Re: 세포장례식(efferocytosis) 그리고 자가면역 질환.. 2021년

[문형철]

Physiological Roles of Apoptotic Cell Clearance: Beyond Immune Functions

by 

Minjoo Han

 1,†,

Gyoungah Ryu

 1,†,

Seong-Ah Shin

 1

,

Jangeun An

 1,

Huiji Kim

 1,

Daeho Park

 2

,

Dae-Hee Lee

 3 and

Chang Sup Lee

 1,*

1

College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea

2

School of Life Sciences and Aging Research Institute, Gwangju Institute of Science and Technology, Gwangju 61005, Korea

3

Department of Marine Food Science and Technology, Gangneung-Wonju National University, Gangneung 25456, Korea

*

Author to whom correspondence should be addressed.

†

These authors contributed equally to this work.

Life 2021, 11(11), 1141; https://doi.org/10.3390/life11111141

Submission received: 29 September 2021 / Revised: 24 October 2021 / Accepted: 25 October 2021 / Published: 26 October 2021

(This article belongs to the Special Issue Apoptosis and Autophagy)

Abstract

The clearance of apoptotic cells is known to be a critical step in maintaining tissue and organism homeostasis. This process is rapidly/promptly mediated by recruited or resident phagocytes. Phagocytes that engulf apoptotic cells have been closely linked to the release of anti-inflammatory cytokines to eliminate inflammatory responses. Defective clearance of apoptotic cells can cause severe inflammation and autoimmune responses due to secondary necrosis of apoptotic cells. Recently accumulated evidence indicates that apoptotic cells and their clearance have important physiological roles in addition to immune-related functions. Herein, we review the current understanding of the mechanisms and fundamental roles of apoptotic cell clearance and the beneficial roles of apoptotic cells in physiological processes such as differentiation and development.

초록

사멸 세포의 제거는

조직 및 유기체의 항상성을 유지하는 데 중요한 단계로 알려져 있습니다.

이 과정은 모집된 또는 상주하는

식세포에 의해 신속하게 매개됩니다.

사멸 세포를 삼키는 식세포는

염증 반응을 제거하기 위해

항염증성 사이토카인의 분비와 밀접하게 연관되어 있습니다.

사멸 세포의 제거 결함은

사멸 세포의 2차 괴사로 인해 심각한 염증 및 자가면역 반응을 유발할 수 있습니다.

최근 축적된 증거는

사멸 세포와 그 제거가 면역 관련 기능 외에도 중요한 생리적 역할을 수행한다는 것을 보여줍니다.

본 연구에서는 사멸 세포 제거의 메커니즘과 기본적 역할,

분화 및 발달과 같은 생리적 과정에서의

사멸 세포의 유익한 역할에 대한 현재의 이해를 검토합니다.

Keywords: 

apoptosis; apoptotic cell clearance; differentiation; development; inflammation; phagocyte

1. Overview of Apoptotic Cell Clearance

There are various types of cell death such as apoptosis, pyroptosis, necroptosis, ferroptosis, and NETosis. In pyroptosis, pathologic stimuli and inflammatory caspases form pores in cell membranes [1]. Necroptosis is a programmed inflammatory cell death characterized by both apoptosis and necrosis [2]. Ferroptosis is an iron-dependent programmed cell death, in response to intracellular oxidative perturbations [3]. NETosis is a regulatory neutrophil cell death that occurs with the formation of neutrophil extracellular traps (NETs) [4]. These cell death types are also referred to as “regulated cell death’’ because various pathways define them at the molecular level [5]. In this review, we focused on apoptotic cell death and apoptotic cell clearance. Apoptosis is referred to as “programmed cell death”, which mediates normal development and tissue homeostasis in multicellular organisms [6,7,8]. Dysregulated apoptosis is known to cause a variety of pathological diseases, including cancer and neurodegenerative disorders [9,10,11]. Furthermore, cellular senescence is a state of irreversible cell cycle arrest exhibiting apoptosis resistance, and recent studies have found that it increases with aging and aging-related disease [12]. One form of cellular senescence called SASP (senescence-associated secretory phenotype) results in pathological outcomes [13]. During the past several decades, many critical results and scientific research data in the field of apoptosis have been obtained at the level of dying cells [6,9,14]. Currently, the removal of cell corpses after apoptosis in vivo is a major focus issue in this field [6].

Apoptotic cells arise under a variety of pathophysiological conditions, such as tissue remodeling during normal development, aging of cells, infection by viruses and bacteria, and damage by wounding [9]. Remarkably, the cell turnover rate in the human body is known to be approximately 1 million cells per second (>109 per day) to maintain normal cellular and tissue homeostasis [15,16]. Although this indicates significant cell death per day, apoptotic cells are hardly detected in the body [15,16]. This implies that cell corpses are rapidly removed through a highly efficient mechanism for the clearance of apoptotic cells [15].

Professional phagocytes (macrophages, neutrophils, and immature dendritic cells) or non-professional (neighbor) phagocytes (fibroblasts, endothelial cells, and epithelial cells) have been implicated in apoptotic cell clearance with similar steps but different engulfment kinetics and capacity [6,17]. The main consequences of apoptotic cell clearance are “immunological silencing” through the physical removal of dying cells and “anti-inflammation” signals via the release of anti-inflammatory cytokines (transforming growth factor (TGF)-β and interleukin (IL)-10) in phagocytes [6,14,18]. Efficient and prompt removal of dying cells is very important for preventing apoptotic cells from undergoing secondary necrosis, which leads to the release of intracellular components via the disintegration of the plasma membrane [6,14,18]. The intracellular contents thus released may be toxic to neighboring cells and serve as immunogenic materials to induce strong inflammation [6,15,19]. Therefore, failure of apoptotic cell clearance can cause autoimmune diseases (autoimmunity, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis) and immune-related disorders (chronic obstructive pulmonary disease, asthma, atherosclerosis, and cancer) [6,14,17,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29]. Recent findings indicate that apoptotic cell clearance and dying cells themselves have unique roles in cellular differentiation and organ development, in addition to functioning as immunosuppressors [6]. Therefore, in this review, we focus on the current understanding of the special functions of apoptotic cell clearance under physiological conditions, as well as the mechanism of clearance of dying cells.

1. 사멸 세포 제거의 개요

세포 사멸에는

아포토시스, 피로토시스, 네크로토시스, 페로토시스, NETosis 등 다양한 유형이 있습니다.

피로토시스에서는

병리적 자극과 염증성 카스파제가 세포막에 구멍을 형성합니다 [1].

네크로토시스는

아포토시스와 괴사의 특징을 모두 갖춘 프로그램된 염증성 세포 사멸입니다 [2].

페로토시스는

세포 내 산화적 교란에 반응하여 발생하는

철 의존성 프로그램된 세포 사멸입니다 [3].

네토시스는

중성구 세포 외 트랩 (NETs) 형성과 함께 발생하는

조절성 중성구 세포 사멸입니다 [4].

이러한 세포 사멸 유형은

분자 수준에서 다양한 경로에 의해 정의되기 때문에

“규제된 세포 사멸”로도 불립니다 [5].

regulated cell death’’

본 리뷰에서는

아포토시스 세포 사멸과 아포토시스 세포 제거에 초점을 맞췄습니다.

아포토시스(apoptosis)는

다세포 생물의 정상적인 발달과 조직 항상성을 조절하는

“프로그램된 세포 사멸”로 알려져 있습니다 [6,7,8].

아포토시스의 조절 장애는

암과 신경퇴행성 질환을 포함한 다양한 병리적 질환을 유발하는 것으로 알려져 있습니다 [9,10,11].

또한

세포 노화는

아포토시스 저항성을 보이는 불가역적인 세포 주기 정지 상태로,

최근 연구에서 노화와 노화 관련 질환과 함께 증가하는 것으로 밝혀졌습니다 [12].

세포 노화의 한 형태인

SASP(노화 관련 분비 현상)는

병리학적 결과를 초래합니다[13].

지난 수십 년간 아포토시스 분야에서는

죽어가는 세포 수준에서 많은 중요한 결과와 과학적 연구 데이터가 얻어졌습니다[6,9,14].

현재,

아포토시스 후 체내에서 세포 잔여물을 제거하는 것은

이 분야의 주요 연구 과제입니다[6].

세포 사멸은

정상적인 발달 과정에서의

조직 재모델링, 세포 노화, 바이러스 및 세균 감염, 상처로 인한 손상 등

다양한 병리생리학적 조건 하에서 발생합니다 [9].

놀랍게도,

인체 내 세포 회전율은

정상적인 세포 및 조직 항상성을 유지하기 위해

초당 약 100만 개(하루 10⁹ 이상)로 알려져 있습니다[15,16].

이는 하루에 상당한 양의 세포 사멸이 발생함을 의미하지만,

아포토시스 세포는 신체에서 거의 검출되지 않습니다[15,16].

이는 아포토시스 세포 제거를 위한

고도로 효율적인 메커니즘을 통해

세포 잔여물이 신속히 제거됨을 시사합니다[15].

전문적 식세포(대식세포, 중성구, 미성숙 ден드리틱 세포) 또는

비전문적(인접) 식세포(섬유모세포, 내피세포, 상피세포)는 유사한 단계이지만

다른 포식 동역학 및 용량을 통해 아포토시스 세포 제거에 관여하는 것으로 알려져 있습니다 [6,17].

세포 사멸 세포 제거의 주요 결과는

죽어가는 세포의 물리적 제거를 통한

“면역 억제”와 식세포에서 방출되는 항염증 사이토킨(변형 성장 인자(TGF)-β 및 인터루킨(IL)-10)을 통한

“항염증 신호”입니다 [6,14,18].

사멸하는 세포의 효율적이고 신속한 제거는

세포막의 분해로 인해 세포 내 성분이 방출되는

2차 괴사를 방지하는 데 매우 중요합니다 [6,14,18].

이렇게 방출된 세포 내 성분은

주변 세포에 독성 영향을 미치거나 강한 염증을 유발하는

면역원성 물질로 작용할 수 있습니다 [6,15,19].

따라서, 사멸 세포의 제거 실패는

자가면역 질환(자가면역, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염) 및

면역 관련 장애(만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 동맥경화증, 암)를 유발할 수 있습니다.

Therefore, failure of apoptotic cell clearance can cause autoimmune diseases (autoimmunity, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis) and immune-related disorders (chronic obstructive pulmonary disease, asthma, atherosclerosis, and cancer) [6,14,17,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29].

최근 연구 결과는

아포토시스 세포 제거와 죽어가는 세포 자체가 면역 억제제로 기능하는 것 외에도

세포 분화 및 장기 발달에 독특한 역할을 한다는 것을 보여줍니다 [6].

따라서

본 리뷰에서는 생리적 조건 하에서 아포토시스 세포 제거의 특수 기능에 대한

현재 이해와 죽어가는 세포의 제거 메커니즘에 초점을 맞춥니다.

2. Mechanisms of Apoptotic Cell Clearance

Phagocytic processes to remove apoptotic cells can be categorized into four different levels (Figure 1): (a) the “find me” stage, wherein apoptotic cells release chemoattractants to recruit phagocytes; (b) the “eat me” stage, wherein phagocytes recognize “eat me” signals exposed on the surface of apoptotic cells; (c) the “engulfment/internalization” stage, wherein apoptotic corpses are internalized through cytoskeletal rearrangement of phagocytes; and (d) the “digestion and post-engulfment” stage, wherein internalized apoptotic cells are degraded through phagolysosomal processing in phagocytes, and phagocytes secrete anti-inflammatory cytokines [18,28,30].

2. 사멸 세포 제거의 메커니즘

사멸 세포를 제거하는 식작용 과정은

네 가지 단계로 분류될 수 있습니다(그림 1):

(a) “찾아라” 단계에서 사멸 세포는 식작용 세포를 유인하기 위해 화학유인물을 방출합니다;

(b) “먹어라” 단계에서 식작용 세포는 사멸 세포 표면에 노출된 ‘먹어라’ 신호를 인식합니다;

(c) “포식/내부화” 단계에서 식세포의 세포골격 재편성을 통해 아포토시스 시체가 내부화됩니다; 및

(d) “소화 및 포식 후” 단계에서 내부화된 아포토시스 세포는 식세포 내의 식세포소체 처리 과정을 통해 분해되며, 식세포는 항염증성 사이토카인을 분비합니다 [18,28,30].

Figure 1. Sequential steps for apoptotic cell clearance.

(a) The “find me” stage: apoptotic cells secrete “find me” signals (ATP/UTP, lysophosphatidylcholine (LPC), sphingosine-1-phosphate (S1P), and fractalkine (FKN/CX3CL1)) that can bind to receptors (P2Y2, G2A, S1P receptors, and CX3CR1) of phagocytes to induce chemotactic migration toward them.

(b) The “eat me” stage: apoptotic cells expose “eat me” signals (phosphatidylserine (PS), intercellular adhesion molecule 3 (ICAM3), serum proteins (complement component 1q (C1q) and thrombospondin), intracellular proteins (calreticulin and annexin I), and oxidized low-density lipoprotein (LDL)) on their surface. Phagocytes recognize specific “eat me” signals with their receptors (phosphatidylserine (PS)/PS receptors (brain-specific angiogenesis inhibitor (BAI)-1, T cell immunoglobulin and mucin (TIM) family (TIM-1, 3, 4), and stabilin-2) or PS/soluble PS bridge molecules (milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) and growth arrest-specific 6 (Gas6)); these bridge molecules simultaneously bind to their receptors (integrin αvβ3/5 and Tyro3-Axl-Mer tyrosine kinase (MerTK) family of receptors (TAM receptors), respectively) on phagocytes, and to calreticulin- LDL receptor–related protein-1 (LRP1)/CD91, C1q-LRP1/CD91, thrombospondin-CD36 (with integrin αvβ3/5), ICAM3-CD14, and oxidized LDL-scavenger receptors. (c) The “engulfment/internalization” stage: recognition of “eat me” signals by phagocytic receptors induces cytoskeletal changes to engulf dying cells. There are two major pathways to activate Rac, which mediates the internalization of cell corpses (αvβ3/5, TAM receptor, or BAI1 →CrkII-Dock180-ELMO → Rac, and LRP1/CD91 or stabilin-2 → GULP → Rac). (d) The “digestion and post-engulfment” stage: after internalizing dying cells, phagocytes degrade engulfed cells via a phagolysosomal pathway involving dynamin, Vps34, Rab5, Mon1a, Ccz1, and Rab7, and release anti-inflammatory cytokines (transforming growth factor (TGF)-β and interleukin (IL)-10) to perform the “immunological silencing” function.

그림 1. 세포 사멸에 따른 세포 제거의 순차적 단계.

(a) “찾아라” 단계: 세포 사멸 세포는 “찾아라” 신호(ATP/UTP, 리소포스파티딜콜린 (LPC), 스핑고신-1-인산 (S1P), 프랙탈킨 (FKN/CX3CL1))를 분비하여 식세포의 수용체(P2Y2, G2A, S1P 수용체, CX3CR1)에 결합하여 그 방향으로 화학유인성 이동을 유도합니다.

(b) “먹어라” 단계: 아포토시스 세포는 표면에 “먹어라” 신호(포스파티딜세린(PS), 세포간 접착 분자 3(ICAM3), 혈청 단백질(보체 성분 1q(C1q) 및 트롬보스폰딘), 세포 내 단백질(칼레티쿨린 및 안네신 I), 산화된 저밀도 지단백질(LDL))를 노출시킵니다. 파고사이트는 수용체(포스파티딜세린(PS)/PS 수용체(뇌 특이적 혈관新生 억제제(BAI)-1, T 세포 면역글로불린 및 뮤신(TIM) 가족(TIM-1, 3, 4), 및 스태빌린-2) 또는 PS/용해성 PS 브리지 분자(우유 지방 글로불-EGF 인자 8(MFG-E8) 및 성장 억제 특이적 6(Gas6)); 이 브리지 분자들은 동시에 그들의 수용체(인테그린 αvβ3/5 및 티로신 키나제 MerTK 가족(TAM 수용체))에 결합합니다. 에 결합하며, 칼레티쿨린-LDL 수용체 관련 단백질-1 (LRP1)/CD91, C1q-LRP1/CD91, 트롬보스폰딘-CD36 (integrin αvβ3/5와 함께), ICAM3-CD14, 및 산화 LDL-스캐버저 수용체에 결합합니다.

(c) “포식/내화” 단계: 식세포 수용체에 의해 “먹어라” 신호가 인식되면 세포 골격 변화가 발생하여 죽은 세포를 포식합니다. Rac 활성화를 위한 두 가지 주요 경로가 있으며, 이는 세포 잔여물의 내화를 매개합니다 (αvβ3/5, TAM 수용체 또는 BAI1 → CrkII-Dock180-ELMO → Rac, 및 LRP1/CD91 또는 stabilin-2 → GULP → Rac).

(d) “소화 및 포식 후” 단계: 사멸한 세포를 내재화한 후, 식세포는 다이나민, Vps34, Rab5, Mon1a, Ccz1, Rab7이 관여하는 식세포소체 경로를 통해 포식된 세포를 분해하고, 항염증성 사이토킨(전환 성장 인자(TGF)-β 및 인터루킨(IL)-10)을 방출하여 “면역학적 침묵” 기능을 수행합니다.

At the “find me” stage, dying cells release “find me” signals such as nucleotides (ATP and UTP), lysophosphatidylcholine (LPC), sphingosine-1-phosphate (S1P), and fractalkine (CX3CL1). These molecules bind to their specific receptors (P2Y2, G2A, S1P receptors, and CX3CR1) on the phagocyte surface and induce the migration of phagocytes toward apoptotic cells [6,15,31]. Recently, it has been reported that traditional chemokines such as IL-8 and monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) released by Fas/ cluster of differentiation (CD) 95-induced apoptotic cells can act as “find me” signals to promote the migration of phagocytes toward dying cells [32].

Phagocytes recognize the “eat me” signals on the surface of apoptotic cells to distinguish dying cells from normal cells in the vicinity [14,33]. These “eat me” signals are considered as markers of apoptotic cells [14,33,34,35]. They include exposure of phosphatidylserine (PS) on the outer leaflet of the plasma membrane, glycosylation of cell surface proteins, changes in cell surface charge, accumulation of serum proteins (complement component 1q (C1q) and thrombospondin), expression‎ of intercellular adhesion molecule 3 (ICAM3), and exposure of intracellular proteins (calreticulin and annexin I) [14]. The most well-studied “eat me” signal is the exposure of PS [36,37]. In living cells, PS exclusively resides on the inner leaflet of the plasma membrane due to the action of ATP-dependent translocases in maintaining PS asymmetry [38]. When cells undergo apoptosis, dying cells show a dramatic exposure of PS on the outer leaflet of the plasma membrane [18]. Several studies have identified the molecules involved in PS exposure during apoptosis. Recently, Nagata et al. reported that transmembrane protein 16F (TMEM16F), a Ca2+-dependent phospholipid scramblase, is a key component for PS exposure on the surface of live cells (Ba/F3 cells) [39]. However, TMEM16F-dependent PS exposure on the surface of live cells did not cause engulfment by macrophages. Furthermore, they also identified the Xk-family protein (Xkr8) that mediates PS exposure on the apoptotic cell surface and promotes the removal of cell corpses [40]. Most recently, they identified that, in addition to scramblases (TMEM16F and Xkr8), adenosine triphosphatase type 11C (ATP11C) and cell division cycle protein 50A (CDC50A) are phospholipid flippases that can translocate PS from the outer membrane to the inner membrane, and these flippases are required for the localization of PS on the outer membrane of apoptotic cells [41,42]. The PS exposed on the apoptotic cell surface can be recognized by PS receptors (brain-specific angiogenesis inhibitor (BAI)-1, T cell immunoglobulin and mucin (TIM) family (TIM-1, 3, 4), and stabilin-2) or soluble PS bridge molecules (milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) and growth arrest-specific 6 (Gas6)) [6,15]. PS receptors on the surface of phagocytes can directly interact with PS on the apoptotic cell surface [6,33]. MFG-E8 and Gas6 bind to PS on the surface of apoptotic cells and simultaneously interact with their specific receptors (integrin αvβ3/5 and Tyro3-Axl-Mer tyrosine kinase (MerTK) family of receptors (TAM receptors), respectively) on phagocytes [30,33]. In addition to PS and PS receptors, many molecules are known to be “eat me” signals, and their receptors include calreticulin-low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1/CD91), C1q-LRP1/CD91, thrombospondin-CD36 (with integrin αvβ3/5), ICAM3-CD14, and oxidized low density lipoprotein (LDL)-scavenger receptors [18]. Furthermore, it has recently been suggested that several new members can serve as “eat me” signals or engulfment receptors. For example, Galectin-3 (Gal-3), an “eat me” signal, has been identified as a ligand for Mer, an engulfment receptor [43]. In addition, the transthyretin-like protein 52 (TTR-52) in Caenorhabditis elegans is known to be secreted into the extracellular region and function as a PS-binding molecule to mediate phagocytosis of apoptotic cells by the cell death abnormality protein 1 (CED-1) engulfment receptor [35]. Moreover, it has been reported that “triggering receptor expressed on myeloid cells (TREM)”-like protein 2 (TREML2/TLT2) can act as a phagocytic receptor to engulf apoptotic cells [44]. Furthermore, the receptor for advanced glycation end products, a new PS receptor, has been reported to bind to PS on the surface of dying cells and mediate the clearance of apoptotic cells [45]. Most recently, death domain 1α, a target gene of p53, was shown to play dual roles as an engulfment ligand or receptor that can mediate the engulfment of apoptotic cells through homophilic interaction [46]. Although a variety of “eat me” signals and engulfment receptors have been identified, further detailed characterizations including signaling mechanisms and in vivo relevance are still required to elucidate their functions.

“찾아라” 단계에서 죽어가는 세포는

ATP와 UTP와 같은 뉴클레오티드, 리소포스파티딜콜린(LPC), 스핑고신-1-인산(S1P), 프랙탈킨(CX3CL1)과 같은

“찾아라” 신호를 방출합니다.

이 분자들은 식세포 표면의 특정 수용체(P2Y2, G2A, S1P 수용체 및 CX3CR1)에 결합하여 식세포가 사멸 세포 방향으로 이동하도록 유도합니다 [6,15,31]. 최근 연구에서 Fas/분화군(CD) 95에 의해 유도된 사멸 세포에서 방출되는 전통적인 케모카인인 IL-8 및 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1)이 “찾아와라” 신호로 작용하여 파고사이트의 사멸 세포로의 이동을 촉진한다는 보고가 있었습니다 [32].

파고사이트는

주변의 정상 세포와 죽어가는 세포를 구분하기 위해

아포토시스 세포 표면의 “먹어라” 신호를 인식합니다 [14,33].

이러한

“먹어라” 신호는

아포토시스 세포의 표지자로 간주됩니다 [14,33,34,35].

이에는 세포막의 외막에 포스파티딜세린(PS) 노출,

세포 표면 단백질의 글리코실화,

세포 표면 전하 변화,

혈청 단백질(보체 성분 1q(C1q) 및 트롬보스폰딘) 축적,

세포 간 접착 분자 3(ICAM3) 발현,

세포 내 단백질(칼레티쿨린 및 안네신 I) 노출 등이 포함됩니다 [14].

가장 잘 연구된

“먹어라” 신호는 PS의 노출입니다 [36,37].

살아있는 세포에서 PS는

ATP 의존성 트랜스록레이스의 작용으로 인해

세포막의 내막에 독점적으로 존재합니다 [38].

세포가 아포토시스 과정을 거칠 때, 죽어가는 세포는

세포막의 외막에 PS가 극적으로 노출됩니다 [18].

여러 연구에서 아포토시스 동안 PS 노출에 관여하는 분자들이 식별되었습니다.

최근 Nagata 등[39]은

Ca2+-의존성 인산지질 스크램블레이즈인 막을 관통하는

단백질 16F(TMEM16F)가 살아있는 세포(Ba/F3 세포) 표면에서의

PS 노출에 핵심 구성 요소임을 보고했습니다.

그러나

TMEM16F에 의존한 살아있는 세포 표면의 PS 노출은

대식세포에 의한 포식 현상을 유발하지 않았습니다.

또한 그들은 아포토시스 세포 표면에서의 PS 노출을 매개하고 세포 잔여물의 제거를 촉진하는 Xk 가족 단백질(Xkr8)을 식별했습니다 [40]. 최근에는 스크램블레이스(TMEM16F와 Xkr8) 외에도 아데노신 삼인산 분해효소 유형 11C (ATP11C)와 세포 분열 주기 단백질 50A (CDC50A)가 인산지질 플리파아제로서 PS를 외막에서 내막으로 이동시킬 수 있으며, 이러한 플리파아제는 사멸 세포의 외막에 PS가 국소화되는 데 필수적이라는 것을 밝혀냈습니다 [41,42]. 세포사멸 세포 표면에 노출된 PS는 PS 수용체(뇌 특이적 혈관新生 억제제(BAI)-1, T 세포 면역글로불린 및 뮤신(TIM) 가족(TIM-1, 3, 4), 및 안정인-2) 또는 용해성 PS 브리지 분자(유지방 글로불린-EGF 인자 8(MFG-E8) 및 성장 억제 특이적 6(Gas6))에 의해 인식될 수 있습니다 [6,15]. 식세포 표면의 PS 수용체는 사멸 세포 표면의 PS와 직접 상호작용할 수 있습니다 [6,33]. MFG-E8과 Gas6은 사멸 세포 표면의 PS에 결합하며 동시에 식세포의 특정 수용체(integrin αvβ3/5와 Tyro3-Axl-Mer 티로신 키나제(MerTK) 수용체 가족(TAM 수용체) 각각)와 동시에 상호작용합니다 [30,33]. PS와 PS 수용체 외에도 많은 분자들이 “먹어라” 신호로 알려져 있으며, 그 수용체에는 칼레티쿨린-저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 1(LRP1/CD91), C1q-LRP1/CD91, 트롬보스폰딘-CD36(integrin αvβ3/5와 함께), ICAM3-CD14, 산화 저밀도 지단백질(LDL)-스캐버저 수용체 등이 포함됩니다 [18]. 또한 최근 몇 가지 새로운 구성원이 ‘먹어라’ 신호나 포식 수용체로 기능할 수 있다는 제안이 제기되었습니다. 예를 들어, ‘먹어라’ 신호인 갈레틴-3(Gal-3)은 포식 수용체인 Mer의 리간드로 식별되었습니다 [43]. 또한, Caenorhabditis elegans의 트랜스티레틴 유사 단백질 52(TTR-52)는 세포 외 공간으로 분비되어 세포 사멸 이상 단백질 1(CED-1) 포식 수용체를 통해 사멸 세포의 포식을 매개하는 PS 결합 분자로 알려져 있습니다 [35]. 또한, 골수 세포에 발현되는 트리거링 수용체(TREM)-유사 단백질 2(TREML2/TLT2)가 사멸 세포를 포식하는 포식 수용체로 작용할 수 있다는 보고가 있습니다[44]. 또한, 고급 당화 최종 생성물(AGEs) 수용체는 새로운 PS 수용체로, 사멸 세포 표면의 PS에 결합하여 사멸 세포의 제거를 매개한다는 보고가 있습니다[45]. 최근에는 p53의 표적 유전자인 death domain 1α가 동형 상호작용을 통해 사멸 세포의 포식을 매개하는 포식 리간드 또는 수용체로서의 이중 역할을 수행한다는 것이 밝혀졌습니다 [46]. 다양한 “eat me” 신호와 포식 수용체가 식별되었지만, 신호 전달 메커니즘과 생체 내 관련성을 포함한 추가적인 상세한 특성화가 필요하며, 이는 그들의 기능을 규명하는 데 필수적입니다.

Engagement of phagocytic receptors by “eat me” signals induces cytoskeletal reorganization to mediate the engulfment of apoptotic cells. It is known that the small GTPase Rac, a key mediator of actin-cytoskeletal dynamics, can be activated through two major signaling pathways for the internalization of cell corpses. Firstly, integrin αvβ3/5, TAM receptor, and BAI1 can activate Rac to induce engulfment using the CrkII-Dock180-ELMO pathway [47,48,49]. Secondly, LRP1/CD91 and stabilin-2 can stimulate Rac activation through GULP [50,51,52]. The downstream signaling mediator of TIM-4 has not been identified. Moreover, TIM-4 has been suggested to be a “tethering receptor” that cannot mediate direct downstream signaling for the engulfment of apoptotic cells [53,54]. Recently, other signaling pathways in addition to the two main engulfment pathways have been suggested as independent pathways. ABL-1 and ABI-1 have been reported to be involved in engulfment via a pathway independent from the CrkII-Dock180-ELMO and GULP pathways [55]. It is also known that G-protein-coupled receptor kinase 6 (GRK6) and GRK-interacting ADP ribosylation factor GTPase-activating protein 1 (GIT1) can cooperatively activate Rac, which induces the engulfment of dying cells through a pathway that is distinct from the two main pathways [56]. These examples show that extensive investigations to identify and establish new signaling pathways are required to broaden the understanding of engulfment processes.

After internalization, engulfed corpses are further processed through the phagolysosomal pathway and digested into amino acids, nucleotides, and phospholipids. The sequential steps of phagosome maturation have common endocytic machinery as well as unique molecules, including dynamin, Vps34, Rab5, Mon1a, Ccz1, and Rab7 [57]. In addition to physical removal to prevent apoptotic cells from undergoing secondary necrosis, which leads to inflammatory responses, phagocytes can release anti-inflammatory cytokines (TGF-β and IL-10) as one of the main consequences of apoptotic cell clearance to achieve “immunological silencing” [6,30,34,58]. Four different stages of apoptotic cell clearance are highly regulated to achieve efficient and prompt clearance of such cells, and these can also be closely linked to one another. In particular, it has been suggested that the “find me” signal from dying cells can upregulate the engulfment receptors and/or engulfment-related machinery in phagocytes, as well as induce the recruitment of phagocytes [31]. In addition, sequential downstream events after engulfment have been known to affect the engulfment of apoptotic cells by phagocytes. For example, knockout (KO) studies of liver-X receptor (LXR) αβ and peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) γ/δ, which are the major players in lipid metabolism, have shown impaired apoptotic cell clearance [59,60,61]. The engulfment of apoptotic cells activates PPARs and LXR. These transcription factors then upregulate phagocytic receptors (MerTK and CD36) and opsonins (C1qb and MFG-E8) in phagocytes [62]. Moreover, Park et al. reported that uncoupling protein (UCP2) knockdown in phagocytes induced uncoupling between energy generation and nutrient digestion of apoptotic corpses in phagocytes, which led to the reduction of continued engulfment of apoptotic cells by phagocytes [63]. As a proton transporter, UCP2 induces the loss of the proton gradient across the inner mitochondrial membrane, eventually leading to a reduction in mitochondrial membrane potential without ATP generation. Therefore, through controlling the engulfment capacity of phagocytes, UCP2 regulation of mitochondrial membrane potential affects continued clearance. Therefore, crosstalk and internetworking among each stage is possible. However, ideas and experiments to prove these notions remain challenging.

“eat me” 신호에 의한 식작용 수용체의 활성화는 세포 소체 재편성을 유도하여 사멸 세포의 식작용을 매개합니다. 액틴-세포 골격 동역학의 핵심 매개체인 소형 GTPase Rac은 세포 잔여물의 내재화를 위해 두 가지 주요 신호 전달 경로를 통해 활성화될 수 있습니다. 첫째, integrin αvβ3/5, TAM 수용체, 및 BAI1은 CrkII-Dock180-ELMO 경로를 통해 Rac을 활성화하여 포식을 유도합니다 [47,48,49]. 둘째, LRP1/CD91 및 stabilin-2는 GULP를 통해 Rac 활성화를 자극합니다 [50,51,52]. TIM-4의 하류 신호 전달 매개체는 아직 식별되지 않았습니다. 또한 TIM-4는 사멸 세포의 포식을 직접적으로 매개하지 않는 '고정 수용체'로 제안되었습니다 [53,54]. 최근에는 두 주요 포식 경로 외에도 독립적인 경로로 제안된 다른 신호전달 경로들이 보고되었습니다. ABL-1과 ABI-1은 CrkII-Dock180-ELMO 및 GULP 경로와 독립적인 경로를 통해 포식에 관여한다는 보고가 있습니다 [55]. 또한 G-단백질 결합 수용체 키나제 6(GRK6)와 GRK 상호작용 ADP 리보실화 인자 GTPase 활성화 단백질 1(GIT1)이 Rac을 협동적으로 활성화하여 두 주요 경로와 다른 경로를 통해 사멸하는 세포의 포식을 유도한다는 것이 알려져 있습니다 [56]. 이 예시들은 포식 과정에 대한 이해를 넓히기 위해 새로운 신호전달 경로를 식별하고 확립하기 위한 광범위한 연구가 필요함을 보여줍니다.

내포 후, 포식된 시체는 파고리소좀 경로를 통해 추가로 처리되어 아미노산, 뉴클레오티드, 인산지질로 분해됩니다. 파고소체 성숙의 순차적 단계는 공통된 내포체 기계장치와 함께 다이나민, Vps34, Rab5, Mon1a, Ccz1, Rab7 등 독특한 분자들을 포함합니다 [57]. 세포 사멸 세포가 2차 괴사로 이어져 염증 반응을 유발하는 것을 방지하기 위한 물리적 제거 외에도, 식세포는 세포 사멸 세포 제거의 주요 결과 중 하나로 항염증성 사이토킨(TGF-β 및 IL-10)을 방출하여 “면역학적 침묵”을 달성합니다 [6,30,34,58]. 사멸 세포의 효율적이고 신속한 제거를 위해 네 가지 다른 단계가 엄격히 조절되며, 이 단계들은 서로 밀접하게 연관되어 있습니다. 특히, 사멸하는 세포에서 발생하는 “찾아라” 신호가 식세포의 포식 수용체 및/또는 포식 관련 기구를 활성화시키고 식세포의 모집을 유도할 수 있다는 제안이 있습니다 [31]. 또한, 포식 후의 연속적인 하류 사건이 파고사이트에 의한 아포토시스 세포의 포식에 영향을 미친다는 것이 알려져 있습니다. 예를 들어, 지방 대사에서 주요 역할을 하는 간-X 수용체 (LXR) αβ와 과산화체 증식 활성화 수용체 (PPAR) γ/δ의 노크아웃 (KO) 연구는 아포토시스 세포 제거 장애를 보여주었습니다 [59,60,61]. 사멸 세포의 포식은 PPARs와 LXR을 활성화합니다. 이 전사 인자들은 이후 식세포의 식세포 수용체(MerTK 및 CD36)와 오포신(C1qb 및 MFG-E8)을 상향 조절합니다 [62]. 또한 Park 등[63]은 식세포에서 UCP2 발현을 억제하면 식세포 내 사멸 세포의 에너지 생성 및 영양소 소화 사이의 연결이 끊어져 식세포의 지속적인 사멸 세포 포식이 감소한다고 보고했습니다. 프로톤 운반체인 UCP2는 내막 프로톤 그라디언트를 감소시켜 ATP 생성 없이 미토콘드리아 막 전위를 감소시킵니다. 따라서, 식세포의 포식 능력을 조절함으로써 UCP2는 미토콘드리아 막 전위를 조절하여 지속적인 제거에 영향을 미칩니다. 따라서 각 단계 간의 교차 작용과 상호 연결이 가능할 수 있습니다. 그러나 이러한 개념을 증명하기 위한 아이디어와 실험은 여전히 도전적입니다.

3. 사멸 세포의 제거와 분화

위에서 언급된 바와 같이, 죽어가는 세포의 제거는 면역학적 침묵 현상뿐만 아니라 세포 분화 및 장기 발달과 같은 다른 특수 기능도 매개할 수 있습니다. 이 섹션에서는 아포토시스 세포가 면역 세포, 신경 세포, 근육 세포의 분화에 미치는 영향을 논의합니다 (그림 2).

3. Apoptotic Cell Clearance and Differentiation

As mentioned above, clearance of dying cells can mediate not only immunologically silent events but also other special functions, including cellular differentiation and organ development. In this section, we discuss the effects of apoptotic cells on the differentiation of immune cells, neural cells, and muscle cells (Figure 2).

Figure 2. Roles of apoptotic cells in cellular differentiation. (a) M1-type macrophages that secrete inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23, and tumor necrosis factor (TNF)-α), reactive oxygen species (ROS), and nitric oxide (NO) act as key immune effectors against intracellular microbes and clear affected apoptotic cells. After engulfing apoptotic cells, M1-type macrophages exhibit properties of M2-type macrophages (expression‎ of arginase-1 and 12/15-lipoxygenases, and anti-inflammatory response (high IL-10 and TGF-β levels) involved in wound healing, tissue repair, and resolving of inflammation). (b) Engulfment of apoptotic blebs by immature dendritic cells can induce maturation of dendritic cells (increase in levels of co-stimulatory molecules CD40 and CD86) to activate T cells. Moreover, clearance of apoptotic cells by immature dendritic cells can block lipopolysaccharide (LPS)-induced maturation of dendritic cells. (c) Activation of complement receptors (C3a receptor (C3aR) and C5a receptor (C5aR)) on neuronal progenitor cells induces their differentiation and maturation in the central nervous system (CNS). Synaptic pruning in the postnatal retinogeniculate system can be induced by engulfment of developing presynaptic elements through complement receptor 3 (CR3-the receptor of iC3b, ICAM1, and fibrinogen) on microglia. Furthermore, removal of apoptotic neuronal cells by neuronal progenitor cells is critical in adult neurogenesis. (d) PS on apoptotic myoblast cells can be recognized by BAI1 (PS receptor) on neighboring myoblasts. Eventually, this mediates multinucleated myotube generation through muscle fusion/differentiation.

그림 2. 세포 분화에서 사멸 세포의 역할.

(a) 염증성 사이토킨 (IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23 및 종양 괴사 인자 (TNF)-α), 활성 산소 종 (ROS) 및 질소 산화물 (NO)을 분비하는 M1형 대식세포는 세포 내 미생물에 대한 주요 면역 효과기로 작용하며 영향을 받은 사멸 세포를 제거합니다. 아포토시스 세포를 섭취한 후 M1형 대식세포는 M2형 대식세포의 특성을 나타내며(아르기나제-1 및 12/15-리포산화효소 발현, 염증 억제 반응(IL-10 및 TGF-β 수준 증가)을 통해 상처 치유, 조직 복구, 염증 해소 과정에 관여합니다.

(b) 미성숙 ден드리틱 세포에 의한 사멸성 블롭의 포식은 ден드리틱 세포의 성숙(공극 자극 분자 CD40 및 CD86의 수준 증가)을 유도하여 T 세포를 활성화합니다. 또한, 미성숙 ден드리틱 세포에 의한 사멸 세포의 제거는 리포폴리사카라이드(LPS)에 의한 ден드리틱 세포의 성숙을 차단합니다.

(c) 신경 전구 세포 표면의 보체 수용체(C3a 수용체(C3aR) 및 C5a 수용체(C5aR)) 활성화는 중추 신경계(CNS)에서 세포의 분화 및 성숙을 유도합니다. 출생 후 망막-시상체 시스템에서의 시냅스 정리는 미세아교세포 표면의 보체 수용체 3(CR3, iC3b, ICAM1, 피브리노겐의 수용체)를 통해 발달 중인 전시냅스 요소를 삼키는 것으로 유도될 수 있습니다. 또한, 신경 전구 세포에 의한 사멸한 신경 세포의 제거는 성인 신경 발생에 필수적입니다.

(d) 사멸한 근육 전구 세포의 PS는 인접한 근육 전구 세포의 BAI1(PS 수용체)에 의해 인식됩니다. 결국 이는 근육 융합/분화를 통해 다핵 근관 생성으로 이어집니다.

3.1. Differentiation of Immune Cells

M1 and M2 macrophages are differentiated from monocytes based on their exposure to mediators and environments [64,65]. Classically activated (M1) macrophages act as immune effectors against intracellular microbes and mediate the clearance of affected cells [64,65]. They release high levels of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23, and tumor necrosis factor (TNF)-α), reactive oxygen species (ROS), and nitric oxide (NO) [58,66,67,68]. However, alternatively activated (M2) macrophages secrete low levels of inflammatory cytokines and high levels of an anti-inflammatory cytokine (IL-10); they also express high levels of arginase-1 to interrupt NO generation and scavenger receptors [58,66,67,68,69,70]. M2 macrophages are known to mediate immune responses against extracellular parasites, wound healing, tissue repair, and resolving of inflammation [71,72,73,74]. Several reports suggest that after M1-type macrophages engulf apoptotic leukocytes, they exhibit features of M2-type macrophages, such as expression‎ of arginase-1 and 12/15-lipoxygenases, and anti-inflammatory responses (low IL-12 and high IL-10 expression‎) [67]. Recently, CD36 and platelet-activating factor (PAF) receptor, which are implicated in apoptotic cell clearance, have been reported to be required for the characteristics of M2-type macrophages [75]. In addition, they have been reported to have a high capacity for apoptotic cell clearance [58]. Furthermore, it has been suggested that after M2-type macrophages are saturated with respect to the ability of clearing dying cells, they can be further changed into new types of macrophages (referred to as resolution-promoting macrophages), which might have anti-fibrotic and immune regulatory functions [58]. There have been several recent reports on the effects of engulfment of apoptotic bodies/cells on the maturation of dendritic cells, a type of professional phagocytes [76,77,78]. Fransen et al. reported that engulfment of apoptotic blebs, but not apoptotic cell bodies, induced dendritic cell maturation (increase in levels of co-stimulatory molecules CD40 and CD86), and the matured dendritic cells activated T cells to induce Th1/Th17 responses that mediated the induction of interferon (IFN)-γ and IL-17 [77,78]. However, Stuart et al. reported that the ingestion of apoptotic cells by immature dendritic cells blocked lipopolysaccharide (LPS)-mediated upregulation of CD86 expression‎ in dendritic cells [76]. This result indicates that apoptotic cell clearance can mediate inhibitory effects on LPS-induced dendritic cell maturation. In the two studies mentioned above, apoptotic cell clearance played contradictory roles in dendritic cell maturation. However, each study used different apoptotic blebs/bodies/cells induced by different methods and cells. Therefore, the precise functions of apoptotic blebs, bodies, and cells in the maturation of dendritic cells need to be examined closely under well-defined conditions. Many studies have focused on the function of Mer tyrosine kinase (MerTK) as an engulfment receptor in apoptotic cell clearance. Research using knockout mice indicated that MerTK is implicated in T-cell-dependent B-cell differentiation, as its KO resulted reduced T-cell activation and B-cell differentiation [79]. However, the study did not clarify the exact mechanisms of MerTK action on T-cell activation and B-cell differentiation. Therefore, although the clearance of apoptotic cells can affect the differentiation of professional phagocytes (macrophages and dendritic cells), it is still unclear whether the engulfment of apoptotic cells is critical for the differentiation. Therefore, further studies are required to reveal whether apoptotic cell clearance is necessary and sufficient for the differentiation of these cells.

3.1. 면역 세포의 분화

M1 및 M2 대식세포는 매개체 및 환경에 노출되는 정도에 따라 단핵구에서 분화됩니다 [64,65]. 전통적으로 활성화된 (M1) 대식세포는 세포 내 미생물에 대한 면역 효과기로 작용하며 영향을 받은 세포의 제거를 매개합니다 [64,65]. 이들은 염증성 사이토킨(IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23 및 종양 괴사 인자(TNF)-α), 활성 산소 종(ROS), 및 질소 산화물(NO)을 고농도로 분비합니다 [58,66,67,68]. 반면, 대안적으로 활성화된(M2) 대식세포는 염증성 사이토카인을 낮은 수준으로 분비하고 항염증성 사이토카인(IL-10)을 높은 수준으로 분비하며, NO 생성을 차단하기 위해 아르기나제-1을 높은 수준으로 발현하고 scavenger 수용체를 표현합니다 [58,66,67,68,69,70]. M2 대식세포는 세포외 기생체에 대한 면역 반응, 상처 치유, 조직 복구, 염증 해소 등을 매개하는 것으로 알려져 있습니다 [71,72,73,74]. 여러 보고서에 따르면 M1형 대식세포가 사멸한 백혈구를 삼킨 후 M2형 대식세포의 특징을 나타내며, 이는 아르기나제-1과 12/15-리포산화효소의 발현 및 항염증 반응(낮은 IL-12와 높은 IL-10 발현)을 포함합니다 [67]. 최근에 세포 사멸 세포 제거와 관련된 CD36 및 혈소판 활성화 인자(PAF) 수용체가 M2형 대식세포의 특성에 필수적이라는 보고가 있었습니다 [75]. 또한 이들은 세포 사멸 세포 제거 능력도 높다는 보고가 있습니다 [58]. 또한, M2형 대식세포가 사멸하는 세포의 제거 능력에 포화 상태에 이르렀을 때, 이들은 새로운 유형의 대식세포(해결 촉진 대식세포라고 불림)로 추가 변환될 수 있으며, 이는 항섬유화 및 면역 조절 기능을 가질 수 있다는 제안이 제기되었습니다 [58]. 최근에는 전문 식세포인 ден드리틱 세포의 성숙에 대한 아포토시스 체/세포의 포식 효과에 대한 여러 보고가 있었습니다 [76,77,78]. Fransen 등[77,78]은 사멸 소포의 포식(사멸 세포체의 포식이 아닌)이 ден드리틱 세포의 성숙(공극 자극 분자 CD40 및 CD86의 수준 증가)을 유도하며, 성숙한 ден드리틱 세포는 T 세포를 활성화하여 인터페론(IFN)-γ 및 IL-17의 유도 를 매개하는 Th1/Th17 반응을 유발한다고 보고했습니다. 그러나 Stuart 등[76]은 미성숙 ден드리틱 세포가 사멸 세포를 섭취하는 것이 LPS에 의한 ден드리틱 세포의 CD86 발현 증가를 차단한다고 보고했습니다. 이 결과는 사멸 세포 제거가 LPS에 의한 ден드리틱 세포 성숙에 억제 효과를 매개할 수 있음을 시사합니다. 위에서 언급된 두 연구에서 사멸 세포의 제거는 ден드리틱 세포 성숙에 상반된 역할을 했습니다. 그러나 각 연구는 서로 다른 방법과 세포로 유도된 사멸 블롭/체/세포를 사용했습니다. 따라서 ден드리틱 세포 성숙에서 사멸 블롭, 체, 세포의 정확한 기능은 잘 정의된 조건 하에서 자세히 조사되어야 합니다. 많은 연구는 사멸 세포 제거에서의 Mer 티로신 키나제(MerTK)의 기능에 초점을 맞췄습니다. 노크아웃 마우스 연구는 MerTK가 T 세포 의존적 B 세포 분화에 관여함을 보여주었으며, 그 KO는 T 세포 활성화와 B 세포 분화가 감소했습니다 [79]. 그러나 이 연구는 MerTK가 T 세포 활성화와 B 세포 분화에 미치는 정확한 메커니즘을 명확히 하지 않았습니다. 따라서, 사멸 세포의 제거가 전문적 식세포(대식세포와 ден드리틱 세포)의 분화에 영향을 미칠 수 있지만, 사멸 세포의 포식이 이러한 분화에 필수적인지 여부는 여전히 명확하지 않습니다. 따라서, 이러한 세포의 분화에 사멸 세포 제거가 필요하고 충분한지 밝히기 위해 추가 연구가 필요합니다.

3.2. Neurogenesis

During neuronal development, many neuronal cells die, and the remaining surviving cells form neural circuits in the brain [80]. Complement proteins are known not only as mediators of immune responses via accumulation on the surface of apoptotic cells (“eat me” signal) but also as players with novel functions in tissue proliferation and regeneration [81]. In particular, it has been reported that complement factors (C3a and C5a) can mediate neurogenesis and synaptogenesis in the CNS and can directly act on neuronal progenitor cells to induce differentiation and maturation [82]. Furthermore, the engulfment of developing synapses using CR3 (the receptor of iC3b, ICAM1, and fibrinogen) on microglia has been recently reported to mediate synaptic pruning in the postnatal retinogeniculate system [82]. In addition, this report suggested that presynaptic elements engulfed by microglia were healthy and intact, but not apoptotic [82]. However, the functions of complement factors involved in neurogenesis and synaptogenesis remain elusive. Recently, engulfment of apoptotic cells through autophagy has been shown to be involved in the early stages of retinal development to develop the retinal neuroepithelium and inner ear development to remove neuroepithelial dying cells [83,84]. In addition, during the development of dorsal root ganglia (DRG) neurons, glial precursors play a key role in engulfment of apoptotic DRG neurons using Jedi-1 and multiple EGF like domains 10 (MEGF10) [85]. Furthermore, it has been reported that doublecortin (DCX)-positive neuronal progenitor cells can serve as phagocytes to engulf apoptotic neuronal cells in the adult brain, and their apoptotic cell clearance is critical to mediating adult neurogenesis [86]. Most recently, DCX-low human neural precursor cells and DCX-high neuroblasts have also been reported to be involved in apoptotic cell clearance via P2X7 during early neurogenesis [87]. Currently, there is not enough knowledge to fully explain the effects of cell clearance on neurogenesis, and there are many unanswered questions on the CNS, as follows: Which cells (neighbor cells or microglia/astrocytes) are involved in specific cell clearance in the CNS? Which “find me”, “eat me”, and phagocytic receptors contribute to engulfment activity for neurogenesis? Which mechanisms of cell clearance are important for neuronal development?

3.2. 신경 발생

신경 발달 과정에서 많은 신경 세포가 죽고, 생존한 세포는 뇌에서 신경 회로를 형성합니다 [80]. 보체 단백질은 사멸 세포 표면에 축적되어 면역 반응의 매개체로 작용하는 “먹어라” 신호로 알려져 있지만, 조직 증식 및 재생에 새로운 기능을 가진 요소로도 알려져 있습니다 [81]. 특히, 보체 인자(C3a 및 C5a)가 중추 신경계(CNS)에서 신경 발생과 시냅스 형성을 매개하며, 신경 전구 세포에 직접 작용하여 분화 및 성숙을 유도한다는 보고가 있습니다 [82]. 또한, 미세아교세포의 CR3(iC3b, ICAM1, 피브린겐의 수용체)를 통해 발달 중인 시냅스를 포식하는 것이 출생 후 망막-시상체 시스템에서 시냅스 정리를 매개한다는 보고가 최근에 발표되었습니다 [82]. 이 보고서는 미세아교세포에 의해 포식된 전신경 요소들이 건강하고 완전하며, 사멸 상태가 아니라는 점을 제시했습니다 [82]. 그러나 신경 발생 및 시냅스 형성에 관여하는 보체 인자의 기능은 아직 명확하지 않습니다. 최근, 자가포식을 통한 세포 사멸 세포의 포획이 망막 신경 상피를 발달시키고 내이 발달을 촉진하여 신경 상피의 죽은 세포를 제거하는 망막 발달의 초기 단계에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다 [83,84]. 또한, 등쪽 신경절(DRG) 신경세포의 발달 과정에서 글리아 전구체는 Jedi-1과 다중 EGF 유사 도메인 10(MEGF10)을 사용하여 사멸한 DRG 신경세포를 포식하는 데 핵심 역할을 합니다 [85]. 또한, 성인 뇌에서 DCX 양성 신경 전구 세포가 사멸한 신경 세포를 포식하는 역할을 하며, 이 사멸 세포 제거는 성인 신경 발생을 매개하는 데 필수적이라는 보고가 있습니다 [86]. 최근에는 DCX 저발현 인간 신경 전구 세포와 DCX 고발현 신경 블라스트가 초기 신경 발생 과정에서 P2X7을 통해 사멸 세포 제거에 관여한다는 보고가 있었습니다 [87]. 현재 신경 발생에 대한 세포 제거의 영향을 완전히 설명하기에는 지식 부족이 있으며, 중추 신경계(CNS)에 대한 많은 미해결 질문이 남아 있습니다: CNS에서 특정 세포 제거에 관여하는 세포는 어떤 세포(인접 세포 또는 미세아교세포/성상세포)인가? 신경 발생을 위한 포식 활동에 기여하는 “찾아라”, “먹어라” 및 포식 수용체는 무엇인가? 신경 발달에 중요한 세포 제거 메커니즘은 무엇인가?

3.3. Muscle Differentiation

In skeletal muscle, mononucleated myoblasts turn into multinucleated myotubes through cell fusion/differentiation, which is a critical process for muscle development, regeneration, and repair [88,89]. Differentiation includes many different processes such as migration, cell-to-cell contact, fusion, and growth [90,91]. It has been reported that transient PS exposure (“eat me” signal, a unique feature of apoptotic cells) was detected on mouse embryonic myotubes at E13, and that PS exposure on the muscle cell surface is required for the fusion of myoblasts (muscle progenitor cells) into myotubes [92]. Furthermore, several studies have reported that PS was reversibly exposed on activated mast cell membranes after antigenic stimuli [93,94], although this exposure was not related to apoptosis. In addition, clusters of PS exposure are known to be localized in cell-to cell contact [95]. There are contradictory results regarding whether PS exposure and muscle fusion are dependent on the apoptosis of myoblasts [92]. Van den Eijnde et al. reported that PS exposure and muscle fusion cannot be inhibited by a pan-caspase inhibitor, whereas Fernando et al. found that caspase-3 activity for apoptosis is critical for myotube formation and induction of muscle-specific proteins [92,96]. Recently, Hochreiter-Hufford et al. reported that apoptosis through a pan-caspase inhibitor, zVAD, is required for PS exposure and muscle fusion, and that apoptotic cells themselves can work as novel players to induce muscle fusion/differentiation [97]. Furthermore, BAI1, a PS receptor, has been shown to be a key mediator for recognizing apoptotic cells and mediating myotube generation. This observation has generated a novel concept that apoptotic cells can not only be removed quickly but can also contribute to specific functions such as differentiation [97]. Most recently, BAI3, a member of the BAI family, has also been implicated in the myoblast fusion process [98]. However, the following question remains: How does the PS-BAI1 (BAI3) axis mediate the fusion processes of healthy myoblasts without engulfment of apoptotic cells?

3.3. 근육 분화

골격근에서 단핵성 근모세포는 세포 융합/분화를 통해 다핵성 근관으로 변환되며, 이는 근육 발달, 재생, 및 수리에 필수적인 과정입니다 [88,89]. 분화는 이동, 세포 간 접촉, 융합, 성장 등 다양한 과정을 포함합니다 [90,91]. 마우스 배아 근관세포(E13)에서 일시적인 PS 노출(“먹어라” 신호, 사멸 세포의 독특한 특징)이 관찰되었으며, 근육 세포 표면의 PS 노출이 근모세포(근육 전구세포)가 근관세포로 융합되는 데 필수적이라는 보고가 있습니다[92]. 또한 여러 연구에서 항원 자극 후 활성화된 비만 세포막에서 PS가 가역적으로 노출되었다고 보고되었으나 [93,94], 이 노출은 아포토시스와 관련이 없었습니다. 또한 세포 간 접촉 부위에 PS 노출 클러스터가 국소화되어 있다는 것이 알려져 있습니다 [95]. 근모세포의 아포토시스와 PS 노출 및 근육 융합 간의 의존성에 대해 상반된 결과가 존재합니다 [92]. Van den Eijnde 등[92]은 PS 노출과 근육 융합이 판-카스파제 억제제에 의해 억제되지 않는다고 보고했으나, Fernando 등[96]은 아포토시스 관련 카스파제-3 활성이 근관 형성 및 근육 특이적 단백질 유도에서 결정적 역할을 한다고 발견했습니다. 최근 Hochreiter-Hufford 등[97]은 pan-caspase 억제제 zVAD를 통해 유도된 아포토시스가 PS 노출과 근육 융합에 필수적이며, 아포토시스 세포 자체가 근육 융합/분화를 유도하는 새로운 역할을 할 수 있음을 보고했습니다. 또한 PS 수용체인 BAI1은 아포토시스 세포를 인식하고 근관 생성 매개체로 작용하는 핵심 매개체로 밝혀졌습니다. 이 관찰은 사멸 세포가 단순히 빠르게 제거되는 것뿐 아니라 분화 같은 특정 기능에 기여할 수 있다는 새로운 개념을 제시했습니다 [97]. 최근에는 BAI 가족의 일원인 BAI3도 근모세포 융합 과정에 관여한다는 것이 밝혀졌습니다 [98]. 그러나 다음과 같은 질문이 남아 있습니다: PS-BAI1 (BAI3) 축은 사멸 세포의 포식 없이 건강한 근모세포의 융합 과정을 어떻게 매개할까요?

4. Apoptotic Cell Clearance and Organogenesis

Although there is substantial long-standing supportive evidence that clearance of dying cells during development essentially contributes to organogenesis/organ morphogenesis for specialized structures and functions [99,100], herein, we discuss only recent studies in the fields of mammary and testis development (Figure 3).

4. 사멸 세포 제거와 장기 발생

발달 과정에서 죽어가는 세포의 제거가 특수한 구조와 기능의 장기 발생/장기 형태 형성에 필수적으로 기여한다는 오랜 기간에 걸친 강력한 증거가 존재함에도 불구하고 [99,100], 본 논문에서는 유방과 고환 발달 분야의 최근 연구만 논의합니다 (그림 3).

Figure 3. Roles of apoptotic cell clearance in organogenesis. (a) During mammary morphogenesis, removal of apoptotic mammary epithelial cells is essential for the formation of lumen. In addition, after weaning, residual milk and dying epithelial cells can be removed by engulfment of neighboring epithelial cells and macrophages to mediate mammary involution. (b) Spermatogenesis/sperm maturation is mediated by Sertoli cells that can control the maturation of germ cells to sperm cells via physical interaction. During spermatogenesis in testes, Sertoli cells act as phagocytic cells to remove defective sperm cells that have PS exposed. This process is critical for normal spermatogenesis.

4.1. Mammary Development

In mammary morphogenesis, apoptosis of mammary epithelial cells and their clearance are well known to be critical for the formation of lumina (referred to as acini), which produce milk to feed newborns during lactation [100]. Recent advances in this field have focused on the relationship between the clearance of dying epithelial cells and mammary involution after weaning. Mammary involution is a step in which milk generation from the mammary gland is stopped and regression of the gland to the quiescent state is induced through removal of the remaining cells, apoptosis of the epithelial cells in the gland, clearance of dying cells, and regrowth of the interstitial adipocytes after weaning [101]. During the initial apoptosis of epithelial cells of mammary alveoli, the remaining neighbor epithelial cells that function as milk-secreting cells are changed to enable a role for phagocytes that mediate macropinocytosis to absorb milk and engulfment to remove apoptotic cells [101]. It has been suggested that this change can be induced upon contact with dying cells or by cytoskeletal reorganization of the surrounding epithelial cells during the extrusion of apoptotic cells. Recently, TGF-β signaling has been reported to induce junction reorganization between mammary epithelial cells for engulfment by epithelial cells [102]. At this stage, neighboring epithelial cells are known to induce many phagocytic activity-related genes such as those of receptors (LRP1/CD91 and CD47 (integrin-associated protein (IAP))), bridging molecules (Gas6 and protein S (ProS)), and lysosomal proteins (ATP6K and lysosomal-associated membrane protein 2 (LAMP2)). In addition, they can also express macrophage markers such as arginase-1 and inducible nitric oxide synthase (iNOS) during the early involution stages. Moreover, macrophages, which are professional phagocytes, are recruited to the glands around day 4 after weaning in the mouse system [101]. These observations strongly support the hypothesis that the engulfment activity of epithelial cells and macrophages contributes to the clearance of residual milk and dying epithelial cells during mammary involution. Furthermore, direct evidence and the in vivo relevance of the effects of apoptotic cell clearance on mammary involution have been revealed through KO mouse studies. Deficiency in MFG-E8, a bridging molecule that connects PS on apoptotic cells and engulfment receptors on phagocytes, impaired the redevelopment of the mammary gland and led to the development of periductal mastitis, which may have been caused by triggering the inflammatory process induced by secondary necrosis due to delayed clearance of dying cells [103]. In addition, loss of Disabled-2, an endocytic adaptor, impaired apoptotic cell clearance and delayed involution [104]. Furthermore, KO of Dock180 and Rac1, which are engulfment mediators, also resulted in the accumulation of apoptotic cells in the mammary gland at the late stage of involution, and delayed involution of the mammary glands [105,106]. Moreover, deficiency in autophagy-related protein 7 (ATG7) in mammary epithelial cells resulted in defective engulfment of apoptotic cells and a strong response to involution-related inflammation [107]. Although clearance of apoptotic epithelial cells has been suggested to be required for normal mammary involution based on direct and indirect evidence, many further investigations are needed to answer the following questions: What promotes the transition of epithelial cells into phagocytic cells post-weaning? Which cell types and receptors (molecules) are important for engulfment of dying epithelial cells during mammary involution?

4.2. Testis Development

During spermatogenesis in the testes, many germ cells undergo apoptotic cell death to obstruct the abnormal maturation of sperm with genetic or morphological defects [108,109]. Sperm maturation is closely linked to Sertoli cells located in the basal lamina of the seminiferous tubule [108]. Sertoli cells control the maturation of germ cells into spermatozoa through physical contact and by modulating the environment [108]. In particular, it is known that Sertoli cells carry out phagocytic clearance for apoptotic germ cells by recognizing PS exposure on the surface of dying cells and residual bodies to remove defective sperm cells during spermatogenesis [108]. Recently, several reports have shown the molecules involved in the phagocytic clearance of apoptotic sperm cells by Sertoli cells. Triple-null mice of TAM receptors (Tyro 3, Axl, and Mer) are known to show no mature sperm and a significant increase in the number of uncleared dying germ cells due to the impaired phagocytic activity of apoptotic differentiating germ cells among Sertoli cells [108,110,111,112,113].

In addition, Gas6, which links PS on apoptotic cells and TAM receptors on phagocytes, has been reported to be involved in the phagocytic activity of Sertoli cells to eliminate dying germ cell corpses [114]. Moreover, it has been suggested that the CD36 scavenger receptor can contribute to apoptotic germ cell clearance via its translocation to the plasma membranes of Sertoli cells [115]. Furthermore, injection of the BAI1-thrombospondin type 1 repeat (TSR) region (PS-binding region of BAI1) into testes increases the numbers of immature sperm and uncleared dying germ cells [116]. This indicates that BAI1 may also be involved in spermatogenesis and engulfment of apoptotic germ cells via the recognition of PS on the surface of dying cells [116]. In addition, Sertoli cell-specific deletion mice of Elmo1, which is known to be a direct downstream molecule of BAI1, also showed an increased number of uncleared dying germ cells and a significantly decreased number of mature sperm cells [116]. These reports indicate that there is a close relationship between efficient clearance of apoptotic germ cells and spermatogenesis to generate intact sperms [116]. Recently, the autophagy process has also been implicated in the ability of Sertoli cells to clear PS-exposed substrates [117]. Upon ingesting both PS-exposed legitimate and illegitimate substrate, Sertoli cells only degrade illegitimate substrates via autophagy pathways (MAP1LC3A-II/LC3-II clustering and SQSTM1/p62 degradation) [117]. Although there are several hypothetical scenarios in which apoptotic cell clearance may affect the interaction between Sertoli cells and germ cells, the integrity of the Sertoli cell barrier (tight junction), and the immune response after engulfment, the effect of phagocytic removal of dying germ cells on spermatogenesis is unknown [108].

5. Conclusions

Currently, it is known that “removal/clearance” issues are as essential as “making/synthesis” issues in a variety of pathophysiological processes. Apoptotic cell death and clearance of dying cells occur throughout the life of an organism (from the developmental stage to the end of life). Apoptotic cell clearance is known to have immunological silencing and anti-inflammatory effects via the efficient removal of apoptotic corpses by phagocytes to block secondary necrosis and the secretion of anti-inflammatory cytokines after the engulfment of dying cells by phagocytes [6,30,34,58]. However, recent accumulating findings on the roles of apoptotic cell clearance suggest a modification of these main concepts. In other words, the clearance of dying cells can contribute to physiological processes such as differentiation and development beyond immunosuppression-related pathways. Furthermore, attention must be paid to the role of apoptotic cells or clearance of dying cells as “new signal players,” which can directly cause differentiation and development. Currently, the functions of apoptotic cells and their clearance under a variety of pathophysiological conditions need to be thought of from a new point of view. In addition, tumor-associated macrophages (TAMs) are involved in activating immunosuppression and promoting tumor growth in the tumor microenvironment [118,119,120]. These TAMs are characteristic of M2 type macrophages producing anti-inflammatory cytokines. Therefore, phagocytes do not always function as the only cleaner of apoptotic cells. Inhibiting TAM activity is a potential therapeutic target for cancer prevention [121]. Another special issue is cellular cannibalism, which is defined as “cell-eat-cell” [122], with atypical phagocytosis by cancer cells being a clear example. This process is similar to phagocytosis by normal phagocytes, except that both living and dead cells are consumed [123]. These new discoveries broaden our understanding of cell removal, including living-cell clearance from atypical phagocytic cells in addition to apoptotic cell clearance from normal phagocytic cells.

However, there are many unanswered basic questions to be addressed before verifying this concept. For example, the reason why phagocytes recognize a variety of “eat me” signals, and the specific profiles of “eat me” signals and receptors in tissue-specific phagocytes (macrophages, dendritic cells, epithelial cells, and fibroblasts) are unknown. In addition, interrelationships and crosstalk among “eat me” signals, receptors, and/or phagocytes have not been determined. Additionally, downstream molecules and pathways of engulfment receptors need to be identified and characterized. Furthermore, investigating the function of apoptotic cells and their clearance in other pathophysiological processes, and identifying the “eat me” signals, engulfment receptors, and signaling pathways involved in differentiation and development processes will be the first step in understanding and verifying the new concept. Meta-data analysis and integration of new information and knowledge through systemic approaches such as the proteomic/genomic approach will be helpful in answering the above questions.

Author Contributions

M.H., G.R. and C.S.L. wrote the manuscript with guidance from C.S.L. S.-A.S., J.A., H.K., D.P. and D.-H.L. provided intellectual contributions in this study. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

Funding

This research was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (Grant Number: 2020R1F1A1070844) and the Korea Polar Research Institute (KOPRI, PE21900).

Institutional Review Board Statement

Not applicable.

Informed Consent Statement

Not applicable.

Conflicts of Interest

The authors declare no conflict of interest.

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