꿀벌의 세대간 면역 프라이밍 (논문)

[꿀벌나라]

trans-generational immune primingin honeybees 

꿀벌의 세대간 면역 프라이밍(준비)

(저자)

Javier Hernández López

Wolfgang Schuehly

Karl Crailsheim

Published:22 June 2014https://doi.org/10.1098/rspb.2014.0454

출판 날짜 : 2014 년 6 월 22 일 https://doi.org/10.1098/rspb.2014.0454

Maternal immune experience acquired during pathogen exposure and passed on to progeny to enhance resistance to

infection is called trans-generational immune priming (TgIP). In eusocial insects like honeybees, TgIP would result in a

significant improvement of health at individual and colony level.

병원체에 노출되는 동안 취득한 모체의 면역 경험이 전염병에 대한 내성을 강화하기 위해 자손에게 물려주는

것을 세대간 면역 프라이밍 (TgIP)이라고 한다.  꿀벌과 같은 진사회적 곤충에서, TgIP는 개체 및 봉군 수준에서

건강을 상당하게 향상시킨다.

Demonstrated in invertebrates other than honeybees, TgIP has not yet been fully elucidated in terms of intensity and

molecular mechanisms underlying this response.  Here, we immune-stimulated honeybee queens with Paenibacillus

larvae (Pl), a spore-forming bacterium causing American Foulbrood, the most deadly bee brood disease worldwide.

꿀벌 이외의 무척추 동물에서 입증된, TgIP는 이 반응의 기초가 되는 강도 및 분자 메커니즘 측면에서 아직

완전히 밝혀지지 않았다.  여기에서, 우리는 전 세계적으로 가장 치명적인 꿀벌 유충 질병인 미국 부저병을

유발하는 포자 형성 박테리아인 패니바실루스 유생 (Pl)으로 꿀벌 여왕벌을 면역 자극했다.

Subsequently, offspring of stimulated queens were exposed to spores of Pl and mortality rates were measured to

eval‎uate maternal transfer of immunity. Our data substantiate the existence of TgIP effects in honeybees by direct

eval‎uation of offspring resistance to bacterial infection.

그 후에, 자극받은 여왕벌의 자손을 Pl의 포자에 노출 시켰고, 모체의 면역 전달을 평가하기 위해 사망률을

측정했다. 우리의 데이터는 박테리아 감염에 대한 자손 저항성을 직접 평가하여 꿀벌에서 TgIP 효과의

존재를 입증한다.

A further aspect of this study was to investigate a potential correlation between immune priming responses and

prohaemocytes–haemocyte differentiation processes in larvae. The results point out that a priming effect triggers

differentiation of prohaemocytes to haemocytes.

이 연구의 또 다른 측면은 유충에서 면역 프라이밍 반응과 전혈구(前血球) 혈액세포(prohaemocytes-

haemocyte) 분화 과정 사이의 잠재적인 상호관계를 조사하는 것이었다.  그 결과는 프리밍 효과가

혈액세포에 대한 전혈구의 분화를 유발한다는 것을 밝힌다.

However, the mechanisms underlying TgIP responses are still elusive and require future investigation.

그러나, TgIP 대응의 기초가 되는 메커니즘은 파악하기 어렵고 향후 조사가 필요하다

1. Introduction

   소개

Recent studies involving different species of insects have expanded the knowledge of immunology in invertebrates,

but also increased the understanding of its limits [1–7].

다른 종의 곤충을 포함하는 최근의 연구는 무척추동물에서 면역학의 지식을 넓혔지만, 그 한계에 대한

이해도 증가시켰다[1-7].

Invertebrates were previously believed to rely purely on their innate defences to combat infections [8], and specificity or

memory of immune responses were previously considered the hallmark of a highly evolved immune system, only present

in vertebrates.

무척추 동물은 이전에 감염과 싸우기 위해 선천적인 방어에 순전히 의존하는 것으로 믿어졌고 [8], 면역 반응

의 특이성 또는 기억은 이전에는 척추 동물에만 존재하는 고도로 진화된 면역 체계의 특징으로 간주되었다.

Research, however, has revealed that the immune system of invertebrates shares several homologies with that of

vertebrates [9–12]. Although the invertebrate immune system lacks lymphocytes and functional immunoglobulins, an

increasing number of studies cite induced immune responses in invertebrates which in some cases indicate specificity

[13,14]. 

그러나 연구에 따르면, 무척추 동물의 면역 체계는 척추 동물의 면역 체계와 몇 가지 상동관계를 공유

한다고 밝혀졌다 [9-12]. 무척추 동물 면역체계는 림프구와 기능성 면역 글로불린 항체가 부족하지만, 점점

더 많은 연구에서 무척추 동물에서 유도 면역 반응을 인용하는데 어떤 경우는 특이성을 나타낸다[13,14]..

Other studies have identified haemocytes to be responsible for the specificity of these responses. Cumulatively, these

studies show that encounters with a pathogen can enhance the phagocytic activity of haemocytes and mediate

specificity in immune protection [15–18].

다른 연구에서는 이러한 반응의 특이성을 담당하는 혈구(혈액세포)를 확인했다. 누적 적으로, 이러한 연구는

병원체와의 만남이 혈구의 식세포 활동을 향상시키고 면역 보호의 특이성을 매개할 수 있음을 보여준다

[15-18].

Moreover, maternal immune experience has been demonstrated to be transmitted to progeny and may therefore have

a positive impact on offspring resistance and survival of infections.

더욱이, 모성 면역 경험은 자손에게 전하는 것으로 입증되어 자손 저항성과 감염 생존에 긍정적인 영향을 줄

수 있다.

This phenomenon of trans-generational immune priming (TgIP) has been reported in both vertebrates [19,20] and

invertebrates [21–27]. Nevertheless, the magnitude of this response and the underlying molecular mechanisms are still

poorly understood in invertebrates.

세대간 면역 프라이밍 (TgIP) 현상은 척추 동물 [19,20]과 무척추 동물 [21-27] 모두에서 보고되었다. 그럼에도

불구하고,이 반응의 크기와 근본적인 분자 메커니즘은 무척추 동물에서 여전히 잘 이해되지 않는다.

Honeybees are social insects, forming colonies composed of up to 50 000 individuals or more, residing in a minimal

space that offers ideal conditions for the transmission of pathogens and parasites [28]. They show high levels of sociability

and physical contact between individuals and environmental homeostasis inside the colony is highly controlled.

꿀벌은 사회적인 곤충으로, 최대 5만 명 이상의 개체로 구성된 봉군을 형성하며, 병원균과 기생충의 전염을

위한 이상적인 조건을 제공하는 최소 공간에 거주한다 [28]. 그들은 높은 수준의 사교성과 개체 간의 신체적

접촉을 보여 주며 봉군 내부의 환경적인 생체 항상성은 고도로 통제된다.

Offspring are likely to face the same pathogen pressures as queens and could benefit from TgIP effects. In such an

environment, the mother queen, upon immunological encounter with a pathogen, could influence the immunity of direct

progeny, thus increasing resistance to current infection in the colony.

자손은 여왕벌과 동일한 병원균 압력에 직면할 수 있으며 TgIP 효과로 부터 이익을 얻을 수 있다. 그러한 환경

에서, 어미 여왕벌은 병원체와 면역학적으로 만났을 때 직접 자손의 면역에 영향을 줄 수 있으며, 따라서 봉군의

현재 감염에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다.

Here, we investigated the occurrence of TgIP in honeybees by immune-challenging queens with heat-killed bacteria of

Paenibacillus larvae (Pl), causative agent of American foulbrood (AFB) [29] and exposing their first instar larvae to Pl spores.

AFB is considered to be the most threatening bacterial disease of honeybee brood.

여기에서, 우리는 미국 부저병 (AFB) [29]의 원인균인, 패니바실루스 유생 (Pl)의 열-사멸 박테리아를 가진

면역 활동을 일으키는 여왕벌에 의해 꿀벌에서 TgIP(세대간 면역 프라이싱)의 발생을 조사하였고 그들의 1일령

유충을 Pl 포자에 노출시켰다. AFB는 꿀벌 유충의 가장 위협적인 세균성 질병으로 간주된다.

주) immune-challenging 는 새로 우리말로 생성해야 하는데 뜻을 풀어서 해석합니다

challenge [의학] 공격: 생체에 항원 · 병원균을 투여하여 면역 활동을 일으키기.

The spores represent Pl's infectious stage and adult honeybees, which are resistant to infection, serve as vectors within and

between colonies, delivering spores to the brood while nursing [30]. During the summers of 2011 and 2012, we conducted

a series of experiments to address the existence of TgIP, eval‎uated the magnitude of such a response and quantified changes

in haemocyte populations in honeybee larvae.

포자는 Pl의 감염 단계를 나타내며, 감염에 내성이있는 성봉은 봉군 내부와 봉군 사이에서 매개체로 역할을 하여,

먹이를 주는 동안 포자를 유충에게 전달한다 [30]. 2011 년과 2012 년 여름 동안, 우리는 TgIP의 존재를 다루기

위해 일련의 실험을 수행하고, 그러한 반응의 크기를 평가하고 꿀벌 유충의 혈구 개체수 변화를 정량화했다.

To the best of our knowledge, for the first time a TgIP effect is demonstrated in honeybees by directly assessing the mortality

rate of artificially infected offspring of immune-challenged queens.

우리가 아는 한, 면역에 도전한 여왕벌의 인위적으로 감염된 자손의 사망률을 직접 평가함으로써 꿀벌에서 TgIP

효과가 처음으로 입증되었다.

2. Material and methods(a) Insects, bacteria and spore suspensions

  재료 및 방법 (a) 곤충, 박테리아 및 포자 현탁액

All honeybees used in our study belong to Apis mellifera subsp. carnica and were kept in the garden apiary of the Karl-Franzens

University of Graz under normal living conditions. For initial dose-finding experiments that were carried out to determine the

required spore dose for infection, offspring from queens of regular colonies (named full colonies) were used.

우리 연구에 사용된 모든 꿀벌은 서양종 꿀벌 아종에 속한다. 카니카 벌은 정상적인 생활 조건에서 가라즈의

칼-프란젠스 대학의 정원 양봉장에 보관되었다. 감염에 필요한 포자 용량을 결정하기 위해 수행된 초기 용량

찾기 실험의 경우, 표준적인 봉군의 여왕벌 (전체 봉군이라고 함)의 자손이 사용되었다.

For trans-generational experiments, we used colonies kept in small polystyrene chambers composed of ca 1000–2000

individuals each headed by one young naturally multi-mated queen (nucleus colonies). During this study, our goal was

to work with colonies as unrelated as possible in order to assure genetic variability of queens.

세대간 실험을 위해, 우리는 각각 한 마리의 젊은 자연적으로 많은 작짓기를 한 여왕벌 (핵군)이 이끄는 약

1000 ~ 2000 마리의 개체로 구성된 작은 폴리스치렌 상자에 보관된 봉군을 사용했다. 이 연구를 하는 동안,

우리의 목표는 여왕벌의 유전적 다양성을 보장하기 위해 가능한 관련이 없는 봉군과 작업하는 것이었다.

trans-generational experiments, queens were randomly assigned to one of the following two treatments: challenge with ringer

(injected with ringer solution) or challenge with heat-killed Pl bacteria (injected with heat-killed Pl bacteria). The experimenta

l set-up of the experiments carried out in 2011 and 2012 is summarized in table 1.

세대간 실험에서, 여왕벌은 다음 두 가지 처리 중 하나에 무작위로 배정되었다 : 링거 (링거 용액으로 주입) 또는

열 사멸 패니바실루스 유생 박테리아 (열 사멸 Pl 박테리아로 주입)로 면역 검사. 2011년과 2012년에

수행된 실험의 실험적인 설정은 표 1에 요약되었다

In summer 2011, Pl genotype Eric II (strain CCUG 48972) was used in our experiments and in summer 2012, Pl genotype Eric II

(strain 233/00) was used [31,32]. Owing to the small size of the colonies used for the priming experiments, which makes a

successful overwintering impossible, all colonies were discarded at the end of summer.

2011년 여름에, 패니바실루스 유생 유전자형 Eric II (변종 CCUG 48972)가 실험에 사용되었고 2012년 여름에는,

패니바실루스 유생 유전자형 Eric II (변종 233/00)가 사용되었다 [31,32]. 프라이밍 실험에 사용된 봉군의 크기가

작아서, 성공적인 월동이 불가능하게 되었기 때문에, 모든 봉군은 여름이 끝날 때 폐기 되었다.

Table 1.

표 1

Summary table, including experimental design, colonies, cumulative mortality at day 12, number of larvae and replicates

. (Numbers in parenthesis refer to larvae used for each experiment and replicates.)

실험 설계, 봉군, 12일째 누적 사망률, 유충 수 및 복제 수를 포함한, 요약표. (괄호 안의 숫자는 각 실험과

복제에 사용된 유충을 가르킨다.) 

Table 1.Summary table, including experimental design, colonies, cumulative mortality at day 12, number of larvae and

replicates. (Numbers in parenthesis refer to larvae used for each experiment and replicates.) Collapse cumulative mortality

at day 12 (number of larvae and replicates per colony)post-challenge (%)pre-challenge (%)ringerheat-killed Pl

표 1. 실험 설계, 봉군, 12일째 누적 사망률, 유충 및 복제 수를 포함한 요약표. (괄호 안의 숫자는 각 실험 및

복제에 사용된 유충을 나타낸다.) 12일째 누적 사망률 (유충 수 및 봉군 당 복제 수) 면역 검사 후 (%)

면역 검사 전 (%) 링거 열로 죽인 Pl

2011	nucleus colonies	11–1	72.9 (48)	65.1 (48/48/48/48)	—
		11–2	66.7 (48)	—	38.2 (48/48/48)
		11–3	68.7 (48)	—	40.3 (48/48/48)
	full colonies	Hive-20sp	64.6 (48/48)	—	—
2012	nucleus colonies	12–1	54.2 (48/48)	50.7 (48/48/48)	—
		12–2	51 (48/48)	47.9 (48/48/48)	—
		12–3	45.8 (48/48)	—	27.3 (47/43/20)
		12–4	52.1 (48/48)	—	29.9 (48/48/48)
		12–5	45.8 (48/48)	—	19.4 (48/48/48)
		12–6	44.8 (48/48)	—	17.5 (48/48/47)
	full colonies	Hive-20sp	56.2 (48/48)	—	—

Typing of different strains of Pl led to the description of four different genotypes (Eric I, II, III and IV), of which Eric I and Eric II

are associated with classical AFB outbreaks [33]. Eric I and Eric II show genotype-specific differences in disease progression and

in pathogenesis [34]. We chose to work with two strains of Eric II (these strains share the same mechanism of pathogenesis)

owing to the high virulence of Eric II at the individual level [29].

Pl의 다른 변종을 입력하면 4가지 다른 유전자형 (Eric I, II, III 및 IV)이 설명되며, 그중 Eric I과 Eric II는 고전적인

AFB 발병과 관련이 있다 [33]. Eric I과 Eric II는 질병 진행과 발병에 있어서 유전형 특이적 차이를 보여준다 [34].

우리는 개별 수준에서 Eric II의 높은 발병력으로 인해, 두 가지 Eric II 변종 (이 변종은 동일한 발병 체계를 공유함)으로

작업하기로 결정했다 [29].

As known from sporulating bacteria, Pl strains used repeatedly under laboratory conditions may lose the ability to sporulate,

which made it necessary for us to work with a different Pl strain for the experiments in 2012. The two different strains of Eric II

used in 2011 and 2012, respectively, differ solely in the degree of virulence at the individual level (see §3b).

포자 형성 박테리아에서 알려진 바와 같이, 실험실 조건에서 반복적으로 사용된 Pl 변종은 포자 형성 능력을 잃을

수 있으며, 이로 인해 2012년 실험을 위해 다른 Pl 변종으로 작업해야 했다. 2011년과 2012년에 각각 사용된 Eric II의

두 가지 변종은 개별 수준에서 발병력 정도만 다르다 (§3b 참조)

To obtain spores, a few colony forming units (CFU) of Pl were used to inoculate Columbia sheep blood agar slants and

incubated at 34.5°C for 12–14 days. Subsequently, the liquid supernatant was collected, heated for 10 min at 85°C to

eliminate vegetative forms (three repetitions with each 10 min at room temperature between treatments) and used to

determine spore concentration by cultivating serial dilutions on MYPDG-agar plates.

포자를 얻기 위해, Pl의 봉군 형성 단위 (CFU) 몇 개를 사용하여  Columbia sheep blood agar slants에 접종하고

34.5° C에서 12-14 일 동안 배양했다. 이어서, 액체 상층액을 수집하고, 85°C에서 10분 동안 가열하여 식물

형태를 제거하고 (처리 사이에 상온에서 각 10분씩 3회 반복) MYPDG- 한천 배양기 플레이트 위에서 연속

희석물을 배양함으로써 포자 농도를 결정하는데 사용했다.

The spore suspension was stored at 4°C and used throughout all experiments. Previous to any study of the effects of queen

priming on larvae, the virulence level of both strains of Pl Eric II was assessed by using larvae from four different

colonies of regular dimensions. For artificial rearing of honeybee larvae, we used a method by Aupinel et al.

[35], which was further developed in our laboratory[36] (see the electronic supplementary material).

포자 현탁액은 4° C에서 저장되었으며 모든 실험에 사용되었다. 여왕벌 프라이밍이 유충에 미치는 영향에 대한

연구 이전에, Pl Eric II의 두 변종의 빌병력 수준은 표준적인 크기의 4가지 다른 봉군의 유충을 사용하여 평가되었다.

꿀벌 유충의 인공 사육을 위해 ,Aupinel 등에 의한 방법이 사용돠었고 [35], 이는 우리 실험실에서 추가로 개발

되었다 [36] (전자 보충 자료 참조).

We aimed at finding a spore concentration that produces a larval mortality in a range where any positive or negative effect

owing to the priming of queens can be eval‎uated. For this purpose, we exposed first instar honeybee larvae to

different spore loads of Pl (exposure bioassays) to obtain the mortality rate due to Pl infection at day 12 of

the experiment as a function of the spore inoculum per larva (see the electronic supplementary material determination

of bacterial virulence and electronic supplementary material, figure S1 for spore doses and related mortality).

우리는 여왕벌의 프라이밍으로 인한, 긍정적 또는 부정적 영향을 평가할 수 있는 범위에서 유충 사망률을 생성하는

포자 농도를 찾는 것을 목표로 했다. 이 목적을 위해, 우리는 1일령 꿀벌 유충을 Pl의 다른 포자 부하 (노출

생물 검정)에 노출하여 유충당 포자 접종물의 기능으로 실험 12일째에 Pl 감염으로 인한 사망률을 얻었다

(박테리아 발병력 및 전자 보충 물질의 전자 보충 물질 결정, 포자 투여량 및 관련 사망률은 그림 S1 참조)

The experiments were ended at day 12 to minimize the risk of laboratory contamination through spore-forming larval masses.

실험은 포자를 형성하는 유충 덩어리를 통한 실험실 오염 위험을 최소화하기 위해 12일에 종료되었다.

(b) Exposure bioassay before the challenge of queens

    여왕벌의 면역성 검사전 노출 생물학적 정량(검정)

 주) bioassay :(생물학적 정량(定量)) 살아있는 유기체 및 물질에 미치는 영향을 테스트하여 물질에 대한 변화의 농도, 활성 또는

                   영향을 결정하는 방법입니다.

Before any challenge of queens of nucleus colonies, their offspring were exposed at first instar to the previously determined

spore dose of ca 20 spores per larva to confirm‎ mortality rates obtained in full colonies (see the electronic  supplementary

material, figure S1). Artificial larval rearing was followed as described in the electronic supplementary material (see

determination of bacterial virulence).

핵군 여왕벌의 면역성 검사 전에, 그들의 자손은 전체 봉군에서 얻은 사망률을 확인하기 위해 이전에

결정된 유충당 약 20 개의 포자 투여량에 1일령에 노출되었다 (전자 보충 자료, 그림 S1 참조). 인공 유충 사육은

전자 보충 물질에 설명된대로 따랐다 (박테리아 발병력 결정 참조).

This procedure was carried out in three and six nucleus colonies in 2011 and in 2012, respectively. The number of dead larvae

was recorded every day for all groups during 12 consecutive days. Artificial rearing leads generally to small losses of larvae in

the range of ca 10%. To put the number of larvae dying from Pl infection in relation to control larvae, the mortality in a

control group was always co-assessed.

이 절차는 각각, 2011 년과 2012년에 3개와 6개의 핵군에서 수행되었다. 죽은 유충의 수는 연속 12일 동안

모든 그룹에 대해 매일기록되었다. 인공 사육은 일반적으로 약 10% 범위의 작은 유충 손실로 이어진다. 대조군

유충과 관련하여 Pl 감염으로 죽어가는 유충의 수를 평가하기 위해, 대조군의 사망률은 항상 공동 평가되었다.

For the experiments, a total of 3154 larvae were artificially reared. For the study, detailed numbers of each group and

replicates are given in table 1. To confirm‎ the inoculum of ca 20 spores, infectious diet fed to larvae was plated every time

on MYPGD-agar and CFU were counted 6 days later. Larval diet with a 50% content of royal jelly has a strong antibacterial

activity.

실험을 위해, 총 3154 마리의 유충이 인공적으로 사육되었다. 연구를 위해, 각 그룹 및 복제의 자세한 수는 표 1에

나와 있다. 약 20개의 포자의 접종을 확인하기 위해, 유충에게 먹이를주는 감염성 식량을 MYPGD-한천 배양기에

매번 배양되었고 6일 후에 CFU를 계산했다. 로열 젤리 함량이 50 %인 유충 식량은 항균력이 강하다.

Plating diet on agar allows spores to germinate and first CFU appear after 3–6 days. The growth of Pl was confirmed: (i) when

no bacterial growth was detected before day 3, which indicated that no significant bacterial contamination was present; and

(ii) by occasionally checking the identity of Pl using PCR.

한천 배양기에 배양을 하면 포자가 발아하고 3~6일 후에 첫 번째 CFU가 나타난다. Pl의 성장이 확인되었다 :

(i) 3일 전에 박테리아 성장이 검출되지 않았을 때, 이는 심각한 박테리아 오염이 존재하지 않았음을 나타낸다. 

그리고 (ii) 때때로 PCR을 사용하여 Pl의 동일성을 확인한다.

(c) Challenge of queens

   여왕벌의 면역성 검사

Queens of the nucleus colonies were randomly assigned to either a ringer- or Pl-challenge group (1 ringer- and 2 Pl-challenge

queens in 2011 and 2 ringer- and 4 Pl-challenge queens in 2012). Queens were chilled on ice for around 5–10 min and injected

between the fifth and sixth abdominal tergites using a Hamilton micro-litre syringe.

핵군의 여왕은 무작위로 링거 또는 Pl- 챌린지 그룹 (2011년에 1개의 링거 및 2개의 Pl- 면역 검사 여왕벌과

2012년에 2개의 링거 및 4개의 Pl- 면역검사 여왕벌)에 무작위로 할당되었다. 여왕벌은 약 5~ 10분 동안 얼음

위에서 냉각하였고 해밀턴 마이크로-리터 주사기를 사용하여 5번째와 6번째 복부 등판 사이에 주입되었다.

Immune-challenged queens received 2 µl of heat-killed (90°C, 10 min) vegetative forms of Pl genotype Eric II (strain CCUG

48972 in 2011 and strain 233/00 in 2012, respectively) suspended in sterile ringer solution at a concentration of 108 bacterial

cells ml−1 and the efficiency of the process was confirmed by plating out samples of the suspension on MYPGD-agar. Control

queens received 2 µl of sterile ringer solution. Following injections, queens were immediately taken off ice and returned to

their colonies.

면역성 검사를 받은 여왕벌은 108개의 박테리아 세포 ml-1 농도로 살균 링거 용액에 부유된 Pl 유전자형 Eric II

(각각 변형 CCUG 48972 및 변형률 233/00)의 열 사멸 (90°C, 10분) 식물성 형태의 2 µl를 받았고, 공정의 효율성을

위해 MYPGD-한천 배양기 위에 현탁액 샘플로 배양함으로써 확인되었다. 대조군 여왕벌은 2 µl의 멸균 링거 용액을

받았다. 주사 후, 여왕벌은 즉시 얼음에서 제거하여 그들의 봉군으로 돌아 왔다.

(d) Exposure bioassays after the challenge of queens

     여왕벌의 면역성 검사 후 노출 생물학적 정량

After the challenge of queens, colonies were observed daily and, at first, first instar larvae were grafted and artificially

reared and exposed to Pl spores as described above. Each experiment consisted of offspring from ringer- or Pl-challenged

queens that were fed with infectious diet in a concentration of ca 20 spores per larva and their mortality rate was

compared with the mortality of control groups, which were fed with non-infectious diet.

여왕벌에게 면역성 검사 후, 봉군을 매일 관찰하고, 처음에 1일령 유충을 접합하고 인위적으로 사육하고 위에서

설명한대로 Pl 포자에 노출시켰다. 각 실험은 유 충당 약 20개의 포자 농도로 감염성 식량을 먹은 링거 또는

Pl- 검역성 검사를 받은 여왕벌의 자손으로 구성되었으며, 그들의 사망률은 비 감염성 식량을 먹은 대조군의

사망률과 비교되었다.

Conditions and rearing methods were exactly the same as for larvae for the exposure bioassay before the challenge of queens.

The number of dead larvae was recorded every day for all groups during the following 12 days. To confirm‎ the inoculum of

ca 20 spores, infectious diet was plated every time on MYPGD-agar, CFU were counted 6 days later and the identity of Pl was

confirmed as described in §2b.

조건과 사육 방법은 여왕벌에게 면역성 검사를 하기 전에 노출 생물 검정을 하기 위하여 유충과 정확히 동일했다. 

죽은 유충의 수는 다음 12일 동안 모든 그룹에 대해 매일 기록되었다. 약 20개의 포자의 접종물을 확인하기 위해,

MYPGD-한천 배양기 위에 매번 감염성 식량을 배양하고, 6일 후 CFU를 세어 §2b에 설명한대로 Pl의 동일성을

확인했다.

(e) Larval samples for haemocyte counts

    혈구 수에 대한 유충 샘플

Parallel to the exposure bioassays, larvae of queens challenged with ringer or Pl of the six colonies in 2012 were artificially

reared in the laboratory under regular conditions (no exposure to spores) and were used on day 6 to perform haemocyte

counts using a Bürker-Türk haemocytometer. In this study, we included counts for total haemocytes and for differential

haemocytes.

노출 생물학적 정량과 병행하여, 2012 년에 링거 또는 6개 봉군의 Pl로 면역성 검사를 받은 여왕벌의 유충을

표준적인 조건 (포자에 노출되지 않음)하에 실험실에서 인위적으로 사육되었고 6일째에 Bürker-Türk 혈구계를

사용하여 전체 혈구수를 측정하는데 사용했다. 이 연구에서는, 우리는 총 혈구 수와 차등 혈구 수를 포함했다.

Here, we refer to differential haemocytes to all those other haemocyte types observed which are no longer in the

prohaemocyte stadium but have reached a different developmental stadium (granulocyte, oenocytoid or plasmatocyte).

Total haemocyte counts include prohaemocytes and all differential haemocytes observed.

여기에서, 우리는 더 이상 전혈구 경기장에는 없지만 다른 발달 경기장 (과립구, 곤충거대혈구 또는 세포질 혈구)에

도달한 다른 모든 혈구 유형에 대한 차동 혈구를 가리킨다. 총 혈구 수에는 전혈구와 관찰된 모든 차등 혈구가

포함된다.

Haemolymph samples were extracted by puncturing larvae with a sterile needle and 1 µl of haemolymph was collected

by using sterile glass micro capillaries. A Bürker-Türk haemocytometer was then used to determine total haemocyte counts

and differential haemocyte counts in a 1/10 dilution factor. Cell counts were carried out 5–10 min after filling the

haemocytometer. Differential haemocytes were identified by their morphology as described in the literature [37,38].

유충을 멸균 바늘로 천공하여 혈림프 샘플을 추출하고 멸균 유리 마이크로 모세관을 사용하여 1 ㎕의 혈 림프를

수집 하였다. 그런 다음 Bürker-Türk 혈구계를 사용하여 1/10 희석 인자에서 총 혈구 수와 차등 혈구 수를 결정했다. 

계수는 혈구계를 채운 후 5-10분에 수행되었다. 차동 혈구는 문헌에 설명 된대로 형태학으로 식별되었다 [37,38].

(f) Statistical analysis

    통계 분석

The software package SPSS v. 19 was used for statistical analyses. A Cox regression analysis was performed to estimate

differences in larval mortality among colonies considering the effect of the three different parameters:

소프트웨어 패키지 SPSS v. 19는 통계 분석에 사용되었다. Cox 회귀 분석을 수행하여 세 가지 다른 매개 변수의

효과를 고려하여 봉군 간의 유충 사망률 차이를 평가하였다.

(i) type of treatment, (ii) strain, and (iii) queens used. Regarding levels of haemocytes, an examination of the histograms of the

distribution of total haemocyte counts and differential haemocyte counts showed a deviation from normal distribution.

Therefore, non-parametric methods (Mann–Whitney U-test, Kruskal Wallis one-way ANOVA) were used for statistical analysis.

(i) 처리 유형, (ii) 변종 및 (iii) 사용된 여왕. 혈구의 수준과 관련하여, 총 혈구 수 분포와 차등 혈구 수 분포의

히스토그램을 조사한 결과 정상 분포에서 벗어난 것으로 나타났다. 따라서, 통계 분석에는 비모수 방법 (Mann–

Whitney U-test, Kruskal Wallis 일원 분산 분석)이 사용되었다.

3. Results(a) Determination of bacterial virulence

    결과 (a) 세균 발병력의 결정

Mortality rates assessed in initial experiments in full colonies of larvae exposed to different doses of Pl spores for both strains

are plotted in the electronic supplementary material, figure S1. The results allowed us to select an adequate spore dose of ca

20 spores per larva for subsequent experiments, which causes a mortality rate of around 65% for Pl strain CCUC 48972 and

a mortality of 50% for Pl strain 233/00, respectively.

두 변종에 대해 서로 다른 용량의 Pl 포자에 노출된 유충의 전체 봉군에서 초기 실험에서 평가된 사망률은 전자

보충 자료 (그림 S1)에 표시됩니다. 결과를 통해 우리는 후속 실험을 위해 유충당 약 20개의 포자의 적절한 포자

용량을 선택할 수 있었으며, 이는 Pl 변종 CCUC 48972의 경우 약 65%의 사망률과 Pl 변종 233/00의 경우 50 %

의 사망률을 각각 유발한다

In subsequent experiments, nucleus colonies composed of 1000–2000 individuals and a young multi-mated queen were

exclusively used. This points to a different virulence of the test strains as shown by their different absolute mortality rates.

이후의 실험에서는, 1000 ~ 2000 마리 개체와 젊은 다중 교미된 여왕으로 구성된 핵군은 독점적으로 사용되었다.

이것은 서로 다른 절대 사망률에 의해 나타난 바와 같이 시험 변종의 다른 발병력을 가리킨다. 
(b) Exposure bioassay before the challenge of queens

    여왕의 면역 검사전 노출 생물학적 정량

A Cox regression analysis revealed no statistically significant differences in mortality between larvae of full colonies

(named Hive-20sp) and nucleus colonies for 2011 and 2012, respectively (table 2). The data also showed that there is no

significant difference in the mortality rate of larvae from different queens for both the 2011 and 2012 experiments (table 2).

Cox 퇴화 분석에서 2011년과 2012년 동안 각각, 전체 봉군 (Hive-20sp로 명명 됨)과 핵군 사이의 사망률에

통계적으로 상당한 차이가 없는 것으로 나타났다 (표 2). 이 데이터는 또한 2011 년과 2012 년 동안 실험

모두에서 다른 여왕의 유충 사망률에 큰 차이가 없음을 보여 주었다 (표 2).

For survival profiles of larvae of nucleus colonies and details regarding replicates and number of larvae used, see figures

1a and 2a for colonies in 2011 and 2012, respectively. The mortality rate obtained at a dose of ca 20 spores (Hive-20sp)

was later confirmed in three independent colonies in 2011 (one time tested, three colonies) and six independent colonie

s in 2012 (two times tested, six colonies).

핵군 유충의 생존 프로파일과 사용된 복제 및 유충 수에 관한 자세한 내용은 각각 2011년 및 2012년 봉군에

대한 그림 1a 및 2a를 참조하라. 약 20개의 포자 (Hive-20sp) 용량에서 얻은 사망률은 나중에 2011년에 3개의

독립된 봉군 (1회 테스트, 3개의 봉군)와 2012년 6개의 독립된 봉군 (2회 테스트, 6개의 봉군)에서 확인되었다.

A Cox regression analysis revealed no significant differences in mortality rates of larvae and also no effect of queens on the

mortality rate. Hence the mortality rate did not depend on the fact that queens were recruited from different colonies.

This strongly confirm‎s that Pl strain CCUC 48972 is responsible for a mortality of around 65% (2011) and that Pl strain

233/00 is responsible for a mortality of 50% (2012) when applied at a dose of ca 20 spores per larva independently of

the colony.

Cox 퇴화 분석은 유충의 사망률에 큰 차이가 없었으며 사망률에 대한 여왕벌의 영향도 없음을 보여주었다.

따라서 사망률은 여왕벌이 다른 식민지에서 모집되었다는 사실에 달린 것이 아니다. 이는 Pl 변종 CCUC 48972가

약 65% (2011)의 사망률에 원인이 있고 Pl 변종 233/00이 독립적으로 봉군의 유충당 약 20개의 포자의 용량으로

적용될 때 50% (2012)의 사망률의 원인이라는 것을 강력하게 확인한다. 

Table 2.

표 2

Results of the Cox regression analysis for mortality of larvae of full colonies (Hive-20sp) and nucleus colonies exposed to

a dose of 20 spores per larva before the treatment of queens.

여왕벌을 처리하기 전에 유충당 20 \개의 포자 용량에 노출된 전체 봉군 (Hive-20sp) 및 핵군의 유충 사망률에 대한

Cox 퇴화 분석 결과.

treatment 20 spores (2011)	0.163	1	0.687	0.761	0.201	2.873
queens (2011)	0.178	3	0.981
treatment 20 spores (2012)	1.328	1	0.249	0.463	0.125	1.714
queens (2012)	4.974	7	0.663

Figure 1. Survival profile of larvae of nucleus colonies exposed to 20 spores of Pl Eric II-strain CCUG 48972 in 2011.

그림 1. 2011년에 20개의 Pl Eric II-변종 CCUG 48972 포자에 노출된 핵군 유충의 생존 프로파일.

(a) Pre-challenge: colony 11–1; 11–2 and 11–3 (n = 48 per colony, one time tested); control pre-challenge (n = 48 + 48, l

arvae from all three nucleus colonies fed with non-infectious diet, two replicates throughout this part of the experiments).

(a) 사전 면역검사 : 봉군 11-1; 11–2 및 11–3 (n=봉군 당 48, 한 번 테스트됨); 면역검사 전 대조군 (n=48+48,

비 감염성 식량이 공급된 3개의 핵군 모두에서 유충, 실험의 이 부분을 통해 2 번 복제됨).

Hive-20sp: full colony from preliminary screening of bacterial virulence (n = 48 + 48, two replicates). (b) Post-challenge: colony

11–1 ringer-treated queen (n = 48 + 48 + 48 + 48, four replicates); 11–2 Pl-treated queen (n = 48 + 48 + 48, three replicates);

11–3 Pl-treated queen (n = 48 + 48 + 48, three replicates); control post-challenge (n = 144, larvae of all three nucleus colonies

fed with non-infectious diet, four replicates throughout this part of the experiments). (Online version in colour.)

Hive-20sp : 박테리아 발병력의 예비 스크리닝에서 얻은 전체 봉군(n=48+48, 2 회 복제). (b) 면역검사 후 : 봉군

11-1 링거 처리된 여왕벌 (n=48+48+48+48, 4 번 반복); 11–2 Pl- 처리된 여왕벌 (n=48+48+48, 3번 반복);

11–3 Pl- 처리된 여왕벌 (n 48+ 48+48, 3 회 반복); 면역 검사 후 대조군 (n=144, 비 감염성 식량을 먹인 세 개의

핵군 모두의 유충, 실험의 이 부분 전체에 걸쳐 네 번의 복제). (컬러 온라인 버전.)

Figure 2. Survival profile of larvae of nucleus colonies exposed to 20 spores of Pl Eric II-strain 233/00 in 2012.

그림 2. 2012년에 20개의 Pl Eric II-변종 233/00 포자에 노출된 핵군 유충의 생존 프로파일.

(a) Pre-challenge: colony 12–1; 12–2; 12–3; 12–4; 12–5; 12–6 (n = 48 + 48 per colony, two replicates); control pre-challenge

(n = 355, larvae of all six nucleus colonies fed with non-infectious diet, seven replicates throughout this part of the experiments).

(a) 사전 면역 검사 : 봉군 12-1; 12–2; 12–3; 12–4; 12–5; 12–6 (봉군 당 n=48+48, 2회 반복); 면역 검사 전 대조군

(n = 355, 비 감염성 식량을 먹인 모든 6개의 핵군의 유충, 실험의 이 부분 전체에 걸쳐 7개의 복제).

Hive-20sp: full colony from preliminary screening of bacterial virulence (n = 48 + 48, two replicates). (b) Post-challenge:

colony 12–1 ringer-treated queen (n = 48 + 48 + 48, three replicates); 12–2 ringer-treated queen (n = 48 + 48 + 48, three

replicates); 12–3 Pl-treated queen (n = 47 + 43 + 20, three replicates); 12–4 Pl-treated queen (n = 48 + 48 + 48, three

replicates); 12–5 Pl-treated queen (n = 48 + 48 + 48, three replicates); 12–6 Pl-treated queen (n = 48 + 48 + 47, three

replicates); control post-challenge (n = 338, larvae of all six colonies fed with non-infectious diet, eight replicates

throughout this part of the experiments). (Online version in colour.)

Hive-20sp : 박테리아 발병력의 예비 스크리닝에서 얻은 전체 봉군 (n=48+48, 2회 복제). (b) 면역 검사 후 :

봉군 12-1 링거 처리된 여왕벌 (n=48+48+48, 3 번 반복); 12-2 벨소리 처리된 여왕벌 (n=48+48+48, 3번 반복);

12–3 Pl- 처리된 여왕벌 (n=47+43 +20, 3 회 반복); 12-4 Pl- 처리된 여왕벌 (n=48+48+48, 3회 반복); 12–5

Pl- 처리된 여왕벌 (n=48+48+48, 3회 반복); 12–6 Pl- 처리된 여왕벌 (n=48+48+47, 3 회 반복); 면역 검사 후

대조군 (n=338, 비 감염성 식량을 먹인 6개 봉군 모두의 유충, 실험의 이 부분 전체에 걸쳐 8번 복제).

(컬러 온라인 버전.)

(c) Challenge of queens

    여왕벌의 면역 검사

The procedure of the challenge of queens is generally well tolerated. From 3 years of experiments, we found that the caging

of challenged queens before returning them to the nucleus colonies leads to 100% acceptance of queens, as found during

experiments in 2013. However, in 2011 and 2012, we were not completely aware of this fact and some queens were rejected

after returning them into the nucleus colonies.

여왕벌의 면역 검사 절차는 일반적으로 잘 허용된다. 3년간의 실험에서, 우리는 면역 검사받은 여왕벌을 핵군으로

되돌리기 전에 케이지에 넣는 것은 2013년 실험에서 발견된 것처럼, 여왕을 100% 수용한다는 것을 발견했다.

그러나 2011년과 2012년에는 이 사실을 완전히 알지 못했고, 일부 여왕벌은 그들을 핵군으로 돌려 보낸 후

거부당했다.

(d) Exposure bioassay after the challenge of queens

    여왕벌의 면역 검사 후 노출 생물학적 정량

A Cox regression analysis showed significant differences in the mortality rate of larvae regarding treatment of their mothers

(table 3), indicating that a challenge of queens with heat-killed Pl significantly reduces mortality rates upon an exposure to

Pl spores. This is not dependent on the origin of queens (table 3). As expected, the strain type has an influence on mortality

rates obtained.

Cox 퇴화 분석은 어미 처리에 관련하여 유충의 사망률에 상당한 차이를 보였으며 (표 3), 열 사멸 Pl을 가진

여왕벌의 면역 검사는 Pl 포자에 노출될 때 사망률을 현저히 감소 시킨다는 것을 나타낸다. 이것은 여왕벌의

기원에 달려 있지 않다 (표 3). 예상대로, 변종 유형은 얻어진 사망률에 영향을 준다.

As previously mentioned, the strain type used in 2011 causes a slightly higher mortality in the exposure bioassays than the

strain type used in 2012 (table 3). For survival profiles per colony, details regarding replicates, and number of larvae used,

see figures 1b and 2b for colonies in 2011 and 2012, respectively.

앞서 언급했듯이, 2011년에 사용된 변종 유형이 2012년에 사용된 변종 유형보다 노출 생물학적 정량(검정)에서

약간 더  높은 사망률을 야기한다 (표 3). 봉군 당 생존 프로파일, 복제에 관한 세부 사항 및 사용된 유충 수에

대해서는 각각 2011년과 2012년의 봉군에 대한 그림 1b 및 2b를 참조하라.

Table 3.

표 3

Results of the Cox regression analysis for mortality of larvae of nucleus colonies exposed to a dose of 20 spores per larva

after treatment of queens with ringer or bacteria.

여왕벌을 링거 또는 박테리아로 처리한 후, 유충당 20 개의 포자 용량에 노출된 핵군 유충의 사망률에 대한 Cox

퇴화 분석 결과.

treatment ringer_Pl	26.994	1	0.000	0.297
queens	10.131	6a	0.119
strain	16.056	1	0.000	0.383

aDegree of freedom reduced because of constant or linearly dependent covariates.

일정하거나 선형적으로 종속 변수로 인해 감소된 자유도. 

bConstant or linearly dependent covariates queen(3)= 2 –year–queen(1)–queen(2); ringer_PI = 2–queen(1)–queen(4)–queen(5).

일정하거나 선형적으로 종속 변수   queen(3)= 2 – year – queen (1) – queen (2); ringer_PI = 2 – queen (1) – 

queen (4) – queen (5). 

A Cox regression analysis showed no effect of ringer-injection on mortality of larvae compared with mortality rates obtained

for the same colonies before injection of ringer.

Cox 퇴화 분석은 링거 주입 전 동일한 봉군에 대해 얻은 사망률과 비교하여 유충의 사망률에 대한 링거 주입의

효과가 없음을 보여 주었다.

As expected, the origin of the queens has no effect on the results and the two strain types used show a variation in virulence

(table 4). This result allows us to confirm‎ that the ringer-challenge has no effect on mortality rates obtained before and after t

he injection of queens, and, strongly reinforces that the reduction of mortality observed for experimental colonies is owing to

the injection of heat-killed bacteria.

예상대로 여왕의 기원은 결과에 영향을 미치지 않으며 사용된 두 가지 변종 유형은 발병력의 변화를 보여줍니다

(표 4). 이 결과를 통해 우리는 링거-면역성 검사가 여왕벌 주입 전후의 사망률에 영향을 미치지 않음을 확인할 수

있으며, 실험 봉군에서 관찰된 사망률 감소가 열 사멸 박테리아 주입으로 인한 것임을 강력하게 강조한다.

Hence, we had a total of three ringer control colonies and six experimental colonies in 2 years where the effect of TgIP is

consistent and the strain type used only affects the cumulative mortality at the end of day 12. Cumulative mortalities for all

colonies used in the experiments are shown in table 1.

따라서, 우리는 TgIP의 영향이 일관되고 사용된 변종 유형이 12일이 끝날 때 누적 사망률에만 영향을 미치는, 2년

동안 총 3개의 링거 대조군 봉군과 6개의 실험 봉군을 보유했다. 실험에 사용된 모든 봉군의 누적 사망률은

표 1에 나와 있다.

Table 4.

표 4

Results of the Cox regression analysis for mortality of larvae of nucleus colonies exposed to a dose of 20 spores per larva

after treatment of queens with ringer.

여왕벌을 링거로 처리한 후 유충당 20개의 포자 용량에 노출된 핵군 유충의 사망률에 대한 Cox 퇴화

분석 결과.

ringer_treatment	0.800	1	0.371	0.909	0.737	1.121
queens	0.065	1a	0.799
strain	11.775	1	0.001	0.656	0.515	0.835

aDegree of freedom reduced because of constant or linearly dependent covariates.

일정하거나 선형적으로 종속 변수로 인해 자유도가 감소되었다.

bConstant or linearly dependent covariates queen(1) = 2 – year.

일정하거나 선형적으로 종속 변수 여왕벌 (1) = 2 – 연도.

Survival functions for all larvae of each of the complete number of offspring from ringer-challenged or Pl-challenged queens

in 2011 and 2012 are presented in figure 3.

2011년과 2012년에 링거에 면역 검사한 여왕벌이나 Pl에 면역 검사한 여왕벌의 자손 전체 수의 모든 유충에 대한

생존 함수는 그림 3에 나와 있습니다.

Cumulative larval mortality for ringer-challenged queens is 65.1% and for Pl-challenged queens 39.2% in 2011, which

indicates a reduction in larval mortality of 25.9%, whereas in 2012 cumulative larval mortality for ringer-challenged queens

is 49.3% and for Pl-challenged queens 23.2%, which indicates a reduction in larval mortality of 26.0%. The effect of

Pl-challenge is consistent independently of the strain type, which causes a deviation in mortality owing to the higher

virulence of the strain used in 2011.

 링거에 면역 검사한 여왕벌의 누적 유충 사망률은 65.1 %이고 Pl에 면역 검사한 여왕벌의 경우 39.2입니다.

2011 년에는 유충 사망률이 25.9 % 감소한 반면, 2012 년에는 링거에 감염된 여왕벌의 누적 유충 사망률이

49.3 %, Pl- 면역 검사된 여왕벌의 경우 23.2 %로 유충 사망률이 26.0 % 감소했음을 나타낸다. Pl- 면역

검사의 효과는 변종 유형과 관계없이 일관되며, 2011년에 사용된 변종의 더 높은 발병력으로 인해 사망률

편차를 야기한다.

이벤트에 의해 가중치가 부여 된 경우

Figure 3. Survival profile of all larvae of nucleus colonies after challenge of queens with ringer or Pl bacteria. Arrows

indicate the difference in mortality for colonies treated with ringer versus Pl. (Online version in colour.)

그림 3. 링거 또는 Pl 박테리아와 여왕벌의 면역 검사 후 핵군의 모든 유충의 생존 프로필. 화살표는 링거 대 Pl로

처리된 봉군의 사망률 차이를 나타낸다. (컬러 온라인 버전.)

To equalize the paternal influence on the genetic constitution of larvae, we used multi-mated queens to minimize the

individual male genetic donation. Interestingly, we noted that upon exposure to Pl spores, segregation among the four

colonies in 2012 headed by Pl-challenged queens into two groups with different larval mortality rates occurred (12–3 and

12–4 versus 12–5 and 12–6, figure 2b).

유충의 유전적 구성에 대한 부계의 영향을 동등하게 하기 위해, 우리는 개별 수벌 유전적 기증을 최소화하기

위해 다중 교미 여왕벌을 사용했다. 흥미롭게도, 우리는 Pl 포자에 노출되었을 때, Pl- 면역 검사된 여왕벌이

이끄는 2012년에 4개의 봉군 사이의 유충 사망률이 다른 두 그룹으로 분리된다는 점에 주목했다 (12–3 및

12–4 대 12–5 및 12–6, 그림 2b).

Since experimental procedures were strictly the same for all colonies in both seasons, we can hypothesize that either

differences among the effector genes of immune responses prevail or that the individual history of pathogen exposure

of the parents contributes to this variation. Further, environmental conditions within each nest could also have an

influence on the observed segregation.

실험 절차는 두 계절의 모든 식민지에 대해 엄격하게 동일했기 때문에, 면역 반응의 반응기 유전자 간의 차이가

우세하거나 부모의 병원균 노출에 대한 개별 이력이 이러한 변화에 기여한다고 가정할 수 있다. 또한, 각 둥지

내의 환경 조건은 관찰된 분리에 영향을 미칠 수 있다

주) effector : 반응기 (외부 자극에 반응을 하도록 되어 있는 인체 조직이나 세포)

주) segregation : 분리 [유전학] (유전자·형질의) 분리: 감수 분열 때, 부계와 모계의 유전자 혹은 염색체가 분리하는 것.

(e) Haemocyte levels in larvae

     유충의 혈구 수준

First, differences between colonies within the two treatment groups (two colonies with ringer-challenged queens and

four colonies with Pl-challenged queens) were analysed. Results showed no statistically significant differences for total

haemocyte counts (ringer colonies: Mann–Whitney U-test, p = 0.902; Pl colonies Kruskal Wallis one-way ANOVA p = 0.982)

and differential haemocyte counts (ringer colonies: Mann–Whitney U-test, p = 0.456; Pl colonies Kruskal–Wallis one-way

ANOVA p = 0.135).

첫째, 두 처리 그룹 (링거에 면역 검사된 여왕벌이 있는 두 개의 봉군과 Pl에 면역 검사된 여왕벌이 있는 4개의

봉군) 내의 봉군 간의 차이를 분석했다. 결과는 총 혈구 수에 대해 통계적으로 상당한 차이를 보이지 않았다 

(링거 봉군 : Mann–Whitney U-test, p = 0.902; Pl 봉군 Kruskal Wallis one-way ANOVA p = 0.982)와 다른

혈구 수 (링거 봉군 : Mann–Whitney U- test, p = 0.456; Pl colonies Kruskal–Wallis one-way p = 0.135).

Because no significant differences were observed, we combined the two ringer-treated colonies and the four Pl-treated

colonies, respectively, and compared differences in total (prohaemocytes, granulocytes, oenocytoids and plasmatocytes)

and differential (granulocytes, oenocytoids and plasmatocytes) haemocyte counts for these two groups of colonies.

상당한 차이가 관찰되지 않았기 때문에, 우리는 각각 2개의 링거 처리된 봉군과 4개의 Pl 처리된 봉군을 통합하고, 

이 두 그룹의 봉군을 위해 총 (전구세포, 과립구, 거대혈구 및 형질 세포) 및 차등 (과립구, 거대혈구 및 형질 세포)

의 혈구 수 차이를 비교했다.

No statistically significant differences were found for total haemocyte counts (Mann–Whitney U-test p = 0.735). An average

of 3826.8 (s.d. = 1840.5) total haemocyte counts per µl of haemolymph was found in larvae of the ringer-challenged queens

and 3675.6 (s.d. = 2082.1) in the Pl-challenged queens, respectively.

총 혈구 수에 대해 통계적으로 상당한 차이는 발견되지 않았다 (Mann–Whitney U-test p = 0.735). 평균 3826.8

(s.d. = 1840.5)의 총 혈구 수는 혈림프 1μl 당 링거에 면역 검사된 여왕벌의 유충에서, 그리고 3675.6

(s.d. = 2082.1)은 Pl- 면역 검사된 여왕벌에서, 각각, 발견되었다.

Interestingly, we found statistically significant differences between the differential haemocyte counts for the two treatment

groups (Mann–Whitney U-test p = 0.003). The levels of differential haemocytes were higher in larvae of Pl-challenged queens

as compared with those in larvae of ringer-challenged queens.

흥미롭게도, 우리는 두 처리 그룹에 대한 차등 혈구 수 사이에 통계적으로 상당한 차이를 발견했다

(Mann–Whitney U-test p = 0.003). 차등 혈구의 수준은 링거에 면역 검사된 여왕벌의 유충에 비해 Pl- 면역

검사된 여왕벌의 유충에서 더 높았다.

Differential haemocytes, which include all other haemocytes types except for prohaemocytes, were clearly identified as

oenocytoids, plasmatocytes and granulocytes in all types of larvae.  The percentage of differential haemocytes of total

counts was 0.98% in larvae of ringer-challenged queens compared with 3.22% in larvae of Pl-challenged queens.

전혈구를 제외한 다른 모든 혈구 유형을 포함하는 차등 혈구는 모든 유형의 유충에서 거대혈구, 세포질 혈구

및 과립구로 명확하게 확인되었다. 총 수의 차등 혈구 비율은 Pl- 면역 검사된 여왕벌의 유충에서 3.22 %에

비해 링거-면역 검사된 여왕벌의 유충에서 0.98 %였다.

This translates to a threefold increase in the number of differential haemocytes in the haemolymph (electronic

supplementary material table S2). These results support a previously described role of haemocytes in TgIP in

invertebrates [27,39].

이는 혈림프에서 차등 혈구 수가 3 배 증가한 것으로 해석된다 (전자 보충 재료 표 S2). 이러한 결과는

무척추 동물의 TgIP에서 이전에 설명한 혈구의 역할을 뒷받침 한다 [27,39].

4. Discussion

    토론

The aim of our study was to seek evidence of TgIP in a scenario as close to natural conditions as possible by directly

eval‎uating offspring resistance to a specific bacterial infection and by quantifying the cellular response. This aim

complements approaches pursued in other works, where immune parameters such as levels of antimicrobial peptides

in offspring were measured [22,23,40].

우리 연구의 목적은 특정 박테리아 감염에 대한 자손 저항성을 직접 평가하고, 세포 반응을 정량화하여 가능한 한

자연 조건에 가까운 시나리오에서 TgIP의 증거를 찾는 것이었다. 이 목표는 자손의 항균 펩타이드 수준과 같은

면역 매개 변수가 측정된, 다른 연구에서 추구된 접근법을 보완한다 [22,23,40].

The latter studies demonstrated that induced levels of antimicrobial peptides in offspring are higher when their parents

received an immune challenge. In line with this, recent work on Tenebrio molitor focused on determining associated costs

due to the induced immune response produced in progenitors.

후자의 연구는 부모가 면역 검사를 받았을 때 자손에게서 유도된 항균 펩타이드 수준이 더 높다는 것을 증명

하였다. 이에 따라, 갈색 거저리에 대한 최근 연구는 조상에서 생성되어 유도된 면역 반응으로 인한 관련 비용을

결정하는데 중점을 두었다.

Apparently, maintaining enhanced levels of immune defence showed interdependence with other fitness-related traits like

a longer time of development in primed offspring [23,27] or trade-offs between maternal immunity, egg production and

protection [41,42].

분명히, 강화된 수준의 면역 방어를 유지하는 것은, 준비된 자손의 발달 기간이 더 길어지거나 [23,27] 모성 면역,

난자 생산 및 보호 사이의 균형과 같은 다른 건강 관련 특성과의 상호 의존성을 보여 주었다 [41,42].

So far, the eval‎uation of the individual benefit of TgIP responses, i.e. how strong a TgIP effect confers protection to offspring

in terms of reduced mortality, has not been a primary goal of investigation. We aimed at filling this gap of knowledge

through quantification of maternal transfer in terms of offspring's survival rate upon pathogen exposure.

지금까지, TgIP 반응의 개별적인 이점의 평가, 즉 TgIP 효과가 사망률 감소 측면에서 자손에게 얼마나 강력한

보호를 부여하는지는 조사의 주요 목표가 아니다. 우리는 병원균에 노출되었을 때, 자손의 생존율 측면에서

모성 전달의 정량화를 통해 이러한 지식의 격차를 메우는 것을 목표로 했다  .

Our observations reveal an immune priming-dependent maternal effect on offspring immunity that strongly increases

their survival rate by ca 26.0% to AFB infection. Many questions have not been fully answered yet, e.g. whether the priming

effect observed in offspring is a consequence of a general immune activating in the queen (e.g. through antimicrobial

peptides) or belongs to a more complex and targeted pathogen-dependent response (e.g. through haemocytes).

우리의 관찰은 AFB(미국 부저병) 감염에 대한 생존율을 약 26.0 %까지 강력하게 증가시키는 자손 면역에 대한

면역 프라이밍 의존 모체 효과를 보여 준다. 많은 질문들은 아직 완전히 답변되지 않았다. 예를 들면, 자손에서

관찰된 프라이밍 효과가 여왕의 일반적인 면역 활성화의 결과인지 (예 : 항균 펩티드를 통해), 또는 더 복잡하고

표적화된 병원균 의존 반응 (예 : 혈구를 통해)에 속하는지 여부.

Besides, nothing is known about the transfer mechanism of a TgIP response from mother to offspring in invertebrates.

Evidently, there is a general interest in investigating fitness costs related to TgIP, which is of great importance to better

understand the interdependence and coevolution of a host–parasite system in insects.

게다가, TgIP 반응이 무척추 동물의 어미에서 자손에게 전달되는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 없다. 분명히,

곤충에서 숙주-기생충 시스템의 상호 의존성과 공진화를 더 잘 이해하는데 매우 중요한 TgIP와 관련된 건강

비용을 조사하는데 일반적인 이해관계가 있다.

주) coevolution : [생물] 공진화(共進化): 계통적으로는 관계가 없는 복수의 생물체가 서로 관련되면서 동시에 진화하는 일.

Besides, the physiological feasibility of immune investments has to be taken into account. An investment in immune

competence could be beneficial as long as the infection is present in the colony and as long as it does not exert excessive

negative effects on the queen's fitness.

게다가, 면역 투자의 생리학상 타당성을 고려되어야 한다. 면역 능력에 대한 투자는, 감염이 봉군에 존재하고,

여왕의 건강에 과도한 부정적인 영향을 미치지 않는 한 유익할 수 있다.

In the case of severe colony infection, a high investment in immunity might be unavoidable to prevent the loss of the

whole colony. Thus, queens may possess mechanisms to somehow estimate the magnitude of a current infection and act

accordingly [41].

심각한 봉군 감염의 경우에, 전체 봉군의 손실을 방지하기 위해 면역력에 대한 높은 투자가 불가피 할 수 있다.

따라서, 여왕벌은 현재 감염의 정도를 추정하고 그에 따라 행동하는 메커니즘을 보유 할 수 있다 [41].

Honeybees possess only one-third of genes involved in immunity in their genome as compared with Anopheles or

Drosophila. Nonetheless, the four known pathways implicated in immunity in invertebrates remain functional in honeybees

[6]. Compensation for this lack of genes has been attributed to the existence of social immunity [43].

꿀벌은 학질모기또는 초파리에 비해 게놈에서 면역에 관여하는 유전자의 1/3 만 가지고 있다. 그럼에도 불구하고,

무척추 동물의 면역과 관련된 4가지 알려진 경로는 꿀벌에서도 기능을 유지한다 [6]. 이러한 유전자 부족에 대한

보상은 사회적 면역의 존재에 기인한다 [43].

Considering fitness costs, this would suggest that a short-lived worker honeybee is not expected to display a complex

immune response as that found in other insects. If, however, long-lived honeybee queens maintained even part of these

immunological features, the queen as a single individual could positively influence the immunological status of the

whole colony.

건강 비용을 고려할 때, 이것은 수명이 짧은 일벌이 다른 곤충에서 발견되는 복잡한 면역 반응을 나타내지 않는

것으로 예상됨을 시사한다. 그러나 ,수명이 긴 꿀벌 여왕이 이러한 면역학적 특징의 일부라도 유지한다면, 단일

개체로서 여왕벌은 전체 봉군의 면역학적 상태에 긍정적인 영향을 줄 수 있다.

Hence, this finding could also have a major impact on the beekeeping industry to combat diseases challenging this

indispensable pollinator by naturally conferring resistance to infections (e.g. the development of immunization programmes

in apiculture). While the mechanisms underlying this transmission of immunity are not fully understood in invertebrates,

results in bumblebees point out the existence of a factor transmitted via the eggs [40].

따라서, 이 발견은 자연적으로 감염에 대한 저항성을 부여함으로써 (예 : 양봉에서 예방 접종 프로그램 개발)

이런 필수적인 수분 매개체에 도전하는 질병과 싸우기 위해 양봉 산업에 주요한 영향을 미칠 수 있다. 무척추

동물에서는 이러한 면역 전달의 기초가 되는 메커니즘이 완전히 이해되지는 않았지만, 호박벌은 알을 통해 전

달되는 인자의 존재를 알려준다 [40].

Therefore, in future, an in-depth study of the genetic expression‎ and epigenetic factors that might be involved in this

transfer of immunity from primed progenitors to offspring may reveal molecular characteristics of such process.

Parallel to the exposure bioassays demonstrating TgIP, we examined the degree of differentiation of haemocytes in l

arval immunity.

따라서, 미래에, 준비된 선조에서 자손으로의 면역 전달에 관여할 수 있는 유전적 발현과 후생적인 요인에

대한 심층 연구는 그러한 과정의 분자적 특성을 나타낼 수 있다. TgIP를 입증하는 노출 생물학적 정량(검정)와

병행하여, 우리는 유충 면역에서 혈구의 분화 정도를 조사했다.

Haemocytes are the immune cells of the innate immune system of invertebrates and prohaemocytes are the non-immune

competent precursor cells of all haemocyte populations, which we name here differential haemocytes. Our results point

out that maternal immune experience triggers differentiation of prohaemocytes to prepare offspring for a

prevailing pathogen.

혈구는 무척추 동물의 타고난 면역 체계의 면역 세포이며 전혈구는 모든 혈구 집단의 비면역 적격 전구체

세포이며, 여기에서 우리는 차등 혈구라고 한다. 우리의 결과는 모성 면역 경험이 우세한 병원균에 대한 자손을

준비하기 위해 전혈구의 분화를 유발한다는 것을 지적한다.

Thus, larvae containing enhanced levels of immune competent cells could possess the ability to react more rapidly to

infection, which results in reduced mortality rates. Even though in larvae a direct contact haemocyte-Pl bacterium is unlikely,

immune competent haemocytes associated with the gut tissue actively participate in the production of antimicrobial peptides

and secretion towards epithelial cells of the gut tissue and gut lumen, where the infection starts [44].

따라서, 강화된 수준의 면역 적격 세포를 가진 유충은 감염에 더 빠르게 반응할 수 있는 능력을 보유할 수있어,

사망률이 감소한다. 유충에서 직접 접촉하는 혈구-Pl 박테리아는 있을 가능성이 낮지만, 장 조직과 관련된 면역

능력이 있는 혈구는 감염이 시작되는 장 조직과 창자 내강의 상피 세포에 대한 항균 펩타이드의 생산과 분비에

적극적으로 참여한다[44].

On a related topic, a transfer of immunity to offspring upon viral infections has been shown for Lepidoptera [24]. Since

high virus titres of different viruses have been found co-infecting colonies suffering from Varroa and colony collapse

disorder [28], experimental verification of such a transfer of immunity upon viral infection in honeybees would be of

great interest.

관련 주제에서, 바이러스 감염시 자손에게 면역의 전달은 나비목 [24]에 대해 나타났다. 다양한 바이러스의

높은 바이러스 역가가 바로아 응애 및 봉군 붕괴 현상 [28]을 겪고 있는 봉군을 공동 감염시키는 것으로

밝혀졌기 때문에, 꿀벌의 바이러스 감염에 대한 그러한 면역 전달의 실험적 검증은 큰 관심을 끌 것이다.

Acknowledgements

감사의 말

We greatly acknowledge the laboratory work of Sophie Krainer. Bacterial strains were kindly donated by Eva

Forsgren from The Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala. We thank the statistician Fedor Daghofer

(Graz) for his professional help. We thank Inés Sumann for haemocyte counts and thanks are due to Gebhard

Feierl (Graz) for PCR identification of Pl. We thank the Steirische Imkerschule for providing the colonies.

우리는 소피 크라이너의 실험실 작업에 매우 감사드린다. 세균 변종은 웁살라에 있는 스웨덴 농업과학

대학의 Eva Forsgren이 기꺼이 기증했다. 전문적인 도움을 주신 통계 학자 Fedor Daghofer (Graz)에게

감사드린다. 우리는 혈구 수에 대해 Inés Sumann에게 감사하고 Pl의 PCR 식별을 위해 Gebhard Feierl

(Graz)에게 감사드립니다. 봉군을 제공한 Steirische Imkerschule에 감사드립니다.

Funding statement

자금 명세서

This work was funded by an FWF Individual Project P20510.

이 작업은 FWF 개별 프로젝트 P20510에 의해 지원되었다. 

Footnotes

주석

© 2014 The Authors. Published by the Royal Society under the terms of the Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/, which permits unrestricted use, provided the original author and source

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