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Antimicrobial properties of diethylamine NONOate, a nitric oxide donor, against Escherichia coli: a pilot study

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• Published: 28 December 2020

Antimicrobial properties of diethylamine NONOate, a nitric oxide donor, against Escherichia coli: a pilot study

• Annette M. Sysel, 
• Michael J. Dunphy & 
• Joseph A. Bauer 

The Journal of Antibiotics volume 74, pages260–265 (2021)Cite this article

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Abstract

The emergence of SARS-CoV-2, the causative agent of COVID-19, highlights the increasing need for new and effective antiviral and antimicrobial agents. The FDA has recently banned several active ingredients used in hand sanitizers, including triclosan and benzethonium chloride. Nitric oxide (NO) is involved in the innate immune response and is a major component of macrophage-mediated attack on foreign viruses and bacteria. The specific aim of this study was to assess the antibacterial effects of 2-(N,N-diethylamino)-diazenolate-2-oxide (DEA-NONOate) against Escherichia coli (E. coli). A bacterial growth assay was compared to an adenosine triphosphate (ATP) activity assay at various time points to assess effects of DEA-NONOate on E. coli growth. A UV/Vis spectrophotometer was used to determine concentration of E. coli by measuring optical density (OD) at 630 nm. A luminescent assay was used to measure ATP activity correlating to viable cells. DEA-NONOate at a concentration of 65 mM was able to inhibit the growth of E. coli with the same efficacy as 1 μg ml−1 concentration of ciprofloxacin. Both the OD and ATP assays demonstrated a 99.9% reduction in E. coli. Both a 1 μg ml−1 concentration of ciprofloxacin and a 65 mM concentration of DEA-NONOate achieved 99.9% inhibition of E. coli, verified using both optical density measurement of bacterial cultures in 96 well plates and a luminescent ATP activity assay. The bactericidal effects of DEA-NONOate against E. coli is proof-of-concept to pursue eval‎uation of nitric oxide-based formulations as antimicrobial and antiviral agents as hand sanitizers.

요약

코로나19의 원인인 SARS-CoV-2의 출현으로 인해

새롭고 효과적인 항바이러스 및 항균제의 필요성이 증가하고 있습니다.

FDA는

최근 트리클로산과 벤제토늄 클로라이드를 포함한 손 소독제에 사용되는

여러 가지 활성 성분을 금지했습니다.

산화질소(NO)는

선천성 면역 반응에 관여하며,

외래 바이러스와 박테리아에 대한 대식세포 매개 공격의 주요 구성 요소입니다.

이 연구의 구체적인 목적은

대장균(E. coli)에 대한 2-(N,N-diethylamino)-diazenolate-2-oxide(DEA-NONOate)의

항균 효과를 평가하는 것이었습니다.

대장균의 성장에 대한 DEA-NONOate의 효과를 평가하기 위해

다양한 시점에서 박테리아 성장 분석과

아데노신 삼인산(ATP) 활성 분석을 비교했습니다.

UV/Vis 분광광도계를 사용하여 630nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 E. coli의 농도를 측정했습니다. 발광 분석을 사용하여 생존 가능한 세포와 관련된 ATP 활성을 측정했습니다. 65mM 농도의 DEA-NONOate는 1μgml-1 농도의 ciprofloxacin과 동일한 효능으로 E. coli의 성장을 억제할 수 있었습니다. OD와 ATP 분석 모두 대장균의 99.9% 감소를 입증했습니다. 1μgml-1 농도의 시프로플록사신과 65mM 농도의 DEA-NONOate 모두 96웰 플레이트에서 세균 배양물의 광학 밀도 측정과 발광 ATP 활성 분석을 통해 대장균의 99.9% 억제를 달성했습니다.

대장균에 대한 DEA-NONOate의 살균 효과는

항균 및 항바이러스제로서

산화질소 기반 제제의 평가를 추구하는 개념 증명의 증거입니다.

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Introduction

One of the challenges of eval‎uating antimicrobial agents as hand sanitizers is the United States Food and Drug Administration (FDA) gold standard use of the viable plate count method, which utilizes bacteria diluted on agar plates to quantify colony forming units (CFU) following 20–24 h of incubation [1]. Interestingly, the counting of CFUs to assess antimicrobial efficacy has remained relatively unchanged since the seminal work of microbiology [2], which established the validation criteria for CFU counting. Based on counting of more than 1000 agar plates, Breed and Dotterrer determined that the number of CFUs at the end of an experiment should be between 40 and 200 colonies per plate to validate antimicrobial activity. Other microbiologists have recommended ranges between 25 and 250 CFUs [3]. Thus, dilutions of 1:100,000 (10−5), 1:1,000,000 (10−6) or even 1:10,000,000 (10−7) of bacteria are generally required to achieve a valid number of CFUs for testing antibiotic efficacy. Such dilutions are, however, tedious to perform and prone to errors.

Both the FDA and the field of microbiology are interested in developing new assays to aid in the development of hand sanitizers by replacing outdated serial dilutions and agar plate incubations that rely on manual or computer-aided colony counts. Several high-throughput assays, including broth dilution microplate assays, quantitative polymerase chain reaction assays, enzymatic assays and luminescent assays have been used to complement the viable plate count method for eval‎uation of antimicrobial activity [4,5,6,7,8,9,10]. The BacTiter-Glo™ assay is a luminescent assay that determines the number of viable bacterial cells by quantitation of adenosine triphosphate (ATP), which is a vital measure of mitochondrial cellular respiration required for cell survival. ATP bioluminescent assays have been used to effectively eval‎uate antibacterial properties of various antimicrobial test agents [11,12,13,14]. The efficacy of antibacterial agents is associated with a decrease in cellular respiration, which correlates to a decrease in ATP activity [15].

Nitric oxide (NO), is a free radical and ubiquitous signaling molecule which inhibits cellular respiration [16]. NO was discovered alongside oxygen by chemist Joseph Priestly [17]. Several studies have shown that NO and its surrogates are involved in a variety of physiologic as well as pathologic processes including cardiovascular disease [18], vascular dysfunction [19], asthma [20], pulmonary disorders [21], sepsis [22], retinopathy [23], and cancer [24, 25]. NO-generating drugs such as glyceryl trinitrate (nitroglycerin) [26] and sodium nitroprusside [27] were first used clinically for treatment of angina and regulation of hypertension respectively. More recently, NO has been used to treat Sudden Acute Respiratory Syndrome [28], Pediatric Acute Respiratory Distress Syndrome [29] and COVID-19 [30, 31], shedding light on the clinical importance of harnessing NO in a biologically compatible and useful form as a therapeutic intervention.

Nitric oxide (NO) is one of the most functionally diverse, ubiquitous, and biologically dichotomous molecules in nature, contributing to physiology as well as pathology in almost every biological setting. The double-edged nature of NO is a function of three principle factors: (1) site of NO production/delivery, (2) NO concentration, and (3) duration of NO production/delivery. NO is generated enzymatically in vivo by three enzymes known as NO synthases: NOS-1, NOS-2, and NOS-3 [32]. In addition, NO can be produced by a NO-recycle pathway from nitrate and nitrite precursors [33,34,35], elevating these once-considered inert end products to biological surrogates of NO. Nitric oxide is a crucial component of both innate and adaptive defense mechanisms and is involved in T cell-mediated immunity as well as in macrophage-mediated killing of intracellular bacteria [36,37,38]. As a free radical, NO can react with other molecules to produce reactive oxygen species (ex. Superoxide) and reactive nitrogen species (ex. peroxynitrite), which together contribute to the regulation of the immune response [39].

NO exists as a gas, and as such has proved challenging to manage for biomedical applications. Discovery of the widespread biological activities of NO have ultimately led to the development of solid, convenient dosage forms to harness NO gas, namely “NO-donors.” The first class of NO donors, which were tested for biological activity were NONOates or diazeniumdiolates [40, 41]. NONOates can be distinguished from each other based on the half-life of NO release (seconds to hours) as well as the number of moles of NO released. Thus, the physiologic or pathologic effects of NO from a NONOate can be controlled by selecting a specific NO-donor to promote cell death or invoke cellular responses. NO donors have demonstrated antibacterial, antiviral, and antitumor properties and have been included in biofilms, nanoparticles and hydrogels to expand delivery options [42,43,44,45,46,47,48]. Current trends in overcoming antibiotic resistance have utilized NO donors as prodrugs in combination with antibiotics to achieve enhanced bacterial killing [49].

In this study, we set out to eval‎uate the antimicrobial efficacy of diazeniumdiolate diethylamine NONOate (DEA-NONOate) against E. coli using both broth dilution and luminescent ATP assays to assess proof-of-concept for further eval‎uation of NO as a potential hand sanitization agent.

항균제를

손 소독제로 평가하는 데 있어 어려움 중 하나는

미국 식품의약국(FDA)의 골드 스탠다드인 생존균 수 측정법(viable plate count method)을 사용하는 것입니다.

이 방법은 20-24시간 배양 후 콜로니 형성 단위(CFU)를 정량화하기 위해 한천 배지에 희석된 박테리아를 활용합니다 [1]. 흥미롭게도, 항균 효과를 평가하기 위한 CFU의 수는 CFU 계산을 위한 검증 기준을 확립한 미생물학의 중요한 업적 [2] 이후 비교적 변하지 않고 유지되어 왔습니다. 1000개 이상의 한천 플레이트를 세어본 결과, Breed와 Dotterrer는 실험 종료 시 항균 활성을 검증하기 위해 플레이트당 40~200개의 콜로니가 있어야 한다고 결론지었습니다. 다른 미생물학자들은 25~250 CFU의 범위를 권장했습니다 [3]. 따라서 항생제 효능을 테스트하기 위한 유효한 CFU 수를 얻으려면 일반적으로 1:100,000(10-5), 1:1,000,000(10-6), 심지어 1:10,000,000(10-7)의 박테리아 희석액이 필요합니다. 그러나 이러한 희석액은 수행하기가 번거롭고 오류가 발생하기 쉽습니다.

FDA와 미생물학 분야 모두 수동 또는 컴퓨터 보조 식민지 수에 의존하는 구식 연속 희석 및 한천 플레이트 배양을 대체하는 손 소독제 개발을 돕기 위해 새로운 분석법을 개발하는 데 관심이 있습니다. 항균 활성을 평가하기 위해, 배양액 희석 마이크로플레이트 분석, 정량적 중합효소연쇄반응 분석, 효소 분석, 발광 분석 등 여러 가지 고처리량 분석법이 사용되어 왔습니다 [4,5,6,7,8,9,10]. BacTiter-Glo™ 분석법은 세포 생존에 필요한 미토콘드리아 세포 호흡의 중요한 지표인 아데노신 삼인산(ATP)의 정량화를 통해 생존 가능한 박테리아 세포의 수를 결정하는 발광 분석법입니다. ATP 발광 분석법은 다양한 항균 시험제의 항균성을 효과적으로 평가하는 데 사용되어 왔습니다 [11,12,13,14].

항균제의 효능은

세포 호흡의 감소와 관련이 있으며,

이는 ATP 활동의 감소와 관련이 있습니다 [15].

산화질소(NO)는

세포 호흡을 억제하는 자유 라디칼이자

어디에나 존재하는 신호 전달 분자입니다 [16].

NO는

화학자 조셉 프리스트리(Joseph Priestly)가 산소와 함께 발견했습니다[17].

여러 연구에 따르면

NO와 그 유사체는

심혈관 질환[18], 혈관 기능 장애[19], 천식[20], 폐 질환[21], 패혈증[22], 망막증[23], 암[24, 25]을 포함한

다양한 생리적 및 병리학적 과정에 관여합니다.

글리세릴 트리니트레이트(니트로글리세린) [26]와

나트륨 니트로프루시드 [27]와 같은 NO 생성 약물은

각각 협심증 치료와 고혈압 조절을 위해 임상적으로 처음 사용되었습니다.

최근에는

급성 호흡기 증후군(28),

소아 급성 호흡 곤란 증후군(29),

코로나19(30, 31) 치료에 NO가 사용되면서,

생물학적으로 호환되고 유용한 형태로 NO를 활용하는 것이

치료적 개입으로서 임상적으로 중요하다는 사실이 밝혀졌습니다.

산화질소(NO)는

자연계에서 가장 기능적으로 다양하고,

어디에나 존재하며,

생물학적으로 양면성을 띠는 분자 중 하나로서,

거의 모든 생물학적 환경에서 생리학 및 병리학에 기여합니다.

NO의 양면성은

세 가지 주요 요인의 기능에 의해 결정됩니다:

(1) NO 생산/전달 부위,

(2) NO 농도,

(3) NO 생산/전달 기간.

NO는

생체 내에서 NOS-1, NOS-2, NOS-3으로 알려진

세 가지 효소에 의해 효소적으로 생성됩니다 [32].

또한, NO는

질산염과 아질산염 전구물질로부터

NO 재활용 경로에 의해 생성될 수 있습니다 [33,34,35],

한때 불활성 최종 산물로 간주되었던 이들을

NO의 생물학적 대리물로 승격시킵니다.

산화질소는

선천적 방어 기제와 적응적 방어 기제 모두의 중요한 구성 요소이며,

T세포 매개 면역과 대식세포 매개 세포 내 박테리아 살해에 관여합니다 [36,37,38].

자유 라디칼인 NO는

다른 분자와 반응하여

활성 산소(예: 슈퍼옥사이드)와

활성 질소(예: 퍼옥시니트라이트)를 생성할 수 있으며,

이 둘은 함께 면역 반응의 조절에 기여합니다 [39].

NO는

기체 상태로 존재하기 때문에

생체 의학 분야에서 관리하기가 어렵다는 것이 증명되었습니다.

NO의 광범위한 생물학적 활동이 발견되면서,

NO 기체를 활용하기 위한 견고하고 편리한 투여 형태,

즉 “NO 기증자”가 개발되었습니다.

생물학적 활동을 테스트한 최초의 NO 기증자 종류는

NONOates 또는

diazeniumdiolates였습니다 [40, 41].

NONOate는

NO 방출의 반감기(초에서 시간)와 방출된 NO의 몰 수에 따라 서로 구별할 수 있습니다.

따라서,

NONOate의 NO가 미치는 생리적 또는 병리학적 영향은

세포 사멸을 촉진하거나 세포 반응을 유발하는 특정 NO-기증자를 선택함으로써 조절할 수 있습니다.

항균, 항바이러스, 항암 특성을 보이는 NO 기증자는

바이오필름, 나노입자, 하이드로겔에 포함되어 전달 옵션을 확대하는 데 사용되었습니다 [42,43,44,45,46,47,48].

항생제 내성을 극복하기 위한 현재의 추세는

항생제와 함께 NO 기증자를 전구약물로 사용하여

박테리아 살상 효과를 높이는 데 활용되고 있습니다 [49].

이 연구에서는 대

장균에 대한 디아제늄디올레이트 디에틸아민 NONOate(DEA-NONOate)의 항균 효과를 평가하기 위해,

NO를 잠재적인 손 소독제로서 추가 평가하기 위한 개념 증명을 평가하기 위해,

배양 희석법과 발광 ATP 분석을 모두 사용했습니다.

Methods

Reagents

DEA-NONOate (Enzo Biochem; Farmingdale NY), high performance liquid chromatography-grade water, and consumables were purchased from VWR Scientific (Radnor, PA). The BacTiter-Glo™ kits were provided as a generous donation from Promega Corporation (Madison, WI).

Preparation of E. coli and Broth dilution and CFU assays

We chose to examine the effects of DEA-NONOAte on E. coli as previous studies have shown that E. coli is susceptible to NO [50]. Briefly, E. coli ATCC® 11229™ KWIK-STIK™ was inoculated on agar plates according to manufacturer’s instructions using Mueller–Hinton (MH) medium (MilliporeSigma; Burlington, MA). An individual colony was selected and grown to midlog phase, in accordance with standard microbiological techniques, by growing the culture in MH medium overnight at 37 °C and 275 rpm in a shaking incubator. The E. coli broth was then diluted to an absorbance of 0.01 (corresponding to ~10 million cell counts) for the broth dilution assay and transferred to 96 well plates. OD was determined using a spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc.; Winooski, VT) and samples were analyzed at 630 nm as previously described for MH medium [51]. Each treatment, including the untreated control, was eval‎uated in sextuplicate (n = 6). For qualitative comparison of each treatment, CFUs were manually counted after 20 h of incubation on three plates in accordance with FDA guidelines [1].

DEA-NONOate stocks were prepared in water and diluted in MH broth to achieve final concentrations of 8 and 65 mM. DEA-NONOate (65 mM) was selected as the high dose as it represented the theoretical maximum for the solubility of NO gas in water from a commercial gas cylinder at 500 psig [52]. DEA-NONOate (8 mM) was selected as the low dose as scouting studies demonstrated bactericidal activity assessed after 3 h (data not shown). Ciprofloxacin was used as a positive control at a concentration of 1 μg ml−1, which has shown to be effective against E. coli [53].

BacTiter-Glo™ ATP assay

A BacTiter-Glo™ Microbial Cell Viability assay was conducted according to manufacturer’s instructions (Promega; Madison, WI). E. coli was diluted to a starting absorbance of 0.01. BacTiter-Glo™ Reagent was added directly to the bacterial cells, supporting generation of a luminescent signal. Samples were transferred to 96 well white tissue culture plates and analyzed using a GloMax Navigator luminometer (Promega; Madison, WI). Each treatment, including the untreated control, was eval‎uated in sextuplicate (n = 6). Quantitation of cellular ATP, as indicated by luminescent signal, was proportional to the number of viable bacterial cells in each sample.

Results

At 20 h, both ciprofloxacin (1 μg ml−1) and DEA-NONOate (65 mM) inhibited bacterial growth, resulting in between 0 and 2 CFUs after manual counts of three agar plates. Untreated plates and DEA-NONOate (8 mM)-treated plates were fully confluent and could not be counted (data not shown).

Consistent with the plate counts, the broth dilution assay showed the greatest inhibition of E. coli growth by DEA-NONOate (65 mM) at 20 h, resulting in 99.9% reduction in E. coli (3 log reduction) (Fig. 1a, b). DEA-NONOate (65 mM) outperformed ciprofloxacin (1 μg ml−1) at every time point in the BacTiter-Glo™ assay (Fig. 2a, b).

Fig. 1

E. coli were treated with DEA-NONOate and eval‎uated at various time points for growth inhibition. Each data point represents the average ± SEM. a Inhibition of E. coli assessed by optical density (OD) growth assay, b percent inhibition as assessed by OD

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Fig. 2

E. coli were treated with DEA-NONOate and eval‎uated at various time points for growth inhibition. Each data point represents the average ± SEM. a Inhibition of E. coli assessed by BacTiter-Glo™ ATP activity, b percent inhibition as assessed by ATP activity

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Growth inhibition assessing the optical density (OD) was comparable to the decrease in ATP activity illustrating the usefulness of the BacTiter-Glo™ assay as a viable addition to bacterial counting assays. Of interest, the antibacterial effects of DEA-NONOate at a concentration of 8 mM were significant at all times points compared to untreated controls assessing the broth dilution assay similar to the ATP assay with the exception of the 20 h time point (BacTiter-Glo™) which was not significant.

Discussion

Currently, several hand sanitizers, including alcohol-based hand sanitizers [54], are not effective at killing bacteria and viruses as labeled, and are currently under review by the FDA. Antimicrobial resistance is among the top three threats to global health [55] and must be considered when designing a hand sanitization agent.

The use of NO as a hand sanitizing agent is warranted based on the antimicrobial properties of NO and its proven use in various formulations [56]. Several studies have demonstrated antimicrobial activity of NO using diazeniumdiolates [47], the most widely available solid-dose form capable of generating NO. The diazeniumdiolate PROLI-NONOate [57], which very quickly releases NO, has demonstrated 99% growth inhibition (3 log reduction) of both Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis at a concentration of 25 mM examined after a 2 h treatment period with no additional time points measured. Our study eval‎uated 8 mM DEA-NONOate, which demonstrated ~80% inhibition of E. coli at 2 h; this effect was not sustained at 20 h. DEA-NONOate has a slower release of NO (t½ = 2 min. at 37 °C) compared to PROLI-NONOate (t½ = 1.8 sec. at 37 °C), which may account for differences in bactericidal effect. As well, treatments should ideally be examined at 20–24 h to appropriately determine log reduction [1].

Other NO-donors, including modified S-nitroso-penicillamine, have demonstrated inhibition of E. coli and S. epidermidis growth when used at concentrations in the low mM range [58]. A 2.5 mM concentration of polyethylenimine-based NO donor had some efficacy against E. coli and Staphylococcus aureus bacterial suspensions [59] but failed to achieve 3 log reduction. The NO-donor nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) exhibited some activity against Coxsackievirus [60]; interestingly, this NO-donor induced nitrosylation of a critical cysteine residue in the active site of Coxsackievirus protease 3 C, and this reaction was proposed to be its mechanism of antibacterial action.

Both nitrate and nitrite have been shown to generate NO in vivo. Studies have examined the efficacy of nitrite as well as NO derived from a 0.002 mM concentration of DETA-NONOate against E. coli and Shewanella oneidensis [50]; nitrite was more effective against S. oneidensis whereas NO was more effective against E. coli [50], which may be a result of nitrite reduction mechanisms. The antimicrobial action of NO derived from sodium nitrite against verotoxigenic E. coli O157:H7 was demonstrated at NO concentrations of 84 mM [61] which compares more closely to the results of this study. Some studies have also shown that nitrite at 1 mM can inhibit bacteria such as Helicobacter pylori [62]. Although our results demonstrate that much higher millimolar concentrations of NO are required to achieve 99.9% growth inhibition, differences in NO-donor antibacterial efficacy can most likely be attributed to the release characteristics specific to each NO donor.

Direct use of NO gas has been shown to be effective against E. coli, Pseudomonas aeruginosa, and S. aureus [63] as well as other bacterial pathogens [64]. A Phase I clinical trial of patients with cystic fibrosis demonstrated that 160 ppm (5.3 mM) NO delivered for 30 min three times daily for 5 days, administered in 2 cycles, reduced CFU of several bacteria (including E.coli) and lessened lung infection [65]. Inhaled NO (6.6 mM) was also effective in treating patients with pneumonia [66]. A quantitative modeling study eval‎uated continuous in vitro NO generation and determined that a concentration of at least 0.002 mM was required for optimal antibacterial activity [67]. Another in vitro study [68] examined NO gas (5.3 mM), which demonstrated efficacy against S. aureus with 6 cycles of NO gas every 30 min via continuous exposure; however, the antibacterial effects may have been due to the production of nitrogen dioxide (derived from NO when reacted with oxygen) or the formation of peroxynitrite [69] (a product of NO) and superoxide [70], both of which have been shown to be antibacterial. Other studies have demonstrated an antibacterial response by peroxynitrite derived from NO [71].

Our study demonstrates the utility of NO against E. coli at concentrations of 8 mM and 65 mM. A concentration of 65 mM DEA-NONOate after 20 h of exposure resulted in a 3-log reduction in bacterial growth in accordance with FDA guidelines. DEA-NONOate at 8 mM was effective at reducing bacterial load at all time points compared to untreated controls which supports the use of low doses of DEA-NONOate, or other NO-donors, for use against lower bacterial loads such as those found on human hands. Hand sanitizers are tested on human hands at bacterial loads below 1 million CFUs, which is tenfold below the starting CFUs used in this study [72]. Normal bacteria skin flora is highest on the scalp at 1 million CFUs/cm2 and has been shown to exceed 4 million CFUs on the hands of medical personnel [72, 73]. It will be interesting to assess 8 mM DEA-NONOate in the clinical setting eval‎uating lower bacterial loads, which may support its use as an effective hand sanitizing agent with single or multiple uses in hand washing.

Differences in effective antibacterial concentration between this study and by other studies can be attributed to the nuances of each bacterial strain, bacterial load, growth conditions, exposure times, differences in NO donor release profiles, production of NO-derived oxidants such as peroxynitrite, measurement techniques or other confounding variables not readily identifiable.

Our study supports the use of the BacTiter-Glo™ assay as a viable alternative to gold standard CFU plate counts. The BacTiter-Glo™ assay correlated to the CFU counts as did OD of bacterial suspensions. The BacTiter-Glo™ assay thus represents a high-throughput method for eval‎uation of antimicrobial agent efficacy.

In conclusion, the application of NO as an antimicrobial agent is promising. Use of NO, in combination with antibiotic agents, may be a viable option to address antibiotic resistance. FDA approval of NO as a hand sanitizing agent will require formal eval‎uation against a panel of bacteria and fungi, as well as clinical testing, but is much needed as effective hand sanitizing agents are in great demand.

토론

현재, 알코올 기반 손 소독제 [54]를 포함한 여러 손 소독제가 표시된 대로 세균과 바이러스를 죽이는 데 효과적이지 않다는 사실이 밝혀져, 현재 FDA의 검토를 받고 있습니다. 항생제 내성은 세계 보건에 대한 위협 3대 요소 중 하나이며 [55], 손 소독제를 설계할 때 반드시 고려해야 합니다.

NO를 손 소독제로 사용하는 것은 NO의 항균 특성과 다양한 제형에서의 입증된 사용을 근거로 할 수 있습니다 [56]. 여러 연구에서 NO를 생성할 수 있는 가장 널리 이용되는 고체 투여 형태인 디아제늄디올레이트를 이용한 NO의 항균 작용을 입증했습니다 [47]. NO를 매우 빠르게 방출하는 디아제늄 디올레이트 PROLI-NONOate [57]는 2시간의 처리 기간 후 추가적인 시간 지점 측정 없이 25mM의 농도에서 Aggregatibacter actinomycetemcomitans와 Porphyromonas gingivalis 모두에 대해 99%의 성장 억제(3log 감소)를 입증했습니다.

우리의 연구에서는 8mM DEA-NONOate를 평가했는데, 2시간에 대장균을 약 80% 억제하는 것으로 나타났습니다. 이 효과는 20시간 후에는 지속되지 않았습니다. DEA-NONOate는 PROLI-NONOate(t½=37°C에서 1.8초)에 비해 느린 NO 방출(t½=37°C에서 2분)을 가지고 있으며, 이것이 살균 효과의 차이를 설명할 수 있습니다. 또한, 로그 감소를 적절하게 결정하기 위해 20-24시간에 치료를 검사하는 것이 이상적입니다 [1].

수정된 S-니트로소-페니실라민을 포함한 다른 NO-기증자들은 저mM 범위에서 농도로 사용될 때 대장균과 황색포도상구균의 성장을 억제하는 것으로 나타났습니다 [58]. 2.5mM 농도의 폴리에틸렌이미인 기반 NO 기증자는 대장균과 황색포도상구균 세균 현탁액에 대해 어느 정도의 효능을 보였지만 [59], 3log 감소에는 실패했습니다. NO-기증자 nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP)은 콕사키바이러스[60]에 대해 약간의 활성을 나타냈습니다. 흥미롭게도, 이 NO-기증자는 콕사키바이러스 프로테아제 3C의 활성 부위에서 중요한 시스테인 잔기의 니트로실화를 유도했으며, 이 반응이 항균 작용의 메커니즘으로 제안되었습니다.

질산염과 아질산염 모두 생체 내에서 NO를 생성하는 것으로 나타났습니다. 연구에 따르면 E. coli와 Shewanella oneidensis에 대한 0.002mM 농도의 DETA-NONOate에서 유래된 NO뿐만 아니라 아질산염의 효능도 조사되었습니다 [50]; 아질산염은 S. oneidensis에 더 효과적이었고, NO는 E. coli에 더 효과적이었습니다 [50], 이는 아질산염 감소 메커니즘의 결과일 수 있습니다. 아질산나트륨에서 유래된 NO의 항균 작용이 E. coli O157:H7에 대한 항균 작용을 나타낸다는 사실이 NO 농도 84mM에서 입증되었습니다[61]. 이는 본 연구의 결과와 더 가깝습니다. 일부 연구에서는 1mM의 아질산이 헬리코박터 파일로리와 같은 박테리아를 억제할 수 있다는 사실도 밝혀졌습니다[62]. 우리의 연구 결과에 따르면 99.9%의 성장 억제를 달성하기 위해서는 훨씬 더 높은 밀리몰 농도의 NO가 필요하지만, NO-기증 항균 효능의 차이는 각 NO 기증자의 특정한 방출 특성에 기인할 가능성이 큽니다.

NO 가스를 직접 사용하는 것은 E. coli, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus [63] 및 기타 세균성 병원체 [64]에 효과적이라는 것이 입증되었습니다. 낭포성 섬유증 환자의 1단계 임상 시험에서 5일 동안 하루에 세 번, 30분 동안 160ppm(5.3mM)의 NO를 2회 주기로 투여한 결과, 여러 박테리아(대장균 포함)의 CFU가 감소하고 폐 감염이 감소하는 것으로 나타났습니다[65]. 흡입된 NO(6.6mM)도 폐렴 환자의 치료에 효과적인 것으로 나타났습니다[66]. 양적 모델링 연구를 통해 연속적인 체외 NO 생성을 평가한 결과, 최적의 항균 작용을 위해서는 최소 0.002mM의 농도가 필요하다고 결론지었습니다 [67]. 또 다른 체외 연구 [68]에서는 NO 가스(5.3mM)를 조사한 결과, S. aureus는 30분마다 6주기의 NO 가스를 지속적으로 노출시키면 항균 효과가 나타날 수 있습니다. 그러나 항균 효과는 이산화질소(산소와 반응할 때 NO에서 생성됨)의 생성 또는 퍼옥시니트라이트[69](NO의 생성물)와 슈퍼옥사이드[70]의 형성 때문일 수 있으며, 둘 다 항균 효과가 있는 것으로 나타났습니다. 다른 연구에서는 NO에서 파생된 퍼옥시니트라이트의 항균 효과를 입증했습니다[71].

우리의 연구에 따르면, 8mM 및 65mM 농도의 NO가 대장균에 대한 유용성을 입증합니다. 20시간 노출 후 65mM DEA-NONOate 농도는 FDA 지침에 따라 세균 성장의 3-log 감소를 가져왔습니다. 8mM의 DEA-NONOate는 처리되지 않은 대조군과 비교했을 때 모든 시점에서 세균 부하를 감소시키는 데 효과적이었습니다. 이는 사람의 손에서 발견되는 것과 같은 낮은 세균 부하에 사용하기 위해 저용량의 DEA-NONOate 또는 다른 NO-donor의 사용을 지지합니다. 손 소독제는 사람의 손에서 1백만 CFU 미만의 세균 부하를 테스트하는데, 이는 이 연구에 사용된 시작 CFU의 10분의 1 수준입니다 [72]. 정상적인 박테리아 피부 세균총은 두피에서 1백만 CFU/cm2로 가장 많으며, 의료진의 손에서는 4백만 CFU를 초과하는 것으로 나타났습니다 [72, 73]. 임상 환경에서 8mM DEA-NONOate를 평가하여 세균 부하를 낮추는 것이 흥미로울 것입니다. 이는 손을 씻을 때 한 번 또는 여러 번 사용하는 효과적인 손 소독제로서의 사용을 뒷받침할 수 있습니다.

이 연구와 다른 연구들 사이의 효과적인 항균 농도의 차이는 각 박테리아 균주, 박테리아 부하, 성장 조건, 노출 시간, NO 기증자 방출 프로파일의 차이, 퍼옥시니트라이트와 같은 NO 유도 산화제의 생성, 측정 기술 또는 쉽게 식별할 수 없는 기타 혼란 변수들의 미묘한 차이에 기인할 수 있습니다.

우리의 연구는 BacTiter-Glo™ 분석법을 금본위 CFU 플레이트 카운트의 실행 가능한 대안으로 사용할 수 있음을 뒷받침합니다. BacTiter-Glo™ 분석법은 박테리아 현탁액의 OD와 마찬가지로 CFU 카운트와 상관관계가 있습니다. 따라서 BacTiter-Glo™ 분석법은 항균제의 효능을 평가하기 위한 고처리량 방법을 나타냅니다.

결론적으로, NO를 항균제로 사용하는 것은 유망한 방법입니다. 항생제와 함께 NO를 사용하는 것은 항생제 내성을 해결할 수 있는 실행 가능한 옵션이 될 수 있습니다. FDA가 NO를 손 소독제로 승인하려면 임상 시험뿐만 아니라 박테리아와 곰팡이 패널에 대한 공식적인 평가가 필요하지만, 효과적인 손 소독제에 대한 수요가 매우 높기 때문에 매우 필요합니다.

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