7월18일 워크숍4 - 백종희(크래마토그래피)

[임성숙]

Ⅰ. 크로마토그래피 실험

관련 교육과정

중학교 2학년 물질의 특성 – 혼합물의 분리 : 사인펜 잉크분리 실험-성분물질이 용매를 따라 이동하는 속도 차이를 이용하여 혼합물을 분리

고등학교 생명과학2, 고급생명과학 – 광합성, 물질대사 : 광합성 색소의 종류와 특징

– 광합성 색소의 기능과 특성

2. 교과서에 안내된 대로 따라해보는 실험이 아닌 창의적 실험을 위한 아이디어

1) 중학교 수준 : 크로마토그래피의 과학적 원리를 실험을 통해 알아보는 비교 실험

- 유성사인펜과 수성사인펜의 색소

- 전개용매로 물과 유기용매(에탄올, 석유에테르와 아세톤 혼합액) 비교

- 식용 황색과 녹색색소를 종이크로마토그래피로 성분 분석을 하기 위한 실험 설계

2) 고등학교 식물잎색소 크로마토그래피 분리 실험

■ 현재 교과서에 나온 실험 방법의 문제점을 찾아보고 개선 아이디어 도출해보기

- 건강에 해를 끼칠 수 있는 아세톤, 석유에테르의 사용량을 최소화하거나 보다 안전한 대체 가능 전개액 찾기.

- 막자사발보다 사용하기 쉽고 뒷처리가 편리한 실험 도구 찾기

■ 보다 진한 식물잎 색소 추출을 위해 잎을 막자사발에 넣고 분쇄할 때 아무것도 안넣고 갈기, 물을 조금 넣고 갈기, 에탄올또는 아세톤 조금 넣고 갈기 중 어떻게 갈아야 진한 원점을 쉽게 찍을 수 있는지, 그리고 그 이유는?

■ 식물잎을 직접 갈아서 / 식물잎 분말을 이용, 어느 것이 결과가 잘 나올까?

■ 결과 차이가 있다면 그 이유는?

■ 보다 진한 원점을 찍기 위해 식물잎을 막자사발에 넣고 갈 때 식물세포가 물리적으로 잘 분쇄되기 위해 무엇을 함께 넣고 갈면 좋을까?

■ 생녹차잎과 시중에 파는 녹차가루의 크로마토그래피 결과는 같을까?

■ 막자사발을 이용한 식물잎 분쇄가 여러 가지로 번거로운 점이 많은데 마이크로튜브와 같은 1회용 도구를 이용하여 보다 쉽게 할 수 있는 방법 설계해보기.

■ 식물잎이나 그 분쇄액에 자외선을 비추면 어떤 반응이 나타나며 그 이유는?

■ 크로마토그래피 결과물에 자외선을 비추면 어떤 반응이 나타나며 그 이유는?

■ 청상추와 적상추를 크로마토그래피하면 어떤 결과가 나올까?

3. 이론적 기초

1) 크로마토그래피(Chromatography)란?

크로마토그래피(Chromatography)는 미량의 혼합물에서 각 성분 물질마다 고정상(정지해 있는 것으로 종이 또는 TLC판)과 이동상(움직이는 것으로 전개액)에서의 친화력의 차이로 각 성분 물질의 이동 속도의 차이로 혼합물을 분리하는 방법.

2) 크로마토그래피의 두 가지 '상 (Phase)'

크로마토그래피 시스템은 항상 고정된 물질과 흐르는 물질, 두 가지로 구성.

고정상 (Stationary Phase): 자리에 고정되어 움직이지 않는 상으로 종이 크로마토그래피의 종이(셀룰로오스), TLC의 실리카겔 판, 관(Column) 크로마토그래피 내부의 충진물 등으로 성분 물질들을 붙잡아 두려는 역할.

이동상 (Mobile Phase): 고정상을 따라 일정하게 흘러가는 기체나 액체(용매). 성분 물질들을 이동시키려는 역할.

3) 분배와 흡착 (Partition & Adsorption)

혼합물 속 성분 물질들은 고정상에 머무르려고도 하고, 이동상을 따라 움직이려고도 하는데 이때 물질마다 고정상과 이동상을 향한 '인력(친화도)의 크기'가 다름.

이동상과 친화력이 큰 물질: 이동상에 잘 녹거나 잘 결합하는 물질은 고정상을 빠르게 스쳐 지나갑니다. 따라서 이동 속도가 빠름.

고정상과 친화력이 큰 물질: 고정상 표면에 강하게 흡착되거나 고정상 내부에 잘 머무르는 물질은 이동 속도가 느림.

4) 분리 메커니즘을 결정하는 화학적 요인

성분 물질들이 고정상과 이동상에 대해 서로 다른 친화도를 갖게 되는 과학적 원리

① 극성 (Polarity): 가장 대표적인 원리로 고정상이 극성(예: 실리카겔)이고 이동상이 비극성 용매라면, 혼합물 중 극성이 강한 물질은 극성 고정상과 강하게 결합해 천천히 가고, 비극성 물질은 이동상을 따라 빠르게 올라감.

② 분자량 및 크기 (Size): 고정상의 미세한 구멍(pore) 크기에 따라, 크기가 작은 분자는 구멍 깊숙이 들어가 돌아서 나오느라 늦게 이동하고, 크기가 큰 분자는 구멍에 들어가지 못해 이동상을 따라 빠르게 빠져나옴 (크기 배제 크로마토그래피의 원리).

③ 전하 (Charge): 물질이 띠고 있는 정전기적 전하 차이를 이용해 반대 전하를 띤 고정상과의 결합력 차이로 분리합니다 (이온 교환 크로마토그래피).

④ 정량적 지표: 전개율(Rf값)

크로마토그래피 결과를 과학적으로 비교하고 물질을 확인하기 위해 전개율(Retention factor)이라는 수치를 사용.

⑤ 전개율(Rf)=원점으로부터 성분물질이 이동한 거리/원점으로부터 전개액(이동상)이 이동한 거리

5) 크로마토그래피가 필터페이퍼보다 tlc가 잘되는 이유

종이 크로마토그래피(Paper Chromatography)보다 TLC(박층 크로마토그래피, Thin Layer Chromatography)의 분리 효율이 훨씬 더 좋은 이유는 고정상(정지상)의 물질 구조와 성질 차이

-고정상 입자의 크기가 훨씬 작고 균일

TLC:알루미늄이나 유리판 위에 매우 미세하고 균일한 실리카겔(Silica gel)이나 알루미나(Alumina) 입자를 얇게 코팅하여 입자가 작을수록 표면적이 극대화되어 시료와의 흡착·탈착 반응이 잘 일어남.

종이(필터페이퍼):천연 섬유소(Cellulose) 섬유가 엉켜 있는 구조로 섬유 사이의 틈과 기공이 실리카겔 입자에 비해 훨씬 크고 불규칙.

-분리 메커니즘의 차이 (흡착 vs 분배)

TLC (흡착 크로마토그래피):실리카겔 표면의 강한 극성 성질을 이용해 시료가 표면에 직접 붙고 떨어지는 '흡착(Adsorption)'메커니즘으로 물질의 극성 차이로 예리하게 구분.

종이 (분배 크로마토그래피):종이 섬유 자체 구조가 아니라, 섬유 조직 사이에 흡수되어 있는 '물(수분)'이 고정상 역할을 하여 이동상(유기용매)과 고정상(물)이라는 두 액체 사이에서 물질이 얼마나 잘 녹는가 하는 '분배(Partition)'메커니즘을 따르기 때문에 퍼짐 현상이 더 심하고 경계가 흐릿.

- 모세관 현상의 속도가 빠르고 일정.

TLC는 미세한 입자들이 촘촘하게 밀착되어 있어 모세관 현상이 빠르고 일정하게일어납니다. 덕분에 용매가 올라가면서 시료 반점(Spot)이 사방으로 퍼지는 '확산 현상'이 일어날 시간이 짧음.

반면, 종이는 용매가 올라가는 속도가 상대적으로 느리고 섬유 결을 따라 불규칙하게 이동하기 때문에 반점이 옆으로 넓게 번지며 꼬리가 생기는 현상(Tailing)이 자주 발생.

- TLC는 고정상 입자가 훨씬 작고 균일하여 표면적이 넓고, 용매가 빠르게 이동하기 때문에 반점이 번지지 않고 칼로 자른 듯 선명하게 분리되므로 실험실에서는 분석 속도가 빠르고 해상도가 높은 TLC를 많이 사용.