대사체학 Metabolomics 탐구 시작 2017 nature

[문형철]

인슐린 구조를 밝혀 노벨 의학상을 받았다.

그런 구조를 밝혀 바이오마커, 치료에 응용하는 분야가 대사체학이다.

그런데, 그 속도가 100배, 1천배 빨라졌다.

이 분야에서 앞으로 어떤 치료적 성과가 나오는 것일까? 

패턴을 찾는데 탁월한 AI가 본격적으로 도입되면서 더 빨라지고 있다...

앞으로 10년후 인류 의학은 어떻게 변해있을까? 

Nat Rev Mol Cell Biol

. Author manuscript; available in PMC: 2017 Dec 14.

Published in final edited form as: Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Mar 16;17(7):451–459. doi: 10.1038/nrm.2016.25

Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms

Caroline H Johnson 1, Julijana Ivanisevic 2, Gary Siuzdak 3

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PMCID: PMC5729912  NIHMSID: NIHMS924971  PMID: 26979502

The publisher's version of this article is available at Nat Rev Mol Cell Biol

Abstract

Metabolomics, which is the profiling of metabolites in biofluids, cells and tissues, is routinely applied as a tool for biomarker discovery. Owing to innovative developments in informatics and analytical technologies, and the integration of orthogonal biological approaches, it is now possible to expand metabolomic analyses to understand the systems-level effects of metabolites. Moreover, because of the inherent sensitivity of metabolomics, subtle alterations in biological pathways can be detected to provide insight into the mechanisms that underlie various physiological conditions and aberrant processes, including diseases.

초록

대사체학 Metabolomics 은

생체액, 세포 및 조직 내 대사체의 프로파일링을 의미하며,

바이오마커 발견을 위한 도구로 일상적으로 적용되고 있습니다.

정보학 및 분석 기술의 혁신적인 발전과 정교한 생물학적 접근법의 통합으로 인해,

대사체 분석을 시스템 수준에서 대사체의 영향을 이해하는 데 확장할 수 있게 되었습니다.

또한

대사체학의 본질적인 민감성 덕분에

생물학적 경로의 미묘한 변화가 탐지되어

다양한 생리적 조건 및 이상 과정, 특히 질병의 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

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Metabolites are the substrates and products of metabolism that drive essential cellular functions, such as energy production and storage, signal transduction and apoptosis. In addition to being produced directly by the host organism, metabolites can derive from microorganisms, as well as from xenobiotic, dietary and other exogenous sources1.

The biochemical actions of metabolites are far-reaching. To start, metabolites can regulate epigenetic mechanisms and maintain the pluripotency of embryonic stem cells (ES cells)2–6. It has also been well established that metabolites such as ATP, acetyl-CoA, NAD+, and S–adenosyl methionine (SAM) can function as co–substrates, regulating post-translational modifications that affect protein activity7,8. In addition, fatty acids and hormones can interact with plasma proteins to enable their transport in the bloodstream9,10. Furthermore, metabolite–protein interactions can aid in facilitating cellular responses by initiating signalling cascades, thus evidencing the role of metabolites in signal transduction11,12.

대사체 Metabolites는

에너지 생산 및 저장, 신호 전달, 세포 사멸 등

필수적인 세포 기능을 촉진하는 대사 과정의 기질과 제품입니다.

대사체는

호스트 유기체에 의해 직접 생성될 뿐만 아니라

미생물, 외인성 물질, 식이 요인 및 기타 외부 출처에서 유래할 수 있습니다1.

외래물질은 인간이 일상적으로 접하는 물질로, 약물, 환경 오염물질, 화장품, 심지어 식이 성분까지 포함됩니다. 이러한 화학물질은 대사 및 해독 과정을 거쳐 다양한 대사물을 생성하며, 이 중 일부는 독성 등 의도하지 않은 효과를 유발할 수 있습니다. 또한 내인성 대사 과정에 사용되는 효소나 수용체의 작용을 차단하거나, 동시 투여된 약물의 효능 및/또는 생체 이용률을 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 이러한 화학물질이 신체에 미치는 전체 대사 효과를 파악하는 것은 필수적입니다. 대사체학은 생체액 내 소분자의 포괄적 분석을 통해 엑스노바이오틱스 노출로 인한 생물학적으로 의미 있는 변화를 밝혀낼 수 있습니다. 이 리뷰는 유전적, 환경적 요인 및 장내 미생물군집의 변이가 대사체에 미치는 영향과 이러한 변수들이 엑스노바이오틱스 대사 과정과 긍정적 또는 부정적으로 상호작용하는 방식을 논의합니다.

대사체의 생화학적 작용은 광범위합니다.

먼저,

대사체는 에피제네틱 메커니즘을 조절하고

배아 줄기 세포(ES 세포)의 다능성을 유지합니다2–6.

또한

ATP, 아세틸-CoA, NAD+, S-아데노실 메티오닌(SAM)과 같은

대사체가 보-기질로 기능하여 단백질 활성에 영향을 미치는

포스트트랜스레이셔널 변형을 조절한다는 것이 잘 알려져 있습니다7,8.

히스톤 아세틸화는 단일 세포 진핵생물에서 아세틸-코엔자임 A 합성효소(acetyl-CoA synthetase)에 의해 아세테이트를 이용해 아세틸-코엔자임 A를 생성하는 과정에 의존합니다. 그러나 다세포 동물(metazoans)은 포도당을 주요 탄소원으로 사용하며, 세포 외 아세테이트 농도가 매우 낮은 환경에 노출됩니다. 우리는 포유류 세포에서의 히스톤 아세틸화가 포도당에서 유래한 시트르산을 아세틸-코엔자임 A로 전환하는 ATP-시트르산 리아제(ATP-citrate lyase, ACL)에 의존함을 보여주었습니다. 우리는 성장 인자 자극에 따른 히스톤 아세틸화 증가 및 분화 과정에서 ACL이 필수적임을 발견했으며, 포도당 가용성이 ACL에 의존적인 방식으로 히스톤 아세틸화에 영향을 미친다는 것을 확인했습니다. 이러한 결과는 ACL 활성이 성장 인자 유발 영양 대사 증가와 히스톤 아세틸화 및 유전자 발현 조절 사이의 연결 고리를 형성하는 데 필수적임을 시사합니다.

또한

지방산과 호르몬은 혈장 단백질과 상호작용하여

혈류 내 운반을 가능하게 합니다9,10.

더욱이 대사산물-단백질 상호작용은 신호 전달 경로를 활성화하여

세포 반응을 촉진함으로써 대사산물의 신호 전달 역할11,12를 입증합니다.

Indirectly, metabolites affect the environment in which they are produced. Under normal conditions, homeostatic controls exist to counteract any adverse biological consequences of such effects. For example, acidic metabolites decrease the pH of the microenvironment13,14, and high concentrations of these acidic metabolites are found, for instance, in the colon, owing to bacterial fermentation of dietary carbohydrates that leads to the production of short-chain fatty acids. These are, however, efficiently neutralized by mucosal production of bicarbonate. Notably, such homeostatic controls can be compromised with age and during disease, leading to functional decline and a failure to return to steady state. In addition, the adaptation of aberrant glycolytic cancer cells to the large amounts of lactate and protons that they produce occurs through modification of the activity of transporters, exchangers, pumps and carbonic anhydrases, which all help to maintain the intracellular pH and enable cells to survive the acidic microenvironment15. Thus, as metabolites can have a wide range of functions in the cell and organism, there is growing motivation to better ascertain their specific functions, as well as to understand their physiological roles. This can be done by implementing various metabolomic approaches to identify metabolites and metabolic pathways that are associated with particular phenotypes, and then integrating this knowledge with functional and mechanistic biological studies.

The main methodologies that are used for metabolite recovery and identification are untargeted (global) and targeted mass spectrometry-based metabolomics, which are discussed in more detail in BOX 1. Untargeted metabolomics aims to measure the broadest range of metabolites present in an extracted sample without a priori knowledge of the metabolome. The types of metabolites that are recovered are influenced by the extraction and analytical method of choice, but they result in a complex data set that requires computational tools to identify and correlate metabolites between samples and to examine their interconnectivity in metabolic pathways in relation to the phenotype or aberrant process (see BOX 2 and Supplementary information S1 (box)). By contrast, targeted metabolomics provides higher sensitivity and selectivity than untargeted metabolomics, but metabolites are analysed on the basis of a priori information, whereby methods are developed and optimized for the analysis of specific metabolites and metabolic pathways of interest. Targeted analysis also constitutes an important part of a metabolomics workflow to validate and expand upon results from untargeted analysis16.

간접적으로, 대사산물은 생성되는 환경에 영향을 미칩니다.

정상 조건에서는

이러한 효과의 부정적인 생물학적 결과를 상쇄하기 위해

항상성 조절 메커니즘이 존재합니다.

예를 들어,

산성 대사산물은

미세 환경의 pH를 낮춥니다13,14,

그리고

이러한 산성 대사산물의 고농도는

식이 탄수화물의 세균 발효로 인해 단쇄 지방산이 생성되는 대장에서 발견됩니다.

그러나

이러한 산성 대사산물은

점막에서 생성되는 중탄산염에 의해 효율적으로 중화됩니다.

특히,

이러한 항상성 조절 메커니즘은

노화나 질병 상태에서 손상될 수 있으며,

이는 기능 저하와 안정 상태로의 복귀 실패로 이어집니다.

또한,

이상적인 당분해 암 세포는 생성하는 대량의 젖산과 프로톤에 적응하기 위해

운반체, 교환체, 펌프 및 탄산탈수효소의 활성을 조절합니다.

이러한 조절은

세포 내 pH를 유지하고

산성 미세환경에서 세포가 생존할 수 있도록 돕습니다15.

따라서

대사산물이 세포와 유기체에서 다양한 기능을 가질 수 있기 때문에,

그들의 특정 기능을 명확히 규명하고 생리적 역할을 이해하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다.

이는 특정 표현형과 연관된 대사산물과 대사 경로를 식별하기 위해

다양한 대사체학 접근법을 구현하고,

이 지식을 기능적 및 기전적 생물학적 연구와 통합하는 방식으로 이루어질 수 있습니다.

대사체 회수 및 식별에 사용되는 주요 방법은

비표적(전반적) 및 표적 질량 분석 기반 대사체학으로,

이는 BOX 1에서 자세히 논의됩니다.

비표적 대사체학은 대사체에 대한 사전 지식 없이 추출된 시료에 존재하는 가장 넓은 범위의 대사체를 측정하는 것을 목표로 합니다. 회수되는 대사체의 유형은 추출 및 분석 방법에 따라 영향을 받지만, 이는 샘플 간 대사체를 식별하고 상관관계를 분석하며 형질 또는 이상 과정과 관련된 대사 경로 내 상호연결성을 조사하기 위해 계산 도구가 필요한 복잡한 데이터 세트를 생성합니다(BOX 2 및 보충 자료 S1 (박스) 참조). 반면, 타겟형 대사체학은 비타겟형 대사체학보다 높은 감도와 선택성을 제공하지만, 사전에 알려진 정보를 기반으로 대사체를 분석합니다. 이 과정에서 특정 대사체나 관심 있는 대사 경로의 분석을 위해 방법론이 개발되고 최적화됩니다. 타겟형 분석은 비타겟형 분석 결과의 검증 및 확장을 위해 대사체학 워크플로우의 중요한 부분을 구성합니다16.

Box 1. Mass spectrometry in metabolomics.

Mass spectrometry

Mass spectrometry is an excellent analytical platform for metabolomic analysis, as it provides high sensitivity, reproducibility and versatility. It measures the masses of molecules and their fragments to determine their identity. This information is gained by measuring the mass–to–charge ratio (m/z) of ions that are formed by inducing the loss or gain of a charge from a neutral species. The sample, comprising a complex mixture of metabolites, can be introduced into the mass spectrometer either directly or preceded by a separation approach (using liquid chromatography or gas chromatography). Direct injection has been successfully implemented for high-throughput metabolomics. However, as thousands of ions can be present in metabolomic experiments, chromatographic separation before entering the mass spectrometer minimizes signal suppression and allows for greater sensitivity, and — by providing a retention time identifier — it can further aid metabolite identification. In addition to m/z and retention time information, the identification of an ion is facilitated by fragmentation pattern information that is acquired by tandem mass spectrometry83.

Untargeted metabolomics

Untargeted or global metabolomic analysis allows for an assessment of the metabolites extracted from a sample and can reveal novel and unanticipated perturbations. Untargeted analyses are most effective when implemented in a high-resolution mass spectrometer, to facilitate structural characterization of the metabolites. Its primary advantage is that it offers an unbiased means to examine the relationship between interconnected metabolites from multiple pathways. However, it is not yet possible to obtain all metabolite classes simultaneously, as many factors affect metabolite recovery, depending on the functional group of the metabolite. In addition, there are a large number of unknown metabolites that remain unannotated in metabolite databases35. Thus, depending on the pH, solvent, column chemistry and ionization technique used, untargeted metabolomics can provide a detailed assessment of the metabolites in a sample, revealing a wide range of metabolite classes.

Targeted metabolomics

Targeted metabolomic analyses measure the concentrations of a predefined set of metabolites. A standard curve for a concentration range of the metabolite of interest is prepared, so that accurate quantification can be gained. This type of analysis can be used to obtain exact concentrations of metabolites identified by untargeted metabolomics, providing analytical validation.

Imaging metabolomics

It is also possible to reveal the localization of selected metabolites within a tissue sample using imaging mass spectrometry techniques, such as matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)84, nanostructure-imaging mass spectrometry (NIMS)70,85, desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI)86 and secondary ion mass spectrometry (SIMS)87, among others. NIMS and DESI are especially suited to the analysis of small molecules.

상자 1. 대사체학에서의 질량 분석법.

질량 분석법

질량 분석법은

높은 감도, 재현성 및 다기능성을 제공하기 때문에

대사체 분석을 위한 우수한 분석 플랫폼입니다.

이 방법은

분자 및 그 조각의 질량을 측정하여

그 정체성을 결정합니다.

이 정보는 중성 종으로부터 전하를 잃거나 얻는 과정에서 형성된 이온의 질량-전하 비율(m/z)을 측정하여 얻어집니다. 메타볼리트의 복잡한 혼합물로 구성된 시료는 직접 또는 분리 방법(액체 크로마토그래피나 가스 크로마토그래피)을 거쳐 질량 분석기에 도입될 수 있습니다. 직접 주입은 고효율 대사체 분석에 성공적으로 적용되었습니다. 그러나 대사체 분석 실험에서 수천 개의 이온이 존재할 수 있기 때문에, 질량 분석기 진입 전 크로마토그래피 분리는 신호 억제를 최소화하고 감도를 높이며 — 유지 시간 식별자를 제공함으로써 — 대사체 식별을 추가로 지원합니다. m/z 및 유지 시간 정보 외에도, tandem 질량 분석법83을 통해 획득된 분해 패턴 정보는 이온 식별을 용이하게 합니다.

비표적 대사체학

비표적 또는 전대사체 분석은

시료에서 추출된 대사체를 평가하고

새로운 및 예상치 못한 변화를 밝혀낼 수 있습니다.

비표적 분석은

대사체의 구조 특성을 용이하게 하기 위해

고해상도 질량 분석기에 적용될 때 가장 효과적입니다.

그 주요 장점은 다양한 경로에서 상호 연결된 대사체 간의 관계를 편향 없이 조사할 수 있다는 점입니다. 그러나 대사체 기능 그룹에 따라 대사체 회수율에 영향을 미치는 요인이 많아, 모든 대사체 클래스를 동시에 얻을 수는 없습니다. 또한 대사체 데이터베이스에 미주석화된 미지 대사체가 대량 존재합니다35. 따라서 pH, 용매, 컬럼 화학, 이온화 기술 등에 따라 비표적 대사체학은 시료 내 대사체를 상세히 평가하여 다양한 대사체 클래스를 밝혀낼 수 있습니다.

표적 대사체학

표적 대사체학 분석은

사전 정의된 대사체 세트의 농도를 측정합니다.

관심 대사체의 농도 범위에 대한 표준 곡선이 준비되어 정확한 정량화가 가능합니다. 이 유형의 분석은 비표적 대사체학으로 식별된 대사체의 정확한 농도를 얻는 데 사용될 수 있으며, 분석적 검증을 제공합니다.

이미징 대사체학

매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI)84,

나노구조 이미징 질량 분석법(NIMS)70,85,

탈착 전기분사 이온화 질량 분석법(DESI)86 및 이차 이온 질량 분석법(SIMS)87 등

이미징 질량 분석법 기술을 활용해 조직 샘플 내 선택된 대사체의 위치를 확인할 수 있습니다.

NIMS와 DESI는 특히 소분자 분석에 적합합니다.

Box 2. Computational tools in metabolomics.

Metabolomic analyses, and untargeted metabolomics in particular, result in the generation of complex data sets; therefore, computational tools are crucial to process and interpret these results. The problems associated with big data processing, statistical analyses, metabolite identification and biological interpretation are not trivial, but there are now some novel tools available that accelerate and automate the computational workflows, providing user-friendly tools for both novice and expert bioinformaticians (for further details, refer to Supplementary information S1 (box)).

Data processing and statistical analysis

After data upload, mass spectral peaks are picked, realigned and annotated. The data is deconvoluted using computational tools to remove instrumental and chemical noise, thus providing only the biologically relevant information.

The types of statistical analyses that can be implemented for metabolomics data are vast, and choosing the correct test can be challenging. Online tools such as XCMS Online42, DeviumWeb MetaboAnalyst43 and many others give researchers the ability to carry out a wealth of tests. Some of the most recent advances are tools that provide false discovery rate measurements to ensure that the data have statistical power. Other concepts that are especially useful for finding biologically relevant metabolites are multi-group and meta-analyses, which can reveal shared metabolic changes across multiple experiments88.

Metabolite identification and databases

Initial putative metabolite identifications can be made on the basis of the accurate mass–to–charge ratio (m/z) of the mass spectral ion. This is aided by the use of comprehensive metabolite databases such as METLIN89, HMDB90, MassBank91 and GMD26,92. Tandem mass spectrometry experiments can then be carried out on the isolated ion, followed by matching with an authentic standard, in order to obtain characteristic fragments and retention time information to distinguish the ion from structural isomers. In silico prediction tools provide further insight into metabolite identification when a particular m/z or tandem mass spectrometry fragmentation pattern does not provide a match24,93. A recent innovation in ion mobility mass spectrometry, the rotationally averaged cross-collisional section (CCS), provides another level of metabolite identification, and databases containing CCS information are currently in the early stages of development94. Despite all of these innovations, some metabolite features cannot be assigned to a molecular structure. It is therefore important that they are published (databases for these have already been set up on METLIN) to aid in their future identification and correlation to phenotypes.

상자 2. 대사체학에서의 계산 도구.

대사체학 분석, 특히 비표적 대사체학은 복잡한 데이터 세트를 생성합니다. 따라서 이러한 결과를 처리하고 해석하기 위해 계산 도구는 필수적입니다. 빅 데이터 처리, 통계 분석, 대사체 식별 및 생물학적 해석과 관련된 문제는 간단하지 않지만, 이제 계산 워크플로우를 가속화하고 자동화하는 새로운 도구들이 등장했으며, 초보자부터 전문가까지 모든 생물정보학자에게 사용자 친화적인 도구를 제공합니다(자세한 내용은 보충 자료 S1 (상자)를 참조하세요).

데이터 처리 및 통계 분석

데이터 업로드 후, 질량 스펙트럼 피크가 선택, 재정렬 및 주석이 추가됩니다. 계산 도구를 사용하여 데이터에서 기기 및 화학적 노이즈를 제거하여 생물학적으로 관련 있는 정보만 추출합니다.

대사체학 데이터에 적용할 수 있는 통계 분석의 유형은 매우 다양하며, 적절한 테스트를 선택하는 것은 도전적일 수 있습니다. XCMS Online42, DeviumWeb MetaboAnalyst43 등 온라인 도구는 연구자들이 다양한 테스트를 수행할 수 있도록 지원합니다. 최근의 주요 발전 중 하나는 데이터의 통계적 유의성을 보장하기 위해 거짓 발견률(false discovery rate) 측정을 제공하는 도구입니다. 생물학적으로 관련 있는 대사물을 찾는 데 특히 유용한 다른 개념으로는 다중 그룹 분석과 메타 분석이 있으며, 이는 여러 실험 간에 공유되는 대사 변화를 밝혀낼 수 있습니다88.

대사물 식별 및 데이터베이스

초기 대사물 후보 식별은 질량 스펙트럼 이온의 정확한 질량-전하 비율(m/z)을 기반으로 수행됩니다. 이 과정은 METLIN89, HMDB90, MassBank91 및 GMD26,92와 같은 포괄적인 대사체 데이터베이스의 활용으로 지원됩니다. 분리된 이온에 대해 tandem 질량 분광법 실험을 수행한 후, 구조 이성체와 구별하기 위해 특이적인 파편 및 유지 시간 정보를 얻기 위해 표준 물질과의 일치 검사를 수행할 수 있습니다. 특정 m/z 또는 tandem mass spectrometry 분해 패턴이 일치하지 않을 경우, in silico 예측 도구는 대사체 식별에 추가적인 통찰을 제공합니다24,93. 이온 이동도 질량 분석법의 최근 혁신인 회전 평균 교차 충돌 단면(CCS)은 대사체 식별에 또 다른 수준을 제공하며, CCS 정보를 포함한 데이터베이스는 현재 초기 개발 단계에 있습니다94. 이러한 혁신에도 불구하고 일부 대사체 특징은 분자 구조에 할당될 수 없습니다. 따라서 이러한 특징은 미래의 식별 및 표현형과의 상관관계 분석을 돕기 위해 출판되어야 하며(이러한 데이터베이스는 이미 METLIN에 구축되었습니다), 이는 매우 중요합니다.

Biological interpretation

Network modelling and pathway-mapping tools can help us to understand the parts that metabolites play in relation to each other and in biological aberrations. Thereafter, metabolites can be placed into context with upstream genes and proteins to lead mechanistic investigations47. As well as the established and comprehensive metabolic network resources Kegg95, Recon1 (REF. 34) and Biocyc96, there are several recently developed programs that use novel methods to find pathway connectivity, as well as aiding in metabolite identification. These include mummichog46 and metabolite set enrichment analysis (MSEA)97. In addition, stable isotope metabolomics56,57 and omics-scale big data integration can reveal interconnectivity between metabolites and their relationships with genes and proteins (see also main text).

The types of samples that can be analysed using metabolomics are wide-ranging and include tissues, cells and biofluids. Tissue analysis, in particular, is perhaps the most powerful approach for studying localized and specific responses to stimuli and pathogenesis, yielding explicit biochemical information about the mechanisms of disease. Traditionally, tissue analysis involves extraction of the complete tissue material into a liquid form, from which the metabolite changes are averaged across the different cell types and regions of the analysed organ. In addition to this total tissue analysis, subregional, cellular and even subcellular metabolite profiles can provide further insight into structure-to–function relationships; this is particularly valuable in the case of heterogeneous tissues such as brain and cancers17. Simultaneous sampling of arterial blood (entering the organ) and venous blood (draining the organ), followed by paired analysis, can also have value in the investigation of tissue metabolic activity16. This paired arteriovenous approach provides information about the metabolite uptake and release patterns across the tissue of interest and therefore gives insight into tissue metabostasis. The power of this paired analysis allows for the measurement of metabolite arteriovenous differences or ratios and offers a compelling compromise with sampling effort, compared to the traditional approach of venous blood analysis.

During the past few years, substantial progress has been made in metabolomic analysis by improving instrument performance, experimental design and sample preparation, ultimately facilitating broader analytical capabilities. Moreover, the surge in new chemoinformatic (computational approaches for handling chemical information) and bioinformatic (computational approaches for handling biological information) tools has provided extensive support for data acquisition, analysis and integration. This has greatly enhanced our ability to identify metabolites in various samples and allowed us to correlate these metabolites with particular phenotypes, thus establishing useful biomarkers that are indicative of particular physiological states or aberrations. The ultimate challenge now is to move beyond simply identifying metabolites and using them as biomarkers, and to start establishing the direct physiological roles of metabolites and their involvement in metabolic networks, as well as determining how changes in their levels are implicated in different phenotypic outcomes. This Innovation article focuses on how this most relevant hurdle for metabolomics can be overcome. We describe how advances in technologies that are used in metabolite identification and analysis, experimental design and pathway mapping are helping us to gain more meaningful data, revealing important nodes for further investigation. We also discuss how this information, when combined with traditional biological methods, can enable us to ascertain molecular mechanisms and begin to infer biological causality.

생물학적 해석

네트워크 모델링 및 경로 매핑 도구는 대사물이 서로 및 생물학적 이상과 관련하여扮演하는 역할을 이해하는 데 도움을 줍니다. 이후 대사물은 상류 유전자 및 단백질과 맥락에 배치되어 기전적 연구를 이끌 수 있습니다47. 기존의 포괄적인 대사 네트워크 자원인 Kegg95, Recon1 (REF. 34) 및 Biocyc96 외에도, 새로운 방법을 사용하여 경로 연결성을 찾고 대사체 식별을 돕는 최근 개발된 프로그램들이 있습니다. 이에는 mummichog46과 대사체 세트 풍부도 분석(MSEA)97이 포함됩니다. 또한 안정 동위 원소 대사체학56,57 및 오믹스 규모 빅데이터 통합은 대사체 간의 상호 연결성과 유전자 및 단백질과의 관계를 밝혀낼 수 있습니다(주요 텍스트 참조).

대사체학을 통해 분석할 수 있는 샘플의 종류는 매우 다양하며,

조직, 세포 및 생체액이 포함됩니다.

특히

조직 분석은

자극이나 병리 과정에 대한 국소적이고 특정적인 반응을 연구하는 데 가장 강력한 접근 방식이며,

질병 메커니즘에 대한 명확한 생화학적 정보를 제공합니다.

전통적으로 조직 분석은 조직의 전체 물질을 액체 형태로 추출한 후, 분석된 장기 내 다양한 세포 유형과 지역에서 대사체 변화를 평균화하는 과정을 포함합니다.

이 전체 조직 분석 외에도,

하위 지역, 세포 수준, 심지어 세포 내 대사체 프로파일은

구조-기능 관계에 대한 추가적인 통찰을 제공할 수 있습니다.

이는 뇌나 암과 같은 이질적인 조직에서 특히 유용합니다17.

동맥 혈액(장기로 유입되는 혈액)과 정맥 혈액(장기에서 유출되는 혈액)을 동시에 채취한 후 쌍을 이루어 분석하는 방법은 조직 대사 활성 연구에 가치를 가질 수 있습니다16. 이 쌍을 이룬 동맥-정맥 접근법은 관심 조직 내 대사체 흡수 및 방출 패턴에 대한 정보를 제공하며, 따라서 조직 대사 균형에 대한 통찰을 제공합니다. 이 쌍을 이룬 분석의 힘은 대사체 동맥-정맥 차이나 비율을 측정할 수 있으며, 전통적인 정맥 혈액 분석 접근법과 비교할 때 채취 노력 측면에서 매력적인 타협점을 제공합니다.

최근 몇 년간 기기 성능, 실험 설계 및 시료 준비의 개선을 통해 대사체 분석 분야에서 상당한 진전이 이루어졌으며, 이는 더 넓은 분석 능력을 가능하게 했습니다. 또한 새로운 화학정보학(화학 정보를 처리하는 계산적 접근법) 및 생물정보학(생물학적 정보를 처리하는 계산적 접근법) 도구의 급속한 발전은 데이터 수집, 분석 및 통합에 대한 광범위한 지원을 제공했습니다. 이는 다양한 샘플에서 대사체를 식별하는 능력을 크게 향상시켰으며, 이러한 대사체를 특정 표현형과 연관시켜 특정 생리적 상태나 이상을 나타내는 유용한 바이오마커를 확립하는 데 기여했습니다. 현재의 최종 과제는 단순히 대사체를 식별하고 바이오마커로 사용하는 것을 넘어, 대사체의 직접적인 생리적 역할과 대사 네트워크에서의 관여를 확립하며, 그 수준 변화가 다양한 표현형 결과에 어떻게 영향을 미치는지 규명하는 것입니다. 이 혁신 기사에서는 대사체학 분야에서 가장 중요한 과제인 이 장벽을 어떻게 극복할 수 있는지 중점적으로 다룹니다. 대사체 식별 및 분석에 사용되는 기술의 발전, 실험 설계 및 경로 매핑이 어떻게 더 의미 있는 데이터를 얻는 데 기여하고, 추가 연구를 위한 중요한 노드를 밝혀내는지 설명합니다. 또한 이 정보가 전통적인 생물학적 방법과 결합될 때 분자 메커니즘을 규명하고 생물학적 인과 관계를 추론하는 데 어떻게 기여할 수 있는지 논의합니다.

Current challenges in metabolomics

During the past few years, metabolomics has evolved considerably to overcome challenges that initially confounded analysis18. A major challenge still exists for the identification of metabolites and validation of metabolites in human populations. However, the most important challenge is to develop workflows for assigning biological meaning to metabolites and to move towards finding mechanisms of disease.

대사체학의 현재 과제

최근 몇 년간 대사체학은 초기 분석을 방해했던 과제들을 극복하기 위해 크게 발전해 왔습니다18. 인간 인구에서 대사체 식별 및 검증은 여전히 주요 과제입니다. 그러나 가장 중요한 과제는 대사체에 생물학적 의미를 부여하는 워크플로우를 개발하고 질병 메커니즘을 규명하는 방향으로 나아가는 것입니다.

Metabolite identification and validation

The initial focus of metabolomics has been on biomarker discovery, with the aim of identifying metabolites that are correlated with various diseases and environmental exposures. This has, for example, led to the identification of plasma trimethylamine N–oxide (TMAO) and urinary taurine as markers of cardiovascular disease (CVD)19 and ionizing radiation exposure20–22, respectively. In order to correlate metabolites with a phenotype, the two biggest hurdles faced are metabolite identification and biomarker validation. In any given untargeted metabolomics experiment, only a subset of all metabolite features present can be positively identified. This has been facilitated by novel in silico tools23–25 (see below, as well as BOX 2 and Supplementary information S1 (box)), the expansion and development of metabolite databases26 (see BOX 2 and Supplementary information S1 (box)) and the synthesis of previously unattainable standard compounds that can confirm‎ the identification of the metabolite (these standards are either novel compounds or were previously not available in an isotope-labelled form)27.

Biomarker validation can be challenging, owing to difficulties in measuring subtle differences in metabolite concentrations between control and aberrant conditions, and because of the lack of follow–up with targeted metabolomic experiments (BOX 1). These follow–up experiments should be carried out in an additional cohort of biological samples for validation of the metabolite changes with the phenotype. Moreover, one of the largest challenges to biomarker validation is overcoming inter-individual metabolite variation, which arises owing to differences in genetic factors and environmental exposures. All of these influences result in significantly different metabolic responses in population studies1, making it extremely difficult to pinpoint metabolites that are correlated with a particular condition and, ultimately, to provide clinical biomarkers. This is the case especially when examining a multifaceted disease such as cancer. There are a number of methods that can be applied before and after analysis to overcome some of the biological variation associated with human studies. Establishing appropriate experimental design and statistical power for the study, and using patient questionnaires with subsequent population stratification, as well as regression modelling, can allow for the extraction of important metabolites28. These types of approaches can remove confounding samples from the analysis and help to streamline the data to identify metabolites that are correlated with the biological stimulus and not another influence. In addition, using appropriate metabolite normalization strategies, such as analysing metabolite ratios or normalizing to creatinine in urine studies, may help. Developing databases to collect data on the normal fluctuations in metabolite concentration ranges that occur in response to factors such as diet29, age, gender, circadian rhythm and exercise, which are frequent causes of sample-to-sample variability, would also be useful. Indeed, some databases that contain information on specific metabolite concentration ranges in human biofluids and in dietary components — the Human Metabolome Database (HMDB)30 and FooDB, respectively — have already been developed.

대사체 식별 및 검증

대사체학의 초기 연구는

다양한 질병 및 환경 노출과 연관된 대사체를 식별하는 것을 목표로 한

바이오마커 발견에 초점을 두었습니다.

예를 들어,

혈장 트리메틸아민 N-옥사이드(TMAO)와

요중 타우린이

각각 심혈관 질환(CVD)19 및 이온화 방사선 노출20–22의 바이오마커로 식별되었습니다.

대사체를 표현형과 연관시키기 위해 직면한 두 가지 가장 큰 장애물은 대사체 식별과 바이오마커 검증입니다. 어떤 비표적 대사체학 실험에서도 존재하는 모든 대사체 특징 중 일부만 긍정적으로 식별될 수 있습니다. 이 과정은 새로운 in silico 도구23–25 (아래 참조, BOX 2 및 보충 자료 S1 (상자) 참조), 대사체 데이터베이스의 확장 및 개발26 (BOX 2 및 보충 자료 S1 (상자) 참조) 및 이전에 얻기 어려웠던 표준 화합물의 합성(이 표준 화합물은 새로운 화합물이나 이전에 동위 원소 표지 형태로 존재하지 않았던 화합물입니다)27에 의해 촉진되었습니다.

생물표지자 검증은 대조군과 이상 조건 간 대사체 농도의 미묘한 차이를 측정하는 어려움과 표적 대사체학 실험을 통한 추적 연구의 부족(BOX 1)으로 인해 도전적입니다. 이러한 추적 실험은 대사체 변화와 표현형 간의 관계를 검증하기 위해 추가 생물학적 샘플 코호트에서 수행되어야 합니다. 또한 바이오마커 검증의 가장 큰 도전 과제 중 하나는 유전적 요인과 환경적 노출의 차이로 인해 발생하는 개인 간 대사체 변이를 극복하는 것입니다. 이러한 모든 요인은 인구 연구에서 대사 반응에 현저한 차이를 초래하며1, 특정 조건과 연관된 대사체를 특정하고 궁극적으로 임상적 바이오마커를 제공하기 매우 어렵게 만듭니다. 이는 특히 암과 같은 다면적 질환을 연구할 때 특히 그렇습니다. 인간 연구와 관련된 생물학적 변이를 극복하기 위해 분석 전후에 적용할 수 있는 여러 방법이 있습니다. 연구에 적합한 실험 설계와 통계적 힘을 확립하고, 환자 설문지를 사용한 인구 집단 분할, 회귀 모델링 등을 통해 중요한 대사체를 추출할 수 있습니다28. 이러한 접근 방식은 분석에서 혼란 요인을 제거하고 데이터를 간소화하여 생물학적 자극과 관련이 있으며 다른 영향과 무관한 대사체를 식별하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한 적절한 대사체 표준화 전략을 사용하는 것도 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 대사체 비율을 분석하거나 소변 연구에서 크레아티닌으로 표준화하는 방법이 있습니다. 식이29, 연령, 성별, 생체 리듬, 운동 등 샘플 간 변이의 주요 원인인 요인에 따라 대사체 농도 범위의 정상적인 변동 데이터를 수집하기 위한 데이터베이스를 개발하는 것도 유용할 것입니다. 실제로, 인간 생체액 및 식이 성분 내 특정 대사체 농도 범위에 대한 정보를 포함하는 데이터베이스 — 인간 대사체 데이터베이스(HMDB)30 및 FooDB —가 이미 개발되었습니다.

Functional analysis of metabolites

Perhaps the largest challenge that metabolomic researchers face in any study is relating the identified metabolites to their biological roles, which is a necessary step for moving beyond biomarkers and towards mechanisms. Biomarkers obtained from human population studies can provide a starting point for finding links between diseases and metabolic pathways31, and further mechanistic work can be carried out using in vitro and animal-based studies, as previously shown32. Furthermore, patient-derived primary cell lines and xenografts can provide more reliable models for finding relatable data, as such samples make it possible to control for genetic and environmental influences.

However, to eval‎uate the biological roles of one or several metabolites (a metabolic signature), one first has to determine their functions in metabolic pathways and their interconnectivity, and, more broadly, determine which metabolic pathways are perturbed by the aberrant condition33. Only such a multi-level analysis can provide a comprehensive understanding of the systemic biological changes that are associated with particular metabolites and potentially direct further mechanistic studies. Determining the interactions of metabolites in metabolic pathways is particularly challenging. Metabolic pathway maps currently include ~2,000 metabolites; however, similar to metabolite databases, they are somewhat incomplete, as some metabolites have not yet been characterized34,35. Novel molecules are regularly being discovered, adding to the pool of known metabolites22,36. Multi-layered approaches that integrate metabolomic and other ‘omics’ data (see below) acquired from the same samples provide an opportunity to investigate the system-wide changes in a disease and to delve further into metabolic pathway interactions and the mechanisms of disease development and progression37,38. In addition, novel experimental approaches, such as stable isotope-assisted analysis (see below), can trace metabolite utilization in pathways in a temporal manner.

대사체 기능 분석

대사체학 연구자들이 어떤 연구에서든 직면하는 가장 큰 도전 중 하나는 식별된 대사체를 그들의 생물학적 역할과 연결하는 것이며, 이는 바이오마커를 넘어 메커니즘으로 나아가는 데 필수적인 단계입니다. 인간 인구 연구에서 얻은 바이오마커는 질병과 대사 경로 간의 연관성을 찾는 출발점이 될 수 있으며31, 이전 연구에서 보여진 바와 같이 체외 및 동물 기반 연구를 통해 추가적인 메커니즘 연구가 진행될 수 있습니다32. 또한 환자 유래 원시 세포주와 이종 이식 모델은 유전적 및 환경적 영향을 통제할 수 있어 관련 데이터를 찾는 데 더 신뢰할 수 있는 모델을 제공할 수 있습니다.

그러나 한 가지 또는 여러 대사체의 생물학적 역할을 평가하려면 먼저 대사 경로 내에서의 기능과 상호 연결성을 확인해야 하며, 더 넓게는 이상 상태에 의해 교란된 대사 경로를 식별해야 합니다33. 이러한 다단계 분석만이 특정 대사체와 관련된 체계적 생물학적 변화에 대한 포괄적인 이해를 제공하며, 추가적인 메커니즘 연구를 안내할 수 있습니다. 대사 경로 내 대사체 간의 상호작용을 결정하는 것은 특히 어렵습니다. 현재 대사 경로 지도에는 약 2,000개의 대사체가 포함되어 있지만, 대사체 데이터베이스와 마찬가지로 일부 대사체는 아직 특성화되지 않아 불완전합니다34,35. 새로운 분자들이 지속적으로 발견되어 알려진 대사체 풀에 추가되고 있습니다22,36. 동일한 샘플에서 수집된 대사체학 및 기타 '오믹스' 데이터(아래 참조)를 통합하는 다층적 접근법은 질병의 시스템 전체적 변화를 조사하고 대사 경로 상호작용 및 질병 발생 및 진행 메커니즘을 더 깊이 탐구하는 기회를 제공합니다37,38. 또한 안정 동위 원소 보조 분석(아래 참조)과 같은 새로운 실험적 접근법은 경로 내 대사체 이용을 시간적 차원에서 추적할 수 있습니다.

Recent technical advancements

Developments in innovative informatics strategies have been a major driver in overcoming some of the challenges presented with metabolomic analysis33. Advances in data processing, statistical analysis and metabolite characterization have enabled the identification of more metabolites that are associated with a particular phenotype than was ever previously achievable. Moving towards mechanistic investigations, novel metabolic pathway analysis tools that assess the interconnectivity of these metabolites can provide important insights, particularly when paired with advanced metabolomic techniques such as stable isotope tracing and integration with other orthogonal data sets, ultimately providing systems-level analyses (FIG. 1).

최근 기술적 진전

혁신적인 정보학 전략의 발전은 대사체 분석에서 직면한 일부 도전 과제를 극복하는 데 주요한 동력이 되었습니다33. 데이터 처리, 통계 분석 및 대사체 특성화 분야의 진보는 특정 표현형과 연관된 대사체를 이전보다 훨씬 더 많이 식별할 수 있게 했습니다. 메커니즘적 연구로 나아가기 위해, 이러한 대사체 간의 상호 연결성을 평가하는 새로운 대사 경로 분석 도구는 특히 안정 동위 원소 추적과 같은 고급 대사체 분석 기술이나 다른 정교한 데이터 세트와의 통합과 결합될 때 중요한 통찰을 제공할 수 있으며, 궁극적으로 시스템 수준 분석(그림 1)을 가능하게 합니다.

Figure 1. From metabolites to pathways and mechanisms.

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The workflow outlines a holistic approach that begins with high-throughput untargeted metabolite profiling. Analysis of biofluids, cells or tissues reveals quantitative metabolite changes (as a result of a stimulus) that can be validated further. Metabolites can be mapped and analysed within metabolic pathways to relate the metabolites to each other, and within interconnected biological pathways, providing potential targets for further mechanistic studies. The combination of metabolomic, orthogonal biological analysis and isotope–assisted deciphering of pathways allows the mechanism of the aberrant phenotype to be ascertained.

Informatics

The development of computational and chemoinformatic tools for metabolomics can effectively support experimental data upload, processing, statistical analyses and metabolite identification, and, when used in conjunction with bioinformatic tools, can place metabolites into biological context (see BOX 2 and Supplementary information S1 (box)). Metabolomic data sets obtained by mass spectrometry (BOX 1) contain information on thousands of ions that are generated in the mass spectrometer from each sample, in which the ions represent the precursor intact metabolite or its fragments, adducts or isotopes. Computational tools are thus essential for reducing the redundancy in these complex data sets and facilitating identification of the most relevant metabolites.

For researchers in the field of metabolomics, computational resources are growing at a rapid rate, and many of these have been discussed in detail elsewhere33,39. However, metabolomic analysis remains a time-consuming process, and metabolite identification is still a limiting factor. Therefore, computational workflows that significantly speed up the process of data upload and data mining, with novel methods for automated or in silico metabolite identification and biological interpretation, are needed. Such automated computational workflows — allowing data streaming from the instrument to the software, automated qualitative and quantitative metabolite characterization, calculation of fold change and statistical significance, and, importantly, metabolite pathway analysis — have recently been developed (for more detail, see Supplementary information S1 (box)).

As metabolomics is highly interdisciplinary, and not all laboratories have personnel that are specialized in all areas of the experimental workflow, it is often the case that some of these computational tools are out of reach for those not specialized in informatic approaches or new to the metabolomics field. Fortunately, this is beginning to change, with several resources provided through the US National Institutes of Health (NIH) Common Fund Metabolomics Program. This programme funds six regional comprehensive metabolomic resource cores, a data repository and a coordination centre, to enable hands–on and online training in a range of areas, including data processing and interpretation. Another initiative, the Coordination of Standards in Metabolomics (COSMOS), is also helping to promote the standardization of metabolomics, by providing both experimental and data sharing, thus aiding new researchers in the field40 (see Supplementary information S1 (box)). There are several tools, including the workflows mentioned, that are user-friendly but have advanced parameters for expert users, thus providing a resource for all levels of expertise41,42. Some of these are available as part of the mass spectrometry vendor software, whereas other tools are provided as open-access software that can be utilized from data upload through to the metabolite pathway analysis42,43. These tools have already been successfully used to correlate single or multiple validated metabolites to a biological aberration. For example, MZmine 2 was used to show the interaction between dietary lipids and gut microbiota for regulating cholesterol metabolism44, and metabolomic analysis using both XCMS Online and MetaboAnalyst revealed metabolic dysregulation in ischaemic retinopathy45.

As discussed above, to move from using metabolites as predictive biomarkers to leading mechanistic investigations, the metabolites need to be put into their biological context by identifying their roles in metabolic pathways, their interconnectivity with other metabolites, and their relationships to upstream genes and proteins. Informatics approaches can greatly facilitate these analyses and can help to reveal broad potential metabolite activity across multiple metabolites and pathways46, and can also provide big data integration across different-omics technologies (see below)47 such as the systems biology approach recently developed on XCMS Online. As an example, a recent study took advantage of various bioinformatics tools to analyse genetic influences on metabolites in human blood. For this, a network of genetic–metabolic interactions was generated, first using Gaussian graphical models to connect biochemically related metabolites and then connecting metabolites with genetic loci from a genome-wide association study38. Novel concepts such as these have maximized the ability to extract important biological information from metabolites.

정보학

대사체학 연구를 위한 계산 및 화학정보학 도구의 개발은 실험 데이터의 업로드, 처리, 통계 분석 및 대사체 식별을 효과적으로 지원할 수 있으며, 생물정보학 도구와 결합하여 대사체를 생물학적 맥락에 배치할 수 있습니다(BOX 2 및 보충 자료 S1 (상자) 참조). 질량 분석법(BOX 1)을 통해 얻은 대사체학 데이터 세트는 각 시료에서 질량 분석기에서 생성된 수천 개의 이온에 대한 정보를 포함하며, 이 이온들은 전구체 완전 대사체, 그 조각, 부가물 또는 동위 원소를 나타냅니다. 따라서 이러한 복잡한 데이터 세트의 중복을 줄이고 가장 관련성 높은 대사체를 식별하는 데 계산 도구가 필수적입니다.

대사체학 분야 연구자들은 계산 자원이 급속히 증가하고 있으며, 이 중 많은 부분이 다른 곳에서 상세히 논의되었습니다33,39. 그러나 대사체 분석은 여전히 시간이 많이 소요되는 과정이며, 대사체 식별은 여전히 제한 요소입니다. 따라서 데이터 업로드 및 데이터 마이닝 과정을 크게 가속화하고, 자동화 또는 in silico 대사체 식별 및 생물학적 해석을 위한 새로운 방법을 포함한 계산 워크플로우가 필요합니다. 이러한 자동화된 계산 워크플로 — 기기에서 소프트웨어로 데이터 스트리밍, 자동화된 정성적 및 정량적 대사체 특성 분석, 변화율 계산 및 통계적 유의성 평가, 그리고 무엇보다도 대사체 경로 분석 —는 최근 개발되었습니다(자세한 내용은 보충 자료 S1 (상자) 참조).

대사체학은 고도로 다학제적 분야이며, 모든 실험실은 실험 워크플로우의 모든 분야에 전문 인력을 갖추고 있지 않습니다. 따라서 정보학 접근법에 익숙하지 않거나 대사체학 분야에 신규 진입한 연구자들은 이러한 계산 도구를 활용하기 어려운 경우가 많습니다. 다행히 이 상황은 변화하기 시작했으며, 미국 국립보건원(NIH) 공통 기금 대사체학 프로그램(Common Fund Metabolomics Program)을 통해 여러 자원이 제공되고 있습니다. 이 프로그램은 6개의 지역 종합 대사체학 리소스 코어, 데이터 저장소 및 협응 센터에 자금을 지원하여 데이터 처리 및 해석을 포함한 다양한 분야에서 실무 및 온라인 교육을 실시할 수 있도록 하고 있습니다. 또 다른 이니셔티브인 대사체학 표준 조정(COSMET)도 실험 및 데이터 공유를 통해 대사체학의 표준화를 촉진하고, 이 분야의 새로운 연구자들을 지원하고 있습니다40 (보충 정보 S1 (박스) 참조). 사용자 친화적이지만 전문가용 고급 파라미터를 갖춘 여러 도구(앞서 언급된 워크플로우 포함)가 존재해 모든 수준의 전문성에 맞는 자원을 제공합니다41,42. 일부 도구는 질량 분석기 제조업체의 소프트웨어 일부로 제공되며, 다른 도구들은 데이터 업로드부터 대사체 경로 분석까지 활용 가능한 오픈 액세스 소프트웨어로 제공됩니다42,43. 이러한 도구는 이미 단일 또는 다중 검증된 대사체를 생물학적 이상과 연관시키는 데 성공적으로 사용되었습니다. 예를 들어, MZmine 2는 식이 지방과 장 미생물군집 간의 상호작용이 콜레스테롤 대사 조절에 미치는 영향을 보여주기 위해 사용되었습니다44, 그리고 XCMS Online과 MetaboAnalyst를 활용한 대사체 분석은 허혈성 망막병증에서의 대사 장애를 밝혀냈습니다45.

위에서 논의된 바와 같이, 대사체를 예측 바이오마커로 사용하는 것에서 메커니즘 연구로 나아가기 위해서는 대사체를 대사 경로 내에서의 역할, 다른 대사체와의 상호연결성, 상위 유전자 및 단백질과의 관계 등을 통해 생물학적 맥락에 배치해야 합니다. 정보학 접근법은 이러한 분석을 크게 촉진할 수 있으며, 다중 대사체 및 경로 전반에 걸친 광범위한 대사체 활성 잠재력을 밝혀낼 수 있습니다46. 또한 시스템 생물학 접근법과 같은 다양한 오믹스 기술 간 빅데이터 통합을 제공할 수 있습니다(아래 참조)47, 예를 들어 XCMS Online에서 최근 개발된 접근법이 있습니다. 예를 들어, 최근 연구에서는 인간 혈액 내 대사체에 대한 유전적 영향을 분석하기 위해 다양한 생물정보학 도구를 활용했습니다. 이를 위해 먼저 가우시안 그래픽 모델을 사용하여 생화학적 관련성을 가진 대사체를 연결한 후, 유전체 연관 연구에서 유래한 유전적 위치와 대사체를 연결하여 유전-대사 상호작용 네트워크를 생성했습니다38. 이러한 새로운 개념은 대사체로부터 중요한 생물학적 정보를 추출하는 능력을 극대화했습니다.

Stable isotope-assisted metabolomics

One of the most promising ways to ascertain the roles of metabolites in metabolic pathways is to track their utilization with stable isotope tracers. These experiments make use of commercially available metabolites labelled with stable isotopes such as carbon (13C), nitrogen (15N) or deuterium (2H). The design of stable isotope-assisted experiments is based on a priori information for a particular metabolite or metabolic pathway of interest; these studies can thus be led by information obtained from untargeted metabolomic analysis (BOX 1).

The results from targeted and/or untargeted metabolomic analysis do not provide information on intracellular metabolic rates and relative pathway activities, and, for example, increased levels of one metabolite can be caused by increased activity of metabolite-producing enzymes or decreased activity of metabolite-consuming enzymes49. Following up with stable isotope-labelling experiments provides additional information on how a particular compound (nutrient or substrate) is metabolized with respect to a particular phenotype and can help to identify the pathways that contribute the most to substrate utilization. Thus, stable isotope-assisted tracing of a labelled substrate can reveal its metabolic fate.

There are several ways to carry out a stable isotope-assisted experiment. In metabolic steady state experiments, the measured metabolite pools (or levels) are equilibrated, and fluxes (or conversion rates) are roughly constant35. In addition, the labelling enrichment becomes stable over time (from a labelled nutrient into a given metabolite) to reach the isotopic steady state. The interpretation of isotope-enriched data in such conditions can provide information on relative pathway activity, such as the relationship between metabolites, and it also allows quantification of nutrient contributions to the production of different metabolites49. By contrast, in kinetic (or dynamic) flux experiments, the system has yet to reach steady state, and flux refers to the in vivo velocities of the individual metabolic reactions35. Thus, kinetic flux analysis provides dynamic labelling patterns, which allow quantification of metabolite flux when combined with intracellular metabolite concentrations48,49. As a notable example, kinetic flux revealed mechanisms for NADPH metabolism, including the contribution of the 10–formyl-tetrahydrofolate pathway to NADPH production50. Steady state flux analyses have also contributed to revealing important substrate utilization, with a recent clinical example uncovering selective activation of pyruvate carboxylase over glutaminase 1 in early-stage non-small-cell lung cancer51.

Stable isotope-assisted metabolomics can be used to calculate flux within a specific set of related pathways — or, on a larger scale, it can encompass multiple metabolites, labelled precursors and pathways. However, such analyses are computationally highly complex for dynamic experiments, leading to a decrease in accuracy35. In order to overcome this, algorithms have recently been developed that combine both stable isotope analysis and untargeted metabolomics52–55. This technology, called global isotope metabolomics, provides comprehensive differential labelling between two biological conditions, offering further understanding of metabolism at a systems level. Even though untargeted stable isotope metabolomics is a relatively new tool, its value has already been demonstrated in several studies56,57. It also provides yet another example of the power of informatics in metabolomic analyses.

Orthogonal approaches for mechanistic studies

Owing to the fact that transcript and protein levels have only a modest correlation with each other, and that metabolites can be further modified by enzymatic processes and can originate from and be modified by various internal and external stimuli, it is necessary to introduce metabolomic analysis approaches that provide big data integration across different-omics (genomics, epigenomics, proteomics and transcriptomics) in order to comprehensively determine the consequences of all metabolites on biology (FIG. 2). Such integrative approaches can help to determine the relationships between gene and protein expression‎ and metabolite concentrations, and the balance between production and consumption of metabolites58. As an example, by combining metabolomics with metagenomics and metatranscriptomics data, it was possible to elucidate the origins and roles of bacteria-derived metabolites59,60. A recent study also revealed that gut bacteria transplanted from thin or obese people recapitulated the respective phenotypes in gnotobiotic mice, with changes to microbial genes and concomitant downstream metabolites60. In addition, it was possible to demonstrate that individuals from rural African and African American populations that exchanged diets underwent large changes in their metagenome and metabolome, and this altered their cancer risk61.

정교한 메커니즘 연구를 위한 정교한 접근법

전사체와 단백질 수준이 서로 약한 상관관계를 보이며, 대사체는 효소적 과정에 의해 추가로 변환될 수 있고 다양한 내부 및 외부 자극으로부터 발생하거나 변환될 수 있기 때문에, 모든 대사체가 생물학에 미치는 영향을 포괄적으로 규명하기 위해 다양한 오믹스(게놈, 에피게놈, 프로테옴, 트랜스크립트옴) 간 빅데이터 통합을 제공하는 대사체학 분석 접근법을 도입해야 합니다(그림 2). 이러한 통합적 접근법은 유전자 및 단백질 발현과 대사체 농도 간의 관계, 그리고 대사체의 생산과 소비 사이의 균형을 규명하는 데 도움을 줄 수 있습니다58. 예를 들어, 대사체학 데이터를 메타게놈학 및 메타전사체학 데이터와 결합함으로써 세균 유래 대사체의 기원 및 역할을 규명할 수 있었습니다59,60. 최근 연구에서는 마른 사람이나 비만인 사람으로부터 이식된 장내 세균이 무균 마우스에서 각각의 표현형을 재현했으며, 미생물 유전자 변화와 동반된 하류 대사체 변화가 관찰되었습니다60. 또한 아프리카 농촌 지역과 아프리카계 미국인 인구 집단에서 식단을 교환한 개인들은 메타게놈과 대사체에 큰 변화를 겪었으며, 이는 암 위험을 변화시켰습니다61.

Figure 2. Controlling and influencing metabolism: perspectives from metabolomics.

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Using various orthogonal techniques, targets identified with metabolomics can be further verified and investigated in more detail. For instance, other ‘omics’ approaches, including (epi)genomics, transcriptomics and proteomics, can reveal further mechanistic insights into phenotypical changes associated with the metabolite. Various orthogonal techniques also allow targeting of metabolic pathways and can be used to influence metabolite levels and to interfere with metabolic pathways. These approaches can be directed at the gene level and aimed at silencing gene expression‎, with techniques like CRISPR–Cas-mediated knock outs or RNA interference (RNAi). Alternatively, metabolic pathways can be influenced at at the protein level with the use of antimetabolites. Manipulating sources of exposure to different stimuli can also influence the metabolome, providing further mechanistic insights. For instance, using antibiotics or germ-free models with species-specific inoculation reveals the direct effect of the microbiome on metabolite production. Similarly, immunomodulators can be used to change the efficacy of the host immune system to respond to both the resident microbiota and pathogens, and their metabolic products. This collectively opens up possibilities for better understanding and, eventually, controlling metabolism.

다양한 정교한 기술을 활용하면 대사체학으로 식별된 표적 물질을 더욱 상세히 검증하고 조사할 수 있습니다. 예를 들어, (에피)게노믹스, 트랜스크립토믹스, 프로테오믹스 등 다른 '오믹스' 접근법은 대사체와 관련된 형질 변화의 메커니즘적 통찰을 추가로 제공할 수 있습니다. 다양한 정교한 기술은 대사 경로를 표적화하는 데도 활용될 수 있으며, 대사체 수준을 조절하거나 대사 경로를 방해하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 접근법은 유전자 수준에서 유전자 발현을 억제하는 것을 목표로 할 수 있으며, CRISPR–Cas 매개 유전자 결실이나 RNA 간섭(RNAi)과 같은 기술이 사용될 수 있습니다. 대안으로, 대사 경로는 단백질 수준에서 대사 억제제를 사용하여 조절될 수 있습니다. 다양한 자극에 대한 노출원을 조작하는 것도 대사체를 영향을 미쳐 추가적인 메커니즘적 통찰을 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 항생제나 종 특이적 접종이 적용된 무균 모델을 사용하면 미생물군이 대사체 생산에 미치는 직접적인 영향을 확인할 수 있습니다. 마찬가지로, 면역 조절제는 호스트 면역 체계가 거주 미생물군과 병원체, 그리고 그들의 대사산물에 대한 반응 효율을 변경하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 접근법은 대사 과정의 이해를 심화시키고 궁극적으로 대사 조절을 가능하게 하는 새로운 가능성을 열어줍니다.

Leading on from multi-layered omics approaches, there are a number of additional orthogonal techniques that can be used to further investigate the biological relationships between metabolites, proteins and genes (FIG. 2). At the gene level, RNA interference (RNAi) or CRISPR–Cas systems can be used to modulate gene expression‎, and this can help to determine how genes directly affect enzyme activity and metabolite production. Similarly, at the protein level, structural analogues of essential metabolites — so-called antimetabolites — can be used to inhibit a specific metabolic process and attenuate metabolite production or transportation from the cell62, thereby allowing investigation of the function and importance of specific metabolites63. Other approaches that can be used are those that directly change the host metabolome, for instance, through modulating the exposure of the organism to certain stimuli. For example, manipulating the microbiome using germ-free models, antibiotics or immunomodulators (which can change the host response to the resident microbiota) can reveal how bacteria and their metabolites affect the host and their metabolism and can allow us to link these changes to susceptibility to certain diseases60. As an example, it has been shown recently that the microbiome is important for the efficacy of immunotherapeutics used in cancer therapy, and that only in individuals harbouring certain bacterial species can these compounds lead to efficient stimulation of cancer-fighting T cells64,65. Of note, T cells are known to have distinct energy requirements depending on their activation status, with naive T cells utilizing oxidative phosphorylation for ATP generation, and effector (activated) T cells consuming glucose by aerobic glycolysis and glutaminolysis to support cell growth, in a similar manner to cancer cells66,67. Altogether, targeted manipulation of the local cellular environment to affect cellular energy status, in concert with modulation of the microbiome, opens up interesting possibilities to influence the survival of both effector T cells and cancer cells68.

다층적 오믹스 접근법을 기반으로, 대사체, 단백질 및 유전자 간의 생물학적 관계를 더욱 심층적으로 조사하기 위해 사용할 수 있는 여러 가지 추가적인 정교한 기술이 존재합니다(그림 2). 유전자 수준에서는 RNA 간섭(RNAi) 또는 CRISPR–Cas 시스템을 사용하여 유전자 발현을 조절할 수 있으며, 이는 유전자가 효소 활성과 대사체 생산에 직접적으로 어떻게 영향을 미치는지 파악하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 단백질 수준에서는 필수 대사체의 구조 유사체인 이른바 '항대사체'를 사용하여 특정 대사 과정을 억제하고 대사체 생산이나 세포 내 운반을 감소시킬 수 있습니다62. 이를 통해 특정 대사체의 기능과 중요성을 조사할 수 있습니다63.

다른 접근법으로는 호스트 대사체를 직접 변경하는 방법이 있으며, 예를 들어 유기체가 특정 자극에 노출되는 정도를 조절하는 것이 포함됩니다. 예를 들어, 무균 모델, 항생제 또는 면역 조절제(호스트의 거주 미생물군에 대한 반응을 변경할 수 있음)를 사용하여 미생물군을 조작하면 세균과 그 대사산물이 호스트 및 그 대사 과정에 미치는 영향을 밝힐 수 있으며, 이러한 변화를 특정 질환에 대한 취약성과 연결할 수 있습니다60.

최근 연구에서는 암 치료에 사용되는 면역치료제의 효능에 미생물군이 중요하며, 특정 세균 종을 보유한 개인에서만 이러한 화합물이 암 싸움 T 세포의 효율적인 자극을 유도한다는 것이 밝혀졌습니다64,65. 참고로, T 세포는 활성화 상태에 따라 에너지 요구량이 다르며, 미성숙 T 세포는 ATP 생성을 위해 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)를 이용하고, 효과기(활성화된) T 세포는 세포 성장 지원을 위해 포도당을 유산소적 당분해(aerobic glycolysis)와 글루타민 분해(glutaminolysis)를 통해 소비합니다. 이는 암 세포와 유사한 메커니즘입니다66,67.

전체적으로, 미생물군집 조절과 병행하여 세포 내 에너지 상태를 조절하기 위해 국소 세포 환경을 표적화하여 조작하는 것은 효과기 T 세포와 암 세포의 생존에 영향을 미칠 수 있는 흥미로운 가능성을 열어줍니다68.

Novel biological insights

Advances in metabolomic analysis have allowed us to gain a novel understanding of metabolism for various states, processes and diseases, and a few of the most recent studies exemplifying the novel biological insights that can be gained with the use of metabolomics are discussed below. These studies collectively show how information at the metabolite level, particularly when combined with other techniques, can lead to successful association of metabolites with phenotypical causality, thus bringing us closer to a mechanistic understanding of metabolism.

새로운 생물학적 통찰
대사체 분석 기술의 발전은 다양한 상태, 과정 및 질병에 대한 대사 과정의 새로운 이해를 가능하게 했습니다. 대사체학을 활용하여 얻을 수 있는 새로운 생물학적 통찰을 보여주는 최근 연구 중 몇 가지를 아래에서 논의합니다. 이 연구들은 대사체 수준에서의 정보, 특히 다른 기술과 결합될 때, 대사체와 형질적 인과 관계의 성공적인 연관성을 이끌어내어 대사 과정의 메커니즘적 이해에 한 걸음 더 다가서게 함을 보여줍니다.

Role of bacterial biofilms in cancer

A recent study carried out on a patient population investigated in more detail a previously validated biomarker for colon cancer, N1, N12–diacetylspermine (DAS)69. In this study, a multidisciplinary approach was used that combined four different metabolomic tools with traditional biochemical techniques. First, it revealed that only DAS, and not its precursors, was correlated with biofilm presence as well as with colon cancer, and that DAS is probably a metabolic end-product of polyamine metabolism. The metabolomic approaches used included untargeted analysis (BOX 1) to compare normal tissues to the tumour tissues, both of which were either associated with or devoid of biofilms. This was followed by a targeted validation step (BOX 1) to confirm‎ the fold change in metabolites and expand the analysis to other metabolites in related pathways. Nanostructure-imaging mass spectrometry (NIMS)70 (BOX 1) revealed the in situ localization of DAS in the mucosal layer of the colon where the biofilms resided. Global isotope metabolomics was further used to investigate the metabolic fate of a stable isotope of DAS in colon cancer cell lines, confirm‎ing that it is indeed an end-product of metabolism and is not involved in any other metabolic pathways.

In order to determine the source of the metabolite (the patient versus the biofilm), patients were treated with antibiotics to remove the biofilms (this was confirmed by fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis), and their samples were analysed for the presence of DAS. In these tissues, DAS concentrations were similar to those previously measured in biofilm-negative patients, showing that the elevated DAS levels seen in biofilm-positive patients originated from the biofilms. In line with this, immunohistochemical analysis of patient samples did not show any change in protein levels of enzymes involved in DAS production.

As DAS is a metabolite of polyamine precursors, and polyamines have been associated with various cellular responses including increased cellular proliferation, the propensity of colon cells to overproliferate in the presence of biofilms was investigated and confirmed by immunohistochemistry. In addition, immunofluorescence revealed the presence of pro-inflammatory cytokines in biofilm-covered tissues. This inflammatory state was observed in normal-looking tissues that were associated with biofilms, suggesting that such tissues might be in a pro-carcinogenic state and that biofilm formation indeed promotes colon tumorigenesis71. In sum, this example shows how a combination of several metabolomic approaches with orthogonal biological techniques can be used for the initial metabolite discovery, leading to the elucidation of the potential role of biofilms in colon carcinogenesis (FIG. 3). According to this study, colonic bacteria utilize polyamines to build biofilms (producing DAS), and this biofilm formation induces pro-inflammatory and pro-carcinogenic effects in the host tissues, increasing the risk of tumour formation. Interestingly, some metabolomic studies have associated DAS with other cancers, including cancers of the lung72, breast73, blood74 and bladder75, as well as identifying it as a dietary metabolite76. Thus, further studies assessing the roles of diet and bacteria in cancers are of the utmost importance.

박테리아 생물막의 암에서의 역할

최근 환자 집단에서 수행된 연구는 이전에 검증된 대장암 바이오마커인 N1, N12–디아세틸스페르민(DAS)69를 더 자세히 조사했습니다. 이 연구에서는 전통적인 생화학적 기술과 네 가지 다른 대사체학 도구를 결합한 다학제적 접근법을 사용했습니다. 첫째, DAS만이 그 전구체와 달리 생물막의 존재 및 대장암과 상관관계가 있으며, DAS는 폴리아민 대사 과정의 대사 최종산물일 가능성이 높다는 것이 밝혀졌습니다. 사용된 대사체학 접근법에는 정상 조직과 생물막이 존재하거나 없는 종양 조직을 비교하기 위한 비표적 분석(BOX 1)이 포함되었습니다. 이어 타겟팅 검증 단계(BOX 1)를 통해 대사체의 변화율을 확인하고 관련 대사 경로 내 다른 대사체로 분석을 확장했습니다. 나노구조 이미징 질량 분석법(NIMS)70 (BOX 1)은 생물막이 존재하는 대장 점막층에서 DAS의 in situ 위치를 확인했습니다. 전역 동위 원소 대사체학은 대장암 세포주에서 DAS의 안정 동위 원소의 대사 경로를 조사하기 위해 추가로 사용되었으며, 이는 실제로 대사 최종산물이며 다른 대사 경로에 관여하지 않음을 확인했습니다.

대사체의 출처(환자 대 생물막)를 확인하기 위해 환자에게 항생제를 투여하여 생물막을 제거했습니다(이것은 형광 현미경 위치 특이적 하이브리드화(FISH) 분석으로 확인됨), 그리고 그들의 샘플을 DAS의 존재 여부를 분석했습니다. 이 조직에서 DAS 농도는 생물막 음성 환자에서 이전에 측정된 것과 유사했으며, 생물막 양성 환자에서 관찰된 DAS 농도 상승이 생물막에서 유래했음을 보여주었습니다. 이와 일치하게, 환자 샘플의 면역조직화학 분석은 DAS 생성에 관여하는 효소의 단백질 수준에 변화가 없음을 보여주었습니다.

DAS는 폴리아민 전구체의 대사산물이며, 폴리아민은 세포 증식 증가를 포함한 다양한 세포 반응과 연관되어 있습니다. 따라서 생물막 존재 시 대장 세포의 과증식 경향이 면역조직화학으로 조사되고 확인되었습니다. 또한 면역 형광 분석을 통해 생물막으로 덮인 조직에서 염증성 사이토카인의 존재가 확인되었습니다. 이러한 염증 상태는 생물막과 연관된 정상적으로 보이는 조직에서도 관찰되어, 이러한 조직이 발암 촉진 상태에 있을 수 있으며 생물막 형성이 실제로 대장 종양 발생을 촉진한다는 것을 시사합니다71.

요약하면, 이 사례는 여러 대사체학 접근법과 정교한 생물학적 기술을 결합하여 초기 대사체 발견을 수행하고, 생물막이 대장 암 발생에 미치는 잠재적 역할을 규명하는 데 활용될 수 있음을 보여줍니다(그림 3). 이 연구에 따르면, 대장 세균은 폴리아민을 이용해 생물막을 형성(DAS 생성)하며, 이 생물막 형성은 호스트 조직에서 염증 촉진 및 암 촉진 효과를 유발해 종양 형성 위험을 증가시킵니다. 흥미롭게도 일부 대사체학 연구는 DAS를 폐암72, 유방암73, 혈액암74, 방광암75 등 다른 암과 연관시켰으며, 이를 식이 대사체로 식별하기도 했습니다76. 따라서 식이와 세균이 암에 미치는 역할을 평가하는 추가 연구는 극히 중요합니다.

Figure 3. Novel biological insights.

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Diacetylspermine (DAS) has a role in biofilm-associated colon cancer. Various metabolomic and orthogonal biological techniques contributed to the association of DAS with bacterial biofilms and their role in the pathology of cancer. Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis and 16S rRNA sequencing identified the presence of bacterial species and biofilms on colon tissues. Untargeted and targeted metabolomics identified and validated the association of polyamine metabolites with colon cancer tissues. Stratification by biofilm status showed that DAS was upregulated primarily in biofilm-associated tissues, which was confirmed by mass spectrometry imaging. Network modelling using the KEGG and BioCyc databases, and pathway analysis using untargeted stable-isotope assisted metabolomics, showed that DAS is an end-product of polyamine metabolism. For further analysis, orthogonal techniques were used. Immunohistochemistry and immunofluorescence revealed increased cellular proliferation and pro-inflammatory cytokines in biofilm-associated tissues. The combination of these techniques led to the conclusion that bacterial biofilms induce a pro-carcinogenic state in the colon epithelium.

디아세틸스페르민(DAS)은 생물막과 관련된 대장암에 역할을 합니다. 다양한 대사체학 및 정교한 생물학적 기술은 DAS와 세균 생물막의 연관성 및 암 병리학에서의 역할을 규명하는 데 기여했습니다. 형광 현미경 위치 하이브리드화(FISH) 분석과 16S rRNA 시퀀싱을 통해 대장 조직에 세균 종과 생물막의 존재가 확인되었습니다. 비표적 및 표적 대사체학은 폴리아민 대사산물과 대장암 조직 간의 연관성을 식별하고 검증했습니다. 생물막 상태에 따른 분류 결과, DAS는 주로 생물막 관련 조직에서 과발현되었으며, 이는 질량 분광법 이미징으로 확인되었습니다. KEGG 및 BioCyc 데이터베이스를 활용한 네트워크 모델링과 비표적 안정 동위 원소 보조 대사체학을 통한 경로 분석은 DAS가 폴리아민 대사 최종산물임을 보여주었습니다. 추가 분석을 위해 정교한 기술이 사용되었습니다. 면역조직화학 및 면역형광 분석은 생물막 관련 조직에서 세포 증식 및 염증성 사이토카인의 증가를 보여주었습니다. 이러한 기술의 결합은 세균 생물막이 대장 상피에서 발암 촉진 상태를 유도한다는 결론을 이끌어냈습니다.

Metabolic regulation of cell pluripotency

At the epigenetic level, metabolites have been shown to regulate pluripotency in human ES cells, with a recent study revealing a metabolic switch during the transition between human naive and primed ES cells2. It has been found that this switch is regulated by nicotinamide N–methyltransferase (NNMT), which controls SAM levels that are required for histone methylation. Analysis of oxygen consumption rates revealed that primed human ES cells have a lower mitochondrial respiration capacity than naive human ES cells, and transcriptomic analysis confirmed a downregulation of mitochondrial electron transport chain genes in the primed state. The transition from naive to primed human ES cells also involved reduced WNT signalling and increased hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) stabilization (shown by proteomic analysis). Untargeted and targeted metabolomics based on gas chromatography and liquid chromatography mass spectrometry (GC–MS and LC–MS) (BOX 1) revealed concomitant changes in metabolic pathways, including glycolysis, fatty acid β-oxidation and lipid biosynthesis. Transcriptomic and genomic analyses showed that the genes involved in these pathways were also changed. The use of WNT inhibitors and the generation of HIF1α-knockout cells by CRISPR–Cas gene editing further demonstrated that WNT activity is required for the naive state, and that HIF1α is required for human ES cell transition to the primed state. Furthermore, the loss of NNMT in naive human ES cells was associated with an increase in repressive histone marks (histone 3 Lys27 trimethylation; H3K27me3) in developmental and metabolic genes that regulate the metabolic switch in naive to primed cells. Collectively, this comprehensive analysis showed that both NNMT and the metabolic state regulate ES cell development.

세포 다능성의 대사 조절

에피제네틱 수준에서 대사산물은 인간 배아 줄기세포(ES 세포)의 다능성을 조절하는 것으로 밝혀졌으며, 최근 연구에서는 인간 원시 ES 세포와 활성화된 ES 세포 사이의 전환 과정에서 대사 전환이 발생한다는 것이 밝혀졌습니다2. 이 전환은 히스톤 메틸화에 필요한 SAM 수준을 조절하는 니코틴아미드 N-메틸트랜스퍼레이즈(NNMT)에 의해 조절되는 것으로 확인되었습니다. 산소 소비율 분석 결과, 프라이밍된 인간 ES 세포는 원시 인간 ES 세포보다 미토콘드리아 호흡 능력이 낮았으며, 전사체 분석을 통해 프라이밍 상태에서 미토콘드리아 전자 전달 사슬 유전자 발현이 감소했음이 확인되었습니다. 원시 상태에서 활성화된 인간 ES 세포로의 전환은 WNT 신호전달의 감소와 저산소증 유도 인자 1α(HIF1α)의 안정화(프로테오믹스 분석으로 확인)를 동반했습니다. 가스 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 질량 분석법(GC–MS 및 LC–MS)을 기반으로 한 비표적 및 표적 대사체학 분석(BOX 1)은 글리코lysis, 지방산 β-산화 및 지질 생합성 등 대사 경로의 동시적 변화를 보여주었습니다. 전사체 및 유전체 분석은 이러한 경로에 관여하는 유전자들도 변화했음을 보여주었습니다. WNT 억제제 사용과 CRISPR–Cas 유전자 편집을 통해 생성된 HIF1α 결손 세포는 WNT 활성이 naive 상태에 필요하며, HIF1α가 인간 ES 세포의 primed 상태로의 전환에 필요함을 추가로 입증했습니다. 또한, 순수 인간 ES 세포에서 NNMT의 상실은 순수 상태에서 활성화 상태로의 대사 전환을 조절하는 발달 및 대사 관련 유전자에서 억제성 히스톤 표지(히스톤 3 라이신 27 트리메틸화; H3K27me3)의 증가와 연관되었습니다. 종합적으로, 이 포괄적인 분석은 NNMT와 대사 상태가 모두 ES 세포 발달을 조절한다는 것을 보여주었습니다.

Novel therapy for cardiovascular disease

Another example shows how using metabolomics, together with other techniques, can lead to the establishment of a new therapeutic approach — in this case, for decreasing the risk of CVD. Initially, using untargeted metabolomics and then targeted metabolomics for validation and quantification (BOX 1), an association between an increased risk of CVD and plasma concentrations of choline, betaine and TMAO was established19,77,78. This was further replicated in apolipoprotein E−/− mice, a mouse model that is highly susceptible to the formation of atherosclerotic plaques — the primary cause of CVD — that were fed high-choline and high-TMAO diets, showing a significant correlation between plasma TMAO and the formation of atherosclerotic plaques. Functional experiments revealed that trimethylamine (TMA)-containing nutrients such as choline, phosphatidylcholine and carnitine are dietary precursors for TMAO, and that liver flavin monooxygenases (FMOs; primarily FMO3) are responsible for converting TMA to TMAO. Analysis of antibiotic-treated mice, together with the observation that the risk of CVD was transmissible upon microbial transfer, led to the conclusion that the microbiome generates TMA. As inhibition of FMO3 can produce side-effects and thus does not provide a sustainable therapy, the next step was to search for an inhibitor of microbial TMA production and investigate its potential as a therapeutic for CVD. Using a structural analogue to choline, 3,3–dimethyl-1–butanol (DMB), found in extra-virgin olive oil, it was possible to inhibit microbial TMA lyases, which are responsible for TMA formation. In vivo experiments showed that TMAO levels were indeed reduced in mice fed with high-choline or high-carnitine diets when these mice were simultaneously treated with DMB. Treatment with DMB also prevented atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E−/− mice on a choline-enhanced diet79. Altogether, this work led to the proposal of a novel therapy for CVD, which bypasses the issues that arise when using inhibitors targeted to a patient’s own proteins — an approach potentially resulting in various side-effects for the patient. Instead, this study showed that harmful metabolites can be inhibited at their earliest production, by ‘drugging’ the gut microbiome, which in the case of CVD is the source of the metabolite contributing to the disease.

심혈관 질환을 위한 새로운 치료법

또 다른 예시는 대사체학(metabolomics)을 다른 기술과 결합하여 새로운 치료 접근법을 확립하는 방법을 보여줍니다. 이 경우 심혈관 질환(CVD)의 위험을 감소시키는 데 초점을 맞췄습니다. 초기 단계에서 비표적 대사체학(untargeted metabolomics)을 사용한 후, 검증과 정량화를 위해 표적 대사체학(targeted metabolomics)을 적용했습니다(BOX 1). 이 과정을 통해 CVD 위험 증가와 혈장 내 콜린(choline), 베타인(betaine), TMAO 농도 사이의 연관성이 확인되었습니다19,77,78. 이 결과는 아포리포프로틴 E−/− 마우스 모델에서 재현되었습니다. 이 마우스 모델은 동맥경화성 플라크 형성에 매우 취약하며, 동맥경화성 플라크는 심혈관 질환의 주요 원인입니다. 고콜린 및 고TMAO 식이를 투여받은 마우스에서 혈장 TMAO 농도와 동맥경화성 플라크 형성과의 유의미한 상관관계가 관찰되었습니다. 기능적 실험을 통해 콜린, 포스파티딜콜린, 카르니틴과 같은 트리메틸아민(TMA)을 함유한 영양소가 TMAO의 식이 전구체임을 확인했으며, 간 플라빈 모노옥시게나제(FMOs; 주로 FMO3)가 TMA를 TMAO로 전환하는 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다. 항생제 처리 마우스 분석과 미생물 이식 시 CVD 위험이 전파된다는 관찰 결과는 미생물이 TMA를 생성한다는 결론을 이끌어냈습니다. FMO3 억제는 부작용을 유발할 수 있어 지속 가능한 치료법으로 적합하지 않기 때문에, 다음 단계로 미생물 TMA 생성 억제제를 탐색하고 심혈관 질환 치료제로서의 잠재성을 조사했습니다. 엑스트라 버진 올리브 오일에 함유된 콜린의 구조 유사체인 3,3-디메틸-1-부탄올(DMB)을 사용해 TMA 형성에 관여하는 미생물 TMA 리아제를 억제할 수 있었습니다. in vivo 실험 결과, 고콜린 또는 고카르니틴 식이를 섭취한 쥐에서 DMB를 동시에 투여했을 때 TMAO 수치가 실제로 감소했습니다. DMB 투여는 콜린 강화 식이를 섭취한 아포리포프로틴 E−/− 쥐에서 동맥경화성 병변의 발달을 예방했습니다79. 이 연구 결과는 환자의 자체 단백질을 표적으로 하는 억제제를 사용할 때 발생하는 문제를 회피하는 새로운 CVD 치료법을 제안했습니다. 이 접근 방식은 환자에게 다양한 부작용을 초래할 수 있는 기존 방법과 달리, 유해 대사물을 생성 초기 단계에서 억제함으로써 '장 미생물군을 약물로 활용하는' 방법을 제시했습니다. CVD의 경우, 이 대사물은 질병에 기여하는 대사물의 원천이기 때문입니다.

Metabolite-driven regulation of β–cells

An important metabolite, 3–carboxy-4–methyl-5–propyl-2–furanpropanoic acid (CMPF), was recently identified in the plasma of humans with gestational diabetes, as well as in those with impaired glucose tolerance and type 2 diabetes80. CMPF was identified by untargeted and targeted metabolomic analysis (BOX 1), with further validation by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Mice treated with CMPF at doses comparable to levels found in human individuals with diabetes developed glucose intolerance and impaired insulin secretion after an oral glucose-tolerance test. This was monitored using targeted mass spectrometry and ELISA to measure plasma and tissue CMPF concentrations, and also by glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) tests. Mechanistically, CMPF was shown to impair mitochondrial function, decrease glucose-induced ATP synthesis and induce oxidative stress, as assessed by measuring mitochondrial membrane potential and with fluorescence- and bioluminescence-based assays, as well as gene expression‎ analysis. Inhibitors of organic anion transporters (OAT), which are responsible for the clearance of CMPF, blocked the transportation of CMPF into β–cells of the pancreas and prevented β–cell dysfunction. In line with this, treatment of pancreatic islets isolated from OAT3-knockout mouse models with CMPF had no effect on insulin content or GSIS. Altogether, the metabolite CMPF, identified by metabolomic analysis, provides a mechanistic link between β–cell dysfunction and diabetes and has been shown to function through impairing mitochondrial function and inhibiting insulin biosynthesis.

대사체에 의한 β-세포 조절

임신성 당뇨병을 가진 인간 혈장 및 당뇨병 전단계 및 제2형 당뇨병 환자의 혈장에서 중요한 대사산물인 3-카르복시-4-메틸-5-프로필-2-푸란프로파노산(CMPF)이 최근에 발견되었습니다80. CMPF는 비표적 및 표적 대사체 분석(BOX 1)을 통해 식별되었으며, 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 추가로 검증되었습니다.

당뇨병 환자의 혈중 농도와 유사한 용량의 CMPF를 투여받은 쥐는 경구 포도당 내성 검사 후 포도당 내성 장애와 인슐린 분비 장애를 나타냈습니다. 이는 표적 질량 분석법과 ELISA를 통해 혈장 및 조직 내 CMPF 농도를 측정하고, 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS) 검사를 통해 모니터링되었습니다. 기전적으로, CMPF는 미토콘드리아 기능 장애, 포도당 유발 ATP 합성 감소, 산화 스트레스 유발을 유발하는 것으로 나타났습니다. 이는 미토콘드리아 막 전위 측정, 형광 및 생물발광 기반 분석, 유전자 발현 분석을 통해 평가되었습니다. CMPF의 제거를 담당하는 유기 음이온 운반체(OAT) 억제제는 췌장 β-세포로의 CMPF 운반을 차단하고 β-세포 기능 장애를 방지했습니다. 이와 일치하게, OAT3 유전자 결손 마우스 모델에서 분리된 췌장 섬에 CMPF를 처리해도 인슐린 함량이나 GSIS에 영향을 미치지 않았습니다.

종합적으로,

대사체 분석을 통해 식별된 대사체 CMPF는

β-세포 기능 장애와 당뇨병 사이의 기전적 연관성을 제공하며,

미토콘드리아 기능 장애와 인슐린 생합성 억제를 통해 작용하는 것으로 확인되었습니다.

Mechanism of ischaemia–reperfusion injury

Steady state flux analysis was recently used to help to identify the mechanisms of ischaemia–reperfusion injury, which is a type of tissue damage resulting from oxidative stress and generation of reactive oxygen species (ROS) following the return of circulation to tissue regions previously deprived of oxygen. It was revealed that succinate, which is a metabolite of the tricarboxylic acid (TCA) cycle, is the driver of ROS generation, which can lead to heart attack and stroke following ischaemia–reperfusion injury81. The authors also used a combination of untargeted and targeted metabolomics (BOX 1) to reveal an elevation of succinate levels across several organs in a mouse model of ischaemia. Mechanistic studies involving in silico modelling, mitochondrial membrane potential measurements, ratiometric assessment and fluorescence assays revealed that in ischaemia, succinate dehydrogenase (SDH) functions in reverse, accumulating succinate from fumarate. Upon reperfusion, succinate is oxidized and drives electrons back through the mitochondrial complex I, thus generating ROS. Together, these findings indicated that SDH could be a target for the prevention of ROS accumulation following reperfusion of ischaemic tissue. Accordingly, antimetabolite inhibitors of SDH prevented succinate accumulation, inhibiting electron flow through complex I and subsequent ROS production, and thereby providing protection from ischaemia–reperfusion injury.

허혈-재관류 손상의 메커니즘

최근에 안정 상태 유동 분석이 허혈-재관류 손상의 메커니즘을 규명하는 데 활용되었습니다.

허혈-재관류 손상은

산소 공급이 중단된 조직 부위에 혈류가 회복될 때 발생하는

산화 스트레스와 활성 산소 종(ROS)의 생성으로 인해 발생하는 조직 손상의 한 유형입니다.

연구 결과, 트리카르복실산(TCA) 회로의 대사산물인 수크신산이 ROS 생성의 주요 원인물질로 확인되었으며, 이는 허혈-재관류 손상 후 심근경색과 뇌졸중을 유발할 수 있습니다81. 연구진은 무표적 및 표적 대사체학(BOX 1)을 결합해 허혈 마우스 모델에서 여러 장기에서 수크신산 수치가 증가함을 밝혀냈습니다. in silico 모델링, 미토콘드리아 막 전위 측정, 비율 측정 및 형광 분석을 포함한 기전 연구는 허혈 시 succinate dehydrogenase (SDH)가 역방향으로 기능하여 fumarate에서 succinate를 축적한다는 것을 보여주었습니다.

재관류 시 succinate는 산화되어 미토콘드리아 복합체 I을 통해 전자를 다시 전달하며 ROS를 생성합니다. 이러한 결과는 SDH가 허혈 조직의 재관류 후 ROS 축적을 예방하는 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 이에 따라 SDH의 대사 억제제는 수산화 축적을 방지하여 복합체 I을 통한 전자 흐름을 차단하고 후속 ROS 생성을 억제함으로써 허혈-재관류 손상으로부터 보호 효과를 나타냈습니다.

Regulation of cancer cell metabolism

In addition to the previous example, metabolic flux analysis was recently used to investigate the role of mitochondrial enzyme serine hydroxymethyltransferase (SHMT2) in human glioblastoma cells. Specifically, the roles of SHMT2 in central carbon metabolism and in regulating pyruvate kinase M2 (PKM2) activity were investigated and were further linked to glioma cell survival82. In these experiments, SHMT2-knockdown cells were treated with uniformly labelled 13C-glucose and showed increased flux from pyruvate to lactate, citrate and alanine, with a concomitant increase in PKM2 activity and oxygen consumption rate. In addition, overexpression‎ of RNAi-resistant SHMT2 cDNA reverted these effects, confirm‎ing that SHMT2 negatively affects PKM2. Thus, the stable isotope analysis showed that SHMT2 expression‎ changes the metabolism of cancer cells and limits carbon flux into the TCA cycle via suppression of PKM2. This has been further shown to improve the survival of cells in ischaemic tumour regions. In addition, the study showed that the survival of cancer cells with high SHMT2 expression‎ can be impaired if glycine decarboxylase is inhibited, as this causes accumulation of glycine, which then contributes to the production of toxic metabolites. Altogether, this series of experiments provided novel insights into cancer cell metabolism and demonstrated how metabolic changes can affect cell properties and responses — in this case, cell survival.

암 세포 대사 조절

이전 예시 외에도 최근 대사 유동 분석이 인간 뇌종양 세포에서 미토콘드리아 효소 세린 하이드록시메틸트랜스퍼레이즈(SHMT2)의 역할을 조사하는 데 사용되었습니다. 특히, SHMT2가 중앙 탄소 대사 및 피루vate 키나제 M2(PKM2) 활성 조절에 미치는 역할이 조사되었으며, 이는 글리오마 세포 생존과 연관되어 있음을 확인했습니다82. 이 실험에서 SHMT2 발현을 억제한 세포에 균일하게 표지된 13C-글루코스를 처리한 결과, 피루vate에서 락테이트, 시트르산 및 알라닌으로의 대사 유동량이 증가했으며, 동시에 PKM2 활성과 산소 소비율이 증가했습니다. 또한, RNAi 저항성 SHMT2 cDNA의 과발현은 이러한 효과를 역전시켰으며, 이는 SHMT2가 PKM2에 부정적인 영향을 미친다는 것을 확인했습니다. 따라서 안정 동위 원소 분석은 SHMT2 발현이 암 세포의 대사 과정을 변화시키고 PKM2 억제를 통해 TCA 회로로의 탄소 유동을 제한한다는 것을 보여주었습니다. 이는 허혈성 종양 부위에서 세포 생존을 개선한다는 것이 추가로 입증되었습니다. 또한, 연구 결과 SHMT2 발현이 높은 암 세포의 생존은 글리신 탈카복실화 효소가 억제될 경우 손상될 수 있으며, 이는 글리신의 축적을 유발하여 독성 대사산물 생성에 기여하기 때문입니다. 전체적으로 이 일련의 실험은 암 세포 대사 과정에 대한 새로운 통찰을 제공했으며, 대사 변화가 세포 특성 및 반응(이 경우 세포 생존)에 어떻게 영향을 미치는지 보여주었습니다.

Future perspectives

Metabolomics is an exciting and evolving research area, with numerous success stories demonstrating that its power extends from biomarker discovery to understanding the mechanisms that underlie phenotypes. This step towards mechanistic understanding has been made possible by advances in analytical technologies and informatics, and the combination of these tools has generated novel insights into chemical physiology. It has also been made possible as metabolomics has become more widely used in combination with orthogonal technologies, such as genomics, proteomics, structural biology and imaging, as well as with various techniques that allow us to modify gene expression‎, enzymatic activity, cell signalling or whole metabolic pathways, including the contribution of the naturally occurring microbiota. Thus, the future prospects of metabolomics lie not only in the unique information it provides, but in its integration into systems biology.

Supplementary Material

Supp

NIHMS924971-supplement-Supp.pdf (141.8KB, pdf)

Acknowledgments

The authors would like to thank Nadine Levin at UCLA for her comments on the manuscript. Funding for this work was supported by US National Institutes of Health (NIH) grants R01 GM114368 and PO1 A1043376–02S1.

Footnotes

Competing interests statement

The authors declare no competing interests.

DATABASES

FooDB: http://foodb.ca/

HMDB: http://www.hmdb.ca/

FURTHER INFORMATION

Common Fund Metabolomics Program: https://commonfund.nih.gov/metabolomics

Coordination of Standards in Metabolomics (COSMOS): http://www.cosmos-fp7.eu/

DeviumWeb: https://github.com/dgrapov/DeviumWeb

MetaboAnalyst: http://www.metaboanalyst.ca/

MZmine 2: http://mzmine.github.io/

XCMS Online: https://xcmsonline.scripps.edu/

SUPPLEMENTARY INFORMATION

See online article: S1 (box)

ALL LINKS ARE ACTIVE IN THE ONLINE PDF

Contributor Information

Caroline H. Johnson, Department of Environmental Health Sciences, Yale School of Public Health, Yale University, 60 College Street, New Haven, Connecticut 06520, USA

Julijana Ivanisevic, Metabolomics Research Platform, Faculty of Biology and Medicine, University of Lausanne, Rue du Bugnon 19, 1005 Lausanne, Switzerland.

Gary Siuzdak, Scripps Center for Metabolomics and Mass Spectrometry, Departments of Chemistry, Molecular and Computational Biology, The Scripps Research Institute, 10550 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, USA.

References

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