난황형성단백질을 통한 면역 전달 (논문)

[꿀벌나라]

PLUS PATHOSENS

플러스 병원균 홈페이지

Transfer of Immunity from Mother to Offspring Is Mediated via Egg-Yolk Protein

Vitellogenin

어미에서 자손으로의 면역 전달은 난황형성전구체를 통해 전해진다.

• Published: July 31, 2015
• 발행 : 2015 년 7 월 31 일

(저자 이력)

<Heli Salmela>

Affiliation Centre of Excellence in Biological Interactions, University of Helsinki, Helsinki, Finland & University of Jyväskylä,

Jyväskylä, Finland

핀란드 헬싱키의 헬싱키 대학교 및 핀란드 이위베스퀼레의 이위베스퀼레 대학교의 생물학적 상호 작용 우수 제휴 센터

<Gro V. Amdam>

Affiliations School of Life Sciences, Arizona State University, Tempe, Arizona, United States of America, Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences, Aas, Norway

미국, 애리조나 주, 템피, 애리조나 주립대 학교 생명 과학부, 노르웨이 Aas, 노르웨이 생명 과학대학교 화학, 생명 공학 및 식품 과학부

<Dalial Freitak>

Affiliation Centre of Excellence in Biological Interactions, University of Helsinki, Helsinki, Finland & University of Jyväskylä,

핀란드 헬싱키의 헬싱키 대학교 및 핀란드 이위 베스 퀼레의 이위 베스 퀼레 대학교의 생물학적 상호 작용 우수 제휴 센터

Abstract

요약

Insect immune systems can recognize specific pathogens and prime offspring immunity. High specificity of immune priming can

be achieved when insect females transfer immune elicitors into developing oocytes. The molecular mechanism behind this

transfer has been a mystery.

곤충 면역 체계는 특정 병원균를 인식하고 자손에 대한 면역력을 줄 수 있다. 곤충 암컷이 면역 유출자(流出子;

유도자 뜻)를 발달중인 난모세포로 옮길 때 면역 프라이밍의 높은 특이성이 달성될 수 있다. 이 전달에 숨겨진 분자

메커니즘은 수수께끼였다.

Here, we establish that the egg-yolk protein vitellogenin is the carrier of immune elicitors.

여기서, 우리는 난황 단백질 난황형성전구체가 면역 유출자(유도자)의 운반체임을 입증한다.

Using the honey bee, Apis mellifera, model system, we demonstrate with microscopy and western blotting that vitellogenin

binds to bacteria, both Paenibacillus larvae – the gram-positive bacterium causing American foulbrood disease – and to

Escherichia coli that represents gram-negative bacteria.

서양종 꿀벌, 모델 시스템을 사용하여, 난황형성전구체가 박테리아인, 패니바실루스 유생 (미국 부저병을 일으키는

그람 양성 박테리아) 및 그람 음성 박테리아를 나타내는 대장균에 결합한다는 것을 현미경 및 특수 단백질 검출

검사으로 증명하였다.

Next, we verify that vitellogenin binds to pathogen-associated molecular patterns; lipopolysaccharide, peptidoglycan and

zymosan, using surface plasmon resonance. We document that vitellogenin is required for transport of cell-wall pieces of E. coli

into eggs by imaging tissue sections.

다음으로, 난황형성전구체가 병원균 관련된 분자 패턴에 결합하는지 확인한다 ; 표면 플래즈몬 공명을 사용하여,

지질 다당류(多糖類), 팹티도글리칸 및 자이모샌. 우리는 조직 절편을 영상화하여, 대장균의 세포벽 조각을 난자로

운반하는데 난황형성전구체가 필요하다는 것을 문서화한다.

주) plasmon :플래즈몬 (한 세포 속의 전(全) 세포질 유전자)

주) peptidoglycan : 펩티도글리칸 (다당류에 짧은 펩티드 고리가 결합한 화합물로 세균의 세포벽에서 볼 수 있음)

주) zymosan : 자이모샌 (효모에서 얻어지는 다당(多糖); 항보체(抗補體) 작용을 함)

These experiments identify vitellogenin, which is distributed widely in oviparous species, as the carrier of immune-priming

signals. This work reveals a molecular explanation for trans-generational immunity in insects and a previously

undescribed role for vitellogenin.

이 실험은 난생(卵生)의 종에 널리 분포하는 난황형성전구체를, 면역 프라이밍 신호의 운반자로 확인한다.

이 연구는 곤충의 세대 간 면역에 대한 분자적 설명과 난황형성전구체에 대하여 이전에 설명되지 않았던

역할을 밝힌다.

Author Summary

저자 요약

Insects lack antibodies, the carriers of immunological memory that vertebrate mothers can transfer to their offspring.

Yet, it has been shown that an insect mother facing pathogens can prime her offspring’s immune system. To date, it has

remained enigmatic how insects achieve specific trans-generational immune priming despite the absence of

antibody-based immunity.

곤충은 척추 동물 어미가 자손에게 전달할 수 있는 면역학적 기억의 운반체인, 항체가 부족하다. 그러나,

병원균에 직면한 곤충 어미는 자기 자손의 면역 체계를 줄 수 있다는 것이 밝혀졌다. 지금까지, 항체 기반

면역이 없음에도 불구하고, 곤충이 특정 세대간 면역 프라이밍을 어떻게 달성하는지는 수수께끼로 남아 있다.

Here, we show this is made possible via an egg-yolk protein binding to immune elicitors that are then carried to

eggs. This yolk protein, called vitellogenin, is able to bind to different bacteria and pathogenic pattern molecules.

We use E. coli fragments as a bait to show how vitellogenin is necessary for the carrying of immune elicitors to eggs.

여기서, 우리는 이것이 난자로 운반되고 나서 면역 유출자에 결합하는 난황 단백질을 통해 가능하다는

증명한다. 난황형성전구체라고 불리는 이 난황 단백질은 다른 박테리아와 병원성 패턴 분자에 결합 할 수

있다. 우리는 대장균 단편을 미끼로 사용하여 난황형성전구체가 어떻게 면역 유출자(유도자)를 알로 전달

하는데 필요한지를 증명한다.

These findings help to understand how insects fight pathogens and can be useful for protection of ecologically and

economically important insects, such as the honey bee, that we used as a model species.

이러한 발견은 곤충이 병원균과 싸우는 방법을 이해하는데 도움이 되며, 우리가 모델 종으로 사용한,

꿀벌과 같은, 생태학적으로나 경제적으로 중요한 곤충을 보호하는데 도움이 된다.

Figures

그림

Figures

Citation: Salmela H, Amdam GV, Freitak D (2015) Transfer of Immunity from Mother to Offspring Is Mediated via

Egg-Yolk Protein Vitellogenin. PLoS Pathog 11(7): e1005015. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005015

인용 : 살메라 H, 아담 GV, 프레이탁 D (2015) 어미에서 자손으로의 면역 전달은 난황 단백질인 난황형성

전구체를 통해 전해진다. PLoS Pathog 11 (7) : e1005015. 

Editor: David S. Schneider, Stanford University, UNITED STATES

편집자 : 데이비드S. 슈나이더, 스탠포드 대학교, 미국

Received: January 30, 2015; Accepted: June 9, 2015; Published: July 31, 2015

접수 : 2015년 1월 30일 승인 : 2015년 6월 9일 출판 날짜 : 2015년 7월 31일

Copyright: © 2015 Salmela et al. This is an open access article distributed under the terms of the

Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium,

provided the original author and source are credited

저작권 : © 2015 Salmela et al. 이 문서는 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이선스의 조건에 따라 배포되는

자유 열람 논문으로, 원본 저자와 출처가 인정되는 경우에 모든 매체에서 제한없이 사용, 배포 및 복제할 수 있다.

Data Availability: All relevant data are within the paper and its Supporting Information files.

데이터 가용성 : 모든 관련 데이터는 문서 및 지원 정보 파일에 있다.

Funding: HS was funded by Academy of Finland grant number 265971. www.aka.fi/en-GB/A/ GVA was funded by Norwegian

Research Council grant number 180504 and 191699. www.forskningsradet.no/en/Home_page/1177315753906 DF was funded

by Academy of Finland grant number 251337 and 252411. HS and DF were also supported by University of Helsinki

www.helsinki.fi/university. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or

preparation of the manuscript.

자금 : HS는 핀란드 아카데미 보조금 번호 265971에서 자금을 지원했다. www.aka.fi/en-GB/A/ GVA는 노르웨이

연구위원회 보조금 번호 180504 및 191699에서 자금을 지원했다.

www.forskningsradet.no/en/Home_page/1177315753906 DF 핀란드 아카데미 보조금 251337 및 252411에

의해 자금이 지원되었다. HS 및 DF는 헬싱키 대학교 www.helsinki.fi/university에서도 지원되었다. 자금 제공자는

연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았다.

Competing interests: The authors have declared that no competing interests exist.

경쟁 이해관계 : 저자는 경쟁 이해관계가 존재하지 않는다고 선언하였다.

Introduction

소개

Insects lack antibodies, the carriers of immunological memory in vertebrates. Therefore, it has been thought that

insects are deprived of acquired immunity and only have innate defense mechanisms against pathogens.

곤충은 척추 동물의 면역학적 기억 전달체인 항체가 부족하다. 따라서 곤충은 후천성 면역성이 박탈되고

병원체에 대한 선천적 방어 체계만 있는 것으로 생각되어진다.

Recent research, however, has shown that insects are capable of high specificity in their defense reactions; indeed,

insect immune defenses can recognize specific pathogens [1] and prime offspring against them [2,3]. Immunity is a

major mechanism of survival that carries significant physiological and energetic costs, thus, immune responses must

be regulated to maximise fitness [4,5].

그러나 최근의 연구에 따르면, 곤충은 방어 반응에서 높은 특이성을 가질 수 있다는 것이 밝혀졌다. 실제로,

곤충 면역 방어는 특정 병원체 을 인식하고 그것들에 대항하여 자손에게 줄 수 있다. 면역은 상당한

생리적, 에너지적인 비용을 수반하는 주요 생존 체계이다, 따라서, 면역 반응은 건강상태를 최대화하기 위해

조절이 되어야 한다.

Immunocompetence is traded-off against other life-history traits, such as growth and development, when the risk of

infection is low. In order to maximize the fitness of their offspring in terms of immunity, growth rate and reproductive

potential, selection should favour passing on a plastic signal (i.e. presence or absence of pathogens) about the

pathogenicity of the environment.

면역 능력은 감염 위험이 낮을 때, 성장 및 발달과 같은 다른 생애사 특성과 상충된다. 면역력, 성장률 및 생식

잠재력 측면에서 자손의 건강상태를 최대화하기 위해, 선택은 환경의 병원성에 대하여 가소성 신호 (즉,

병원균의 존재 또는 부재)를 전달하는 것을 선호해야 한다.

plasticity : [Noun] (biology,genetics) The alterable nature of prokaryotic genomes that enables the fluid exchange of

DNA from one microorganism to another and allows to adapt their genomes rapidly so they can survive changes in

environmental conditions.

주) 가소성 : [명사] (생물학, 유전학) 한 미생물에서 다른 미생물로 DNA의 유체 교환을 가능하게하고 원핵 생물이 환경

조건의 변화에서 살아남을 수 있도록 신속하게 게놈을 적응시킬 수 있는 원핵 생물 게놈의 변경 가능한 특성이다.

It has been observed that many organisms can transfer highly specific immune protection to the next generation[6].

Trans-generational immune priming (TGIP) was initially attributed to animals with antibody-based adaptive immune

systems [6].

많은 유기체가 고도로 특이적인 면역 보호를 다음 세대로 전달할 수 있다는 것이 관찰되었다. 세대간 면역

프라이밍 (TGIP)은 처음에는 항체 기반 적응 면역 시스템을 가진 동물것이라고 생각하였다.

The discovery that invertebrates, equipped only with innate immune responses, are also able to prime their offspring

against infections has changed the understanding of innate immunity. Interestingly, even nonpathogenic bacteria in

diet can trigger systemic immune responses in both the same generation and in the next [7,8].

선천성 면역 반응만을 갖춘, 무척추 동물도 자손을 전염병에 대하여 미리 가르쳐 줄 수 있다는 발견은,

선천성 면역에 대한 이해를 바꾸어 놓았다. 흥미롭게도, 식량에 포함된 비병원성 박테리아도 같은 세대와

다음 세대 모두에서 전신 면역 반응을 유발할 수 있다.

Cumulative evidence shows how maternal exposure to immune elicitors, and dead or living bacterial cells, leads to

higher immunocompetence in the offspring [8–12]. For example, Moret et al. (2006) found increased immunity in the

next generation after injecting adult mealworm (Tenebrio molitor) females with bacterial lipopolysaccharides (LPS).

누적된 증거는 면역 유출자(유도체)와, 죽은거나 살아있는 박테리아 세포에 대한 모계 노출이 어떻게 자손의

면역 능력을 높이는지를 보여준다. 예를 들어, 모레트 등은 (2006)은 성체 먼지벌레붙이 (Tenebrio

molitor) 암컷에게 세균성 지질 다당류 (LPS)를 주입한 후 다음 세대에서 증가된 면역력을 발견했다.

Also, in the red flour beetle (Tribolium castaneum), Roth et al. (2009) showed that parental exposure to the Gram-positive

soil-dwelling bacterium, Bacillus thurngiensis, could elicit strain-specific TGIP [10], while Freitak et al. (2009) found that

feeding non-pathogenic bacteria to female cabbage loopers (Trichoplusia ni) during larval stage resulted in higher steady

state immunity in the next generation [8].

또한, 붉은 밀가루 갑충 (Tribolium castaneum)에서는, 로쓰 등 (2009)은 그람 양성 토양에 서식하는

박테리아인 Bacillus thurngiensis에 대한 부모의 노출이 균주 특이적인 TGIP 를 유도할 수 있음을 보여

주었고, 프레이탁 등 (2009)은 유충 단계에서 암컷 남방은무늬 밤나방의 애벌레 (Trichoplusia ni)에

비병원성 박테리아를 먹이면, 다음 세대에서 더 높은 정상 상태 면역을 초래한다는 것을 발견했다.

주) Tribolium castaneum :(붉은밀가루갑충) 적갈색의 작은 갑충(甲蟲)으로, 밀가루의 해충; 창고의 알곡이나 건조한

과일 따위를 파먹는다.

In the tobacco hornworm (Manduca sexta), Adbel-latief & Hilker (2008) demonstrated that the embryonic immune

system is up-regulated after injection of immune elicitors into eggs [13]. Finally, Hernandez-Lopez et al. (2014) showed

that injecting honey bee (Apis mellifera) queens with dead Paenibacillus larvae (bacterium responsible for the American

foulbrood disease) leads to higher resistance against this pathogen in the offspring [14].

박각시나방의 유충 (Manduca sexta)에서, 애드벨-라티에프 & 힐커 (2008)는 난자에 면역 유출자(유도체)를

주입한 후, 배아 면역 체계가 상향 조절된다는 것을 증명했다. 마지막으로, 헤르난데즈-로페츠 등 (2014)은

서양종 꿀벌 여왕벌에게 죽은 패니바실루스 유충 (미국 부저병 질병의 원인이 되는 박테리아)을 주입하면

자손에서 이 병원균에 대한 저항성이 높아진다는 것을 보여주었다.

These findings have created a central dilemma in immunological physiology regarding how immune priming can be

mediated by mechanisms other than antibodies. Innate and adaptive immune responses are triggered by pathogen-

associated molecular patterns, or immune elicitors.

이러한 발견은 면역 프라이밍이 항체 이외의 메커니즘에 의해 매개될 수 있는 방법에 대한 면역학적인

생리학의 중심 딜레마를 만들었다. 선천적 및 적응적 면역 반응은 병원균 관련 분자 패턴 또는 면역 유출자에

의해 유발된다.

Immune elicitors are present on the cell walls of bacteria and fungi [1]. TGIP appears to be mediated by fragments of

such pathogenic microorganisms, which can be transferred from insect midgut lumen to the hemocoel [2]. In the

hemocoel, fragments are transferred and incorporated into fat body, a tissue that is functionally homologous to liver

and white adipose tissue in vertebrates.

면역 유출자(유도체)는 박테리아와 곰팡이의 세포벽에 존재한다. TGIP는 그러한 병원성 미생물의 단편에

의해 매개되는 것으로 보이며, 이는 곤충 중장 내강에서 혈강으로 전달될 수 있다. 혈강에서, 조각은 척추

동물의 간 및 백색 지방 조직과 기능적으로 상동적인 조직인, 지방체로 옮겨져 통합된다.

Eventually, fragments are detected in developing eggs [2]. These findings suggest that microbial fragments are transferred

from mother to offspring, carrying specific immune elicitors to mediate appropriate immune responses. However, it ha

remained unknown exactly how the immune elicitors can enter insect eggs.

마침내, 진화중인 난자에서 단편이 발견된다. 이러한 발견은 미생물 조각이 적절한 면역 반응을 매개하기

위해 특정 면역 유출자를 전달하면서, 어미에서 자손으로 옮겨진다는 것을 시사한다. 그러나, 면역 유출자가

곤충 난자에 어떻게 들어갈 수 있는지 정확히 알려지지 않았다

The ability to utilize TGIP mechanisms can be of considerable economic importance. Industries that rely on beneficial

invertebrates can develop methods of prevention against contagious diseases, whereas industries dealing with pest control

can instead induce reduced TGIP.

TGIP(세대간 면역 프라이밍) 메커니즘을 활용하는 능력은 경제적으로 상당히 중요할 수 있다. 유익한 무척추

동물에 의존하는 산업은 전염성 질병에 대한 예방 방법을 개발할 수 있지만, 해충 방제를 다루는 산업은 TGIP

감소를 유도할 수 있다.

One invertebrate that can benefit from a commercial utilization of TGIP is the honey bee, Apis mellifera. The honey bee is an

ecologically and economically important pollinator of many wild plants as well as cash crops. At the same time, it is susceptible

to many diseases, and thus like many other important pollinators, is in global population decline.

TGIP의 상업적 활용으로 혜택을 얻을 수 있는 무척추 동물 중 하나는 서양종 꿀벌이다. 꿀벌은 현금 작물 뿐만

아니라 많은 야생 식물의 생태학적으로 경제적으로 중요한 수분 매개체이다. 동시에, 그것은 많은 질병에 감염되기

쉬워서 다른 많은 중요한 수분 인자와 마찬가지로, 전세계 개체수가 감소하고 있다.

Since TGIP was recently confirmed in the honey bee system, i.e. in response to the pathogen responsible for American foulbrood

disease, we here combined biochemistry and histology to trace the fate of the immune elicitors during insect egg development

under threat of pathogens.

TGIP가 최근 꿀벌 시스템에서 확인되었기 때문에, 즉 미국의 부저병 질병 원인이 되는 병원균에 대한 반응으로,

우리는 여기에서 생화학과 조직학을 결합하여 병원균의 위협하에 곤충 난자가 발달하는 동안 면역 유출자의 운명을

추적했다.

We hypothesized that TGIP is mediated by a protein that plays roles both in egg-yolk formation and immunity–vitellogenin (Vg).

Vg is a yolk precursor as well as a pathogen pattern recognition receptor [15]. It is a nutritious lipoprotein synthesized by the

fat body or vertebrate liver, secreted to the hemolymph/blood and taken up by nurse cells and eggs by receptor-mediated

endocytosis [7].

우리는 TGIP가 난황 형성과 면역성-난황형성전구체 (Vg)에 역할을 하는 단백질에 의해 매개된다는 가설을 세웠다.

Vg는 병원체 패턴 인식 수용체이자 난황 전구체이다. 그것은 지방체 또는 척추 동물 간에서 합성된 영양분

있는 지질 단백질로, 혈림프 / 체액에 분비되고 수용 매개체 세포에 의해 영양 세포와 난자에 의해 흡수된다.

Vg concentration varies between the members of the honey bee colony, from almost undetectable to 40% of the total

hemolymph protein fraction in the functionally sterile helper females, called workers—and it constitutes up to 70% of the

hemolymph protein fraction in the egg-laying queens [16].

Vg 농도는 꿀벌 봉군의 구성원간에  일벌이라고 부르는, 기능적으로 불임의 조력자 암컷에 있는 전체 혈림프 단백질

비율의 40 %까지 거의 감지할 수 없는 것부터 다양하며, 알 낳은 여왕벌에서 혈림프 단백질 비율의 최대 70 % 까지

구성한다 [16].

In fish, Vg binds to LPS of Gram-negative bacteria, to peptidoglycan (PG, a major constituent of the cell-wall of Gram-positive

bacteria), and to surface glucan of fungi [17]. These immunological properties of Vg are little explored in species other than

fish. Here, we reveal how honey bee Vg has similar immunological binding properties, and, for the first time, demonstrate how

the bound immune elicitors can enter eggs via Vg uptake to the ovary. These results suggest a central role for Vg in TGIP.

어류에서, Vg는 그람 음성 박테리아의 LPS, 펩티도글리칸 (그람 양성 박테리아의 세포벽의 주요 구성 요소인 PG)

및 곰팡이의 표면 글루칸에 결합한다. Vg의 이러한 면역학적 특성은 어류 이외의 종에서는 거의 연구되지

않다. 여기에서, 우리는 꿀벌 Vg가 어떻게 유사한 면역학적 결합 특성을 갖는지 밝히고, 처음으로, 결합된 면역

유출자가 난소에 Vg 흡수를 통해 어떻게 난자에 들어갈 수 있는지를 증명하였다. 이러한 결과는 TGIP에서 Vg의

중심 역할을 시사한다.

주) peptidoglycan :(펩티드글리칸) 다당류에 짧은 펩티드 고리가 결합한 화합물로 세균의 세포벽에서 볼 수 있음

Results

결과

1. Vg binds to bacteria and pathogen patterns

Vg는 박테리아 및 병원균 패턴에 결합한다.

We first verified that honey bee Vg can bind to P. larvae–the Gram-positive bacterium that causes American foulbrood disease–

and to Gram-negative E. coli by using western blotting and microscopy with live bacteria and an antibody that recognizes Vg

(Fig 1A and 1B). In the western blot, Vg signal was found in both P. larvae and E. coli samples that had been incubated with

Vg-rich honey bee hemolymph or fat body homogenate and then thoroughly washed (Fig 1A). The Vg signal appears to be

stronger in the P. larvae samples than in the case of the E. coli samples.

특수 단백질 검출 검사에서, Vg 신호는 Vg가 풍부한 꿀벌 혈림프 또는 지방체 균등액과 함께 배양된 후에 완전히

세척된 패니바실루스 유생 및 대장균 샘플 모두에서 발견되었다 (그림 1A). Vg 신호는 대장균 샘플의 경우보다

P. 유생 샘플에서 더 강한 것으로 보인다.

Negative controls were used to verify that the Vg signal was not due to Vg aggregation (a sample of fat body homogenate

without any bacteria; lane 1, Fig 1A) or due to unspecific antibody binding to bacteria (samples of bacteria only; lanes

numbered 2, (Fig 1A).

음성 대조군을 사용하여 Vg 신호가 Vg 응집 (세균이없는 지방체 균등액 샘플, 레인 1, 그림 1A) 또는 박테리아에

대한 비특이적 항체 결합 (세균 샘플만 ; 레인 번호 2)이 아닌지 확인했다. (그림 1A).

Also, bovine serum albumin (BSA) was used as a negative control, and this protein showed no binding to either bacterial

species (Fig 1A; BSA). We did fluorescence microscopy of P. larvae and E. coli incubated with honey bee hemolymph to

verify the western blot result, and Vg signal was observed covering the bacteria (Fig 1B). The antibody controls for unspecific

binding showed no signal.

또한, 소 혈청 알부민 (BSA)을 음성 대조군으로 사용했으며, 이 단백질은 두 박테리아 종에 결합하지 않는 것으로

보여 주었다 (그림 1A; BSA). 우리는 특수 단백질 검출 검사 결과를 확인하기 위해 꿀벌 혈림프와 함께 배양된

P. 유생과 대장균의 형광 현미경을 사용했으며,  Vg 신호가 박테리아를 덮는 것을 관찰했다 (그림 1B). 비특이적

결합에 대한 항체 대조군은 신호를 보이지 않았다.

Fig 1. Honey bee Vg binding to bacteria was tested by western blotting (A) and microscopy (B).

그림 1. 박테리아에 대한 꿀벌 Vg 결합은 특수 단백질 검출 검사 (A) 및 현미경 (B)으로 시험하였다.

Binding to candidate pathogenic molecules was further tested by surface plasmon resonance technique (C). (A) Vg-rich honey

bee hemolymph (hl), Vg-rich fat body protein extract (fb), or bovine serum albumin control (BSA) were incubated with P. larvae

or E. coli, after which the bacteria were washed and blotted using an antibody that detects Vg or BSA.

후보 병원성 분자에 대한 결합은 표면 플라즈몬 공명 기술 (C)에 의해 추가로 실험하였다. (A) Vg가 풍부한 꿀벌

혈림프 (hl), Vg가 풍부한 지방체 단백질 추출물 (fb), 또는 소 혈청 알부민 대조군 (BSA)을 Vg 또는 BSA를 검출

하는 항체를 사용하여 박테리아를 세척하고 닦아낸 후에, 패니바실루스 유생 또는 대장균과 함께 배양하였다.

Untreated control samples are indicated (hl, fb and BSA), and next to them are located the bacteria-incubated test samples

(N = 3) marked with an overhead line. Two negative controls are numbered: 1 = Control for Vg aggregation (fb without bacteria),

and 2 = control for unspecific antibody binding to P.larvae (above) or E.coli (below).

처리되지 않은 대조군 샘플은 (hl, fb 및 BSA) 표시되고, 그 옆에는 오버 헤드 라인으로 표시된 (N = 3)박테리아

배양된 테스트 샘플이 있다. 2 개의 음성 대조군이 번호가 매겨져 있다 : 1 = Vg 응집 (박테리아없는 fb)에 대한

대조군, 2 = P. 유충 (위) 또는 대장균 (아래)에 대한 비특이적 항체 결합에 대한 대조군.

The image exposure time for the P. larvae blot was 1 s, and 5 s for the E. coli blot to better reveal its weaker bands. Vg appears

as a double band of 180 and 150 kDa. (B) Representative images of P. larvae and E. coli that were incubated with hemolymph,

and carefully washed and fixed (N = 3).

P. 유충 얼룩에 대한 이미지 노출 시간은 약한 밴드(띠)를 더 잘 나타내기 위해 대장균 얼룩에 대해 1 초 및 5 초였다.

Vg는 180 및 150 kDa의 이중 밴드로 나타난다. (B) 혈 림프와 함께 배양되고 조심스럽게 세척 및 고정된 P. 유생

및 대장균의 대표적인 이미지 (N = 3).

The bacteria were visualized using propidium iodide (PI; red). Vg was detected using an Alexa fluor 488 nm conjugated

secondary antibody (green). The primary antibody was omitted in the secondary antibody control. (C) PG, LPS and zymosan

binding to Vg immobilized on a surface plasmon resonance chip.

박테리아는 프로피듐 요오드화물 (PI; red)을 사용하여 시각화되었다. 2 차 항체 (녹색)를 활용한 Alexa fluor 488

nm 을 사용하여 Vg를 검출했다. 1차 항체는 2차 항체 대조군에서 생략되었다. (C) 표면 플라즈몬 공명 칩에

고정된 Vg에 결합하는 PG, LPS 및 지모샌.

주) zymosan[생화학] 지모샌, 자이모산 ((효모에서 얻어지는 다당(多糖)

The data are blank subtracted. Above: The X-axis shows the analyte concentration, and the Y-axis shows the binding response

The curves were fitted based on five measurements at different analyte concentrations. The dots mark the binding response at

each concentration measurement point. Below: The sensogram data of the maximal concentration for each analyte.

데이터는 공백을 뺀다. 위 : X 축은 분석물 농도를 나타내고, Y 축은 결합 반응을 나타낸다. 곡선은 서로 다른 분석물

농도에서 5가지 측정을 기반으로 맞춰졌다. 점은 각 농도 측정 지점에서 결합 반응을 표시한다. 아래 : 각 분석물에

대한 최대 농도의 센소 그램 데이터.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005015.g001

We then verified honey bee Vg binding to the pathogen patterns PG (predominantly a Gram-positive bacteria signature molecule),

LPS (Gram-negative signature) and zymosan (yeast) using a surface plasmon resonance technique (Fig 1C). We detected the

highest binding response for PG followed by LPS, whereas the binding response to zymosan was modest.

그런 다음, 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여, 병원균 패턴 PG (주로 그람 양성 박테리아 시그니처 분자), LPS

(그람 음성 시그니처) 및 지모샌 (효모)에 결합하는 꿀벌 Vg를 확인했다 (그림 1C). 우리는 LPS에 뒤이어 PG에

대한 가장 높은 결합 반응을 발견한 반면, 지모샌에 대한 결합 반응은 보통이었다.

2. Vg is required for the transport of bacteria-derived molecules into eggs

   Vg는 박테리아에서 파생된 분자를 난자로 전달하는데 필요하다.

Next, we verified that Vg can carry pathogen-derived molecules into eggs. This was tested by incubating dissected honey bee

queen ovaries with the commercially available fluorescently labeled E. coli fragments, followed by imaging the fluorescent

material taken up by the ovarioles (ovarian filaments) in the absence and presence of purified Vg (Fig 2).

다음으로, 우리는 Vg가 병원균 파생 분자를 난자로 전달할 수 있음을 확인했다. 이것은 해부된 꿀벌 여왕 난소를

상업적으로 이용 가능한 형광 표지된 대장균 단편과 함께 배양하여 테스트하였고, 뒤를 이어 정제된 Vg의 부재

및 존재하에 난소 (난소 필라멘트)가 차지하는 형광 물질을 이미지화 하였다 (그림 2).

The uptake of bacterial material was found only in the eggs that were provided with Vg. This result is consistent with our

proposition that Vg is a carrier of TGIP messages.

박테리아 물질의 흡수는 Vg로 제공된 난자에서만 발견되었다. 이 결과는 Vg가 TGIP 메시지의 전달자라는 우리의

제안과 일치한다.

Fig 2. The localization of bacterial fragments in honey bee queen ovaries in the presence (left) and

absence (right) of pure Vg.

그림 2. 순수 Vg의 존재 (왼쪽)와 부재 (오른쪽)에서 꿀벌 여왕벌 난소에서 박테리아 조각의 위치.

Freshly detached ovaries were incubated in buffer containing fluorescent (Texas red) E. coli fragments, and

imaged right after (A) or embedded for cryo-sectioning and imaging later (B-C). (A) Whole ovaries mounted

and imaged immediately after incubation and washing steps.

새롭게 분리된 난소를 형광 (텍사스 레드) 대장균 조각을 포함하는 버퍼에서 배양하고, (A) 직후에 이미지화하거나

나중에 냉동 절단 및 이미징 (B-C)을 위해 끼워넣었다. (A) 배양 및 세척 단계 후에 즉시 전체 난소를 탑재하고 촬영

했다.

5 x magnification, the scale is 200 μm. (B) Eggs in cryo-sectioned ovaries. 10 x magnification, the scale is 200 μm. 

(C) A single egg in a cryo-sectioned ovary; 20 x magnification, the scale is 50 μm. In the Vg-incubated ovaries, eggs with

internalized fluorescent material were observed. In the control (right), the bacterial fragments were, typically,

found as bright aggregates on the membranes surrounding the eggs. The images represent N = 6 queens.

5배 배율, 눈금자로 200μm이다. (B) 냉동 절편 난소에 있는 난자. 10배 배율, 눈금자로 200 μm이다. (C) 냉동 절편된

난소의 단일 난자; 20배 배율, 눈금자로 50μm이다. Vg 배양된 난소에서 내재된 형광 물질을 가진 난자가 관찰되었다.

대조군 (오른쪽)에서 , 박테리아 조각은 일반적으로 난자를 둘러싼 막에서 밝은 집합체로 발견되었다. 이미지는 N=6

여왕벌을 나타낸다.

3. Vg is sufficient and necessary for TGIP 

   Vg는 TGIP에 대해 충분하고 필요하다.

Finally, Vg was found to be a sufficient and necessary hemolymph protein for the transfer of immune elicitors to occur. To show

this, we tested if the presence of other, non-Vg honey bee hemolymph proteins produced by ion-exchange fractioning of honey

bee hemolymph can trigger the transfer of immune elicitors to the developing eggs.

마지막으로, Vg는 면역 유출자의 전달이 일어나기 위해서는 충분하고 필요한 혈림프(혈강체액) 단백질인 것으로

밝혀졌다. 이를 보여주기 위해, 우리는 꿀벌 혈림프의 이온 교환 단편에 의해 생성되는 다른 비 Vg 꿀벌 혈림프

단백질의 존재가 면역 유출자를 진화중인 난자로 옮길 수 있는지 테스트했다.

The major protein fractions in the samples of other proteins are apolipophorin and hexamerins that are involved

in transport and storage functions (see S1 Fig for an SDS-PAGE gel of hemolymph, pure Vg and the other

non-Vg proteins, and a hemolymph fractioning chromatogram). In the case of the non-Vg hemolymph proteins,

the result was negative (Fig 3).

다른 단백질 샘플에서 주요 단백질 파편은 수송 및 저장 기능에 관여하는 아포리포포린 및 헥사메린입니다 (혈림프,

순수 Vg 및 기타 비 -Vg 단백질의 SDS-PAGE 겔 및 혈림프 단편 색층렬(色層列)은 S1 그림 참조) ). 비-Vg 혈림프

단백질의 경우, 결과는 음성이었다 (그림 3).

Fig 3. The localization of fluorescently-labeled bacterial fragments in cryo-sectioned honey bee queen ovaries incubated in

the presence of pure Vg, in the presence of hemolymph proteins other than Vg, and in the absence of any externally provided

protein.

그림 3. 냉동 절편된 꿀벌 여왕벌 난소에서 형광 라벨로 표시된 박테리아 조각의 국소화는 순수한 Vg의 존재, Vg

이외의 혈림프 단백질의 존재 및 외부에서 제공된 단백질의 부재하에서 배양되었다.

(A) One ovary was incubated with Vg (left) and the other with other hemolymph proteins (right), N = 3. (B) One ovary was

incubated with Vg (left) and the other without any protein (right), N = 3. (C) One ovary was incubated without any protein

(left) and the other with other hemolymph proteins but Vg (right), N = 2. The scale is 50 μm, or 200 μm (the latter is

indicated with scale bars).

(A) 하나의 난소는 Vg (왼쪽)와 다른 하나는 다른 혈림프 단백질 (오른쪽), N = 3과 함께 배양되었다. (B) 하나의

난소는 Vg (왼쪽), 다른 하나는 단백질 없이 (오른쪽), N = 3으로 배양되었다. (C) 하나의 난소는 단백질없이 (왼쪽)

다른 하나는 다른 혈림프 단백질과 함께 배양되었지만 Vg (오른쪽), N = 2. 눈금자로 50 μm 또는 200 μm입니다 (

후자는 스케일 막대로 표시됨).

Discussion

토론

We establish here a previously undescribed role for the major egg-yolk precursor protein Vg as the carrier of immune elicitors

from mother to eggs in insects. Using the honey bee as a model, we first confirm‎ that Vg binds to different types of bacteria,

both P. larvae, a Gram-positive pathogen that infects and kills honey bee larvae, and to E. coli that represents Gram-negative

bacteria.

우리는 여기에서 곤충의 어미에서 난자로 면역 유도 물질의 운반체로서 주요한 난항 전구체 단백질 Vg에 대한 이전에

기술되지 않은 역할을 증명한다. 꿀벌을 모델로 사용하여, 먼저 Vg가 꿀벌 유충을 감염시키고 죽이는 그람 양성

병원균인 패니바실루스 유생(부저병)과 그람 음성 박테리아를 나타내는 대장균과 같은, 서로 다른 유형의 박테리아와

결합된다는 것을 먼저 입증한다.

This binding could not be mimicked by BSA. Next, we verify that Vg binds to pathogen-associated molecular patterns. Finally,

we document that Vg is required for the transport of fluorescently labeled cell wall pieces of E. coli into developing eggs in

ovaries. These experiments show for the first time that Vg serves as a carrier of immune-priming signals.

이 결합은 BSA에서 모방 할 수 없다. 다음으로, 우리는 Vg가 병원균 관련 분자 패턴에 결합한다는 것을 증명한다.

마지막으로, 우리는 Vg가 대장균의 형광 표지된 세포벽 조각을 난소에서 발달하는 난자로 전달하는데 필요하다는

것을 문서화한다. 이 실험은 Vg가 면역 프라이밍 신호의 운반체 역할을 한다는 것을 처음으로 보여 준다.

This finding provides a new molecular mechanism behind trans-generational immunity in oviparous species. Although not

conclusive, our bacteria western blot with stronger Vg binding to P. larvae than E. coli and surface plasmon resonance data

with stronger PG binding response compared to LPS hint that Vg might have a binding preference to Gram-positive bacteria.

이 발견은 난생(卵生)의 종에서 세대간 면역에 숨겨진 새로운 분자 메커니즘을 제공한다. 결정적이지는 않지만, 

대장균보다 패니바실루스 유생(부저병균)에 더 강한 Vg 결합을 하는 우리의 박테리아 특수 단백질 검출 검사와

LPS에 비해 PG 더 강한 결합 반응을 하는 표면 플라스몬 공명 데이터는 Vg가 그람 양성 박테리아에 대해 결합

선호도를 가질 수 있음을 암시한다.

This could be an adaptation to the major bacterial threats of the honey bee larvae: P. larvae, as well as Melissococcus plutonius

which causes European foulbrood disease. These pathogens are both Gram-positive bacteria.Several human lipoproteins bind to

a broad range of hydrophobic inflammatory molecules including bacterial surface structures and remnants of necrotic cells in an

anti-inflammatory manner [18,19].

이것은 꿀벌 유충의 주요 박테리아 위협에 대한 적응일 수 있다 : 패니바실루스 유생(미국 부저병균)과 유럽 부저병

질병을 일으키는 멜리소코쿠스 플루토니우스, 이 병원균은 모두는 그람 양성균이다. 몇가지 인간 지질 단백질은

항염증 방식으로 박테리아 표면 구조와 괴사성 세포의 잔재를 포함하는 광범위한 소수성(疏水性) 염증 분자에

결합한다 [18,19].

Based on our current and previous data, we propose that the insect lipoprotein Vg shares a similarly broad binding range.

We previously found that honey bee Vg binds strongly to phosphatidylserine containing liposomes, to blebs of apoptotic insect

cells and to necrotic cells packed with phosphatidylserine, while having modest binding capability to healthy insect cell membrane

or liposomes with neutral phosphatidylcholine [20].

현재 및 이전 데이터를 기반으로, 곤충 지질 단백질 Vg가 비슷하게 넓은 결합 범위를 공유한다고 우리는 제안한다.

우리는 이전에 꿀벌 Vg가 리포솜이 들어 있는 포스파티딜세린, 세포 사멸성 곤충 세포의 수포 및 포스파티딜세린으로

채워진 괴사 세포에 강하게 결합하는 반면, 건강한 곤충 세포막 또는 중성 포스파티딜콜린이 있는 리포솜에 적당한

결합 능력을 가지고 있음을 발견했다 [20].

The negative charge of phosphatidylserine may explain the selectivity of Vg binding between lipids, as Vg α-helical part seems

to have higher affinity towards negatively charged damaged cell membranes [20]. We speculate that the combination of negative

charge and hydrophobicity can provoke Vg binding to the bacterial PG and LPS signature molecules as well.

포스파티딜세린의 음전하(陰電荷)는 Vg α- 나선형 부분이 음으로 하전된(바꾸다 뜻) 손상된 세포막에 대해 더 높은

친화력을 갖는 것처럼 보이기 때문에, 지질 사이의 Vg 결합의 선택성을 설명할 수 있다 [20]. 우리는 음전하와

소수성의 조합이 박테리아 PG 및 LPS 시그니처 분자에 대한 Vg 결합을 유발할 수 있다고 또한 예상한다.

Vg participation in TGIP can represent a co-option of the protein’s dual role in fecundity and immunity [21]. The gene

(vitellogenin) experiences rapid evolution in the honey bee [22], it is present in different copy numbers in different insect

species [23], and has several homologous genes in some insects [24].

TGIP에 Vg 참여는 번식과 면역에서 단백질의 이중 역할의 공동 선택을 나타낼 수 있다 [21]. 이 유전자

(난항형성전구체)는 꿀벌에서 급속한 진화를 경험하고 [22], 다른 곤충 종에서 다른 복제개수(複製個數)로 존재

하고 [23], 일부 곤충에서 여러 상동 유전자를 가지고 있다 [24].

Mutation hotspots are found within the honey bee vitellogenin sequence, and the multiple alleles are under ongoing positive

selection in Africa, East- and West-Europe. By analogy to vertebrate adaptive immunity [15,25,26], certain Vg variants could be

more sensitive to specific pathogen recognition.

돌연변이 핫스팟은 꿀벌 난황형성전구체 서열 내에서 발견되며, 다양한 대립 유전자는 아프리카, 동, 서유럽에서

계속적으로 양성 선택을 받고 있다. 척추 동물 적응 면역 [15,25,26]과 유사점으로 인해, 일부 Vg 변종은 특정

병원체 인식에 더 민감 할 수 있다.

Vitellogenin alleles in at least some insects may thus evolve under local pathogen pressure. We speculate that changes in

pathogen pressure over time and in different environments are reflected in these interesting patterns of vitellogenin evolution.

따라서 적어도 일부 곤충에서 난황형성전구체 대립 유전자는 일부분의 병원균 압력 하에서 진화할 수 있다. 우리는

시간이 지남에 따라 그리고 다른 환경에서 병원균 압력의 변화가 이러한 난황형성전구체 흥미로운 진화 패턴에 반영

되었다고 추측한다.

Examining the roles of Vg in invertebrate TGIP can open up entirely new areas in immunology. Immune responses can be very

specific and induced by pathogen associated molecular markers present on the cell walls of microorganisms (PG, LPS,

surface glucans).

무척추 동물 TGIP에서 Vg의 역할을 조사하면 면역학에서 완전히 새로운 영역을 열 수 있다. 면역 반응은 매우

특이적일 수 있으며 미생물 (PG, LPS, 표면 글루칸)의 세포벽에 존재하는 병원체 관련 분자 마커(표지)에 의해

유도될 수 있다.

TGIP can occur and disappear very rapidly, is often maternally transmitted and shows pathogen specificity. The new discovery

of a Vg-mediated transfer-mechanism, as described here, would be consistent with all these observations. For Vg-mediated

TGIP to occur, the mother must be exposed to a certain amount of pathogenic cell wall fragments during or immediately

prior to reproduction.

TGIP는 매우 빠르게 발생하고 사라질 수 있으며 종종 모체로 전염되며 병원균 특이성을 나타낸다. 여기에 설명된

바와 같이, Vg 매개 전달 메커니즘의 새로운 발견은 이러한 모든 관찰과 일치한다. Vg 매개 TGIP가 발생하기

위해서는, 어미는 번식 중 또는 직전에 즉시 일정량의 병원성 세포벽 조각에 노출되어야 한다.

Bacteria are actively lysed in the gut lumen by the digestive system, as well as in the hemolymph by the immune system. Once

in the hemolymph, the immune elicitors are available for binding to Vg and for transfer to the developing eggs in the ovary

. This route would allow a mother to prime her offspring against the specific infections present in her current environment.

박테리아는 면역계에 의해 혈림프에서 뿐만 아니라, 소화계에 의해 창자 내강에서 활발하게 용해된다. 일단 혈림프에

들어가면, 면역 유출자(유도체)는 Vg에 결합하고 난소에서 발달중인 난자로 전달하는데 사용할 수 있다. 이 경로를

통해 어미는 현재 환경에 존재하는 특정 감염에 대하여 자손에게 정보를 줄 수 있다.

When the environment becomes pathogen-free and infection has cleared from the adult female, no transfer to her eggs would

take place. In this manner, the cost of resistance to infections in offspring would be avoided. We propose that Vg-mediated

TGIP can allow for efficient, specific and environmental-dependent immune priming in insects.

환경에 병원균이 없게 되고 성체 어미에게서 감염이 없어지면, 난자로 전이가 일어나지 않는다. 이러한 방식으로,

자손의 감염에 대한 저항성 대가를 피할 것이다. 우리는 Vg 매개 TGIP가 곤충에서 효율적이고 특이하며 환경

의존적인 면역 프라이밍을 허용할 수 있다고 제시한다.

However, this mechanism does not rule out that other mechanisms also participate in TGIP. These can include paternal TGIP,

other molecules transported by mothers or epigenetic modifications [27,28]. In this context, it is interesting to note that male

insects also produce Vg, and that Vg can be found in their seminal fluids [29].

그러나, 이 메커니즘은 다른 메커니즘이 또한 TGIP에 참여한다는 것을 배제하지 않는다. 이런 것은 부계 TGIP, 모계에

의해 전달된 다른 분자 또는 후생적인 변형도 포함될 수 있다 [27,28]. 이러한 맥락에서, 수컷 곤충도 Vg를 생산하고,

Vg는 그들의 정액에서 발견될 수 있다는 것을 주목하는 것도 흥미롭다 [29].

 주) epigenetic : (후생적인) DNA 염기 서열의 변화없이 유전자 기능의 유전적 변형이 일어나는 과정을 의미합니다.

Vg-mediated transfer of pathogenically inactive bacterial fragments could provide a platform for the development of vaccines

for beneficial insects. For example, pollinator-oriented medical genetics could aim to identify the most TGIP efficient vitellogenin

alleles to improve honey bee colony survival.

병원성 비활성 박테리아 단편의 Vg 매개 전달은 유익한 곤충의 백신 개발을 위하여 플랫폼을 제공할 수 있다.

예를 들어, 수분 매개체 중심의 의학 유전학은 꿀벌 봉군 생존을 높이기 위해 가장 효율적인 TGIP 난황형성전구체

대립 유전자를 식별하는 것을 목표로 할 수 있다.

The reproductive female, the queen honey bee, is typically shielded from harsh environmental conditions and infection. However,

her environment is never sterile. Exposure can occur by direct contact or by contaminated food, and honey bee queens are likely

to experience some levels of pathogen load [30–32].

번식하는 암컷인, 여왕벌은 일반적으로 가혹한 환경 조건과 감염으로부터 보호가 된다. 그러나 그녀의 환경은 결코

균이 없는 상태가 아니다. 노출은 직접인 접촉 또는 오염된 식량에 의해 발생할 수 있으며, 꿀벌 여왕벌은 일정 수준의

병원균 부하를 경험할 수 있다 [30-32].

Conversely, knowledge about Vg-mediated TGIP can also open the door for modifying or hijacking TGIP in pest insect species.

For example, TGIP may be impaired by chemically modifying the binding properties of Vg.  Alternatively, TGIP could be

exploited to trigger a reaction against the pathogenic insect’s symbionts, or to put the immune system in overdrive—increasing

the cost of immunity and reducing investment in reproduction.

반대로, Vg 매개 TGIP에 대한 지식은 해충 곤충 종에서 TGIP를 수정하거나 강탈할 수 있는 문을 열 수도 있다.

예를 들어, TGIP는 Vg의 결합 특성을 화학적으로 수정하여 손상될 수 있다. 그대신에, TGIP는 병원성 곤충의 공생체에

대한 반응을 유발하게 하거나, 면역 체계를 증속 구동하여 면역 대가를 높이고 번식에 대한 투자를 줄일 수 있도록

할용할 수 있다

In sum, such applications could be highly beneficial in agriculture. It remains to be tested whether Vg-mediated transfer of

immune elicitors occurs in egg-laying vertebrates. If yes, then the vertebrate lineage would have retained an ancient TGIP

mechanism in addition to their evolutionary innovation of transfer of antibodies.

결국, 그러한 응용은 농업에 매우 유익할 수 있다. 면역 유출자의 Vg 매개 전달이 알을 낳는 척추 동물에서 발생

하는지 여부는 여전히 테스트되어야 한다. 그렇다면, 척추 동물 계통은 항체 전달의 진화적인 혁신과 더불어 오래된

TGIP 메커니즘을 유지했을 것이다.

Materials and Methods

재료 및 방법

1. Western blot with live P. larvae and E. coli

   살아있는 패니바실루스 유생과 대장균을 사용한 특수 단백질 검출 검사

Wintertime worker honey bee hemolymph (hl) and fat body protein extract (fb) are rich in Vg, and were used for testing

Vg-binding to bacteria, adapted from the fish Vg experiment by Tong et al. [17] using an antibody that detects honey bee

Vg. For cell-free hl and fb sampling, see Havukainen et al. [33].

월동 일벌 혈림프 (hl)와 지방체 단백질 추출물 (fb)은 Vg가 풍부하며, 꿀벌 Vg를 검출하는 항체를 사용하여,

Tong 外에 의해 물고기 Vg 실험에서 채택된 박테리아에 대한 Vg 결합 테스트로 사용되었다.  세포가 없는 hl 및

fb 샘플링에 대해서는 Havukainen 外를 참조하라 [33].

The experiment was performed at room temperature, centrifugation steps were 3,000 g for 5 min, and wash volume was

0.5 ml of PBS, if not mentioned otherwise. P. larvae (strain 9820 purchased from Belgian Co-ordinated Collections of

Micro-organisms, Gent, Belgium) grown on MYPGP agar plates for 7 days and Epicurian Gold E. coli grown in LB medium

liquid culture overnight were washed and suspended in 100 μl PBS per sample.

실험은 상온에서 수행되었고, 원심분리 단계는 5분 동안 3,000g이었고, 달리 언급되지 않는 한, 세척 부피는

0.5ml의 PBS였다. 7일 동안 MYPGP 한천 배양기 평판에서 성장한 P. 유충 (벨기에 Gent, Belgian Co-ordinated

Collections of Micro-organisms에서 구입한 균주 9820) 및 밤새 LB 배지 액체 배양에서 성장한 Epicurian Gold

대장균을 샘플 당 100μl PBS로 세척하고 현탁했다. 

The bacteria suspensions (~1.3 x 108 cells/ml) were mixed with either an equal volume of hemolymph diluted 1/10 in PBS

with a protease inhibitor cocktail (Roche, Penzberg, Germany) or with fat body protein extract (5.7 mg/ml total protein in

PBS with the protease inhibitors).

박테리아 현탁액 (~1.3 x 108 세포/ml)은 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, Penzberg, Germany)을 사용하여

PBS에 1/10로 희석된 동일한 부피의 혈림프 또는 지방체 단백질 추출물과 혼합되었다. (프로테아제 억제제가

포함된 PBS의 총 단백질5.7mg/ml).

The following negative controls were used: 1) 100 μl P.larvae and E. coli with an equal volume of PBS but no hl/fb, to detect

possible unspecific antibody binding to the bacteria, 2) 100 μl fb with an equal volume of PBS, but no bacteria, to detect

possible Vg aggregation, and 3) 100 μl P.larvae and E. coli treated with 100 μl 5 mg/ml bovine serum albumin (BSA; control

protein).

다음과 같은 음성 대조군이 사용되었다 : 1) 가능한 박테리아와 결합할 수 있는 비특이적 항체를 검출하기 위해,

동일한 부피의 PBS 이지만  hl/fb가 없는 100 μl  P. 유생 및 대장균, 2) 가능한 Vg 집합체를 검출하기 위한, PBS

부피는 동일하지만 박테리아가 없는 100μl fb, 그리고 3) 100 μl 5mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA; 대조 단백질)으로

처리된 100 μl  P. 유충 및 대장균.

As untreated controls, we kept on ice 0.1 μl of hl, 0.5 μl of fb extract, and 1 μl of BSA. The samples were incubated at 26°C for

50 min under agitation for Vg-bacteria binding to occur. The bacteria were washed six times. The final pellet was resuspended

in 10 μl of 4 M urea in PBS, agitated for 15 min and centrifuged.

처리되지 않은 대조군으로, 우리는 0.1 μl의 hl, 0.5 μl의 fb 추출물 및 1 μl의 BSA를 얼음 위에 보관했다. Vg-

박테리아 결합이 일어나도록 샘플을 교반하면서 26 °C에서 50분 동안 배양하였다. 박테리아는 6회 세척되었다.

최종 펠렛을 PBS 중의 4M 요소 10μl에 재현탁하고 15분 동안 교반하고 원심 분리하였다.

The samples were blotted on a nitrocellulose membrane according to a standard horse-radish peroxidase conjugate protocol

with the Vg antibody tested before [33,34] (dilution 1:25,000; Pacific Immunology, Ramona, CA, USA), or a commercial BSA

antibody (1:2000; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). The bands were visualized using Immune-Star kit and ChemiDoc XRS+

imager. All blotting reagents were purchased from Bio-Rad (Hercules, CA, USA).

표본은 이전에 시험한 Vg 항체 (희석 1 : 25,000; Pacific Immunology, Ramona, CA, USA), 또는 상용 BSA 항체를

사용하여 표준 호스-라디시 과산화 효소 접합 프로토콜에 따라 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. (1 : 2000; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). 밴드는 Immune-Star 키트와 ChemiDoc XRS + 이미저를 사용하여 시각화

되었다. 모든 블로팅 시약은 Bio-Rad (Hercules, CA, USA)에서 구입했다.

2. Microscopy of P. larvae and E. coli

P. 유생과 대장균의 현미경

Vg-binding to bacteria was further tested by fluorescence microscopy. The incubation with hl was as above, except hl and

bacteria volumes were both 20 μl and the number of bacterial cells was ~3 x 106. All centrifugation steps were 10,000 g,

+4°C, 5 min and PBS-T wash volumes were 1 ml.

박테리아에 대한 Vg 결합은 형광 현미경으로 추가로 테스트되었다. hl과의 배양은 hl과 박테리아 부피가 모두

20 μl이고 박테리아 세포의 수가 ~ 3 x 106 인 것을 제외하고는, 위와 같았다. 모든 원심분리 단계는 10,000g,

+ 4 ° C, 5 분이고 PBS-T 세척 부피는 1ml 이었다. 

After hl incubation with the bacteria, the bacteria were washed and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min in room

temperature. The cells were washed twice and blocked with 5% milk in PBS-T for 30 min in room temperature and washed

again. Vg primary antibody (same as above) was used 1:50 in PBS-T and 1% milk for overnight incubation at +4°C.

박테리아와 hl 배양 후, 박테리아를 세척하고 상온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 세포를

2회 세척하고 PBS-T에서 5% 우유로 30분 동안 상온에서 차단하고 다시 세척 하였다. Vg 1차 항체 (상기와 동일)는

+4 °C에서 밤새워 배양하기 위해 PBS-T 및 1 % 우유에서 1:50으로 사용되었다.

The samples were washed twice and incubated with Alexa fluor 488 nm anti-rabbit antibody, 1:50, for 1 h in room temperature in dark and washed three times. DNA was stained with standard propidium iodide (PI) protocol

(Invitrogen).

샘플을 2 회 세척하고 Alexa fluor 488 nm 항-토끼 항체 (1:50)와 함께 1 시간 동안 어두운 곳에서 상온에서

배양하고 3 회 세척했다. DNA는 표준 프로피듐 요오드화물 (PI) 프로토콜 (Invitrogen)로 염색되었다.

The bacteria were mounted with glycerol and imaged with Zeiss Axio Imager M2, excitations 499 nm and 536 nm, and emissions

519 nm and 617 nm. The primary antibody was omitted in the treatment of the secondary antibody control samples.

박테리아를 글리세롤로 장착하고 Zeiss Axio Imager M2, excitations 499nm 및 536nm, emissions 519nm 및

617nm로 이미지화했다. 1차 항체는 2차 항체 대조 샘플의 처리에서 생략되었다.

3. Surface plasmon resonance with LPS, PG and zymosan

   LPS, PG 및 지모샌과의 표면 플라즈몬 공명

Vg was purified from honey bee hemolymph with ion-exchange chromatography as described before [20,34]. Biacore T200

instrument (GE Healthcare, Waukesha, USA) and buffers from the manufacturer were used. The analytes were bought from

Sigma Aldrich: PG from S. aureus #77140, LPS from E. coli #L2630 and zymosan from S. cerevisiae #Z4250. 30 μl/ml Vg in

10 mM acetate buffer pH 4.5 was immobilized on a CM5 chip—primed and conditioned according to the manufacturer’s

instructions—until the response reached 5150 RU.

Vg는 이전에 기술된 바와 같이 이온 교환 색층 분석법을 사용하여 꿀벌 혈림프에서 정제되었다 [20,34]. Biacore

T200 기기 (GE Healthcare, Waukesha, USA) 및 제조업체의 버퍼가 사용되었다. 분석물은 Sigma Aldrich에서

구입했다 : S. aureus # 77140의 PG, 대장균 # L2630의 LPS 및 S. cerevisiae # Z4250의 지모샌. 10mM 아세트삼염

완충액에 pH 4.5의 30μl / ml Vg를 CM5 칩에 고정시켰으며, 응답이 5150RU에 도달할 때까지 제조업체의

설명서에 따라 준비하고 조정되었다.

The chip was blocked using ethanolamine. The analytes were suspended in the running buffer (0.1 M HEPES, 1.5 M NaCl and

0.5% v/v surfactant P20) and heated at 90°C for 30 min with repeated vigorous vortexing, followed by spinning in a table

centrifuge for 20 min. Zymosan was heated for an additional 30 min at 95°C before centrifugation.

에탄올아민을 사용하여 칩을 차단했다. 분석물을 러닝 버퍼 (0.1 M HEPES, 1.5 M NaCl 및 0.5% v/v 계면 활성제

P20)에 현탁하고 격렬한 소용돌이를 반복하면서, 90°C에서 30분 동안 가열한 다음, 테이블 원심 분리기에서 20분

동안 회전시켰다. 지모샌은 원심 분리 전에 95°C에서 추가로 30분 동안 가열되었다.

PG and zymosan form a fine suspension in water solutions, and they formed a pellet during the centrifugation; their

concentrations are given here as the weight added to the volume. The analytes were run with 120 s contact time and 600 s

dissociation time with a 30 μl/min flow rate at 25°C. The analytes flowing in a separate channel on a naked chip was used

as a blank, whose value was subtracted from the sample.

PG와 지모샌은 수용액에서 미세한 현탁액을 형성하고, 원심 분리 중에 펠릿을 형성했다 ; 그들의 농도는 부피에

추가된 무게로 여기에 주어진다. 분석물은 25°C에서 30μl/min 유속으로 120 초의 접촉 시간 및 600 초의 분리 시간

으로 실행되었다. 네이 키드 칩의 별도 채널로 흐르는 분석물은 샘플에서 값을 뺀 블랭크로 사용되었다.

After optimizing the binding-range, the following concentrations were measured. PG: 0, 0.25, 0.5, 2, 3, 5 mg/ml; LPS: 0, 0.1, 0.2,

0.9, 1.8, 3 mg/ml, and zymosan: 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 mg/ml. PG and LPS binding did not reach binding saturation, yet, we did not

exceed 5 mg/ml or 3 mg/ml concentration, respectively, to avoid analyte aggregation (see the manufacturer’s information and

references therein for work concentrations).

결합 범위를 최적화한 후, 다음 농도를 측정했다. PG : 0, 0.25, 0.5, 2, 3, 5 mg / ml; LPS : 0, 0.1, 0.2, 0.9, 1.8,

3 mg / ml 및 지모샌 : 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 mg / ml. PG 및 LPS 결합은 결합 포화도에 도달하지 않았지만, 우리는분석물

응집을 방지하기 위해, 각각, 5mg / ml 또는 3mg / ml 농도를 초과시키지 않았다 (작업 농도에 대해서는 제조업체의

정보 및 참조를 보라).

4. Microscopy of queen ovaries

  여왕벌 난소 현미경

Six one year old A. mellifera ligustica queens were anesthetized on ice. Their ovaries were dissected and washed in ice cold

PBS. One of the paired ovaries per queen was then placed in control solution (50 μl PBS containing 2 mg/ml

Texas Red labeled E. coli Bioparticles; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and the other ovary was placed in

the same solution that contained, in addition, 0.5 mg/ml Vg purified from honey bee hemolymph [20,33].

1년된 서양종 리구스티카 여왕벌 여섯 마리를 얼음 위에서 마취시켰다. 그들의 난소를 해부하고 얼음처럼

차가운 PBS로 세척했다. 여왕벌 당 쌍을 이루는 난소 중 하나를 대조군 용액 (2mg / ml Texas Red 표지된

E. coli Bioparticles; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA를 함유하는 50μl PBS)에 넣고, 또한, 꿀벌의 혈림프

에서 정제된 0.5mg/ml Vg를 함유한,다른 난소를 동일한 용액에 넣었다. [20,33].

The ovaries were incubated at 28ºC for 2 h under agitation. Next, the ovaries were washed twice in 1 ml ice cold PBS for 5

min under agitation. Samples of two queens were directly mounted using Fluoromount (Sigma) and observed by bright field

and fluorescence (excitation 595 nm, emission 615 nm) microscopy (Axio Imager M2, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).

난소는 교반하에 28ºC 에서 2시간 동안 배양되었다. 다음으로, 난소를 교반하에 5분 동안 얼음같이 차가운 PBS  

1ml로 2회 세척 하였다. 두 여왕벌의 샘플을 Fluoromount (Sigma)를 사용하여 직접 장착하고 명시야 및 형광

(여기 595 nm, 방출 615 nm) 현미경 (Axio Imager M2, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)으로 관찰했다.

One additional untreated control queen was imaged for detection of the autofluorescent pedical area of the ovary. The

remaining four queens were embedded in Tissue-Tek (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) and stored in -80ºC. These ovaries

were cut in 17 mm sections at -20ºC, and imaged immediately after mounting. The microscopy settings were kept constant

during imaging.

난소의 자동 형광 페디컬 영역을 검출하기 위해 처리되지 않은 대조군 여왕벌 하나를 추가로 촬영했다. 나머지

4 마리의 여왕은 Tissue-Tek (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)에 넣어 -80ºC에 보관하였다. 이 난소는 -20ºC

에서 17mm 단면으로 절단하고 장착후 즉시 이미지를 촬영했다. 현미경 설정은 이미지화 하는 동안 일정하게

유지되었다.

To test whether hemolymph proteins could trigger the uptake of immune elicitors even in the absence of Vg, we modified

the experimental setup to include hemolymph proteins other than Vg, the majority of which are apolipophorin and

hexamerins, both known to bind to immune elicitors [35].

혈림프 단백질이 Vg가 없는 경우에도 면역 유출자의 흡수를 유발할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 우리는 Vg

이외의 혈림프 단백질을 포함하도록 실험 설정을 수정했다. 대부분은 아포리포포린과 헥사 메린이고, 둘 다 면역

유출자(유도체)에 결합하는 것으로 알려져 있다  [35 ].

The other hemolymph proteins were obtained by running ion-exchange chromatography on honey bee hemolymph and

dividing the collected hemolymph fractions into Vg and non-Vg proteins (S1 Fig) [20,33]. Remaining small molecular

weight hemolymph molecules, such as possible peptides and hormones, were removed during protein

concentration using centrifugal filters with 50 kDa cutoff with both Vg and non-Vg fractions (Millipore, Billerica,

MA, USA).

다른 혈림프 단백질은 꿀벌 혈림프에서 이온 교환 색층 분석법을 실행하고 수집된 혈림프 단편을 Vg 단백질과

비-Vg 단백질로 나누어 얻었다 (S1 그림) [20,33]. 가능한 펩타이드 및 호르몬과 같은, 남아있는 저(低)분자량

혈림프 분자는 Vg 및 비 -Vg 단편 (Millipore, Billerica, MA, USA)과 함께 50kDa 차단한 원심 분리 필터를 사용

하여 단백질 농축 중에 제거되었다.

Fractions containing both Vg and other hemolymph proteins were discarded. The Vg and the non-Vg proteins had a final

concentration of 0.5 mg/ml in the experiment. The queens were as above. The setup was as follows (all incubations contained

the E. coli Bioparticles 1.5 mg/ml): one ovary was incubated with Vg and the other ovary with control solution (see above)

(N = 3); one with Vg and the other with non-Vg hemolymph proteins (N = 3), and one ovary with non-Vg hemolymph

proteins and the other with control solution (N = 2).

Vg 및 기타 혈림프 단백질을 모두 포함하는 단편은 폐기되었다. Vg 및 비-Vg 단백질은 실험에서 최종 농도가

0.5mg/ml 였다. 여왕벌들은 위와 같았다. 설정은 다음과 같았다 (모든 인큐베이션에는 대장균 Bioparticles

1.5 mg/ml가 포함됨) : 한 난소는 Vg 와 다른 난소는 대조군 용액으로 배양되었다 (위 참조) (N = 3);

하나는 Vg이고 다른 하나는 비 -Vg 혈림프 단백질 (N = 3), 그리고 하나의 난소는 비 -Vg 혈림프 단백질과

다른 하나는 대조군 용액 (N = 2)

The cryo-section imaging was done as above.

냉동 단면 이미징은 위와 같이 이루어졌다.

Supporting Information

 지원 정보

Chromatographic fractioning of honey bee hemolymph to Vg and other proteins.

 꿀벌 혈림프를 Vg 및 기타 단백질의 색층분석법 분별

S = size standard.

S = 표준 크기

(A) An SDS-PAGE gel with a honey bee hemolymph sample used for protein fractioning. The major proteins are (in size order)

apolipophorin, vitellogenin and hexamerins.

(A) 단백질 분별에 사용되는 꿀벌 혈림프 샘플이 포함된 SDS-PAGE 젤. 주요 단백질은 (크기 순서대로)

apolipophorin, vitellogenin 및 hexamerins이다.

(B) Pure vitellogenin and other hemolymph proteins produced by ion-exchange chromatography. The faint

~150 and ~40 kDa bands in the pure vitellogenin fraction are the previously mass-spectrometrically verified

vitellogenin fragmentation products [33].

(B) 이온 교환 색층분석법에 의해 생성된 순수한 난황형성전구체 및 기타 혈림프 단백질. 순수한 난황형성전구체

단편의 희미한 ~ 150 및 ~ 40 kDa 밴드는 이전에 질량 분광학적으로 검증된 난황형성전구체 단편화 산물이다

[33].

(C) Hemolymph f 0.45 M NaCl phosphate buffer. The fraction collected as pure Vg is highlighted grey. The other protein

fraction collected is indicated below the X-axis.

(C) 혈림프 f 0.45 M NaCl 인산 완충액. 순수한 Vg로 수집된 단편은 회색으로 강조 표시된다. 수집된 다른 단백질

단편은 X 축 아래에 표시된다.

Acknowledgments

감사의 말

We thank Prof. Liselotte Sundström at the Centre of Excellence in Biological Interactions, University of Helsinki, Finland, for

kind support laboratory and writing wise.  We thank MSc Eugen Pohoata for his great help with optimizing the E. coli imaging

conditions, and D. Page Baluch for expert imaging support (Arizona State University, USA), and Prof. Oyvind Halskau and Ole

Horvli for support with the Biacore instrument (University of Bergen, Norway).

우리는 친절한 지원 실험실과 현명한 집필을 해 주신, 핀란드 헬싱키 대학교, 생물학적 상호 작용의 우수 센터에

근무하는 Liselotte Sundström 교수에게 감사드린다. 대장균 이미징 조건을 최적화하는데 큰 도움을 준 MSc

Eugen Pohoata, 및 숙련된 이미징 지원 (미국 애리조나 주립 대학)에 대하여 D. Page Baluch, 그리고 Biacore

기기 지원에 대해 Oyvind Halskau 및 Ole Horvli 교수에게 감사드립니다 ( 노르웨이 베르겐 대학교).

We thank Claus Kreibich and the Finnish Beekeepers’ Association and, in particular, Ari Seppälä for help with the queen

samples. Thanks to beekeeper Eero Hänninen for providing honey bee test samples. For fruitful discussions, we want to

thank Prof. Ingemar Fries and his group at Swedish University of Agricultural Sciences, Sweden, and Prof. Robin Moritz and

Dr. Silvio Erler at Martin Luther University, Germany, as well as Dr. Daniel Münch at Norwegian University of Life Sciences,

Norway.

Claus Kreibich와 핀란드 양봉가 협회, 특히 여왕벌 샘플을 도와 준 Ari Seppälä에게 감사드린다. 꿀벌 테스트

샘플을 제공해 주신 양봉가 Eero Hänninen에게 감사드린다. 유익한 토론을 위해 스웨덴 농업과학 대학의

잉게마르 프라이스 교수와 그의 그룹, 독일 마틴 루터 대학의 로빈 모리츠 교수와 실비오 얼러 박사, 또한

노르웨이 생명 과학 대학교에 근무하는 다니엘 뭉크 박사에게 감사드린다. 

Author Contributions

저자 기고

Conceived and designed the experiments: HS GVA DF. Performed the experiments: HS DF. Analyzed the data: HS DF.

Contributed reagents/materials/analysis tools: HS GVA DF. Wrote the paper: HS GVA DF.

실험을 구상하고 설계했다 : HS GVA DF. 실험 수행 : HS DF. 데이터 분석 : HS DF. 기고된 시약/재료/분석 도구 :

HS GVA DF. 논문 작성 : HS GVA DF.

References

너무 많아 생략