Re: 대퇴골두 무혈성 괴사증은 전신 system 질환이다.. 2020년 nature

[문형철]

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Systems analysis of avascular necrosis of femoral head using integrative data analysis and literature mining delineates pathways associated with disease

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• Published: 22 October 2020

Systems analysis of avascular necrosis of femoral head using integrative data analysis and literature mining delineates pathways associated with disease

• Ashwin Ashok Naik, 
• Aswath Narayanan, 
• Prakash Khanchandani, 
• Divya Sridharan, 
• Piruthivi Sukumar, 
• Sai Krishna Srimadh Bhagavatam, 
• Polani B. Seshagiri & 
• Venketesh Sivaramakrishnan 

Scientific Reports volume 10, Article number: 18099 (2020) Cite this article

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Abstract

Avascular necrosis of femoral head (AVNFH) is a debilitating disease, which affects the middle aged population. Though the disease is managed using bisphosphonate, it eventually leads to total hip replacement due to collapse of femoral head. Studies regarding the association of single nucleotide polymorphisms with AVNFH, transcriptomics, proteomics, metabolomics, biophysical, ultrastructural and histopathology have been carried out. Functional validation of SNPs was carried out using literature. An integrated systems analysis using the available datasets might help to gain further insights into the disease process. We have carried out an analysis of transcriptomic data from GEO-database, SNPs associated with AVNFH, proteomic and metabolomic data collected from literature. Based on deficiency of vitamins in AVNFH, an enzyme-cofactor network was generated. The datasets are analyzed using ClueGO and the genes are binned into pathways. Metabolomic datasets are analyzed using MetaboAnalyst. Centrality analysis using CytoNCA on the data sets showed cystathionine beta synthase and methylmalonyl-CoA-mutase to be common to 3 out of 4 datasets. Further, the genes common to at least two data sets were analyzed using DisGeNET, which showed their involvement with various diseases, most of which were risk factors associated with AVNFH. Our analysis shows elevated homocysteine, hypoxia, coagulation, Osteoclast differentiation and endochondral ossification as the major pathways associated with disease which correlated with histopathology, IHC, MRI, Micro-Raman spectroscopy etc. The analysis shows AVNFH to be a multi-systemic disease and provides molecular signatures that are characteristic to the disease process.

요약

대퇴골두 무혈성 괴사(AVNFH)는 

중장년층에게 영향을 미치는 쇠약성 질환입니다. 

비스포스포네이트를 사용하여 이 질환을 관리하지만, 

결국 대퇴골두의 붕괴로 인해 고관절 전치환술로 이어집니다. 

단일염기다형성과 AVNFH, 전사체학, 단백질체학, 대사체학, 생물물리학, 

초구조학 및 조직병리학과의 연관성에 관한 연구가 수행되었습니다. 

SNP의 기능적 검증은 문헌을 사용하여 수행되었습니다. 사용 가능한 데이터 세트를 사용한 통합 시스템 분석은 질병 과정에 대한 추가 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. GEO 데이터베이스의 전사체 데이터, AVNFH와 관련된 SNP, 문헌에서 수집한 단백질체 및 대사체 데이터에 대한 분석을 수행했습니다. AVNFH의 비타민 결핍을 기반으로 효소-보조인자 네트워크를 생성했습니다. 데이터 세트는 ClueGO를 사용하여 분석되고 유전자는 경로로 분류됩니다. 대사체 데이터 세트는 MetaboAnalyst를 사용하여 분석합니다. 데이터 세트에서 CytoNCA를 사용한 중심성 분석 결과, 시스타티오닌 베타 합성 효소와 메틸말론닐-CoA-뮤타제는 4개 데이터 세트 중 3개에서 공통적으로 발견되었습니다. 또한, 최소 2개의 데이터 세트에 공통적으로 존재하는 유전자를 DisGeNET을 사용하여 분석한 결과 다양한 질병과 관련이 있는 것으로 나타났으며, 그 중 대부분은 AVNFH와 관련된 위험 인자였습니다. 

분석 결과 

호모시스테인 증가, 

저산소증, 

응고, 

파골세포 분화, 

연골 골화 등이 

조직 병리학, IHC, MRI, 마이크로 라만 분광법 등과 상관관계가 있는 

질병과 관련된 주요 경로로 나타났습니다. 

분석 결과, 

AVNFH는 다발성 전신 질환이며 

질병 과정의 특징적인 분자적 시그니처를 제공하는 것으로 나타났습니다.

The analysis shows AVNFH to be a

multi-systemic disease and

provides molecular signatures that are characteristic to the disease process.

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Introduction

Avascular Necrosis of Femoral Head (AVNFH) is a debilitating disease, usually affecting younger individuals. Clinically AVNFH is associated with reduction in vascular supply to the subchondral bone of the femoral head which leads to necrosis and collapse of articular surface and eventual degeneration of hip joint1,2,3. AVNFH has been categorized basically into idiopathic and secondary varieties. The secondary causes of AVNFH include haemoglobinopathies, storage disorders, SLE, decompression sickness etc.4,5 alcohol, Steroid, trauma, coagulopathies6,7 Numerous other factors like genetic factors, environmental factors, physiological process like pregnancy, lifestyle involving smoking, drug abuse, diseases like haemochromatosis have also been implicated as risk factors in AVNFH8,9,10.

Biophysical characterization of bone from AVNFH patients and piglet model of disease shows reduced mineral to matrix ratio and increased carbonate to phosphate ratio indicative of extensive remodelling due to osteoclast activity1,11. Histopathology shows increased cement lines and lacunae while electron microscopy shows micro-cracks, dead bone and woven bone substitution1. Immuno histochemistry of AVNFH bone shows increased osteocalcein1, iNOS12, RANKL13, BMP-2 and HIF-1 staining14,15. AVNFH is also associated with coagulation disorders and coagulopathies possibly play an important role in the pathophysiology of the disease. Consistent with this, increased microparticles have been observed in the blood of AVNFH patients which might clog capillaries and contribute to avascularity14,15,16,17. High amounts of Von Willebrand Factor which is associated with AVNFH will also lead to thrombosis18. Coagulation factor disorders have been correlated with AVNFH19. Endochondral ossification, where cartilage is replaced by bone was also shown to be inhibited in AVNFH20. These studies point to a complex association of hypoxia, thrombosis, reduced osteoblast activity and increased osteoclast activity in the pathogenesis of AVNFH.

More so, AVNFH has now been considered as a Multi systemic disease rather than as a disease involving just the femoral head4. The genetic factors include mutations in Col2A2, MTHFR, NOS, PAI-1, PON-1, alpha-2-Microglobulin, SREBP-2, VEGFC, ADH-2, and sometimes associated with Increased Lipoprotein A and protein C deficiency21. However, MTHFR mutations do not correlate with the disease in Korean and Japanese populations22, pointing to a possible population specific differences.

소개

대퇴골두 무혈성 괴사(AVNFH)는

쇠약해지는 질환으로,

주로 젊은 층에 영향을 미칩니다.

임상적으로 AVNFH는

대퇴골두 연골하 뼈로의 혈관 공급 감소와 관련이 있으며,

이는 관절 표면의 괴사 및 붕괴를 초래하고

결국 고관절의 퇴행을 초래합니다1,2,3.

AVNFH는 크게

특발성과 이차성으로 분류됩니다.

이차적 원인으로는

헤모글로빈 병증,

저장 장애,

SLE,

감압병 등이 있습니다.4,5

haemoglobinopathies, storage disorders, SLE, decompression sickness etc

알코올,

스테로이드,

외상,

응고 병증6,7

유전적 요인,

환경적 요인,

임신과 같은 생리적 과정,

흡연,

약물 남용,

혈색소증 같은 질병과

같은 생활 방식 등 수많은 다른 요인들도

AVNFH의 위험 요인으로 알려져 있습니다8,9,10.

AVNFH 환자 및 질병의 새끼 돼지 모델에서 뼈의 생물물리학적 특성을 분석한 결과,

파골세포 활성으로 인한 광범위한 리모델링을 나타내는

미네랄 대 매트릭스 비율이 감소하고

탄산염 대 인산염 비율이 증가했습니다1,11.

조직 병리학에서는

시멘트 선과 열공이 증가하고

전자 현미경에서는 미세 균열, 죽은 뼈, 뼈의 치환이 관찰됩니다1.

AVNFH 뼈의 면역 조직화학에서는

오스테오칼세인1, iNOS12, RANKL13,

BMP-2 및 HIF-1 염색14,15 이 증가합니다.

AVNFH는 또한

응고 장애와 관련이 있으며

응고 병증은 질병의 병태 생리학에서 중요한 역할을 할 수 있습니다.

이와 일관되게,

모세혈관을 막고 무혈관을 유발할 수 있는 미세 입자가

AVNFH 환자의 혈액에서 증가하는 것이 관찰되었습니다14,15,16,17.

또한 AVNFH와 관련된 폰 빌레브란트 인자의 양이 많으면

혈전증으로 이어질 수 있습니다18.

응고 인자 장애는

AVNFH와 상관관계가 있습니다19.

연골이 뼈로 대체되는 연골 내 골화도 AVNFH에서 억제되는 것으로 나타났습니다20.

이러한 연구는

저산소증,

혈전증,

조골세포 활성 감소 및 파골세포 활성 증가가

AVNFH의 발병 기전에 복합적으로 연관되어 있음을 시사합니다.

따라서

AVNFH는 이제 대퇴골두에만 국한된 질환이 아니라

다발성 질환으로 간주되고 있습니다4.

유전적 요인으로는

Col2A2, MTHFR, NOS, PAI-1, PON-1, 알파-2-마이크로글로불린, SREBP-2, VEGFC, ADH-2의 변이가 있으며,

때로는 지단백질 A 및 단백질 C 결핍 증가와 관련이 있습니다21 .

그러나 한국인 및 일본인 집단에서 MTHFR 돌연변이는 이 질환과 상관관계가 없는 것으로 나타나22 인구집단별 차이가 있을 수 있습니다.

Omic techniques like transcriptomic, proteomic or metabolomics analysis of serum or tissues from AVNFH patients or model systems have been carried out23,24,25,26. The transcriptomic and proteomic analysis have largely reiterated on the signalling pathways that are deregulated in AVNFH24,26. These pathways are largely binned into osteoclastogenesis, osteoblasts and their function etc. Microarray studies have been carried out using rat models of steroid induced AVNFH and cartilage from diseased area of human AVNFH patients27. The results show deregulation of key pathways involved in the pathogenesis of AVNFH. Microarray analysis of whole transcriptome of AVNFH articular cartilage was performed at different time points from the induction of ischemic injury and compared to control24. The study showed genes involved in ischemic injury and angiogenesis were significantly upregulated at 2 weeks post AVNFH onset and those belonging to the inflammatory pathway four weeks post onset of the disease. Proteomic studies have also been carried out on AVNFH patient bone samples28. These studies points to deregulation of multiple signalling and metabolic pathways which are implicated in cartilage and bone biology. Targeted metabolomic analysis shows elevated levels of metabolites belonging to Methionine–Homocysteine pathway, Polyamine and urea pathway concomitant with low levels of B12, B6 and Betaine in AVNFH patients1. Metabolomic analysis of bone tissue in Chinese population showed changes in amino-acid and fatty acid metabolism25. Serum metabolomic analysis of rabbit model of steroid induced AVNFH showed differentially regulated phospholipids29. These studies show perturbations in different signalling and metabolic pathways in AVNFH.

However, a concerted effort to analyse the disease from a systems perspective by integrating the data sets from omic-studies as well as data from those reported in literature has largely been lacking. In the present study an integrative analysis of AVNFH associated SNPs, transcriptomic data sets of bone and cartilage, proteomic data sets and metabolomic data have been carried out. The data is analysed using cytoscape and binned into different pathways using its plugin ClueGO. The SNP data was validated by literature search for experimentally verified effects or phenotypes. The deficiency of vitamins/cofactors like B6, B12 and Folate and its implications for enzyme activity concomitant with deregulation of metabolic pathways has been analysed. The implications of the deficiency of these vitamins has been analysed in the light of transcriptomic and proteomic data obtained from cartilage or bone from patients and animal models. Further, the SNP data, transcriptomic data and proteomic data have been integrated with Vitamin-cofactor enzyme data. The role of SNPs, transcriptomic, proteomic and metabolomic data and its role in osteoblast, osteoclast and cartilage biology, their function as well as its implications for AVNFH has been discussed. The data analysis shows deregulation of multiple pathways consistent with the multi-systemic nature of AVNFH. In addition, the genes from integrative analysis common to at least two data sets were analysed using DisGeNET. The results show the involvement of these genes with various diseases. These diseases are risk factors associated with AVNFH. Further, we validated the role of elevated homocysteine on MSC differentiation to osteoblast and mineralization. We also show that RANKL is elevated in the AVNFH patients. Using literature mining we show elevated homocysteine, vitamin B6, B12, glutathione, N-acetylcysteine, CBS and MUT Knock out and knock down modulate RANKL induced osteoclastogenesis. Our analysis provides a theoretical basis to understand the disease and raises further questions which could shed light on the disease process. This could in turn provide potential biomarkers and newer therapeutic targets in the disease.

AVNFH 환자 또는 모델 시스템의 혈청 또는 조직에 대한 전사체, 단백질체 또는 대사체 분석과 같은 오믹스 기술이 수행되었습니다23,24,25,26. 전사체 및 단백질체 분석은 주로 AVNFH에서 조절이 완화되는 신호 경로에 대해 반복적으로 이루어졌습니다24,26. 이러한 경로는 크게 파골세포 형성, 조골세포 및 그 기능 등으로 구분됩니다. 마이크로어레이 연구는 스테로이드로 유도된 AVNFH의 쥐 모델과 인간 AVNFH 환자의 병든 부위 연골을 사용하여 수행되었습니다27. 그 결과 AVNFH의 발병에 관여하는 주요 경로의 조절이 완화되는 것으로 나타났습니다. 허혈성 손상을 유도한 시점과 대조군과 비교하여 AVNFH 관절 연골의 전체 전사체 마이크로어레이 분석을 수행했습니다24. 연구 결과, 허혈성 손상과 혈관 신생에 관여하는 유전자는 AVNFH 발병 2주 후, 염증 경로에 속하는 유전자는 발병 4주 후 유의하게 상향 조절되는 것으로 나타났습니다.

AVNFH 환자의 뼈 샘플에 대한 프로테오믹스 연구도 수행되었습니다28. 이러한 연구는 연골과 뼈 생물학에 관여하는 여러 신호 및 대사 경로의 규제 완화를 지적합니다. 표적 대사체 분석에 따르면 메티오닌-호모시스테인 경로, 폴리아민 및 요소 경로에 속하는 대사물질의 수치가 상승한 반면 B12, B6 및 베타인 수치는 낮은 것으로 나타났습니다1. 중국인의 뼈 조직에 대한 대사체 분석 결과 아미노산과 지방산 대사의 변화가 나타났습니다25. 스테로이드 유발 토끼 모델의 혈청 대사체 분석에서는 인지질이 차등적으로 조절되는 것으로 나타났습니다29. 이러한 연구는 AVNFH의 다양한 신호 및 대사 경로에 교란이 있음을 보여줍니다.

그러나 오믹스 연구의 데이터 세트와 문헌에 보고된 데이터를 통합하여 시스템 관점에서 질병을 분석하려는 공동의 노력은 대체로 부족했습니다. 본 연구에서는 AVNFH 관련 SNP, 뼈와 연골의 전사체 데이터 세트, 단백질체 데이터 세트 및 대사체 데이터의 통합 분석을 수행했습니다. 데이터는 사이토스케이프를 사용하여 분석하고 플러그인인 ClueGO를 사용하여 다양한 경로로 분류했습니다. SNP 데이터는 실험적으로 검증된 효과 또는 표현형에 대한 문헌 검색을 통해 검증되었습니다.

B6, B12, 엽산과 같은

비타민/보조인자의 결핍과 대사 경로의 조절 완화와 수반되는

효소 활성에 미치는 영향이 분석되었습니다.

이러한 비타민 결핍이 미치는 영향은

환자 및 동물 모델의 연골이나 뼈에서 얻은 전사체 및 단백질체 데이터에 비추어 분석되었습니다.

또한 SNP 데이터, 전사체 데이터 및 단백질체 데이터는 비타민 보조 인자 효소 데이터와 통합되었습니다. 조골세포, 파골세포 및 연골 생물학에서 SNP, 전사체, 단백질체 및 대사체 데이터의 역할, 기능 및 AVNFH에 대한 함의가 논의되었습니다. 데이터 분석 결과, AVNFH의 다중 시스템적 특성과 일치하는 여러 경로의 조절이 완화되는 것으로 나타났습니다. 또한 최소 두 개의 데이터 세트에 공통적으로 나타나는 통합 분석의 유전자를 DisGeNET을 사용하여 분석했습니다. 그 결과 이러한 유전자가 다양한 질병과 관련되어 있음을 알 수 있었습니다. 이러한 질병은 AVNFH와 관련된 위험 인자입니다.

또한

호모시스테인 상승이

조골세포로의 분화 및 미네랄화에 미치는 역할을 확인했습니다.

또한 AVNFH 환자에서 RANKL이 증가한다는 것을 보여주었습니다.

문헌 마이닝을 통해

호모시스테인, 비타민 B6, B12, 글루타치온,

N-아세틸시스테인, CBS 및 MUT의 증가가

RANKL에 의한 파골세포 형성을 조절하는 것으로 나타났습니다.

우리의 분석은 질병을 이해하기 위한 이론적 근거를 제공하고 질병 과정을 밝힐 수 있는 추가 질문을 제기합니다. 이는 결국 이 질환의 잠재적인 바이오마커와 새로운 치료 표적을 제공할 수 있습니다.

Results

SNPs associated with AVNFH and their functional implication

The SNPs were curated from literature. A total of 57 Genes harbouring SNPs associated with AVNFH were curated. To eval‎uate the importance of SNPs in the disease an interaction network was generated using cytoscape and pathway annotation analysis was carried out using the Plugin ClueGO. The analysis using WikiPathways shows that the genes with SNPs associated with AVNFH are binned into Vitamin B12 metabolism, Folate metabolism, TGFβ signalling, matrix metallo proteases, Clotting and coagulation, HIF-1 pathway, angiogenesis, Endochondral ossification etc. The Reactome pathway binned genes into vacuolar pathway, matrix metallo proteinases, VEGF and purine metabolism. The KEGG pathway binned genes into Coagulation cascade, Fluid shear stress and atherosclerosis, HIF-1 pathway, VEGF signalling and AGE/RAGE pathway (Fig. 1A–C, Supplementary Data S1). Further, to eval‎uate the functional implication of SNPs in genes associated with AVNFH, we manually curated the experimentally verified SNPs with demonstrated impaired function from literature. Of the 57 curated genes harbouring SNPs associated with AVNFH, 26 genes harbouring 38 SNPs were found to have experimentally validated functional consequences. These SNPs were found to be associated with elevated levels of homocysteine, osteoclastogenesis and vasoconstriction. The summary of the genes involved in these processes are provided in Fig. 1D.

AVNFH와 관련된 SNP 및 그 기능적 의미

SNP는 문헌에서 선별되었습니다. AVNFH와 관련된 SNP를 보유한 총 57개의 유전자가 큐레이팅되었습니다. 질병에서 SNP의 중요성을 평가하기 위해 사이토스케이프를 사용하여 상호작용 네트워크를 생성하고 플러그인 ClueGO를 사용하여 경로 주석 분석을 수행했습니다. 위키패스웨이를 사용한 분석 결과, AVNFH와 관련된 SNP를 가진 유전자는 비타민 B12 대사, 엽산 대사, TGFβ 신호, 매트릭스 메탈로 프로테아제, 응고 및 응고, HIF-1 경로, 혈관 신생, 내연골 골화 등으로 분류되는 것으로 나타났습니다. 리액톰 경로는 유전자를 진공 경로, 매트릭스 메탈로 프로테아제, VEGF 및 퓨린 대사로 분류했습니다. KEGG 경로는 유전자를 응고 캐스케이드, 유체 전단 응력 및 죽상 동맥 경화증, HIF-1 경로, VEGF 신호 및 AGE/RAGE 경로로 분류했습니다(그림 1A-C, 보충 데이터 S1). 또한, AVNFH와 관련된 유전자에서 SNP의 기능적 의미를 평가하기 위해 문헌에서 기능 장애가 입증된 실험적으로 검증된 SNP를 수동으로 큐레이팅했습니다. 선별된 57개의 AVNFH 관련 유전자 중 38개의 SNP를 보유한 26개의 유전자가 실험적으로 검증된 기능적 결과를 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 SNP는 호모시스테인 수치 상승, 파골세포 형성 및 혈관 수축과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 과정에 관여하는 유전자에 대한 요약은 그림 1D에 나와 있습니다.

Figure 1

Pathway annotation analysis and functional implications of AVNFH SNP genes. (A) WikiPathways showing involvement of Endochondral Ossification, Angiogenesis, Differentiation pathway, Vitamin B12, Folate metabolism, Blood clotting, Complement and coagulation cascade. (B) KEGG pathways showing fluid shear stress and atherosclerosis. (C) Reactome pathways showing VEGF ligand–receptor interactions. (D) Functional implications of AVNFH SNPs ascertained from literature (References are provided under supplementary references S7).

경로 주석 분석 및 AVNFH SNP 유전자의 기능적 의미.

(A) 연골 골화, 혈관 신생, 분화 경로, 비타민 B12, 엽산 대사, 혈액 응고, 보체 및 응고 캐스케이드의 관여를 보여주는 WikiPathways.

(B) 유체 전단 응력과 죽상 동맥 경화증을 보여주는 KEGG 경로.

(C) VEGF 리간드-수용체 상호작용을 보여주는 리액톰 경로.

(D) 문헌에서 확인된 AVNFH SNP의 기능적 의미(참고 문헌은 보충 참고자료 S7에 제공됨).

Transcriptomic analysis of AVNFH cartilage shows deregulation in multiple pathways

Transcriptomic analysis was carried out on differential gene expression‎ data sets from AVNFH patient cartilage compared to that of controls (GSE74089). The genes with an adjusted P. value of ≤ 0.05 were selected for analysis using cytoscape. The genes are subsequently binned into pathways using the plugin ClueGO. The results of analysis using KEGG shows deregulation of signalling and metabolic pathways having significant term P. value like alanine aspartate and glutamate metabolism, glycolysis/gluconeogenesis, methionine and cysteine metabolism, B6, B12 and Folate (Water soluble vitamin), alcoholism, estrogen pathway etc. (Supplementary Data S2). Analysis using WikiPathways shows deregulation of pathways like Tryptophan and histidine catabolism, RANKL/RANK signalling Pathway, endochondral ossification, Hematopoietic Stem Cell Differentiation, adipogenesis, Folate-Alcohol and Cancer Pathway, Iron metabolism, Blood Clotting Cascade and Folate Metabolism (Supplementary Data S2). Analysis using Reactome pathways shows deregulation of pathways like Metabolism of water soluble vitamins and cofactors, Metabolism of amino acids and derivatives, Phase II conjugation. Regulation of HIF by oxygen, signalling by VEGF, Collagen degradation, etc. (Supplementary Data S2). Further, subnetwork analysis for Reactome pathways was carried out using Reactome pathways browser (Supplementary Figures S7.1 and S7.3). Subnetwork analysis of water soluble vitamins and cofactors shows enrichment of Metabolism of folate and pterines, vitamin B6 activation to pyridoxal phosphate, Cobalamin (B12) transport and metabolism as well as (Fig. 2A–C). Phase II conjugation of compounds showing methylation pathway (Fig. 2D). Subnetwork analysis of metabolism of amino acids and derivatives shows enrichment of degradation of cysteine and homocysteine pathways, choline catabolism (Fig. 2E,F). The changes in gene expression‎ in various deregulated pathways has been analysed for relevance for various metabolic pathways. The deregulation of B12, B6, Folate and Choline metabolism had major implications for the degradation of cysteine and homocysteine pathway as well as methylation reaction. The results are summarised in Fig. 2G.

AVNFH 연골의 전사체 분석 결과, 여러 경로에서 조절이 완화됨을 보여줍니다.

대조군 연골(GSE74089)과 비교한 AVNFH 환자 연골의 유전자 발현 데이터 세트에 대해 전사체 분석을 수행했습니다. 조정된 P값이 0.05 이하인 유전자는 사이토스케이프를 사용하여 분석하기 위해 선택되었습니다. 그 후 플러그인 ClueGO를 사용해 유전자를 경로로 분류했습니다. KEGG를 사용한 분석 결과는 알라닌 아스파르트산염 및 글루타메이트 대사, 해당 작용/당 생성, 메티오닌 및 시스테인 대사, B6, B12 및 엽산(수용성 비타민), 알코올 중독, 에스트로겐 경로 등과 같은 유의미한 용어 P 값을 갖는 신호 및 대사 경로의 조절 완화를 보여줍니다(보충 데이터 S2). WikiPathways를 사용한 분석에서는 트립토판 및 히스티딘 이화 작용, RANKL/RANK 신호 경로, 내연골 골화, 조혈 줄기세포 분화, 지방 형성, 엽산-알코올 및 암 경로, 철 대사, 혈액 응고 캐스케이드 및 엽산 대사와 같은 경로의 조절 완화를 보여줍니다 (보충 데이터 S2). 리액톰 경로를 사용한 분석에서는 수용성 비타민 및 보조 인자의 대사, 아미노산 및 유도체 대사, 2상 접합과 같은 경로의 조절이 완화됨을 보여줍니다. 산소에 의한 HIF의 조절, VEGF에 의한 신호 전달, 콜라겐 분해 등(보충 데이터 S2). 또한, 리액톰 경로에 대한 하위 네트워크 분석은 리액톰 경로 브라우저를 사용하여 수행되었습니다(보충 그림 S7.1 및 S7.3). 수용성 비타민과 보조인자에 대한 하위 네트워크 분석은 엽산과 프테린의 대사, 피리독살 인산염으로의 비타민 B6 활성화, 코발라민(B12) 수송 및 대사뿐만 아니라 (그림 2A-C)의 농축을 보여줍니다. 메틸화 경로를 보여주는 화합물의 2상 접합 (그림 2D). 아미노산 및 유도체의 대사에 대한 하위 네트워크 분석은 시스테인 및 호모시스테인 경로, 콜린 이화 작용의 분해가 강화됨을 보여줍니다 (그림 2E, F). 다양한 대사 경로와의 관련성을 분석하기 위해 조절이 완화 된 다양한 경로에서 유전자 발현의 변화를 분석했습니다. B12, B6, 엽산 및 콜린 대사의 조절 완화는 시스테인 및 호모시스테인 경로의 분해와 메틸화 반응에 큰 영향을 미쳤습니다. 결과는 그림 2G에 요약되어 있습니다.

Figure 2

Pathway annotation analysis of AVNFH patient cartilage transcriptomics and RANKL induced osteoclastogenesis transcriptomics. (A–C) Metabolism of water soluble vitamins and cofactors pathway sub networks showing differentially regulated genes belonging to (A) folate metabolism, (B) vitamin B6, (C) vitamin B12. (D) Phase II conjugation of compounds sub network showing methylation pathway. (E,F) Metabolism of amino acids and derivatives sub networks showing (E) degradation of cysteine and Homocysteine pathway and (F) choline catabolism pathway (red—upregulated genes; blue—downregulated genes). (G) Summary of findings showing defective vitamin metabolism could lead to Homocysteine accumulation. (H) RANKL/RANK signaling in AVNFH transcriptomics. (I) Iron uptake and transport pathway in RANKL induced osteoclastogenesis transcriptomics.

AVNFH 환자 연골 전사체학 및 RANKL 유도 파골세포 형성 전사체학의 경로 주석 분석.

(A-C) 수용성 비타민의 대사 및 보조인자 경로 하위 네트워크 (A) 엽산 대사, (B) 비타민 B6, (C) 비타민 B12에 속하는 차등적으로 조절되는 유전자를 보여주는 하위 네트워크. (D) 메틸화 경로를 보여주는 화합물 하위 네트워크의 2상 접합. (E,F) 아미노산 및 유도체 하위 네트워크의 대사 (E) 시스테인 및 호모시스테인 경로의 분해와 (F) 콜린 이화 작용 경로(빨간색 상향 조절 유전자, 파란색 하향 조절 유전자)를 보여주는 아미노산 및 유도체 하위 네트워크. (G) 비타민 대사 결함이 호모시스테인 축적으로 이어질 수 있음을 보여주는 연구 결과 요약. (H) AVNFH 전사체학에서의 RANKL/RANK 신호. (I) RANKL로 유도된 파골세포 형성 전사체학에서의 철분 흡수 및 수송 경로.

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Proteomic analysis of AVNFH Bone shows deregulation in multiple pathways

Proteomic functional analysis was carried out using published dataset for bone tissue affected with AVNFH compared to healthy controls26. The dataset showed 128 significantly upregulated proteins and 52 significantly downregulated proteins. The proteins with significant changes in the levels of expression‎ were used for pathway annotation analysis using ClueGO a plugin of Cytoscape. Analysis using Reactome pathways binned the proteins into pathways involving—defects in cobalamin (B12) metabolism, Platelet degranulation, scavenging of Heme from plasma, Defective AMN causes hereditary megaloblastic anemia, and Glycolysis pathways (Fig. 3A and Supplementary Data S3). Analysis using WikiPathways binned the proteins into pathways involving Cori cycle, Selenium micronutrient network, Vitamin B12 metabolism, Folate metabolism etc. (Fig. 3B and Supplementary Data S3). Analysis using KEGG pathways binned the proteins into pathways involving Complement and coagulation cascades, Glycolysis/ Gluconeogenesis, inositol phosphate metabolism etc. (Fig. 3C and Supplementary Data S3).

AVNFH 뼈의 단백질체 분석 결과, 여러 경로에서 조절 기능이 저하된 것으로 나타났습니다.

건강한 대조군과 비교하여 AVNFH에 영향을 받은 뼈 조직에 대해 공개된 데이터 세트를 사용하여 단백질체 기능 분석을 수행했습니다26. 이 데이터 세트는 128개의 유의하게 상향 조절된 단백질과 52개의 유의하게 하향 조절된 단백질을 보여주었습니다. 발현 수준이 크게 변화한 단백질은 Cytoscape의 플러그인인 ClueGO를 사용하여 경로 주석 분석에 사용되었습니다. 리액톰 경로를 사용한 분석에서는 코발라민(B12) 대사 결함, 혈소판 탈과립화, 혈장에서의 헤모글로빈 제거, AMN 결함으로 인한 유전성 거대적아구성 빈혈 유발, 당분해 경로(그림 3A 및 보충 데이터 S3)와 관련된 경로로 단백질들을 분류했습니다. WikiPathways를 사용한 분석에서는 단백질을 코리 주기, 셀레늄 미량 영양소 네트워크, 비타민 B12 대사, 엽산 대사 등과 관련된 경로로 분류했습니다(그림 3B및 보충 데이터 S3). KEGG 경로를 사용한 분석에서는 단백질을 보체 및 응고 캐스케이드, 해당 작용/당 생성, 이노시톨 인산염 대사 등과 관련된 경로로 분류했습니다(그림 3C및 보충 데이터 S3).

Figure 3

Pathway annotation analysis of AVNFH patient bone tissue proteomics. (A) Reactome pathways showing defects in Cobalamin metabolism, Scavenging heme from plasma, Megaloblastic anemia, Platelet degranulation pathways. (B) WikiPathways showing vitamin B12 and folate metabolism. (C) KEGG pathways showing complement and coagulation cascade pathway. (D) Pathway annotation analysis of AVNFH metabolomics showing significant pathways of patient targeted plasma metabolomics, significant pathways of patient non targeted plasma metabolomics and significant pathways of patient bone trabeculae metabolomics.

AVNFH 환자 뼈 조직 프로테오믹스의 경로 주석 분석.

(A) 코발라민 대사, 혈장으로부터 헴 제거, 거대아세포 빈혈, 혈소판 탈과립화 경로의 결함을 보여주는 리액톰 경로.

(B) 비타민 B12 및 엽산 대사를 보여주는 위키패스웨이.

(C) 보체 및 응고 캐스케이드 경로를 보여주는 KEGG 경로.

(D) 환자 표적 혈장 대사체학의 유의미한 경로, 환자 비표적 혈장 대사체학의 유의미한 경로 및 환자 골주머니 대사체학의 유의미한 경로를 보여주는 AVNFH 대사체학의 경로 주석 분석.

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Metabolomic studies on AVNFH shows changes in critical metabolites involved in bone biology

From our previous study using plasma from AVNFH patient compared to age and gender matched control we have shown elevated levels of metabolites belonging to methionine-homocysteine pathway concomitant with a reduction in B6, B12 and betaine1. Metabolites belonging to polyamine and urea pathway was also found to be deregulated1. Metabolomics of plasma of AVNFH showed 48 differentially regulated metabolites23 while that of bone trabeculae showed 53 differentially regulated metabolites25. Pathway annotation analysis of these metabolites belonging to individual cohorts were carried out using MetaboAnalyst30. The published metabolomic data from bone trabeculae shows changes in aminoacid metabolism, purine and pyrimidine metabolism, Steroid, thymine and quinone metabolism25. The results of MetaboAnalyst are provided in Fig. 3D. Different metabolites influence bone biology by modulating osteoblast and osteoclast differentiation and their function.

Low levels of vitamin B6, B12 and folate or defects in expression‎ of genes that maintain normal physiological levels of vitamins affect activity of different enzymes belonging to multiple metabolic pathways

Data analysis from published Transcriptomic, proteomic and metabolomic data was used to arrive at the cofactors that are deregulated in AVNFH. The data from published literature involving cofactors and their respective enzymes31 were used to understand the role of deficiency in cofactors in AVNFH (B6, B12, Folate). An interaction network of the cofactors and the enzymes were generated and pathway annotation analysis was carried out using ClueGO. The results of this analysis for B6, B12, Folate shows enrichment in amino acid metabolism, Fatty acid and steroid metabolism, taurine and hypotaurine metabolism, one carbon metabolism, cysteine and homocysteine metabolism, selenocysteine metabolism, glycogen and glucose metabolism (Fig. 4A–C and Supplementary Data S4). Subsequently, to eval‎uate if the enzymes which uses cofactors like B6, B12, folate are deregulated in AVNFH, we imported the gene expression‎ or protein expression‎ data sets into the enzyme-cofactor interaction network. Many of the enzymes belonging to the enzyme-cofactor network were found to be upregulated in AVNFH and the genes were subsequently binned into pathways. The analysis also showed that though the enzymes were upregulated in AVNFH the dysfunction might mainly stem from deficiency of the cofactors (Fig. 4D).

뼈 생물학에 관여하는 중요한 대사물질의 변화를 보여주는 AVNFH에 대한 대사체 연구 결과

연령 및 성별이 일치하는 대조군과 비교하여 AVNFH 환자의 혈장을 사용한 이전 연구에서 메티오닌-호모시스테인 경로에 속하는 대사물질의 수치가 상승하고 B6, B12 및 베타인1 이 감소하는 것으로 나타났습니다. 폴리아민과 요소 경로에 속하는 대사산물도 조절이 완화되는 것으로 밝혀졌습니다1 . AVNFH의 혈장 대사체학에서는 48개의 차등 조절 대사체23 가 나타났고, 골소주에서는 53개의 차등 조절 대사체25 가 나타났습니다. 개별 코호트에 속하는 이러한 대사물질에 대한 경로 주석 분석은 MetaboAnalyst30 를 사용하여 수행되었습니다. 발표된 골 섬유주 대사체 데이터는 아미노산 대사, 퓨린 및 피리미딘 대사, 스테로이드, 티민 및 퀴논 대사의 변화를 보여줍니다25. 메타보애널리스트의 결과는 그림 3D에 나와 있습니다. 다양한 대사 산물은 조골세포와 파골세포 분화 및 기능을 조절하여 뼈 생물학에 영향을 미칩니다.

비타민 B6, B12 및 엽산의 낮은 수치 또는 정상적인 생리적 수준의 비타민을 유지하는 유전자의 발현 결함은 여러 대사 경로에 속하는 다양한 효소의 활성에 영향을 미칩니다.

공개된 전사체, 단백질체 및 대사체 데이터의 데이터 분석을 통해 AVNFH에서 조절이 완화되는 보조 인자를 찾아냈습니다. 보조 인자 및 해당 효소31와 관련된 발표된 문헌의 데이터를 사용하여 AVNFH에서 보조 인자(B6, B12, 엽산)의 결핍이 미치는 역할을 이해했습니다. 보조 인자와 효소의 상호 작용 네트워크를 생성하고 ClueGO를 사용하여 경로 주석 분석을 수행했습니다. B6, B12, 엽산에 대한 분석 결과 아미노산 대사, 지방산 및 스테로이드 대사, 타우린 및 저타우린 대사, 일탄소 대사, 시스테인 및 호모시스테인 대사, 셀레노시스테인 대사, 글리코겐 및 포도당 대사가 풍부하게 나타났다 (그림 4A-C 및 보충 데이터 S4). 그 후, B6, B12, 엽산과 같은 보조 인자를 사용하는 효소가 AVNFH에서 조절이 완화되는지 평가하기 위해 유전자 발현 또는 단백질 발현 데이터 세트를 효소-보조 인자 상호 작용 네트워크로 가져왔습니다. 그 결과 효소-보조인자 네트워크에 속하는 많은 효소가 AVNFH에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌고, 이후 유전자들은 경로로 분류되었습니다. 분석 결과 효소가 AVNFH에서 상향 조절되었지만 기능 장애는 주로 보조 인자의 결핍에서 비롯될 수 있음을 보여주었습니다(그림 4D).

Figure 4

Vitamin B6, B12 and folate cofactor dependent proteins network and pathway annotation analysis. (A) KEGG pathways showing one carbon pool by folate, Cysteine and Methionine metabolism, Taurine and Hypotaurine metabolism. (B) Reactome pathways showing degradation of cysteine and homocysteine pathway. (C) WikiPathways showing Vitamin B12, folate, Transulfuration and one carbon metabolism pathway. (D) Overlay of gene expression‎ values onto cofactor—protein pathways showing upregulated genes (Red—upregulated).

비타민 B6, B12 및 엽산 보조인자 의존성 단백질 네트워크 및 경로 주석 분석.

(A) 엽산, 시스테인 및 메티오닌 대사, 타우린 및 하이포타우린 대사에 의한 하나의 탄소 풀을 보여주는 KEGG 경로.

(B) 시스테인 및 호모시스테인 경로의 분해를 보여주는 리액톰 경로.

(C) 비타민 B12, 엽산, 황산화 및 하나의 탄소 대사 경로를 보여주는 위키 경로.

(D) 유전자 발현 값을 조절된 유전자를 보여주는 보조 인자 단백질 경로에 오버레이(빨간색으로 상향 조절됨).

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RANKL induced osteoclastogenesis shows changes in the expression‎ levels of genes belonging to choline metabolism and iron metabolism

Homocysteine induces RANKL expression‎ and secretion in osteoblasts and synovial fibroblasts32. In addition, SNPs in RANKL and OPG are found to be associated with AVNFH33. Transcriptomic analysis also shows enrichment of genes belonging to RANK-RANKL signaling (Fig. 2H). Hence, we analyzed transcriptomics, studying the role of RANKL in osteoclastogenesis. The evidence for increased osteoclastogenesis is also reiterated by Micro-Raman spectroscopy, ultrastructural studies, histopathology and IHC from previous studies1. Analysis of RANKL induced osteoclastogenesis shows enrichment of genes belonging to Choline metabolism, Heme degradation, single carbon metabolism and Iron metabolism (Fig. 2I and Supplementary Data S5). SNPs in genes implicated in Iron metabolism is associated with AVNFH. More so, many diseases like sickle cell anemia, beta-thalassemia and hemochromatosis are associated with AVNFH. All these diseases show iron overload and increased osteoclastogenesis or presence of osteoclast markers in the serum9,10.

Integrative analysis of SNPs associated with AVNFH, Transcriptomic and Proteomic data as well as Cofactor-Enzyme data sets shows common pathways critical for progression of AVNFH which is also reflected in histopathology, IHC, Micro-Raman spectroscopy, CT and MRI of AVNFH patients or animal models

The integrated network was obtained by merging individual networks of AVNFH SNPs, Proteomic, transcriptomic, and cofactor—protein networks using cytoscape. The network centrality analysis gave the degree, closeness and betweenness scores of individual nodes. 123 nodes had degree 2 (the genes were common in at least two data sets used). Two of the nodes, CBS and MUT had degree 3. Defective MUT and CBS due to Vitamin B12 and B6 deficiency respectively leads to accumulation of Methyl malonic acid and Homocysteine which stimulate osteoclastogenesis34,35 (Fig. 5A and Supplementary Data S6). These 125 hub nodes were used for ClueGO functional analyses. The integrative pathway annotation analysis with WikiPathways shows changes in Cori cycle, one carbon metabolism, TGFβ signaling, trans-sulfuration pathway, vitamin metabolism etc., (Fig. 5B and Supplementary Data S6). Reactome shows changes in amino acid metabolism, glucose metabolism, platelet degranulation, Iron and heme metabolism, single carbon metabolism, megaloblastic anemia, platelet degranulation etc., (Fig. 5C and Supplementary Data S6). Pathway annotation analysis using KEGG shows perturbations in amino acid metabolism including cysteine and methionine metabolism, HIF signaling, AGE-RAGE signaling pathway etc., (Fig. 5D and Supplementary Data S6). Further, we also looked at the expression‎ levels of genes belonging to different modules like elevated homocysteine, hypoxia, osteoclastogenesis, endochondral ossification as well as coagulation and vasoconstriction. The expression‎ levels of these genes as well as their statistical significance are provided from transcriptomic analysis (Fig. 5E). These genes could be of potential use for any future investigation to address the role of different modules in AVNFH.

RANKL에 의한 파골세포 형성은 콜린 대사와 철 대사에 속하는 유전자의 발현 수준 변화를 보여줍니다.

호모시스테인은 조골세포와 활막 섬유아세포에서 RANKL 발현과 분비를 유도합니다32 . 또한, RANKL 및 OPG의 SNP는 AVNFH33 와 연관성이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 전사체 분석에서도 RANK-RANKL 신호에 속하는 유전자의 농축이 확인되었습니다(그림 2H). 따라서 우리는 전사체학을 분석하여 파골 세포 형성에서 RANKL의 역할을 연구했습니다. 파골세포 형성이 증가한다는 증거는 이전 연구에서 마이크로 라만 분광법, 초구조 연구, 조직 병리학 및 IHC를 통해 반복적으로 확인되었습니다1. RANKL에 의해 유도된 파골세포 형성을 분석한 결과 콜린 대사, 헴(Heme) 분해, 단일 탄소 대사 및 철 대사에 속하는 유전자가 강화된 것으로 나타났습니다(그림 2I 및 보충 데이터 S5). 철 대사에 관여하는 유전자의 SNP는 AVNFH와 관련이 있습니다. 겸상 적혈구 빈혈, 베타 지중해 빈혈 및 혈색소 침착증과 같은 많은 질병이 AVNFH와 관련이 있습니다. 이 모든 질병은 철분 과부하와 파골세포 생성 증가 또는 혈청 내 파골세포 마커의 존재를 보여줍니다9,10.

AVNFH와 관련된 SNP, 전사체 및 단백질체 데이터, 보조인자-효소 데이터 세트의 통합 분석은 조직 병리학, IHC, 마이크로 라만 분광법, CT 및 동물 모델의 MRI에서도 반영되는 AVNFH의 진행에 중요한 공통 경로를 보여줍니다.

통합 네트워크는 세포스케이프를 사용하여 AVNFH SNP의 개별 네트워크, 단백질체, 전사체 및 보조 인자-단백질 네트워크를 병합하여 얻었습니다. 네트워크 중심성 분석은 개별 노드의 정도, 친밀도 및 간결도 점수를 제공했습니다. 123개의 노드가 2도(사용된 두 개 이상의 데이터 세트에서 유전자가 공통)를 가졌습니다. 노드 중 2개 노드인 CBS와 MUT는 3도였습니다. 비타민 B12와 B6 결핍으로 인한 MUT와 CBS 결함은 각각 파골세포 생성을 자극하는 메틸 말론산과 호모시스테인의 축적으로 이어집니다34,35 (그림 5A 및 보충 데이터 S6). 이 125개의 허브 노드는 ClueGO 기능 분석에 사용되었습니다. WikiPathways를 사용한 통합 경로 주석 분석은 코리 사이클, 하나의 탄소 대사, TGFβ 신호, 트랜스 황화 경로, 비타민 대사 등의 변화를 보여줍니다(그림 5B및 보충 데이터 S6). 리액톰은 아미노산 대사, 포도당 대사, 혈소판 탈과립화, 철 및 헴 대사, 단일 탄소 대사, 거대적아구성 빈혈, 혈소판 탈과립화 등의 변화를 보여줍니다(그림 5C및 보충 데이터 S6). KEGG를 사용한 경로 주석 분석은 시스테인 및 메티오닌 대사를 포함한 아미노산 대사, HIF 신호, AGE-RAGE 신호 경로 등의 교란을 보여줍니다 (그림 5D 및 보충 데이터 S6). 또한 호모시스테인 상승, 저산소증, 파골세포 형성, 연골 내 골화, 응고 및 혈관 수축과 같은 다양한 모듈에 속하는 유전자의 발현 수준도 살펴봤습니다. 이러한 유전자의 발현 수준과 통계적 유의성은 전사체 분석을 통해 제공됩니다(그림 5E). 이러한 유전자는 향후 AVNFH에서 다양한 모듈의 역할을 다루는 모든 조사에 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

Figure 5

Integration of AVNFH omic analyses: (A) Integrated network of AVNFH transcriptomics, Proteomics, SNP genes and cofactor—protein network. Red nodes are hub genes, among which CBS and MUT showed highest network centrality scores. (B) WikiPathways annotation analysis of hub genes showing Vitamin B12, folate metabolism, transulfuration and one carbon metabolism. (C) Reactome pathways showing Iron uptake, transferrin endocytosis, scavenging heme from plasma, megaloblastic anemia pathways. (D) KEGG pathways showing HIF signaling, cysteine and methionine metabolism, one carbon pool by folate pathways. (E) Gene expression‎ values of genes belonging to different modules like elevated homocysteine, hypoxia, osteoclastogenesis, endochondral ossification as well as coagulation and vasoconstriction from transcriptomics analysis.

AVNFH 오믹스 분석의 통합: (A) AVNFH 전사체학, 프로테오믹스, SNP 유전자 및 보조 인자-단백질 네트워크의 통합 네트워크. 빨간색 노드는 허브 유전자이며, 그 중 CBS와 MUT가 가장 높은 네트워크 중심성 점수를 보였습니다. (B) 비타민 B12, 엽산 대사, 트랜스황화 및 탄소 대사 1개를 보여주는 허브 유전자에 대한 WikiPathways 주석 분석. (C) 철 흡수, 트랜스페린 세포 내 침투, 혈장으로부터 헴 제거, 거대적아구성 빈혈 경로를 보여주는 리액톰 경로. (D) HIF 신호 전달, 시스테인 및 메티오닌 대사, 엽산 경로에 의한 하나의 탄소 풀을 보여주는 KEGG 경로. (E) 전사체학 분석을 통한 호모시스테인 상승, 저산소증, 파골세포 형성, 내연골 골화, 응고 및 혈관 수축 등 다양한 모듈에 속하는 유전자들의 발현값.

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In addition, the data from AVNFH patients and animal model systems for MRI, CT, Histopathology, IHC and Micro-Raman Spectroscopy of bone was correlated with molecular signatures obtained from –Omic analysis. Micro-Raman spectroscopy of human AVNFH bone and piglet AVNFH model showed reduced mineral matrix ratio and increased carbonate to phosphate ratio indicative of increased osteoclastogenesis and decreased osteoblast function (Supplementary Table S7.5 and references there in). The molecular signatures of increased osteoclastogenesis and homocysteine mediated inhibition of mineralization by osteoblast correlate with these results (Supplementary Table S7.5 and references there in). Histopathology of AVNFH bone reveals increased cement lines, empty lacunae and marrow calcification, which correlate with the molecular features like osteoclastogenesis, endochondral ossification and elevated homocysteine (Supplementary Table S7.5 and references there in). Consistent with this IHC studies have revealed changes in RANK, RANKL, Osteocalcein, BMP2 etc. which are indicative of bone remodeling, increased osteoclast and osteoblast activity (Supplementary Table S7.5 and references there in). MRI-BOLD of AVNFH patients show significant changes in oxygen content of arterial and venous blood. MRI data also shows changes in velocity of blood flow (Supplementary Table S7.5 and references there in). Histopathology shows coagulation and vasoconstriction in AVNFH patients (Supplementary Table S7.5 and references there in). The molecular signature of increased coagulation, atherosclerosis, platelet degranulation, elevated homocysteine, Von Willebrand factor and microparticles correlate with the findings of MRI and Histopathology (Supplementary Table S7.5 and references there in). The coagulation process also leads to hypoxia (Supplementary Table S7.5 and references there in) which corroborate with increased HIF-1α and VEGF staining in AVNFH bone using IHC (Supplementary Table S7.5 and references there in). The SNP and transcriptomic data also bins genes into hypoxia signaling pathway in AVNFH.

Over all the integrative analysis not only agrees with the results of individual pathways but also provided important pathways that are common to AVNFH from different studies. Our results show the enrichment of genes in pathways that describe the symptoms and its associations with AVNFH such as elevation in homocysteine, coagulation, hypoxia, Vasoconstriction, endochondral ossification, osteoclastogenesis and their eventual effect (Fig. 6). Above all, the observations of Micro-Raman spectroscopy, Histopathology, CT, IHC and MRI studies correlate with the molecular signatures obtained from the Omic analysis. A summary of the role of different pathways and possible processes which they influence in AVNFH is provided (Fig. 7 and Supplementary Table S7.4).

또한, 뼈의 MRI, CT, 조직 병리학, IHC 및 마이크로 라만 분광학에 대한 AVNFH 환자 및 동물 모델 시스템의 데이터는 -오믹 분석에서 얻은 분자 신호와 상관관계가 있었습니다. 인간 AVNFH 뼈와 새끼 AVNFH 모델의 마이크로 라만 분광법은 미네랄 매트릭스 비율이 감소하고 탄산염 대 인산염 비율이 증가하여 파골세포 형성 증가와 조골세포 기능 감소를 나타냅니다(보충 표 S7.5 및 참조 참조). 파골세포 생성 증가와 호모시스테인 매개에 의한 조골세포의 무기질화 억제의 분자적 징후는 이러한 결과와 상관관계가 있습니다(보충 표 S7.5 및 참조 참조). AVNFH 뼈의 조직 병리학에서는 시멘트 선, 빈 열공 및 골수 석회화가 증가하며, 이는 파골세포 형성, 내연골 골화 및 호모시스테인 상승과 같은 분자적 특징과 관련이 있습니다(보충 표 S7.5 및 참조 참조). 이와 일관되게 IHC 연구에서는 뼈 리모델링, 파골세포 및 조골세포 활성 증가를 나타내는 RANK, RANKL, 오스테오칼세인, BMP2 등의 변화가 밝혀졌습니다(보충 표 S7.5 및 여기에 있는 참조). 동맥 및 정맥혈의 산소 함량이 크게 변화한 AVNFH 환자의 MRI-BOLD. MRI 데이터는 또한 혈류 속도의 변화를 보여줍니다(보충 표 S7.5 및 참조 참조). 조직병리학은 AVNFH 환자의 응고 및 혈관 수축을 보여줍니다(보충 표 S7.5 및 참조 참조). 응고, 죽상동맥경화증, 혈소판 탈과립화, 호모시스테인, 폰 빌레브란트 인자 및 미세 입자 증가의 분자적 징후는 MRI 및 조직병리학의 결과와 상관관계가 있습니다(보충 표 S7.5 및 참조 참조). 응고 과정은 또한 저산소증으로 이어지며(보충 표 S7.5 및 그 안의 참조), 이는 IHC를 사용한 AVNFH 뼈의 HIF-1α 및 VEGF 염색 증가로 확증됩니다(보충 표 S7.5 및 그 안의 참조). 또한 SNP 및 전사체 데이터는 유전자를 AVNFH의 저산소증 신호 경로로 분류합니다.

전체적으로 통합 분석은 개별 경로의 결과와 일치 할뿐만 아니라 다른 연구에서 AVNFH에 공통적 인 중요한 경로를 제공했습니다. 우리의 결과는 호모시스테인 상승, 응고, 저산소증, 혈관 수축, 연골 내 골화, 파골 세포 형성 및 최종 효과와 같은 증상과 AVNFH와의 연관성을 설명하는 경로에서 유전자가 풍부하다는 것을 보여줍니다 (그림 6). 무엇보다도 마이크로 라만 분광법, 조직 병리학, CT, IHC 및 MRI 연구의 관찰은 오믹 분석에서 얻은 분자 신호와 상관관계가 있습니다. 다양한 경로의 역할과 AVNFH에 영향을 미치는 가능한 프로세스에 대한 요약이 제공됩니다(그림 7 및 보충 표 S7.4).

Figure 6

Modules of salient features of AVNFH addressed in our study by analysing various omic data and their integration with published results of histopathology, IHC, MRI, CT and Micro-Raman Spectroscopy. (A) Endochondral ossification, (B) osteoclastogenesis, (C) hypoxia, (D) coagulation and vasoconstriction, (E) elevation of homocysteine.

다양한 오믹스 데이터를 분석하고 조직병리학, IHC, MRI, CT 및 마이크로 라만 분광법의 발표된 결과와 통합하여 AVNFH의 두드러진 특징의 모듈을 연구했습니다.

(A) 내연골 골화,

(B) 파골세포 형성,

(C) 저산소증,

(D) 응고 및 혈관 수축,

(E) 호모시스테인 상승.

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Figure 7

AVNFH as a multi systemic disease. (A) Different processes implicated in AVNFH from literature. (B) Possible pathogenesis model of AVNFH constructed on the basis of biochemical, omics, biophysical results and literature mining (references are provided in supplementary references S7).

다발성 전신 질환으로서의 AVNFH. (A) AVNFH에 관여하는 다양한 과정이 문헌에 나와 있습니다. (B) 생화학, 오믹스, 생물물리학적 결과 및 문헌 마이닝을 기반으로 구축된 AVNFH의 가능한 발병 모델(참조는 보충 참고자료 S7에 제공됨).

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Analysis of 125 genes common to at least two data sets from Integrative analysis reveals their association with many diseases which are risk factors for AVNFH

The integrative analysis using data sets from SNP, Transcriptomics, proteomics and enzyme-cofactor data showed 125 genes to be common to at least two data sets. These 125 genes were used for further analysis for diseases enrichment employing DisGeNET and Rare diseases gene set libraries from Enrichr. The top 40 genes were found to be associated with various diseases (Fig. 8A,B). These diseases include Microangiopathy, bone necrosis, aneurysm, pulmonary embolism, diabetic angiopathies, overweight, thrombophilia, hyperthyroidism, cerebrovascular events, anemia, sickle cell eclampsia, nephrotic syndrome, homocysteinemia, Kidney diseases, hemochromatosis and other diseases (Fig. 8A,B). Metabolomic analysis of perfused renal cortex samples from diabetic kidney disease rat models showed derangement of metabolites belonging to methionine pathway36. Further, by literature mining we could show that most of the diseases found using DisGeNET analysis were found to be risk factors for AVNFH (Fig. 8A,B). Taken together our analysis with molecular signatures could predict the diseases which are risk factors associated with AVNFH.

통합 분석에서 최소 두 개의 데이터 세트에 공통된 125개 유전자를 분석한 결과, AVNFH의 위험 인자인 여러 질병과의 연관성이 밝혀졌습니다.

SNP, 전사체학, 단백질체학, 효소 보조인자 데이터의 데이터 세트를 사용한 통합 분석 결과, 125개의 유전자가 최소 두 개의 데이터 세트에 공통적으로 존재하는 것으로 나타났습니다. 이 125개의 유전자는 Enrichr의 DisGeNET 및 희귀 질환 유전자 세트 라이브러리를 사용하여 질병 보강을 위한 추가 분석에 사용되었습니다. 상위 40개 유전자는 다양한 질병과 연관된 것으로 밝혀졌습니다(그림 8A,B).

이러한 질병에는

미세혈관병증, 골괴사, 동맥류, 폐색전증, 당뇨병성 혈관병증, 과체중, 혈전증, 갑상선 기능 항진증,

뇌혈관 질환, 빈혈, 겸상 적혈구 자간증, 신 증후군, 호모시스테인혈증, 신장 질환, 혈색소증 및 기타 질병이 포함됩니다 (그림 8A,B).

당뇨병성 신장 질환 쥐 모델에서 관류된 신장 피질 샘플의 대사체 분석 결과 메티오닌 경로에 속하는 대사물질의 변성이 나타났습니다36. 또한, 문헌 마이닝을 통해 DisGeNET 분석을 통해 발견된 대부분의 질병이 AVNFH의 위험 요인으로 밝혀졌습니다(그림 8A,B). 분자 시그니처와 분석을 종합하면 AVNFH와 관련된 위험 인자인 질병을 예측할 수 있습니다.

Figure 8

(A) DisGeNet clustergram showing enriched disease terms and associated genes. Numbers below show the reference which shows association of the disease with AVNFH. (B) Rare diseases GeneRIF genelists clustergram showing enriched disease terms and associated genes. Numbers below show the reference which shows association of the disease with AVNFH. (C) ALP activity staining showing reduced ALP activity (ALP staining) during osteogenic differentiation, in presence of Homocysteine. (D) ALP activity Staining quantification using ImageJ (Version: 1.46r URL: https://imagej.nih.gov/ij/) (P. value = 0.03) (E) Alizarin Red S staining showing reduced matrix mineralization during osteogenic differentiation in presence of Homocysteine. (F) Alizarin red staining quantification (P. value = 0.02). (G) Box plot showing elevated levels of RANKL in AVNFH patients (with high homocysteine, Narayanan et al. 2017) compared to healthy controls (P. value = 0.0074). P. value ≤ 0.05 was considered to be significant.

(A) 강화된 질병 용어와 관련 유전자를 보여주는 DisGeNet 클러스터그램. 아래 숫자는 AVNFH와 질병의 연관성을 보여주는 참조를 보여줍니다. (B) 희귀 질환 GeneRIF 유전자 목록 클러스터그램으로 강화된 질병 용어와 관련 유전자를 보여줍니다. 아래 숫자는 질병과 AVNFH의 연관성을 보여주는 참조를 보여줍니다. (C) 호모시스테인이 존재할 때 골 형성 분화 중 감소된 ALP 활성(ALP 염색)을 보여주는 ALP 활성 염색. (D) ImageJ (버전: 1.46r URL: https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용한 ALP 활성 염색 정량화 (P. 값 = 0.03) (E) 호모시스테인 존재 시 골형성 분화 중 감소된 매트릭스 미네랄화를 보여주는 알리자린 레드 S 염색 (Alizarin Red S 염색). (F) 알리자린 레드 염색 정량화 (P. 값 = 0.02). (G) 건강한 대조군과 비교하여 AVNFH 환자(호모시스테인이 높은 경우, Narayanan 등, 2017)에서 상승된 RANKL 수준을 보여주는 박스 플롯 (P. 값 = 0.0074). P값 ≤ 0.05는 유의한 것으로 간주했습니다.

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Validation of homocysteine and osteoclastogenesis (RANKL) module by experiments and literature mining

The analysis carried out in this study shows SNP in MTHFR, low B6, B12 and Folate as well as factors like Alcoholism by literature mining to be associated with AVNFH. The data analysis using SNP, transcriptomic, proteomic and metabolomic and the enzyme-cofactor data also showed involvement of elevated homocysteine in AVNFH (Fig. 6). Since the etiological, genetic and metabolic factors lead to elevated levels of homocysteine, we treated Mesenchymal Stem Cells with basal medium as well as osteogenic medium with and without homocysteine. MSC treated with homocysteine led to a significant reduction in ALP staining indicative of reduced osteoblastogenesis (Fig. 8C,D). Further mineralization assay using alizarin red showed significantly reduced mineralization in homocysteine treated sets compared to controls (Fig. 8E,F).

Systems analysis using the data sets shows osteoclastogenesis as one of the modules modulating the disease process (Fig. 6). RANKL is involved in osteoclastogenesis. Since SNP in RANKL is associated with AVNFH and transcriptomic analysis of AVNFH showed RANK-RANKL signaling, we estimated the level of RANKL in AVNFH patients who had high homocysteine1 compared to controls. RANKL was found to be significantly elevated in AVNFH patients compared to controls (Fig. 8G). Our integrative analysis showed CBS and MUT to be common to three of the four data sets used. Hence, we carried out literature mining to see if knock down, knock out, cofactor depletion or supplementing downstream products of CBS could modulate RANKL induced osteoclastogenesis. The results shows that depletion of B6 and B12 significantly augmented RANKL induced osteoclastogenesis (Supplementary Table S7.7). RANKL treatment in presence of siRNA which knock down CBS also significantly increased osteoclastogenesis (Supplementary Table S7.7). Similarly RANKL in presence of homocysteine significantly elevated osteoclastogenesis (Supplementary Table S7.7). Further, RANKL induced osteoclastogenesis could be inhibited by treatment with glutathione (Supplementary Table S7.7). Mice model of CBS KO exhibited hyperhomocystenemia and osteoporosis. Supplementation with N-Acetylcysteine was shown to decrease osteoclastogenesis and increase bone mass (Supplementary Table S7.7). Mice model of MUT KO exhibited hematological abnormalities like mild macrocytic anemia and low bone mineral density (Supplementary Table S7.7). Depletion of Vitamin B12 was shown to stimulate osteoclastogenesis by way of increasing homocysteine and methyl malonic acid (Supplementary Table S7.7).

Taken together our –Omic analysis results as well as integrative analysis using different data sets shows CBS and MUT to be associated with the disease. CBS and MUT, for their activity require B6 and B12 as cofactors respectively, which is present in low levels in the patients. Knock down, knock out or cofactor depletion (B6, B12) lead to elevated levels of homocysteine and methyl malonic acid which modulate MSC differentiation to osteoblasts, macrophage differentiation to osteoclasts as well as their function with potential implications for the disease.

실험 및 문헌 마이닝을 통한 호모시스테인 및 파골세포 형성(RANKL) 모듈의 검증

이 연구에서 수행된 분석은 문헌 마이닝을 통해 알코올 중독과 같은 요인뿐만 아니라 MTHFR, 낮은 B6, B12 및 엽산의 SNP가 AVNFH와 연관되어 있음을 보여줍니다. SNP, 전사체, 단백질체 및 대사체와 효소 보조인자 데이터를 사용한 데이터 분석에서도 호모시스테인 상승이 AVNFH와 관련이 있는 것으로 나타났습니다(그림 6). 병인학적, 유전적, 대사적 요인으로 인해 호모시스테인 수치가 높아지기 때문에 중간엽 줄기세포를 호모시스테인 유무에 관계없이 골 형성 배지뿐만 아니라 기저 배지로 처리했습니다. 호모시스테인으로 처리한 중간엽 줄기세포는 조골세포 생성 감소를 나타내는 ALP 염색이 현저히 감소했습니다(그림 8C,D). 알리자린 레드를 사용한 추가 미네랄화 분석에서는 대조군에 비해 호모시스테인 처리 세트에서 미네랄화가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다(그림 8E,F).

데이터 세트를 사용한 시스템 분석은 파골세포 형성이 질병 과정을 조절하는 모듈 중 하나라는 것을 보여줍니다(그림 6). RANKL은 파골세포 형성에 관여합니다. RANKL의 SNP가 AVNFH와 관련이 있고 AVNFH의 전사체 분석에서 RANK-RANKL 신호가 나타났기 때문에 대조군에 비해 호모시스테인1이 높은 AVNFH 환자에서 RANKL 수준을 추정했습니다. 그 결과, 대조군에 비해 AVNFH 환자에서 RANKL이 유의하게 상승한 것으로 나타났습니다(그림 8G). 통합 분석 결과, 사용된 네 가지 데이터 세트 중 세 가지에서 CBS와 MUT가 공통적으로 나타났습니다. 따라서 우리는 문헌 마이닝을 수행하여 CBS의 녹다운, 녹아웃, 보조인자 고갈 또는 다운스트림 생성물 보충이 RANKL에 의한 파골세포 형성을 조절할 수 있는지 확인했습니다. 그 결과, B6와 B12의 고갈은 RANKL에 의한 파골세포 형성을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났습니다(보충 표 S7.7). CBS를 녹다운시키는 siRNA가 있는 상태에서 RANKL을 처리한 경우에도 파골세포 형성이 유의하게 증가했습니다(보충 표 S7.7). 유사하게 호모시스테인이 있는 상태에서 RANKL은 파골세포 형성을 유의하게 증가시켰습니다(보충 표 S7.7). 또한 글루타치온으로 처리하면 RANKL에 의한 파골세포 형성이 억제될 수 있습니다(보충 표 S7.7). CBS KO 마우스 모델에서 고호모시스테인혈증과 골다공증이 나타났습니다. N-아세틸시스테인을 보충하면 파골세포 생성이 감소하고 골량이 증가하는 것으로 나타났습니다(보충 표 S7.7). MUT KO 마우스 모델은 경미한 거핵구 빈혈과 낮은 골밀도와 같은 혈액학적 이상을 보였습니다(보충 표 S7.7). 비타민 B12의 결핍은 호모시스테인과 메틸 말론산을 증가시켜 파골세포 생성을 자극하는 것으로 나타났습니다(보충 표 S7.7).

오믹스 분석 결과와 다양한 데이터 세트를 사용한 통합 분석 결과를 종합하면 CBS와 MUT가 질병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. CBS와 MUT의 활동을 위해서는 각각 보조 인자로 B6와 B12가 필요한데, 이는 환자들에게서 낮은 수준으로 존재합니다. 녹다운, 녹아웃 또는 보조인자(B6, B12) 고갈은 호모시스테인 및 메틸 말론산 수치를 상승시켜 조골세포로의 MSC 분화, 파골세포로의 대식세포 분화 및 그 기능을 조절하여 질병에 잠재적인 영향을 미칩니다.

Discussion

SNPs associated with AVNFH are collected from the literature. Network of SNPs associated with AVNFH was generated using Cytoscape and the SNPs in genes were binned into pathways. Furthermore, the functional implications of SNPs that were validated experimentally was collected from literature and its implication for AVNFH was discerned. The SNPs were associated with elevated homocysteine, hypoxia, osteoclastogenesis or coagulation and vasoconstriction. Transcriptomic analysis binned the genes into signaling pathways, metabolic pathways and other pathways that has implication for bone biology and disease manifestation. Proteomic data collected from the literature shows changes in pathways like B12 and coagulation which has implications for disease process. The cofactor-enzyme network conjured pathways that are deregulated in the disease, which has major implications for disease progression. The integrated analysis of SNP, Transcriptomic, proteomic and cofactor network shows common pathways that are deregulated in the disease that are very critical to the disease process. Analysis of the genes that are common to at least two data sets in the integrative analysis using DisGeNET showed association with multiple diseases. Interestingly cross validation using literature mining showed that these diseases are risk factors associated with AVNFH. In order to validate the prediction of a role for elevated homocysteine in vitro studies were carried out using MSC. Experimental validation of the role of homocysteine shows impaired MSC differentiation to osteoblasts and their function. In addition to this we also probed into the role of RANKL in AVNFH by measuring the levels of RANKL in our patient cohort. Subsequently the factors that modulate RANKL induced osteoclastogenesis was validated by literature mining. Our analysis showed elevated levels of RANKL in AVNFH patients. Using literature mining we show that RANKL induced osteoclastogenesis is augmented by homocysteine, depletion of B6 and B12, knock down/knock out of CBS or MUT. RANKL induced osteoclastogenesis could be attenuated by supplementation of glutathione or N-Acetylcysteine in CBS KO mice. Taken together the analysis recapitulates the observed processes associated with the disease which could be validated by experiments and literature mining.

토론
AVNFH와 관련된 SNP는 문헌에서 수집했습니다. Cytoscape를 사용하여 AVNFH와 관련된 SNP 네트워크를 생성하고 유전자의 SNP를 경로로 분류했습니다. 또한, 실험적으로 검증된 SNP의 기능적 의미를 문헌에서 수집하고 AVNFH에 대한 의미를 파악했습니다. SNP는 호모시스테인 증가, 저산소증, 파골세포 형성 또는 응고 및 혈관 수축과 관련이 있었습니다. 전사체 분석은 유전자를 신호 전달 경로, 대사 경로 및 뼈 생물학 및 질병 발현에 영향을 미치는 기타 경로로 분류했습니다. 문헌에서 수집한 단백질체 데이터는 B12 및 응고와 같은 경로의 변화를 보여주며, 이는 질병 진행에 영향을 미칩니다. 보조 인자-효소 네트워크는 질병에서 조절이 완화되는 경로를 연상시켰으며, 이는 질병 진행에 중요한 영향을 미칩니다. SNP, 전사체, 단백질체 및 보조인자 네트워크의 통합 분석은 질병 진행에 매우 중요한 질병에서 조절이 완화되는 공통 경로를 보여줍니다. DisGeNET을 사용한 통합 분석에서 최소 두 개의 데이터 세트에 공통적으로 존재하는 유전자를 분석한 결과, 여러 질병과의 연관성이 나타났습니다. 흥미롭게도 문헌 마이닝을 이용한 교차 검증을 통해 이러한 질병이 AVNFH와 관련된 위험 인자임을 보여주었습니다. 호모시스테인 상승에 대한 역할 예측을 검증하기 위해 MSC를 사용하여 시험관 내 연구를 수행했습니다. 호모시스테인의 역할에 대한 실험적 검증 결과 조골세포로의 MSC 분화 및 기능이 손상된 것으로 나타났습니다. 또한 환자 코호트에서 RANKL 수치를 측정하여 AVNFH에서 RANKL의 역할에 대해서도 조사했습니다. 그 후 문헌 마이닝을 통해 RANKL에 의해 유도된 파골세포 형성을 조절하는 인자를 검증했습니다. 분석 결과 AVNFH 환자에서 RANKL 수치가 상승한 것으로 나타났습니다. 문헌 마이닝을 통해 우리는 호모시스테인, B6 및 B12의 고갈, CBS 또는 MUT의 노크다운/노크아웃에 의해 RANKL 유도 파골세포 형성이 증강된다는 것을 보여주었습니다. CBS KO 마우스에 글루타치온 또는 N-아세틸시스테인을 보충하면 RANKL에 의한 파골세포 형성이 약화될 수 있습니다. 이 분석을 종합하면 실험과 문헌 마이닝을 통해 검증할 수 있는 질병과 관련된 관찰된 과정을 요약할 수 있습니다.

Previous studies have shown significant association of elevated levels of homocysteine with AVNFH1. The analyzed data at the level of SNPs, Transcriptomic, proteomic, metabolomics or their integrative analysis shows involvement of cysteine and methionine pathway, one carbon metabolism, B12 metabolism, B6 and folate metabolism, megaloblastic anemia etc. In addition, alcoholism which is a risk factor for AVNFH also leads to reduced levels of B12 and increased levels of homocysteine37. Our previous studies have shown lower levels of hemoglobin in AVNFH patients compared to age and gender matched controls1. However, whether the reduced hemoglobin correlated with megaloblastic anemia was not confirmed. Homocysteine has implications for bone biology as it remodels osteoblastogenesis, osteoclastogenesis and their function38,39. Homocysteine is also an inflammatory molecule and induces inflammatory response in the macrophages. Homocysteine is known to inhibit the activity of NOS. NOS is an important enzyme which is essential for vascular function40. Inhibition of NOS also leads to increased osteoclastogenesis41. Homocysteine also modulates blood coagulation42. In addition, homocysteine is known to induce ROS43. B6 is an important vitamin which is a cofactor for cystathionine beta synthase involved in the synthesis of cysteine and thus glutathione44. Reduced levels of B6 not only contribute to increased homocysteine but also to decreased cysteine, which is essential for the synthesis of glutathione. Our integrative analysis shows CBS as a key enzyme in the transsulfuration pathway which might be involved in AVNFH. Thus SNPs or vitamins like B6, B12 and folate or alcoholism might modulate the levels of homocysteine in different populations which in turn influences multiple pathways in the progression of AVNFH.

이전 연구에 따르면 호모시스테인 수치의 상승은 AVNFH1 과 유의미한 연관성이 있는 것으로 나타났습니다. SNP, 전사체, 단백질체, 대사체 또는 이들의 통합 분석 수준에서 분석된 데이터는 시스테인 및 메티오닌 경로, 1탄소 대사, B12 대사, B6 및 엽산 대사, 거대적아구성 빈혈 등에 관여하는 것으로 나타났습니다. 또한, AVNFH의 위험 요인인 알코올 중독은 B12 수치를 낮추고 호모시스테인 수치를 증가시킵니다37 . 이전 연구에 따르면 연령과 성별이 일치하는 대조군에 비해 AVNFH 환자의 헤모글로빈 수치가 더 낮은 것으로 나타났습니다1. 그러나 헤모글로빈 감소가 거대적아구성 빈혈과 상관관계가 있는지는 확인되지 않았습니다. 호모시스테인은 조골 세포 형성, 파골 세포 형성 및 그 기능을 리모델링하기 때문에 뼈 생물학에 영향을 미칩니다38,39. 호모시스테인은 또한 염증성 분자로서 대식세포에서 염증 반응을 유도합니다. 호모시스테인은 NOS의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있습니다. NOS는 혈관 기능에 필수적인 중요한 효소입니다40. NOS의 억제는 또한 파골세포 생성을 증가시킵니다41. 호모시스테인은 또한 혈액 응고를 조절합니다42. 또한 호모시스테인은 ROS를 유도하는 것으로 알려져 있습니다43. 비타민 B6는 시스테인 및 글루타티온 합성에 관여하는 시스타티오닌 베타 합성 효소의 보조 인자인 중요한 비타민입니다44 . B6 수치가 감소하면 호모시스테인이 증가할 뿐만 아니라 글루타치온 합성에 필수적인 시스테인 또한 감소합니다. 우리의 통합 분석에 따르면 CBS는 AVNFH에 관여할 수 있는 트랜스황화 경로의 핵심 효소입니다. 따라서 SNP나 B6, B12, 엽산과 같은 비타민 또는 알코올 중독은 여러 집단에서 호모시스테인 수치를 조절할 수 있으며, 이는 다시 AVNFH 진행의 여러 경로에 영향을 미칠 수 있습니다.

AVNFH has also been associated with coagulation disorders. Consistent with this SNP analysis Using the Plugin ClueGO binned genes into blood clotting cascade, complement and coagulation cascade. ClueGO analysis of network generated with the SNP containing genes along with first neighbors show that the genes are binned into Platelet degranulation pathway. ClueGO analysis of Network generated from Proteomic data sets shows genes binned into platelet degranulation, complement and coagulation cascade. Platelet degranulation is an important process in coagulation pathway45. Previous studies have shown an association of homocysteine with AVNFH1. Homocysteine potentiate ADP induced platelet degranulation and coagulation46. Increased Von Willebrand factor which is involved in coagulation process is also associated with AVNFH47. SNP in Collagen associated with AVNFH is shown to induce platelet activation48,49. In addition, microparticles in blood are associated with the disease16. The association of coagulation and vasoconstriction is also supported by histopathology and MRI-BOLD as well as blood velocity studies50. Hence multiple factors at the genetic, transcriptomic, metabolomic or at the level of cofactors might contribute to coagulation cascade which is associated with AVNFH.

Previous studies using Micro-Raman Spectroscopy shows increased carbonate to phosphate and decreased mineral matric ratio in AVNFH bone from both patients and piglet model1,11. CT scan shows reduced Houns field unit an indication of reduced bone density1. The data is suggestive of increased osteoclast and decreased osteoblast function. The increased resorption of bone is ascribed to increased osteoclastogenesis and its function51. In addition, AVNFH bone shows increased bone turnover as observed in the Immunohistochemistry (IHC) for osteocalcein1. Homocysteine is shown to modulate osteoclastogenesis. Studies have reiterated a role for homocysteine in osteoblast induced osteoclastogenesis by way of RANKL expression‎ and secretion32. B12 and B6 depleted media are shown to augment the differentiation of macrophages to osteoclasts52. Our AVNFH patient cohort show elevated level of RANKL in plasma. IHC of patient bone also shows increased RANK, RANKL staining13. More so, Iron sequestration is an important event in osteoclastogenesis53. Consistent with these facts, RANKL induced osteoclastogenesis shows upregulation of genes involved in iron metabolism54. Knocking down genes involved in endosome acidification was shown to inhibit osteoclastogenesis55. SNP analysis shows HIF-1 signaling pathway and VEGF signaling pathway are associated with hypoxia. SNP and Transcriptomic analysis shows regulation of gene expression‎ by HIF-1α. Traumatic AVNFH is associated with hypoxia as seen in animal model of AVNFH56. In addition, the microparticles in blood associated with ANVFH is proposed to clog capillaries inducing hypoxic conditions16,17. Consistent with this immuno-histochemistry shows increased HIF-1 staining in AVNFH bone15. MRI-BOLD technique also shows changes in the oxygenation of arterial and venous blood in AVNFH patients compared to controls (Supplementary Table S7.5 and references there in). Hypoxia is involved in osteoclastogenesis and lead to bone resorption57. Transcriptomic analysis shows TGFβ signaling pathway is important for osteoclastogenesis and TGFβ Receptor knock out inhibits osteoclastogenesis58. Thus multiple signaling pathways together might provide conditions favorable to osteoclastogenesis and bone degradation.

AVNFH는 응고 장애와도 관련이 있습니다. 이 SNP 분석과 일치하는 플러그인 ClueGO를 사용하여 유전자를 혈액 응고 캐스케이드, 보체 및 응고 캐스케이드로 이진화했습니다. 첫 번째 이웃 유전자와 함께 SNP를 포함하는 유전자로 생성된 네트워크를 ClueGO로 분석한 결과, 유전자가 혈소판 탈과립 경로로 분류된 것을 확인할 수 있습니다. 단백질체 데이터 세트에서 생성된 네트워크의 ClueGO 분석은 혈소판 탈과립, 보체 및 응고 캐스케이드로 분류된 유전자를 보여줍니다. 혈소판 탈과립은 응고 경로에서 중요한 과정입니다45. 이전 연구에서는 호모시스테인과 AVNFH1 의 연관성이 밝혀진 바 있습니다. 호모시스테인은 ADP가 유도하는 혈소판 탈과립 및 응고를 강화합니다46. 응고 과정에 관여하는 폰 빌레브란트 인자의 증가도 AVNFH와 관련이 있습니다47. AVNFH와 관련된 콜라겐의 SNP는 혈소판 활성화를 유도하는 것으로 나타났습니다48 ,49. 또한 혈액 내 미세 입자는 질병과 관련이 있습니다16. 응고와 혈관 수축의 연관성은 조직 병리학과 MRI-BOLD 및 혈류 속도 연구50 에 의해서도 뒷받침됩니다. 따라서 유전체, 전사체, 대사체 또는 보조 인자 수준의 여러 인자가 AVNFH와 관련된 응고 캐스케이드에 기여할 수 있습니다.

마이크로 라만 분광법을 사용한 이전 연구에 따르면 환자와 새끼 돼지 모델 모두에서 AVNFH 뼈에서 탄산염 대 인산염 비율이 증가하고 미네랄 매트릭 비율이 감소했습니다1,11. CT 스캔은 골밀도 감소를 나타내는 하운스 필드 단위의 감소를 보여줍니다1 . 이 데이터는 파골세포의 증가와 조골세포의 기능 저하를 시사합니다. 뼈의 흡수 증가는 파골 세포 형성과 그 기능의 증가에 기인합니다51. 또한, 오스테오칼세인1 에 대한 면역조직화학(IHC)에서 관찰된 바와 같이 AVNFH 뼈는 뼈의 회전율이 증가한 것으로 나타났습니다. 호모시스테인은 파골세포 형성을 조절하는 것으로 나타났습니다. 연구에 따르면 호모시스테인은 조골세포에서 RANKL 발현과 분비를 통해 파골세포 형성을 유도하는 것으로 밝혀졌습니다32. B12와 B6가 고갈된 배지는 대식세포의 파골세포로의 분화를 촉진하는 것으로 나타났습니다52. AVNFH 환자 코호트에서 혈장 내 RANKL 수치가 상승한 것으로 나타났습니다. 환자 뼈의 IHC에서도 RANK, RANKL 염색이 증가했습니다13. 더욱이 철분 격리는 파골세포 형성에서 중요한 사건입니다53. 이러한 사실과 일관되게 RANKL로 유도된 파골세포 형성은 철 대사에 관여하는 유전자의 상향 조절을 보여줍니다54. 엔도솜 산성화에 관여하는 유전자를 제거하면 파골세포 형성이 억제되는 것으로 나타났습니다55. SNP 분석 결과 HIF-1 신호 경로와 VEGF 신호 경로가 저산소증과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. SNP 및 전사체 분석은 HIF-1α에 의한 유전자 발현 조절을 보여줍니다. 외상성 AVNFH는 동물 모델에서 볼 수 있듯이 저산소증과 관련이 있습니다56. 또한, ANVFH와 관련된 혈액 내 미세 입자는 모세혈관을 막아 저산소 상태를 유도하는 것으로 제안되었습니다16,17. 이러한 면역-조직화학 결과와 일치하는 것은 AVNFH 뼈에서 HIF-1 염색이 증가한다는 것입니다15. 또한 MRI-BOLD 기술은 대조군과 비교하여 AVNFH 환자의 동맥 및 정맥혈 산소화 변화를 보여줍니다(보충 표 S7.5 및 참고 문헌). 저산소증은 파골세포 형성에 관여하여 골 재흡수로 이어집니다57. 전사체 분석에 따르면 TGFβ 신호 전달 경로는 파골세포 형성에 중요하며, TGFβ 수용체 녹아웃은 파골세포 형성을 억제합니다58. 따라서 여러 신호 경로가 함께 작용하여 파골세포 형성과 뼈 분해에 유리한 조건을 제공할 수 있습니다.

Homocysteine is shown to inhibit the expression‎ of LOX159 which is involved in collagen cross linking. Previous studies have shown Homocysteine inhibit the differentiation of mesenchymal stem cells (MSC) into osteoblasts60. However, contradictory results are obtained in case of homocysteine induced mineralization61. Increased iron also inhibit differentiation of MSC into osteoblasts62. Consistent with this a role for iron is conceived in osteoclastogenesis, osteoblastogenesis and their function. Iron overload diseases like sickle cell anemia, beta-thalassemia and hemochromatosis are risk factors for AVNFH. The histopathological changes also report empty lacunae in bone, indicative of absence of osteoblasts, reverse cement lines, marrow calcification etc., which shows deregulation and imbalance in osteoblast and osteoclast function1. The different pathways might act in concert to impede MSC differentiation into osteoblasts and promote differentiation of macrophages into osteoclast as well as modulate their function.

Endochondral ossification is a process where cartilage is replaced by bone63. Network analysis of SNPs associated with AVNFH and transcriptomic analysis of AVNFH cartilage shows binning of genes involved in endochondral ossification pathway. Cartilage in AVNFH shows hypertrophy and death in AVNFH64.

Treatment with Bisphosphonate is the standard care treatment for AVNFH65. Bisphosphonate acts at multiple levels by inhibiting osteoclastogenesis and preventing coagulation by inhibiting platelet degranulation66. Bisphosphonate also helps in increasing mineralization65. However, in the absence of osteoclastogenesis, this might lead to woven bone formation which might hamper bone strength67.

In the present study, analysis of genes common to at least two data sets using DisGeNET showed association with various diseases. Validation using literature showed these diseases are risk factors associated with AVNFH (Supplementary Table S7.6 and the references there in). However, in the diseases which are risk factors for AVNFH, if the associated genes of our DisGeNET analysis are involved in disease process leading to AVNFH remain to be experimentally validated. Analysis of SNPs, the expression‎ levels of these genes or levels of cofactors required for their activity might shed light on their role in progression to AVNFH.

Further, our work shows that elevated levels of homocysteine ensue, as a consequence of multiple factors like SNP on MTHFR, reduced B6, B12 or folate. We show that elevated Homocysteine leads to impairment of MSC differentiation into osteoblasts and inhibit their mineralization function. Previous studies have also shown that homocysteine causes apoptosis in mesenchymal stem cells60. Transcriptomic analysis shows RANK-RANKL signaling in AVNFH. We show that RANKL is elevated in the plasma of AVNFH patients. Literature mining shows that RANKL induced osteoclastogenesis is augmented by depletion of B6 or B12 in media. Knock down of CBS which came up as a critical gene in three of the four data set in our integrated analysis increased osteoclastogenesis, while supplementation of glutathione was shown to inhibit osteoclastogenesis68. CBS KO mice showed increased osteoclastogenesis and osteoporosis which could be mitigated by supplementation of N-acetyl cysteine. Similarly, MUT KO mice exhibited anemia and reduced bone density69.

Overall the results of our analysis show that the molecular signatures of SNPs, transcriptomics, proteomic, metabolomic and cofactor-enzyme data captures the tenets of pathophysiology and symptom associated changes in bone biology, biophysical, immunohistochemical and histopathological changes characteristic of the disease. However, due caution should be exercised as the work with human and animal model systems only can be used to reiterate the conserved pathways as the animal models may not be truly representative of AVNFH in humans. This work also paves way for a deeper insight into the role of homocysteine and iron metabolism in the pathophysiology of AVNFH. The work also shows various diseases which are risk factors associated with AVNFH, and raises additional questions on the potential role or association of different genes in AVNFH. The work also helps to delineate the potential benefits of treatment with bisphosphonate as it interferes with ostoclastogenesis and coagulation process associated with AVNFH.

호모시스테인은 콜라겐 교차 결합에 관여하는 LOX159의 발현을 억제하는 것으로 나타났습니다. 이전 연구에 따르면 호모시스테인은 중간엽 줄기세포(MSC)가 조골세포로 분화되는 것을 억제하는 것으로 나타났습니다60. 그러나 호모시스테인이 미네랄화를 유도하는 경우에는 상반된 결과가 나왔습니다61. 철분 증가는 또한 MSC가 조골세포로 분화하는 것을 억제합니다62. 이와 일관되게 파골세포 형성, 조골세포 형성 및 그 기능에서 철의 역할이 생각됩니다. 겸상 적혈구 빈혈, 베타 지중해 빈혈, 혈색소 침착증과 같은 철분 과부하 질환은 AVNFH의 위험 인자입니다. 또한 조직 병리학적인 변화는 조골세포의 부재, 역 시멘트 선, 골수 석회화 등을 나타내는 뼈의 빈 구멍, 조골세포 및 파골세포 기능의 조절 저하 및 불균형을 나타냅니다1 . 다양한 경로가 함께 작용하여 MSC가 조골세포로 분화하는 것을 방해하고 대식세포가 파골세포로 분화하는 것을 촉진하고 기능을 조절할 수 있습니다.

연골 골화는 연골이 뼈로 대체되는 과정입니다63. AVNFH와 관련된 SNP의 네트워크 분석과 AVNFH 연골의 전사체 분석은 연골 내 골화 경로에 관여하는 유전자의 비닝을 보여줍니다. AVNFH의 연골은 비대와 죽음을 보여줍니다64.

비스포스포네이트 치료는 AVNFH65 의 표준 치료법입니다. 비스포스포네이트는 파골 세포 생성을 억제하고 혈소판 탈과립을 억제하여 응고를 방지함으로써 여러 수준에서 작용합니다66. 비스포스포네이트는 또한 무기질화를 증가시키는 데 도움이 됩니다65 . 그러나 파골세포 형성이 이루어지지 않으면 뼈가 짜여져 뼈의 강도를 저해할 수 있습니다67.

본 연구에서는 DisGeNET을 사용하여 최소 두 개의 데이터 세트에 공통적으로 존재하는 유전자를 분석한 결과 다양한 질병과의 연관성이 나타났습니다. 문헌을 사용한 검증 결과, 이러한 질병은 AVNFH와 관련된 위험 요인으로 나타났습니다(보충 표 S7.6 및 참조 참조). 그러나 AVNFH의 위험 인자인 질병에서 DisGeNET 분석의 관련 유전자가 AVNFH로 이어지는 질병 과정에 관여하는지 여부는 실험적으로 검증해야 합니다. SNP, 이들 유전자의 발현 수준 또는 이들의 활동에 필요한 보조 인자의 수준을 분석하면 AVNFH로의 진행에서 이들의 역할을 밝힐 수 있습니다.

또한, 우리의 연구에 따르면 호모시스테인 수치가 높아지면 MTHFR의 SNP, B6, B12 또는 엽산 감소와 같은 여러 요인의 결과로 호모시스테인 수치가 높아지는 것으로 나타났습니다. 우리는 호모시스테인 수치가 높아지면 조골세포로의 MSC 분화가 손상되고 미네랄화 기능이 억제된다는 것을 보여줍니다. 이전 연구에서도 호모시스테인이 중간엽 줄기세포에서 세포 사멸을 유발한다는 사실이 밝혀졌습니다60. 전사체 분석은 AVNFH에서 RANK-RANKL 신호 전달을 보여줍니다. 우리는 AVNFH 환자의 혈장에서 RANKL이 증가한다는 것을 보여줍니다. 문헌 마이닝을 통해 RANKL에 의한 파골세포 형성이 배지에서 B6 또는 B12의 고갈에 의해 증강됨을 확인했습니다. 통합 분석에서 4개의 데이터 세트 중 3개의 데이터 세트에서 중요한 유전자로 나타난 CBS를 녹다운하면 파골세포 형성이 증가한 반면, 글루타치온을 보충하면 파골세포 형성이 억제되는 것으로 나타났습니다68. CBS KO 마우스는 N-아세틸 시스테인 보충으로 완화될 수 있는 파골세포 생성과 골다공증이 증가한 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, MUT KO 마우스는 빈혈과 골밀도 감소를 보였습니다69.

전반적으로 분석 결과는 SNP, 전사체학, 단백질체학, 대사체학 및 보조인자 효소 데이터의 분자적 시그니처가 질병의 특징인 뼈 생물학, 생물물리학적, 면역조직화학적 및 조직병리학적인 변화의 병리 생리와 증상 관련 변화를 포착하고 있음을 보여줍니다. 그러나 인간과 동물 모델 시스템만을 사용한 연구는 동물 모델이 인간의 AVNFH를 진정으로 대표하지 않을 수 있으므로 보존된 경로를 반복하는 데만 사용할 수 있으므로 주의가 필요합니다. 이 연구는 또한 AVNFH의 병태 생리학에서 호모시스테인과 철 대사의 역할에 대한 더 깊은 통찰을 위한 길을 열어줍니다. 이 연구는 또한 AVNFH와 관련된 위험 요인인 다양한 질병을 보여주고, AVNFH에서 다양한 유전자의 잠재적 역할 또는 연관성에 대한 추가적인 의문을 제기합니다. 이 연구는 또한 비스포스포네이트가 파골세포 형성과 AVNFH와 관련된 응고 과정을 방해하기 때문에 비스포스포네이트 치료의 잠재적 이점을 설명하는 데 도움이 됩니다.

Conclusions

Our integrative analysis points to the contribution of multiple factors like hypoxia, coagulopathy, deficiency of vitamins like B6, B12, folate, high homocysteine, osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, endochondral ossification etc., in remodeling of AVNFH bone and progression of the disease. The molecular signatures correlate with observations like coagulation, hypoxia, decreased osteoblastogenesis, increased osteoclastogenesis and their deregulated function in the disease. This in turn complies with previous MRI, biophysical, immunohistochemical and histopathological studies of the AVNFH bone. The role of coagulation pathway in the diseases and factors that affect it also are evident from the systems analysis of data sets which might contribute indirectly to disease process. The work also shows multiple factors like SNPs, Alcoholism, cofactor deficiency or iron overload diseases as well as other diseases that could lead to similar environment which might favor disease progression. A role for specific genes involved in these diseases which are risk factors for AVNFH remain to be ascertained experimentally. The present work also provides direction where supplementation of vitamins like B6, B12 and folate might help in management of the disease. The result of our analysis shows AVNFH as a multi-systemic disease.

결론

우리의 통합 분석은 

저산소증, 

응고 병증, 

B6, B12, 엽산과 같은 비타민 결핍, 

높은 호모시스테인, 

조골 세포 형성, 

파골 세포 형성, 

내연골 골화 등과 같은 여러 요인이 

AVNFH 뼈의 리모델링과 질병의 진행에 기여하는 것을 지적합니다. 

분자적 시그니처는 

응고, 저산소증, 조골세포 형성 감소, 

파골세포 형성 증가 및 질병의 기능 저하와 같은 관찰 결과와 관련이 있습니다. 

이는 AVNFH 뼈에 대한 이전의 MRI, 생물물리학적, 면역조직화학 및 조직병리학적 연구와도 일치합니다. 질병에서 응고 경로의 역할과 이에 영향을 미치는 요인은 질병 진행에 간접적으로 기여할 수 있는 데이터 세트의 시스템 분석을 통해서도 분명하게 드러납니다. 

이 연구는 또한 

SNP, 알코올 중독, 보조 인자 결핍 또는 철분 과부하 질환과 같은 

여러 요인과 질병 진행을 촉진할 수 있는 유사한 환경으로 이어질 수 있는 다른 질병을 보여줍니다. 

이러한 질병에 관여하는 특정 유전자의 역할과 AVNFH의 위험 요인은 아직 실험적으로 밝혀지지 않았습니다. 

또한 이번 연구는 

B6, B12, 엽산과 같은 비타민의 보충이 질병 관리에 도

움이 될 수 있는 방향을 제시합니다. 

분석 결과 AVNFH는 다발성 질환으로 밝혀졌습니다.

Material and methods

SNPs associated with AVNFH and functional implication

The SNPs associated with AVNFH were obtained from literature. The inclusion criteria were all SNPs that have association with AVNFH/osteonecrosis, while all those that did not show any association in a particular study with AVNFH/osteonecrosis were excluded. GWAS data for AVNFH/osteonecrosis was also searched and SNPs were included. SNPs which were associated only with osteonecrosis other than that of femoral head were excluded. The SNPs were categorised into Exonic, which contained the synonymous and non-synonymous SNPs, Intronic in introns, promoters, 3ÚTR and intergenic regions. The list of SNPs was binned into pathways using ClueGO 70 plugin of cytoscape for pathway annotation 71 and the pathway networks were visualised in Cytoscape. ClueGO uses KEGG, Reactome and WikiPathways 72–74 to bin genes into pathways. Further the functional implication of SNPs was discerned by literature search for experimentally validated data. For finding experimental validation of SNPs associated with AVNFH from literature OMIM data base was searched and search was also carried out with rs ID or name/notation of genes followed by functional implications or experimental validation. All SNPs with impaired function or implications for a function were included while those without any consequence were excluded.

AVNFH gene expression‎ microarray, proteomic and metabolomics data

The gene expression‎ microarray study involved a genome wide Gene expression‎ profiling of hip articular cartilage with AVNFH. Gene expression‎ microarray data of GEO accession GSE74089 was obtained from Gene Expression‎ Omnibus75 (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) based on the platform GPL13497 (Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4 × 44 K v2), deposited by Ruiyu L24. Gene expression‎ profiling of AVNFH articular cartilage was carried out by collecting hip articular cartilage specimens from 12 AVNFH patients and 12 healthy controls. Microarray data of GEO accession GSE74847 was used which studied RANKL induced osteoclastogenesis using RAW 264.7 cells76. The Proteomic data from AVNFH bone tissue compared to healthy control bone tissue was used from a published dataset26. Data from three published metabolomic analyses were used for our study. Our previous study involving targeted metabolomics of plasma samples from 14 patients compared to 14 healthy control samples were used1, a global non-targeted metabolomics of plasma samples from 30 AVNFH patients compared to 30 healthy controls23, and a bone trabecular metabolomics study of 28 patients compared to 20 controls25.

Differential gene expression‎ analysis and data pre-processing

The GEO2R web tool was used to define two groups of samples namely (necrotic femoral head) ‘NFH’ and ‘Control’, and to perform Differential Gene Expression‎ analysis77. The GEO2R tool uses the GEO-query and limma R packages from the Bioconductor project to compare the original processed data tables supplied by the submitter. The GEOquery R package parses GEO data into R data structures that can be used by other R packages77. The limma (Linear Models for Microarray Analysis) R package has statistical tests for identifying differentially expressed genes78. The GEO2R tool was used to define groups such that the logFC gave fold change of NFH group with respect to Control group. i.e., a positive logFC implied upregulation of gene in NFH group and negative logFC implied downregulation in NFH group.

The adjusted p. Value from the Limma package was used to identify genes that were significantly differentially expressed between the Control and NFH patient sample. The Value adjustments, also called multiple-testing corrections, attempt to correct for the occurrence of false positive results. The Benjamini & Hochberg false discovery rate method79 was used for adjustment of the microarray data and provide a good balance between discovery of statistically significant genes and limitation of false positives. Significant differentially expressed genes of Adjusted P. Value ≤ 0.05 were used for this study. Significant changes in the proteomic and metabolomics analyses were obtained from the respective published datasets.

ClueGO and metaboanalyst pathway annotation analyses

The ClueGO plugin of Cytoscape was used for pathway annotation analysis70,71. ClueGo can perform Enrichment (right-sided hypergeometric test), Depletion (left-sided hypergeometric test) or Enrichment/Depletion (two-sided hypergeometric test). We have used Enrichment/Depletion (two-sided hypergeometric test) for our analyses which are recommended80. The significant differentially expressed genes were used for querying Reactome, KEGG and WikiPathways72,73,74 databases for pathway functional analyses. The pathway terms showing term P. Value ≤ 0.05 were considered for further analysis. Significant pathways of interest were used for creating subnetworks containing specific daughter pathways with genes involved to understand differential gene expression‎ and predict mechanism of derangement of metabolic pathways. Cytoscape tools were used to generate specific pathway networks from global pathways.

Cluepedia plugin of Cytoscape was used to add all genes present in all the pathway terms of the network81. Subnetworks of pathways showing pathway terms and their associated genes were created. logFC data of genes was then imported into cytoscape and was overlaid with the subnetwork. MetaboAnalyst tool was used to bin significant metabolites into KEGG Pathways30.

Vitamin B6, vitamin B12 and folate cofactor: protein interaction network

Since Vitamin B6, B12 and Folate cofactors are implicated in AVNFH1,82, an interaction network involving these cofactors and respective proteins was created and visualised in Cytoscape71. We have created this network based on the published dataset involving cofactors–protein interaction network used for understanding relation between human nutrition and diseases31. The created Vitamin B6, B12 and Folate cofactors – protein network was used for ClueGo analyses.

Integratedomic network construction and network centrality analyses

Networks for individual analyses involving AVNFH SNPs, Proteomic, Transcriptomics and Cofactor-protein networks were created using Cytoscape. Next these individual networks were merged in Cytoscape to obtain an integrated network. To understand common key nodes in AVNFH, network centrality analysis was carried out using CytoNCA plugin of Cytoscape 83. The hub nodes obtained from network centrality analysis was used for further functional analyses using ClueGO.

Drug/disease enrichment analyses using Enrichr

The 125 hub nodes from integrated omics network with degree 2 and 3 were used to carry out Drug/Disease enrichment analyses. Enrichr web—based tool was used to carry out Drug / Disease enrichment analyses 84. We used gene—set libraries from DisGeNet and Rare Diseases GeneRIF Gene Lists. DisGeNet is a comprehensive repository of human gene—disease associations. Rare Diseases GeneRIF Gene Lists has gene—disease associations based on GeneRIF (Gene Reference into Function) to enrich the functional annotation of genes. The enriched terms were sorted using combined score ranking after carrying out the enrichment analyses using Enrichr tool.

RANKL ELISA

All the blood samples of AVNFH (n = 5) and controls (n = 7) were procured from patients visiting Sri Sathya Sai Institute of Higher Medical Sciences in a de-identified manner by a honest broker as per approval of the SSSIHMS institutional bioethics commission (Approval number: SSSIHL/IEC/PSN/BS/2012/05) Informed consent was obtained from all subjects and the methods were carried out in “accordance” with the approved guidelines and regulations. Plasma samples from healthy control, and AVNFH were frozen at − 80 °C until assay was done. Commercial ELISA kits (Peprotech) of human sRANK ligand (Cat. No. 900-M142), were used in the study as per manufacturer’s instructions. Dilutions of antibodies were carried out as per manufacturers instruction unless otherwise specified. Briefly, 96 well micro-titer plates (Corning Product #3590) were coated with capture antibody and incubated overnight at room temperature. Following this, the plate was first washed with wash buffer and blocked with block buffer for 1 h at room temperature. Standards and sample dilutions were prepared using the diluent and pipetted into designated wells. Detection antibody was added immediately into the standards and sample wells and incubated for 2 h at room temperature. After thorough washing, Avidin- HRP conjugate was added and incubated for 30 min at room temperature. Finally, ABTS Liquid substrate provided by the manufacturer in the respective kit was added into each well and incubated for 30 min at room temperature. Absorbance at 405 nm (reference absorbance 650 nm) was obtained within 30 min of adding the stop solution and the results were calculated using a log–log or 4- parameter curve fit. P. value ≤ 0.05 was considered significant.

MSC isolation from mice

Animal experiments were approved by the Institutional Animal Ethics Committee, Indian Institute of Science, Bangalore, India. All animal protocols were performed in accordance with the guidelines for care and use of laboratory animals set by Indian National Science Academy. Six to eight -week-old CD-1 female mice, weighing 25–28 g, were used for the isolation of BM-MSCs BM-MSCs were isolated as previously described (PMID: 29760732). Briefly, the mice were sacrificed by cervical dislocation and the femurs and tibias were dissected out. The bone marrow was flushed with Dulbecco's phosphate-buffered solution (DPBS; Thermofisher scientific, Waltham, USA). The cell suspension was filtered through a 70 μm cell strainer (BD Falcon, USA), and centrifuged at 300×g for 10 min. The cell pellet was suspended in 1 ml MSC culture medium composed of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 2 mM glutamine (all purchased from Thermo Scientific, Waltham, USA). Cells were seeded in 35 mm cell culture dishes at a density of 1 × 106 cells/cm2 and incubated in a humidified incubator at 37 °C, 5% CO2. After 1 day, nonadherent cells were removed by washing twice with DPBS and fresh MSC culture medium was added. The medium was replaced with fresh MSC culture medium every 2 days.

MSC cell culture and osteogenic differentiation

Mouse bone marrow derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) were cultured in basal medium (BM) consisting of DMEM (Gibco) supplemented with 10% FBS (Gibco), 1% Penicillin –Streptomycin solution (Gibco) and 1% Glutamax (Gibco). Cells were cultured in 4 well plates in basal medium till cells reached 70% confluence following which the basal medium was replaced with Osteogenic medium (OM) which consisted of basal medium supplemented with Ascorbate—100 µM (Sigma-Aldrich) and β-glycerophosphate—5 mM (Sigma-Aldrich). During osteogenic differentiation, effect of appropriate concentration of Homocysteine—30 µM60 was studied by using DL Homocysteine (Sigma-Aldrich). Medium was changed every 3 days.

ALP activity staining and Alizarin Red S staining

Effect of Homocysteine on Alkaline Phosphatase activity during osteogenic differentiation was carried out after 7 days of treatment. ALP activity staining was carried out by fixing cells with 4% para formaldehyde. After fixation the cells were stained with staining solution containing Napthol–AS–MS Phosphate—0.4 mg/ml (Sigma-Aldrich), Fast Red TR salt—1 mg/ml (Sigma-Aldrich), dissolved in Tris-Maleate buffer—30 mM at pH 9, in presence of 0.08% MgCl2 solution. At pH 9, in presence of Mg2 + and Alkaline Phosphatase, Napthol–AS–MS Phosphate and Fast Red TR combine to form an insoluble Azo red end product.

Effect of Homocysteine on matrix mineralization, was carried out using Alizarin Red S staining to stain calcium deposits. After 14 days of treatment, the cells were fixed with 4% para formaldehyde. Then the cells were stained with 2% Alizarin Red S solution (Sigma-Aldrich) whose pH was adjusted to 4.2 using ammonium hydroxide solution. Alizarin Red S stains calcium deposits to give red colouration.

ALP activity staining and Alizarin staining was quantified using ImageJ software (Version: 1.46r URL: https://imagej.nih.gov/ij/), by calculating the intensity of the stained area. Data is presented as mean fold change of at least 5 sample images from each group. P. Value ≤ 0.05 was considered significant.

Ethics approval

Experiments on humans and the use of human blood samples: We confirm‎ that all experiments were performed in accordance with relevant guidelines and regulations.

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