually emerges from the modulation of several processes (i.e., redox modulation; see Refs. 234, 255). Among these targets, MnPs acting as prooxidants can catalyze the oxidation and inactivation of NF-κB p50 regulatory subunit (diminishing inflammation) and the activation of NRF2 with the upregulation of antioxidant enzymes (250, 256). At the extracellular milieu, where reduced substrates are low or absent, the relatively low SOD activity of MnP and other related metal-containing SOD mimetics can be beneficial, presumably by scavenging O2·− and also peroxynitrite (20, 234, 257).

Other molecules such as uric acid efficiently scavenge peroxynitrite-derived radicals. Peroxynitrite generation at the central nervous system by iNOS induction is a major factor in the pathogenesis of experimental allergic encephalomyelitis (EAE). Uric acid administration has therapeutic value in EAE even after the onset of clinical symptoms, with long-term survival rate (10, 258, 259). The mitochondrially targeted ubiquinol MitoQ [10-(4,5-dimethoxy-2-methyl-3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-yl)decyl]triphenylphosphonium methane sulfonate)] also reacts with peroxynitrite-derived radicals and thus will function as a site-specific directed antioxidant. Within mitochondria, the ubiquinone moiety of MitoQ is reduced by complex II to its active ubiquinol form, which protects mitochondria against oxidative damage (260). Substantial amounts of MitoQ can be administrated orally without toxicity, and it was shown that after administration MitoQ is rapidly cleared from plasma and accumulated in heart, brain, skeletal muscle, liver, and kidney (261). In a mouse model of ALS, MitoQ was administrated in the drinking water when early symptoms of neurodegeneration became evident (90 days of age until death). MitoQ treatment slowed the decline of mitochondrial function both in the spinal cord and in the quadriceps of the treated animals, reducing nitrotyrosine detection in mitochondria (262). Finally, other approaches for scavenging peroxynitrite-derived radicals are cell-permeable tyrosine-containing peptides. The induction of apoptosis in primary motor neurons and in PC12 cells following trophic factor deprivation (as described above) was linked with peroxynitrite production and an increase in nitrated Hsp90, supporting the participation of the peroxynitrite-derived radicals. Tyrosine-containing (but not phenylalanine containing) peptides were able to protect neurons from peroxynitrite-induced apoptosis by scavenging of ·NO2 and thus sparing Hsp90 from nitration and Fas-FasL-dependent apoptosis activation in motor neurons (214, 263).

11. 퍼옥시니트라이트를 향한 산화 환원 기반 치료법

다양한 병리학에서 관찰되는 산화제 생성 증가로 인한 세포/조직 손상을 개선하기 위해 다양한 산화 환원 기반 접근법이 제안되었습니다. 그럼에도 불구하고, 항산화 요법은 종종 인간의 질병 진행을 억제하는 데 국한됩니다(참조: Ref. 234). 여기서는 ·NO와 O2·− 반응으로 인해 발생하는 병원성 작용과 그에 따른 퍼옥시니트라이트 형성에 대처하기 위한 지속적인 접근법에 초점을 맞춥니다.

산화 환원 기반 중재의 첫 번째 단계는 전구체인 ·NO와 O2·−의 양을 줄임으로써 퍼옥시니트라이트의 형성을 억제하는 것입니다. NOS와 NOX 억제제는 모두 퍼옥시니트라이트의 형성을 방지하고 산화 손상을 완화하는 것으로 나타났습니다(115, 235-238). NOX 억제를 위해 여러 합성 펩타이드와 티오리다진 유도체가 보고되었습니다. 그 중에서도 두 가지 피라졸로피리딘 디온은 NOX1과 NOX4의 우선 억제제로서 설명되어 왔으며, 다양한 염증성 및 섬유화 장애에 대한 보호 작용을 제공할 수 있습니다(239).

그럼에도 불구하고, 주요한 산화 환원 기반 전략은 세포의 항산화 능력을 강화하는 특정 효소와 관련 분자의 발현을 증가시키는 약제를 사용하는 것입니다. NF-κB, NRF2, FOXO를 포함한 산화 환원 민감 전사 인자는 헴 산소화 효소 1(HO1), SOD, 글루타메이트-시스테인 리가제(GCL), 글루타티온 퍼옥시다제 4(GPx4), 티오레독신, 퍼옥시레독신(240-242)과 같은 항산화 유전자 유도에 관여합니다. 식이성 폴리페놀, 셀레늄 화합물, 차와 코코아 추출물, 그리고 여러 가지 채소와 과일들이 이러한 전사 인자를 활성화시켜 산화 환원 신호를 자극할 수 있으며, 그 중 일부는 임상 시험에 사용되고 있습니다(234). 이 리뷰의 맥락에서, SOD 또는 퍼옥시레독신의 유도는 각각 퍼옥시니트라이트의 형성 또는 작용을 감소시킵니다.

산화 환원 기반 치료법에 대해 연구된 최초의 셀레늄 함유 화합물 중 하나는 엡셀렌[2-페닐-1,2-벤지소셀레나졸-3(2H)-온]입니다. 퍼옥시니트라이트와 빠르게 반응하여 퍼옥시니트라이트의 환원을 촉매하는 GSH 과산화효소 모방체로서, N⁢O−2N⁢O2−로의 환원을 촉진함으로써 퍼옥시니트라이트 의존성 산화 및 니트로화 반응을 억제합니다(243-245). 페닐셀레놀은 또한 퍼옥시니트라이트와 반응하며, 그 산화 생성물인 디페닐디셀레나이드(diphenyl diselenide)는 퍼옥시니트라이트에서 유래된 라디칼(·OH, ·NO2, CO3·−)을 제거하여 단백질 티로신 니트로화(236, 246)를 억제할 수 있습니다. 에브셀렌과 다른 Se 화합물은 퍼옥시니트라이트와의 직접적인 반응 외에도 NRF2와 FOXO 활성화를 통해 퍼옥시리데옥신과 GPx와 같은 항산화 효소의 유도를 촉진하여 세포 내 퍼옥시니트라이트 해독의 핵심 메커니즘을 나타냅니다(245, 247). 퍼옥시니트라이트를 N⁢O−2N⁢O2−로 환원시키는 촉매 작용을 할 수 있는 다른 화합물로는 “SOD 모방체”로 처음 보고된 망간 포르피린(MnPs)이 있습니다. 퍼옥시니트라이트의 2전자 환원을 촉진하기 위해서는 먼저 이 화합물을 Mn3+에서 Mn2+로 환원해야 하는데, 미토콘드리아 수송 사슬의 복합체 I과 II, 그리고 다양한 세포 환원제를 통해 이 환원을 달성할 수 있습니다(248, 249). 중요한 것은, MnP가 다양한 세포와 세포 소기관에서 높은 생체 이용률을 보였으며, 마이크로몰 농도에 도달했다는 점입니다. 따라서, CO2(20, 250)를 포함한 다른 우선적인 퍼옥시니트라이트 표적과 상당히 잘 경쟁할 수 있습니다. 미토콘드리아는 MnP를 축적할 수 있으며, 약물과 미토콘드리아 환원제의 공동 배치는 퍼옥시니트라이트가 생성되는 동일한 구획에서 촉매 항산화제로서의 기능을 촉진합니다(251, 252). MnPs는 퍼옥시니트라이트 매개 세포 독성에 대해 강력한 보호 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌으며, 혈관 및 신경 변성, 통증, 염증, 패혈증과 같은 퍼옥시니트라이트 생성과 관련된 다양한 병태 생리학적 조건에서 성공적으로 사용되었습니다(194, 205, 253, 254). MnPs의 항산화 능력은 퍼옥시니트라이트와 같은 산화제와 직접 반응하는 능력뿐만 아니라 단백질 티올을 산화적으로 변형시켜 가역적인 S-글루타티온화를 촉진하는 능력에 따라 달라지며, 이는 단백질 활성의 활성화 또는 억제로 이어질 수 있습니다. 사실, 이 티올 신호 조절은 그들의 주요 작용 기전으로 부상했습니다(250). 이는 산화-환원 기반 약리학이 일반적으로 여러 과정의 조절에서 비롯된다는 생각을 강조합니다(즉, 산화-환원 조절; 참고 문헌 234, 255 참조). 이 목표들 중에서도, 산화 촉진제 역할을 하는 MnPs는 NF-κB p50 조절 소단위(염증 감소)의 산화 및 비활성화와 항산화 효소의 상향 조절을 통한 NRF2의 활성화를 촉진할 수 있습니다(250, 256). 환원성 기질이 적거나 없는 세포외 환경에서는, MnP와 다른 관련 금속 함유 SOD 모방체의 상대적으로 낮은 SOD 활성이 유익할 수 있는데, 아마도 O2·-와 퍼옥시니트라이트(20, 234, 257)를 제거함으로써 유익할 수 있습니다.

요산과 같은 다른 분자들은 퍼옥시니트라이트에서 유래된 라디칼을 효율적으로 제거합니다. iNOS 유도에 의한 중추신경계에서의 퍼옥시니트라이트 생성은 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 발병 기전에서 중요한 요소입니다. 요산 투여는 임상 증상이 발현된 후에도 EAE에 치료 효과가 있으며, 장기 생존율도 높습니다(10, 258, 259). 미토콘드리아를 표적으로 하는 유비퀴놀 MitoQ [10-(4,5-dimethoxy-2-methyl-3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-yl)decyl]triphenylphosphonium methane sulfonate)]도 퍼옥시니트라이트에서 유래된 라디칼과 반응하기 때문에 특정 부위를 표적으로 하는 항산화제로 작용할 수 있습니다. 미토콘드리아 내에서, MitoQ의 유비퀴논 부분은 복합체 II에 의해 활성 유비퀴놀 형태로 환원되어, 산화적 손상으로부터 미토콘드리아를 보호합니다(260). 상당한 양의 MitoQ를 독성 없이 경구 투여할 수 있으며, 투여 후 MitoQ가 혈장에서 빠르게 제거되고 심장, 뇌, 골격근, 간, 신장에 축적된다는 사실이 밝혀졌습니다(261). ALS 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 장애의 초기 증상이 뚜렷하게 나타난 시기(생후 90일~사망)에 미토큐를 식수에 투여했습니다. 미토큐 치료는 치료된 동물의 척수와 대퇴사두근에서 미토콘드리아 기능의 감소를 늦추고, 미토콘드리아에서 니트로티로신 검출을 감소시켰습니다(262). 마지막으로, 퍼옥시니트라이트에서 파생된 라디칼을 제거하는 다른 접근법은 세포 투과성 티로신 함유 펩티드입니다. 위에서 설명한 바와 같이 영양 인자 결핍 후 1차 운동 뉴런과 PC12 세포에서 아폽토시스가 유도된 것은 퍼옥시니트라이트 생성 및 니트로화 Hsp90의 증가와 관련이 있으며, 이는 퍼옥시니트라이트에서 파생된 라디칼의 참여를 뒷받침합니다. 티로신(페닐알라닌은 제외)을 함유한 펩티드는 ·NO2를 제거함으로써 퍼옥시니트라이트에 의한 아폽토시스를 막아 신경세포를 보호할 수 있었고, 따라서 운동신경세포에서 Hsp90의 질화와 Fas-FasL 의존성 아폽토시스 활성화가 억제되었습니다(214, 263).

12. CONCLUSIONS AND FUTURE PERSPECTIVES

Three decades have passed since the initial proposals on the role of peroxynitrite in human physiology and pathology were postulated (1, 3, 128, 129). It was in the 1990s that different laboratories worldwide laboriously worked toward the demonstration that the biochemistry behind the O2·− reaction with ·NO and the formation of peroxynitrite was relevant in redox biology and medicine. This progress on the role of the ·NO/O2·− interactions and peroxynitrite in human physiology and medicine was nicely assembled in an authoritative manuscript in Physiological Reviews in 2007 (11). The present review also assists in conceptually reexamining the paradigmatic designation of ·NO, O2·−, and peroxynitrite as “the good, the bad, and the ugly” as originally quoted by J. S. Beckman and W. Koppenol (264), expanding the role of these interactions to redox homeostasis and cell signaling processes.

Much of the difficulty has lain in the challenges of the unambiguous detection and quantitation of peroxynitrite, its derivatives, and biologically relevant reaction products (e.g., 3-nitrotyrosine), the existence of competing and confounding reaction chemistries, and the hard-to-establish direct connections between peroxynitrite formation and observed biological impacts.

At this point, a minimum set of necessary conditions to establish this connection can be defined: 1) the dependence of O2·− and ·NO production; 2) the direct detection of peroxynitrite or some of its biomarkers; and 3) the reversal of both peroxynitrite detection and altered phenotype by the use of appropriate pharmacological or genetics-based interventions on the ·NO, O2·−, and peroxynitrite pathway. These three conditions can be complemented with others such as the recapitulation of the pathologic phenotype by exogenous supply of peroxynitrite or its precursors. The following are selected references that can be used as a guide for accomplishing most or all of the recommended conditions: Refs. 25, 26, 108, 115, 193, 205, 253, 262, 265–267.

Thus, the present contribution has revisited the 2007 review, aiming to provide an updated view on how O2·− can switch the biochemistry of ·NO toward the formation of peroxynitrite and the impact of this process in human physiology and pathology. A recent review focusing on the biological chemistry of peroxynitrite has been published elsewhere (10). Here, we have underscored new methodological advances and biological insights at the physiological and pathological levels that will hopefully stimulate further research; in particular, at this time of maturity of the field, it is central to assess possible interventions in the peroxynitrite reaction and signaling pathways that may serve as therapeutics in a variety of human disease conditions.

12. 결론과 미래 전망

인체 생리학 및 병리학에서 퍼옥시니트라이트의 역할에 대한 초기 제안이 제기된 지 30년이 지났습니다(1, 3, 128, 129). 1990년대에는 전 세계의 여러 연구실에서 O2·−와 ·NO의 반응과 퍼옥시니트라이트의 형성이 산화 환원 생물학과 의학에 관련이 있다는 것을 증명하기 위해 열심히 노력했습니다. ·NO/O2·− 상호 작용과 퍼옥시니트라이트가 인간 생리학과 의학에 미치는 영향에 대한 이러한 진전은 2007년 Physiological Reviews(11)의 권위 있는 원고에 잘 정리되어 있습니다. 현재의 검토는 또한 J. S. Beckman과 W. Koppenol(264)이 처음 인용한 바와 같이 ·NO, O2·−, 퍼옥시니트라이트를 “좋은 것, 나쁜 것, 못생긴 것”으로 개념적으로 재검토하는 데 도움이 되며, 이러한 상호작용의 역할을 산화 환원 항상성 및 세포 신호 전달 과정으로 확장합니다.

퍼옥시니트라이트, 그 유도체, 생물학적으로 관련된 반응 산물(예: 3-니트로티로신)을 명확하게 감지하고 정량화하는 것, 경쟁적이고 혼란스러운 반응 화학 반응의 존재, 퍼옥시니트라이트 형성 및 관찰된 생물학적 영향 사이의 직접적인 연관성을 확립하기 어려운 것 등이 많은 어려움을 야기했습니다.

이 시점에서, 이 연결을 확립하기 위한 최소한의 필요 조건을 정의할 수 있습니다: 1) O2·-와 ·NO 생성의 의존성; 2) 퍼옥시니트라이트 또는 그 일부 생체지표의 직접적인 검출; 그리고 3) ·NO, O2·-, 그리고 퍼옥시니트라이트 경로에 대한 적절한 약리학적 또는 유전학 기반의 개입을 통해 퍼옥시니트라이트 검출과 변형된 표현형의 역전. 이 세 가지 조건은 퍼옥시니트라이트 또는 그 전구물질의 외인성 공급에 의한 병리학적 표현형의 재현과 같은 다른 조건으로 보완될 수 있습니다. 다음은 권장 조건의 대부분 또는 전부를 달성하는 데 참고할 수 있는 참고 문헌입니다: Refs. 25, 26, 108, 115, 193, 205, 253, 262, 265–267.

따라서, 본 논문은 2007년 논문을 다시 검토하여 O2·−가 ·NO의 생화학을 어떻게 전환하여 퍼옥시니트라이트를 형성하는지에 대한 최신 견해를 제공하고, 이 과정이 인간의 생리학 및 병리학에 미치는 영향에 대해 설명하고자 합니다. 퍼옥시니트라이트의 생화학에 초점을 맞춘 최근의 리뷰가 다른 곳에서 발표되었습니다(10). 여기에서는 새로운 방법론적 진보와 생리학적, 병리학적 수준에서의 생물학적 통찰을 강조하여, 향후 연구에 자극이 되기를 바랍니다. 특히, 이 분야가 성숙기에 접어든 지금, 퍼옥시니트라이트 반응과 신호 전달 경로에 개입할 수 있는 가능성을 평가하는 것이 다양한 인간 질병의 치료제로 작용할 수 있는 핵심입니다.

GRANTS

This work was supported by grants from Universidad de la República: Espacio Interdisciplinario (to R.R.), Comisión Sectorial de Investigación Científica, I+D-2017 and I+D-2020 (to L.P.), I+D-2020 (to M.T.), and Grupos 2018 (to R.R.). Additional support was obtained from Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay), Sistema Nacional de Investigadores (SNI, Uruguay), and Centro de Biología Estructural del Mercosur (CeBEM).

DISCLOSURES

No conflicts of interest, financial or otherwise, are declared by the authors.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

A.Z. prepared figures; L.P., A.Z., M.T., and R.R. drafted manuscript; L.P., M.T., and R.R. edited and revised manuscript; L.P., A.Z., M.T., and R.R. approved final version of manuscript.

ACKNOWLEDGMENTS

FIGURE 1 and FIGURES 3–6 were created with permission by Biorender.com.

FOOTNOTES

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