형질전환기술(5)

[동촌]

E. coli 형질전환 실험보고서

1. Transformation의 원리

(1) 형질전환의 시작

 형질전환은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 일을 말한다. 형질전환은 1928년 영국의 F.그리피스가 폐렴쌍구균(肺炎雙球菌)을 이용하여 실시한 실험이 계기가 되어 발견되었다. 다당류로 이루어진 두꺼운 막, 즉 협막(莢膜)을 가진 S형균으로부터 DNA를 추출하여 이것을 다당류성 협막을 가지지 않은 R형균에 작용시키면 R형균의 일부가 S형균으로 변한다. 이것은 S형 세균의 DAN가 R형 세균 속에 들어가서 유전자 발현을 하기 때문이다. 전환을 일으키는 데 필요한 DNA의 최소량은 약 10만분의 1 mol이며, DNA의 single strand를 주는 것보다도 double strand를 주는 쪽이 전환을 일으키기 쉽다. 형질전환 실험에 의하여 유전자의 본체가 DNA라는 것이 밝혀졌다. 그러나 고등생물에 있어서도 세균류에서 볼 수 있는 것 같은 형질전환이 일어나는지 어떤지는 아직 밝혀지지 않았다.

                                                       클로닝 운반체로 작용하는 pBR322

                                                                     클로닝 운반체로 작용하는 pBR322

                                                      plasmid의 정상상태에서와 재조합된 형태 

(2) 형질전환의 메커니즘 

 competent 세포는 만약 그 단편이 적당하게 크다면 이중가닥으로 된 DNA단편과 결합한다.

이 과정은 임의적이며 그리고 공여 단편은 다른 것과 경쟁한다. DNA 흡수는 에너지 소모를 필요로 한다. 하나의 가닥은 외피와 연결된 exonuclease에 의해 수소결합으로 되어 있다. 다른 가닥은 작은 단백질로 연결되고 원형질막을 통해 이동한다. 단일가닥으로 된 단편은 게놈의 상응하는 지역으로 정렬되고 평균적으로 되어있다.

그람 음성세균인 Haemophilus influenzae에서의 형질전환은 여러 면에서 S.pneumoaiae에서와 다르다. Haemophilus는 competence 의 발달을 자극하는 competence인자를 생성하지 못한다. 그리고 그것은 오로지 상대적인 종으로부터 DNA를 추출할 수 있다. 단백질로 복잡화된 이중가닥의 DNA 는 막소낭에서 추출된다. Haemophilus의 형질전환의 특별성은 특별한 11개 염기쌍 서열(5'AAGTGCGGTCA3')에 기인하고 Haemophilus influenzae DNA에서 600번 재현된다.

(3) E.coli의 형질 전환(transformation)

① Competent cell

 DNA를 받아들일 수 있는 능력을 가진 cell을 말하며, E.coli strain을 0.1M CaCl2 처리를 통하여 얻을 수 있다. 보통 사용하는 E.coli 균주는 M13 phage DNA 경우 XLI-Blue가

사용되며 plasmid transformation을 위한 균주는 DH5α 또는 XLA-Blue 등이 사용된다.

② 형질 전환시 E.coli의 특성

 Plasmid의 흡수와 안정된 보존은 plasmid가 보유하고 있는 유전자의 발현을 발견함으로써

감시할 수 있다. E.coli는 일반적으로 생장 저해요소인 Ampicillin이나 Tetracyclin과 같은

한생물질에 감수성이 있다. 그러나 대장균 세포가 일반적인 클로닝 운반체인 pBR322

plasmid를 보유하면 이러한 항생물질에 저항성을 띠게 된다. 이는 Ampicillin을 비독성화

시키는 효소인 β-lactamase와 Tetracyclin의 독성을 제거하는 효소를 암호하는 유전자를

pBR322가 갖고 있기 때문이다. pBR322의 흡수는 대 장균이 ampstets로부터(S=감수성),

ampRtetR(R=감수성)으로 형질 전환함으로써 감지 할 수 있다.

최근 형질전환(transformation)이라는 말은 DNA분자의 흡수를 세포에서 감지할 수 있고, 또 그 변화를 알 수 있거나 또는 DNA를 흡수하는 세포는 세균, 진균, 동물, 식물에 상관없이 확대되었다.

③ 저항성이 나타나는 원리

 저항성은 plasmid에 의해 암호화 되고 항생물질의 독성을 제거하는 효소가 형질 전환된 세포에서 만들어짐으로써 나타난다. 접종하기 전에 세포들은 항생물질이 없는 소량의 액체배지에서 잠시 동안 배양한다. 이러한 처리는 plasmid의 복제와 발현을 시작 하도록 하며, 이 세포들이 접종되고 항생물질에 접했을 때는 이미 생존하기에 충분히 필요한 저항성 효소가 합성되어 있다.

   대장균을 이용하여 사람의 인슐린을 대량 생산하는 과정.

   대장균을 이용하여 사람의 인슐린을 대량 생산하는 과정.

2. 실험재료

     1. 실험에 사용할 Ligation된 DNA

     2. Control로 사용할 plasmid DNA (pBR 322 or 다른 vector DNA)

     3. Competent cell (heat shock용)

     4. LB AP50(ampicillin) plate

     5. water bath

     6. vortex, pippet

3. 실험방법

(1) competent cell 제조

  1) 3ml LB에서 overnight culture한 E.coli DH5α strain을 25 ml LB (in 250 ml

    flask)에 1/100 dilution, 접종하여 37℃ incubation한다.

  2) 배양액을 5,000 rpm, 5min, centrifuge하고 상등액은 버린 후, pellet에 0.4ml 

    volume의 차가운 TFBI buffer를 가하고 suspension시킨다.

  3) ice에 5min 방치 후 다시 centrifuge하고, pellet에 1/25 volume의 ice-cold TFBII

    buffer를 가하여 suspension한다.

  4) ice에 60분 방치한다.

  5) 차가운 0.1N CaCl₂을 첨가한 후, 가볍게 suspension

  6) ice에서 10분간 incubation한다.

  7) 4000rpm 5min centrifuge후 상등액 제거한다.

  8) 2ml의 차가운 0.1N CaCl₂를 넣고, 가볍게 suspension

  9) 200ul씩 1.5ml tube에 옮겨 담는다.

(2) transformation 방법

  1) 1.5ml microcentrifuge tube에 competent cell 100μl를 준비후 plasmid DNA 100ng

    을 가한다.

              '-' Control sample: no DNA

                 Test sample 1 :  ligatilon된 DNA

                 Test sample 2 :  pBR322 (control plasmid)

  2) ice에 60분간 방치

  3) 37℃에서 45초 heat shock를 가한 후 재빨리 얼음으로 옮겨 2분 동안 방치한다.

  4) LB 1.5ml를 가한 후 전체 용액을 test tube로 옮겨 37℃ waterbath에서 30분

    shaking incubation

  5) shaking이 끝난 후 잘 섞은 후, 이중 150 μ를 LB+ampicillin plate에

    spreading하여 37℃에서 overnight culture 

  6) Colony확인

4. 실험결과

	No DNA (negative control)	Ligation DNA	Control DNA (pBR322 or Vector DNA)
Colony 수	0	11	233

5. 실험고찰 

 실험과정에서 몇 가지 살펴보면 ampicillin이 들어간 plate를 사용한 이유는 우리가 사용한 host cell인  DH5α strain의 경우 ampicillin 내성이 없으므로 ampicillin 배지에서 배양 될 수 없는 특징을 가진다. 우리가 ligation된 DNA나 control로 사용한 vector DNA(pBR 322)의 경우는 ampicillin 내성을 가지므로, 이 두개의 DNA가 DH5α로 들어감(insertion)으로써, host cell인 DH5α가 ampicillin 내성을 가지게 되는 것이다. 이러한 형질전환 원리를 통해 실험을 진행하였다.

 또한 실험과정에서 heat shock을 주어 2종의 ampicillin 내성 DNA를 숙주세포인 DH5α에 insertion시키게 되는데 특히, heat shock 주기 전, DH5α를 1시간정도 ice에 밖아 두는 이유는 competent cell을 춥고 배고픈 상태 즉, 최악의 조건, 상태를 만들어 주어 외부 DNA를 쉽게 받아들일 수 있게 하기 위함이었다.

  실험 결과를 살펴보면 control인 pBR322 DNA를 사용한 Plate에서는 많은 수의 colony가 생성됨을 확인할 수 있었다. 또한 negative control로 사용된 plate에서는 colony가 생성되지 않음을 확인할 수 있었다. 만약, negative control에서 colony가 발생하였다면, 이는 배지를 잘 못 만들었을 수 있고, 아니면 다른 ampicillin 내성 유전자를 가진 미생물에 오염 되었을 가능성을 가질 수 있을 것 같다. 그리고 한가지 더 vector DNA을 넣은 plate에서 많은수의 colony가 생기고 ligation DNA쪽에서 colony가 적게 나온 이유는 ligation상태가 완벽하게 붙은 상태가 아니기 때문인 것 같다.

 이번 실험에서는  pBR322등에 내포된 ampicillin 저항성 유전자가 발현하여 ampicillin에 저항능력이 형질전환 통하여 생성되었음을 확인할 수 있는 실험이라 결론을 내릴 수 있을 것 같다. 실험은 성공적임^^

6. 참고문헌

일반 미생물학  2001년 판

최신 분자생물학 2002년 판

Experiment 5

1. 실험제목: 유전자 조작 실험 1, Plasmid 및 DNA의 순수분리와 재조합 DNA 분자 제조

2. 실험목적: 유전공학에서 사용되는 기초실험인 plasmid DNA의 분리기술을 습득하고, 재조합 DNA 분자의 제조방법을 이해한다.

3. 실험원리

☐plasmid preparation

-플라스미드를 정제한다.

E.coli는 genomic DNA이외에 독립적으로 복제가 가능한 Plasmid DNA를 가질 수 있는데 이러한 플라스미드를 가진 E.coli로부터 플라스미드DNA를 분리 정제하는 과정.

☐plasmid

-플라스미드는 박테리아의 세포안에 존재하는 박테리아 크로모좀 이외의 작은 원형의 DNA분자 입니다. 형태는 원형이고, 이중 나선으로 되어 있으며, 박테리아의 유전자와는 독립적으로 분열할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 그러한 이유로 유전자 클로닝을 위한 벡터로 많이 사용되는 것 중 하나입니다. 벡터란 유전자 클로닝시에 우리가 원하는 유전자를 숙주 세포안으로 이동시켜 그 안에서 다량으로 복제 가능하도록하는 일종의 운반체를 말하며, 플라스미드는 그를 위한 조건을 가지고 있습니다. 우선 자가 복제를 위한 복제 기점 (origin of replication)을 가지고 있으며, 유전자의 발현, 즉 삽입된 유전자의 전사를 유도하는 promoter, 나중에 세포 배양에 의한 대량 생산후에 플라스미드가 들어간 세포와 그렇지 않은 세포를 구별해 내기위한 selective marker, 그리고 숙주안에서의 copy number 를 조절하는 replicon, 그리고 원하는 유전자를 끼워 넣을 수 있는 insertion site 등을 가지고 있습니다. insertion site는 제한 효소에 의해 잘려질 수 있는 부위인데요. 거기로 우리가 복제를 원하는 유전자를 삽입할 수 있습니다. 플라스미드와 항생제의 관계를 selection 에 있습니다. 유전자 클로닝 시에 플라스미드가 들어간 숙주세포와 그렇지 않은 세포를 가려낼 때 이용하는 것 중 하나가 플라스미드가 가지는 항생제 저항성 유전자 입니다. 플라스미드는 한개 또는 2개 이상의 항생제 저항성 유전자를 가집니다. 이 유전자는 항생제를 분해할 수 있는 물질을 생산해 내며, 플라스미드를 숙구 세포에 넣은 후에 항새제가 들어간 배지에서 배양을 하면, 숙주 세포 중에서 플라스미드가 들어간 것은 플라스미드의 항생제 저항 유전자 덕분에 살아남을 수 있지만, 플라스미드가 들어가지 않은 숙주 세포는 항생제 저항 물질을 생산하지 못하기 때문에 죽게 됩니다. 또한 플라스미드의 inseertion site가 항생제 저항 유전자의 가운데에 위치하는 경우에는 원하는 유전자의 플라스미드 내 삽입이 안전하게 되면 항생제 저항 유전자가 갈라지기 때문에 그 활성을 할 수가 없게 되어, 항생제 첨가 배지에서 죽게 됩니다. 이런 식으로도 selection이 가능합니다. 플라스미드는 필요에 따라서 인공적으로 생산되기도 합니다. 원활한 selection을 위해서 다른 유전자를 집어넣거나, 하는 등입니다.

☐Plasmid의 구성

Plasmid는 크게 다음과 같은 세 부분으로 구성되어 있습니다.

1) Replication origin

이 부분은 plasmid가 자가복제할 때 처음 인식하는 부위이므로 모든 plasmid에 꼭 필요한 부분입니다. 그림에서 보이는 ColE1 ori라고 씌여진 부분입니다.

다른 곳에서 설명할 기회가 없을 것 같아 여기에서 설명하는데, f1(+) origin이라는 것이 보이지요? 이것은 사실 plasmid의 origin of replication이 아니라 bacteriophage의 origin입니다. 이걸 여기에 삽입해 놓으면 이 plasmid가 때로는 bacteriophage처럼 행동하기도 합니다. Bacteriophage의 장점은 life cycle 중에서 single stranded DNA로 존재할 때가 있다는 것인데, 이런 성질이 유용할 때가 있습니다. 어느 쪽 strand가 single strand 상태로 존재하는가에 따라 f1(+) 혹은 f1(-) origin을 이용합니다.

2) Antibiotics resistance gene

이것은 항생제에 내성을 나타내는 유전자입니다. 대개는 ampicillin resistance gene이 들어 있는데, 이 경우 여기서 나오는 단백질은 그 유명한 beta-lactamase입니다. AmpR이라고 씁니다. 때로는 kanamycin resistance gene을 쓰기도 하고, eukaryote expression‎ vector에는 주로 neomycin resistance gene이 들어 있습니다.

3) Multiple cloning site(MCS)와 LacZ'

이 부위는 제한효소로 잘릴 수 있는 부위를 한꺼번에 모아놓은 부분입니다. 제한효소로 잘라서 다른 DNA를 삽입시킬 때 위에서 설명한 중요한 부분들이 같이 잘리면 곤란하겠지요. 그래서 다른 부분은 절대 잘리지 않고 이 부분에만 잘릴 수 있도록 열 몇가지 제한효소 절단부위를 인위적으로 조작해 놓은 것입니다. 이 MCS 부위는 길어야 100 - 150 bp 정도이며 앞 뒤 부분에 SP6, T3, T7 promoter 등이 붙어있게 됩니다. 이런 부위는 RNA를 시험관에서 만들거나 단백질 발현을 시킬 때, 그리고 DNA sequencing 같은 실험을 할 때 쓰이는 부위입니다. 여기에 써 있는 제한효소는 실험실에서 고추장 된장 간장 등에 해당하는 것으로 이름을 반드시 알아야 하겠습니다. 때로는 절단부위까지도 대개 외우고 있게 됩니다.LacZ'는 꼭 필요한 것은 아니지만 대개는 있으며 반드시 MCS(multiple cloning site)를 포함하고 있습니다.

4. 실험방법

♣alkaline lysis method

alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리 될 수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균 되어 진다(여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다). 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며(SDS는 potassium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.

☐plasmid prep 시 사용되는 solution I,II,II 의 성분들의 역할

solution1: EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여

          세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의

          외형을 유지시켜준다. 이 과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가

          완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와

          구분할 수 없게 된다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는

          것이다.

solution2 : SDS는 ionic detergent로 세포막을 깨는 일을 합니다. NaOH는 DNA를

           denaturation시킵니다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게

           처리한다.

solution3 : Renature시키는 산성용액이다. 이렇게 해서 Chromosomal DNA는 SDS와

           potassium과 함께 엉기게 된다.

♣Polymerase chain reaction

주형이 되는 double strand DNA의 표적 부분의 양끝 염기 배열 정보로부터 상류와 하류의 DNA primer를 합성하고 내열성 DNA polymerase(Taq polymerase)와 thermocycler를 이용해 PCR반응에 따른 특정 유전자 영역의 증폭을 실시한다. 이론적으로는 반응 사이클의 2n으로 증폭이 가능하다.

1.Denaturation temperature(보통 94℃)

2.Hybridization or annealing temperature

3.Extension temperature(보통 74℃, 이는 Taq polymerase의 최적 활성 온도보다 약간 낮은 온도임)

중합효소 연쇄반응이 이용되는 실험

1) Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭

2) 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning

3) DNA sequencing

4) 돌연변이 검사

5) 병인성 바이러스 및 박테리아 검출

6) 유전자의 footprinting

7) 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)

중합효소 연쇄반응의 의학적 응용

1) HLA형의 결정

2) 법의학: 특정인의 유전자 검출

3) 암유전자의 검출: ras, myc, fos 등

4) 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy (Duchenne type)등

5) 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등

중합효소 연쇄반응은 다음과 같이 세 단계로 이루어진다.

1) DNA의 변성(denaturation)

90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.

2) Primer의 결합(annealing)

50°C∼65°C에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 표 1과 같다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.

3) DNA의 합성(polymerization)

70°C∼74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.

위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.

☐ PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점

1. 10x PCR 완충용액

1) Magnesium

다음과 같은 여러가지에 영향을 주는 중요한 요소이다.

A, Primer가 template DNA에 결합하는 능력

B. Template 및 PCR 산물의 변성온도

C. Product specificity

D. dNTP와의 결합

E. Taq DNA polymerase의 활동성

F. Primer-dimer artefact의 형성

a) 반응물내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려 주어야 하고, dNTP나 template의 농도가 높으면 MgCl2의 농도를 높게 변화시켜야 한다.

b) 위에 나열한 Mg의 기능중 A, B, C, D는 농도가 높을수록 실험에 유익하고 E, F는 농도가 낮을수록 실험에 유익하므로 최적 농도를 유지할 수 있도록 노력해야 한다.

c) 반응이 잘 일어나지 않으면 0.5 mM부터 2.5 mM(때로는 8 mM까지)사이에서 농도를 변화시켜 가면서 최적조건을 찾도록 한다.

2. Taq DNA polymerase

Taq는 온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동 적정온도는 70°C∼74°C이며 95°C에서 40분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다. 이 효소가 발견되기 전에는 Klenow 효소를 이용하여 매 cycle마다 효소를 첨가해 주면서 반응을 시켜야만 했다. DNA 합성의 오차율은 1.1×10-4 bp로 DNA polymerase I의 오차율(1.0×10-5)보다 높는데 이는 Taq DNA polymerase가 잘못 들어간 nucleotide를 삭제하고 다시 합성하는 proofreading 기능(3'→5' exonuclease activity)이 없기 때문이다. 따라서 PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되더라도 반드시 확인과정을 거쳐야 한다. 한번의 반응에 사용하는 효소의 양은 보통 0.5-5 unit 정도인데 양이 너무 많으면 비특이 적인 DNA가 형성될 가능성이 많고, 너무 적으면 증폭 산물이 부족하게 되므로 최적 조건을 찾도록 노력해야 한다.

3.Template DNA

선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA(cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을때 반응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다. Chromosomal DNA인 경우 1 μg 이내, plasmid DNA의 경우 100 pg∼100 ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.

4. Primer (제작시 고려해야 될 사항)

Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다.

G+C 비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기전에 신중히 고려해야 할 것이다. Primer 합성은 염기서열을 적어 바이오니아(구 한국생공) 등의 회사에 의뢰하면 주문에 따라서 정제도 해준다. 정제는 Sep-pak, OPC나 PAGE 정제를 이용하는데, 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다.

Primer의 양은 0.1~0.5 μM로 시행한다.

♣제한효소를 이용한 DNA절단

-제한효소 1 unit는 1 μg의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 상품화된 효소는 효소마다 다르지만 대개 10 units/μl 내외의 농도로 공급된다. 제한효소 처리 반응은 절단하려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성된다. 각각의 성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고려하여야 할 것이다.

1) 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 많은 효소를 넣어주기 때문에 그다지 걱정할 필요는 없다.

2) Linear DNA의 끝부분을 자를 때는, 효소에 따라서 인식서열에 몇개의 염기가 더 붙어 있어야만 잘리는 것들이 있음을 주의한다. 이는 plasmid vector의 multiple cloning site를 두가지 효소로 자르는 경우에도 고려해야한다. 또한 PCR primer에 제한효소 인식부위를 넣어 design할 경우에도 반드시 고려해야 한다.

3) DNA의 순수도는 제한효소 처리 효율에 중요하다. DNA 용액 내에 단백질이 남아있는 경우는 보다 많은 양의 효소가 필요하다. Phenol과 같은 유기용매가 남은 경우는 제한효소에 잘리지 않는 DNA가 남는 경우가 많다.

4) 각각의 제한효소는 최적온도, 반응완충용액(reaction buffer)의 조성 및 불활성화 온도 등 각각에 알맞은 반응 조건이 있으며, 제조회사의 안내서에 이 내용이 잘 기록되어 있으므로 잘 읽어보고 사용해야 한다. 어느 회사의 제품이건 효소를 구입할 때 그 효소에 적합한 반응완충용액이 같이 지급되므로 별 어려움 없이 그대로 사용할 수 있으며 대개 10배 농축된 형태(10x)로 만들어져 있으므로 반응액을 조합할 때 10배 희석하는 형태로 반응액을 조성한다.

5) 반응 조건이 최적이 아닌 경우에는 더 많은 양의 효소를 사용해야 한다. 이는 두가지 이상의 효소로 자르는 경우 (효소들의 최적 조건이 다를 때)에 중요하다. 때에 따라서는 이런 경우에 star activity라 불리는 현상(비특이적으로 아무 곳이나 다 잘리는 현상)이 나타날 수도 있으므로 주의해야 한다.

6) 효소가 인식부위를 자르는 데에 있어서 같은 인식부위라도 주위 염기서열에 따라 그 활성도가 다를 수 있다. 그러므로, DNA 양으로 계산한 효소 양보다 조금 더 많이 넣어주는 것이 좋다. 필요할 때는 제한효소 처리 중에 조금씩 덜어 전기영동으로 monitor할 수도 있다.

☐제한효소

DNA도 특정부위를 자르고 붙일 수 있다. DNA를 자른다는 것은 nucleotide들이 연결되어 있는 phosphodiester 결합을 끊어내는 것을 의미하는데, 이런 역할을 하는 효소를 nuclease라고 하며 바깥쪽을 자르는가 안쪽을 자르는가에 따라서 각각 exonuclease, endonuclease라고 부른다. Endonuclease의 대표적인 것이 바로 제한효소(restriction enzyme, restriction endonuclease)이며, DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다. 제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오는 바이러스와 같은 외부 DNA를 제거하기 위한 방어기전으로 가지고 있는 것이며, 자신의 DNA는 절단부위의 염기(adenine, cytosine)를 메칠화시켜서 자신의 제한효소가 자신의 DNA를 자를 수 없게 보호하고 있다.

제한효소는 3가지로 나눌 수 있으며, 실험실에서 사용되는 것은 대부분 type II이다.

A) Type I restriction enzyme

DNA의 특정부위를 인식하긴 하지만 인식된 부위가 아닌 다른 부위를 절단한다. 즉, 인식부위는 특이성을 가지지만 그로부터 약 1,000 base pair가 떨어진 부위를 절단하기 때문에 원하는 부위를 선택하여 자르기가 어렵다. 따라서 이 효소들은 박테리아의 기능에는 중요하지만 실험목적으로는 잘 사용되지 않는다.

B) Type II restriction enzyme

인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생물학 연구에 아주 유용하게 이용되고 있다. 실험에 쓰이는 제한효소는 특별한 말이 없는 한 type II를 말한다. 대부분의 type II 제한효소는 4개, 5개, 또는 6개의 염기서열을 인식하는데, 이에 따라 DNA 상에 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다. 즉 6개의 염기서열을 인식한다면 이론상 46 = 4096 base pair 마다 한번씩 출현하게 된다. 제한효소의 명명은 발견된 세균의 이름 및 serotype에 따라서 붙이게 된다. 즉 Hinf II는 Haemophilus influenza type f에서 분리된 것이다. 제한효소가 인식할 수 있는 부위는 palindrome, 즉 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양을 하고 있는 것이 특징이다. 잘린 후의 DNA 모양은 5'-overhang cohesive end, 3'-overhang cohesive end(sticky end) 또는 blunt end가 만들어질 수 있으므로 목적에 따라서 잘 선택해서 사용해야 한다.

♣Ligation of DNA

Recombinant DNA

1970년대 쯤 등장한 "유전공학(genetic engineering)"이라는 분야가 있다. 요즘도 쓰지만 이 말은 "유전자 재조합 기술(recombinant DNA technology)"를 의미한다. DNA를 자르고 붙여서 새로운 DNA를 만든다. 가위와 풀을 이용해서 종이를 잘라 붙이는 것과 같다. 여기에서 가위에 해당하는 것이 restriction enzyme이고, 풀에 해당하는 것이 DNA ligase이다.

DNA ligase가 하는 일은 그림과 같이 phosphodiester bond를 연결시켜 주는 것이다.

5. 참고문헌

http://blog.naver.com/kuraa.do?Redirect=Log&logNo=80009706622

http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/restriction_enzyme.php

http://kin.naver.com/browse/db_detail.php?d1id=11&dir_id=110205&docid=1399050

http://cafe.naver.com/moleimmunology.cafe?iframe_url=/ArticleRead.nhn%3Farticleid=795

[sunshinetj]

으 갈수록 헤드에잌!
자야하는디,,

[산똘뱅이]

저렇게 해 봐야 진짜로 새로은종은 나오지 않아요 거저 병신만 만들어 놓고 ~~신종이다 뭐다하고 떠들어 대지여 ~`

[sunshinetj]

또 우리 해골 아프게 하고 그지예?

[산똘뱅이]

남의 바가지 만 아푸게 하고 지거는 돈묵꼬 ~~~학위 받고 ~~내에츠암~~!!

[sunshinetj]

고로이 저거 주인도 모르고 지 맘대로 하고 싶은대로 하구로 놔둘라카이 참 불쌍하쟈나예?
암만케도 말 안듣고,,, 지 생각대로 출세하고 잘묵고 잘살고 싶은 용망의 전차를 타고 지도 속고 남도 쏙여가지고 출세하고 잘묵고 잘살고 할 동안에 상대방은 죽는 거 모르고 사는 기라예.
양심도 죽이삐고 이성도 무시하고 그지예?
우리가 건드리지도 모탈 바벨탑 속에 우리가 지금 갖혀 있는기라예,,,
하이고 하나님 가슴 타는 거 생각하믄 미치것심더!
하이고 사랑은 눈물의 씨앗이라 카잉께 쌔끈쌔끈 참마 바야지.
지도 막 지맘대로 감니더,,,지도 모르겟씸더 지는 와 이모양인지,,,
coli 형질환 실험보고서가 와 지 ego까지 왔습니꺼?

[산똘뱅이]

전토에 전토를 가옥에 가옥을 연하여 짖고 홀로 부하려 하는 자들은 화 있을 찐저 ~~히궁 ~~
그러고 살다가 죽도록 내뻐려 둡시다 ~~~나도 자식 키우는 사람이 막말을 할수도 엄꼬~~~
우리는 그래도 그라지 맙시데이 ~~~있는돈도 다쓰지 몬하고 죽을 낀데 와 돈벌라 하겠심니꺼 ~~~

[sunshinetj]

하나님이 하나님 모르는 인간들 불쌍해서 돈이라도 더러븐 명예라고 허락하시는 거쟈나예.
근데 뭐 요새는 초신자도 장로든 목사든 모도다 돈독이 올라서리,,,보기 청말로 가관이더만예,,,
그케가지고 평생 미덤 문턱이 아이라 무덤속에서 한 평생 이라도 잘묵고 잘 살아라하는 거 아인지예,,,
하나님이 보시기도 불쌍하시니까,,,,

[산똘뱅이]

근데 교회가 축복을 돈으로 생각하는 교회도 더러 인는것 가타서 맴이 좀 ~씁쓰무리 ~~~되쓰무리~~

[sunshinetj]

하나님 고 찐짜 은혜 맛쓸 못바쓰리 돈맛에 속가가지고 고걸 은혜라 카밍서,,,
머리 반짝반짝하던 그 양반 옌날에는 대낄로 많은 성도들앞에서 고로케 쇼를 하더만,,,
요새는 무대에서 큰 절도 하고 쌩 쇼를 다하데예...
어떤 목사님 나이 많아가지고 부처님 큰 아들 쯤 되는드시
큰 소리로 땅탕 따탕 꾸중만 하시밍서,,,지는 세상에 제일 조은 고급차 몰고 제일 비싼 집으로 드러다니고...
고 목사들 사탕 든든한 빽이 있어서 하나님 절대 안 무서븐기라예
아멘 부대들...사탕은 안 무섭고 그 거짓말쟁이 목사들만 무서버가지고,,, 똑가테예,

[산똘뱅이]

뭐 목사가 ~~뭘 그리 할까바요 ~~~목사님은 ~~교인들과 함깨 웃고 ~교인들과 함깨 울고 ~~
맹물을 마시고도 이쑤시게 물고 나오는 분이 목사님 아니신가효 ~~내가 존경하는 그런 목사님이 있었는데 ~~
내가 고등핵겨 댕길때 그 목사님 따님을 짝싸랑을 핸는데 ~~지금은 뚱땡이가 돼 있더라고요 ~~~
목사님도 ~~큰교회 한번 못해 보시고 ~~세상 버리실때는 ~~~목욕탕 사우나실에서 ~~아픔없이 그냫 돌아 가셨어요 ~~아마도 그것이 그어른께 최고의 복이셨나 바요 `

[sunshinetj]

뭔 큰교회,,,,,,?
목사님 짝사랑이 안 이뤄진 거 행복하지예?
사모님 사진 뵈니까 참 고우시더만,,, 허지만 고우신 사모님 사랑보다 예수님 사랑땜에 더 복되신거 잊지마십쇼!
맞지예 목사님?

[산똘뱅이]

우리 두목님 말입니꺼~~생기기는 곱게 생겼지만 ~~최희준씨 노래 생각나는 그런 분이라예~~으~~무스브~~!!

[sunshinetj]

어! 코일 형질 전환보고서엣 최희준으로 가고 있네예,,,ㅋㅋ
지는 마 남자라 카모 다 밉지만 최희준씨 노래는 좋더만 무어가 무스브예~!!!
최희준,, 노래무드와 너무 틀리게 부인 돌아가고 난 뒤 금방 재혼했을 때 노래맛 많이 떨어졌지만,,,
하기사 이 세상에 뭐가 진짜란 게 있겠심니꺼?
그래도 생각나는게,,,뭐더라?,,, 길이다 생각납니더

세월따라 걸어온 길 멀지는 않았어도
돌아보니 자욱마다 사연도 많았다오
진달래꽃 피던 길에 첫사랑 불태웠고
지난 여름 그 사랑에 궂은 비 내렸다오
,,,
이 양반 지금은 노인이 되었겠지요.
첫사랑 태웠던 그 사랑이 진짜 사랑였다면,, 바라건데,,
분명히 예수님과 연결되어있겠지예? ^

[산똘뱅이]

거뭐 노래는 노래일뿐 오해하지 맙시다 ~~

[sunshinetj]

아무렴요 목사님!
하지만 인생말년에 우리들의 삶의 촛점들,,,직업이나 노래나 습관이나 우리들의 모든 촉각들이 하나님의 의를 향해 조준되어 있지 않다면,,, 삶따로 신앙따로,,,일 수도 있겠다는 저의 망령 노파심입니당 ^^

[산똘뱅이]

감사 합니다 은혜가 되는 말씀 ~~~삶따로 신앙따로 따로 국밥이 아니고 ~~따로 신앙이네요 ~~으야꼬 ~~내가 바로 그사람인데 ~~흠~~~들켰짜나~~~뭐 할수 없지만 ~~앞으로 죽기전에 틀림없이루어야할 ~~살과신앙의 동일 선 ~~기도해 주세요~~

[sunshinetj]

많은 목숨을 바쳐 건국한 미국이,,,흔들리는 오늘은 독립기념일 입니다.
링컨이랄지라도 삶 = 신앙의 인생을 살았을까요?
인간이라면 동일하게 누구나 이중성을 갖고 있는데 그러기에 인간일진데,,,목사님만 들키남요? ㅋㅋ

[산똘뱅이]

그렁강 !!!그라면 ~~고개 들고 댕겨도 되게꾸마는요 ~~근데 남의 그렁것은 내눈에 안보이지마는 나는 내자신의 이중성을 너무나 잘보고 있거등요~~~크흐 ~~그래도 부끄러브요 ~~그래서 스랍도 두날개로 얼굴을 가리 쟈나요 ~~

[sunshinetj]

지는 스랍처럼 날개가 없구만요,,ㅋ
근대 하나님은 왜 인간에게 가죽으로 옷을 입히시곤 눈가리개는 안해 주셨담?
날개 대신에 눈까풀인감?
때때로는 우리 스스로 부끄러븐걸 자꾸 보다보믄 정말로
예수님한테 정말로 죄송합니더,,,
우리 인간은 정말로 골치덩어리 입니더,,,
예수님 사랑은 쉬운데 사람 사랑은 죽는 것보다 어려버예,,
그기 절대로 사랑이 아니라 섬기라 했는디,,,
그기 다 안되는기 지 자신 때문이지 뭡니꺼,,,
지는예 암이 들컹 걸리믄 깨똥쑥 안먹고 비겁하게 그대로 가고시파예,
목사님 하나님아부지한테 미안하지마는예,,

[sunshinetj]

산중턱 어디 반쯤 쓰러진 집에서 넓은 양푼이에 보리밥 퍼놓고 된장국 퍼넣고 열무 찢어넣고 고추장 퍼넣고 풋고추 썰어넣고 그냥 퍽퍽 퍼묵어믄서 질질 울면서 퍽퍽 울면서 소리 내민서 엉엉 울면서 퍽퍽 퍼묵어 민서 ,,,딱 한달 ,,아니 딱 한 일주일만 살다가 가고 시퍼예
못되 먹어서 십자가로 다 풀지 못한거 하늘에 다 펄펄 날리고 구름에 걸쳐 날리고 산산히 찟어 날리고 훌훌 날라가고파예,,
이렇게 못되 먹은 거 다 태우지도 녹이지도 못한 가스믈 가릴 날개도 없응께 ,,,

[산똘뱅이]

날개가 있을 낀데 ~~~~~~그옷은 내가 불을 안놓았는데 어디 있는지 잘 찿아 보세요 ~~~~~
다시 칯아서 입으시고 날아가이소 고마~~

[sunshinetj]

그러마 지 날라 갔습니데이~ 지 업심데이~~
인자 이룸에는 팔불출이 업심미데이~ ,,헤헤 해피 엔디잉 ~~

[산똘뱅이]

ㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎ

[오직겸손]

읽는데 인내가 필요하군요 ㅎ