물벼룩 배양

[설산]

물과 녹조류의 배양 - 1                                                                                         

물벼룩 배양

[1] 배양 생물 종

Daphnia magna

다프니아 마그나

Daphnia similis​

다프니아 시밀리스

Daphnia pulex

다프니아 퓰렉스​

Moina macrocopa

모이나 마크로코파

Simocephalus vetulus

시모세팔루스 베툴루스

[2] 먹이에 따른 배양법

물벼룩의 먹이는 크게 세 가지로 나뉜다.

- 미세조류

- 미생물

- 사료

미세조류

 녹조류 등의 식물성 플랑크톤 (1~50㎛)

  영향 : 양질의 먹이로 물벼룩의 안정적인 배양이 가능하다.

  공급 : 조류의 배양 조건이 요구되나 급여량의 조절은 쉽다.

  용도 : 물벼룩의 효율적이고 안정적인 고밀도 배양이 가능하다.

   ex) 녹조 배양법

녹조 배양법은 많은 녹조의 확보가 가장 중요하다. 물벼룩의 배양보다 더 까다로운 것이 녹조의 배양이다. 이들은 영양염류와 적당한 광량을 필요로 한다. 녹조를 배양하려면 우선 종자용 녹조가 필요하다. 물벼룩이 먹기 적당한 크기의 소구체 단세포 녹조류가 좋다. 해캄과 같은 사상체나 벽에 붙어 자라는 부착성 조류는 물벼룩이 먹을 수 없으니 기피한다. 배양한 녹조는 고밀도로 농축이 가능하며 미생물에 비해 오랫동안 보관이 가능하다. 수질에 큰 영향을 미치지 않기 때문에 비교적 급여량에 제한이 없으며 물벼룩의 고밀도 배양이 가능해진다. 녹조는 물벼룩의 배양에 있어서 여러 방법으로 사용이 가능한데, 고밀도의 녹조를 저면에 침전시키는 등 특수한 배양 환경을 만들 수 있다.

미생물

 편모충 등의 소형 원생동물과 박테리아 (1~100㎛)

  영향 : 고영양원으로 물벼룩의 성장 속도가 매우 빠르다.

  공급 : 먹이의 고밀도 배양과 보관, 급여량의 조절이 어렵다.

  용도 : 소량의 물벼룩을 빠르게 증식시키거나 유지할 수 있다.

   ex) EM 배양법, 볏짚 배양법

미생물 배양법은 미생물을 배양하여 급여하는 미생물 급여 배양법과 미생물을 배양조에서 함께 증식시키는 미생물 직접 배양법이 있다.

미생물 급여 배양법은 미생물의 지속적인 배양과 공급이 중요하다. 미생물의 배양은 녹조에 비하면 상당히 간단한데, 주변에서 쉽게 구할 수 있는 유기물로도 배양이 가능하다. 하지만 배양한 미생물은 배양액과 분리시키기가 힘들다. 결국 물벼룩 배양조에 미생물과 배양액을 함께 넣을 수밖에 없는데, 물벼룩의 개체 밀도가 높으면 많은 배양액이 배양조에 희석될 것이다. 균을 배양한 배양액의 경우 여러 물질이 포함되어 물벼룩에게 치명적일 가능성이 있기 때문에 주의한다. (단순히 배양액에 녹아있는 이산화탄소가 물벼룩을 산소부족에 빠트릴 수도 있다) 이것이 균을 통한 물벼룩의 고밀도 배양이 어려운 이유이다. 이는 원생동물 또한 마찬가지인데, 많은 양의 지속적인 공급이 어렵기 때문에 물벼룩의 대량 배양은 거의 불가능하다. 대신에 적은 양의 종자용 물벼룩을 배양할 때에는 매우 빠른 증식속도를 볼 수 있다.

미생물 직접 배양법은 수조 내에 간단한 생태계 순환을 만들어 주는 것이 중요하다. 미생물이 증식할 수 있도록 토양에 해당하는 저면을 조성해주어야 한다. 균은 저면에 포함된 유기물을 분해하며 증식하고, 다른 미생물들은 저면 속에서 균과 유기물을 먹으며 자란다. 물벼룩은 수중으로 빠져나온 미생물을 먹으며, 물벼룩의 배설물과 시체는 저면의 침전물이 되어 균을 증식시킨다. 외부로부터 공급되는 먹이가 없기 때문에 물벼룩의 증식 속도는 점차 느려져 일정 수준을 유지하게 될 것이다. 많은 개체를 배양할 수는 없지만 가장 자연 상태에 가까운 배양 방식이다. 광량과 수온 등의 외부 요인만 관리를 잘 해준다면 몇 년도 유지가 가능하다.

사료

 효모(yeast)와 곡물 분말 등의 가공된 먹이

  영향 : 급여량 조절을 실패하면 수질이 쉽게 악화된다.

  공급 : 구입과 보관이 간편하며 급여량 조절 또한 쉽다.

  용도 : 일반적인 물벼룩의 배양에 간단하게 적용할 수 있다.

   ex) 효모 배양법, 미숫가루 배양법

사료 배양법은 먹이의 선정과 급여량의 조절이 가장 중요하다. 우선, 물벼룩이 먹기에 적당한 사료를 찾아야 한다. 물벼룩은 수중에 부유하는 먹이를 여과하여 먹기 때문에 분말 입자의 크기가 중요하다. 또한, 사료 안에 배양에 해로운 수용성 물질이 있지는 않은지 주의해야 한다. 사료의 경우 많은 양을 급여하면 물벼룩이 다 먹지 못하고 저면에 침전되는데, 침전된 사료는 녹조와 달리 곧 부패된다. 그렇기 때문에 먹이는 적은 양을 자주 공급해 주어야 하고, 배양조는 전체적으로 수질이 쉽게 악화되기 때문에 환수가 요구되기도 한다. 그러나 잦은 환수보다는 ‘미생물 직접 배양법‘과 같이 저면을 형성하여 침전된 먹이를 빨리 분해시키는 것이 바람직하며, 낮은 용존 산소량은 조명을 이용해 물벼룩을 수면으로 유도하여 해결할 수 있다. 먹이의 종류에 따라 영양상의 결핍이 발생할 수 있어 보충이 필요하다.

[3] 물벼룩의 배양

물벼룩의 기본적인 배양 환경을 조성하는 기준과 이후 배양을 진행하는 방법이다. 

배양 환경

1. 수조의 선택

물벼룩의 배양에 있어서 배양조의 선택이 크게 중요하진 않다. 배양조는 물벼룩의 관찰이 쉬운 투명한 재질이 좋다. 작은 배양조의 경우 수면적은 곧 물벼룩의 최대 밀도에 비례하므로 넓은 것이 좋으나 저면의 환경을 고려하여 높이는 최소 10㎝ 정도인 것을 택한다.

※ 무작정 넓은 수조보다는 물벼룩의 개체 밀도에 따라 수조를 넓혀주는 것도 좋은 방법이다.

​2. 조명의 선택

물벼룩은 산소의 농도가 더 낮은 곳이라도 빛을 쫓아가는 특성이 있다. 물벼룩의 생존율을 높이기 위해서는 조명을 수면의 연직 위에 설치할 것을 권장한다. 이는 물벼룩을 수면으로 유도하여 산소부족으로 인한 폐사를 막기 위해서이다. 에어레이션이 없는 물벼룩의 고밀도 배양은 24시간 조명이 필요하다. 녹조 배양법의 경우 저면에 침전된 일부 녹조를 유지시켜준다. 조명이 있어서 나쁠 건 없다는 말이다.

※ 물벼룩은 배양 환경에 빛이 있을 때 3배 정도의 카로티노이드를 지닌다고 한다.

3. 저면 조성

배양조 내에서 저면은 박테리아와 각종 미생물의 서식처가 되며, 각종 유기물을 분해하는 일종의 여과조 역할을 한다. 박테리아는 물벼룩의 배설물과 침전된 유기물을 효율적으로 분해하며 증식하고 수질을 안정화 시킨다. 배양조에서 발생한 유기물들을 모아서 자주 교반해주면 오랜 시간이 지나 잘게 분해되어 슬러지가 된다. 이러한 침전물은 내부에 많은 미생물이 살며 유기물이 쉽게 분해되도록 한다. 저면의 조성을 통해 물벼룩을 더 오랫동안 효율적으로 배양할 수 있지만 단점도 존재한다. 우선 환수가 어렵고, 자칫 잘못하면 침전물이 부유하여 먹이의 급여와 물벼룩의 채집이 힘들어질 수 있다. 저면층을 자연적으로 형성하는 것은 오랜 시간이 소요되므로 배양조에 약간의 먹이를 공급하며 방치하거나 외부에서 검역된 저면토를 투입하는 것이 좋겠다.

※ 저면 조성에 좋은 침전물은 물벼룩의 탈피각 분해물이다. 넓은 표면적을 가진 스펀지 상태의 슬러지가 된다.

4. 수온 조절

물벼룩의 배양에 적합한 수온은 약 20~25℃이다. 만약 수온을 20℃에서 물벼룩을 배양한다면 성체가 되는데 약 5일이 소요되며, 수명은 최대 50일 정도이다. 수온을 10℃까지 낮춘다면 이 기간은 각각 12일, 180일까지 증가한다. 대체로 수온이 높아질수록 생태 주기가 빨라지므로 원하는 배양 속도에 맞추어 수온을 조절하면 된다.

※ 수온이 낮아지면 물벼룩은 대체로 몸집이 작아지며 수컷이 발생하여 내구란을 형성할 수 있다.

5. 에어레이션

물벼룩은 저산소에 강한 생물로 에어레이션이 꼭 필요한 요소는 아니다. 다만 에어레이션은 수중 용존 산소량을 높여줄 수 있기 때문에 물벼룩의 생존율을 높여줄 수 있다. 확산기는 저면에서 조금 떨어진 곳에 설치하여 저면의 침전물이 기포에 의해 떠오르지 않게 한다. 물벼룩의 초고밀도 배양에서는 기포로 인해 수면에 몰려있던 물벼룩이 수조 벽에 붙거나 유실될 수 있으니 주의한다.

※ 확산기와 거름망을 통해 물벼룩에게 피해 없이 수중에 산소를 확산시키는 방법이 있다.

배양 방법

​1. 먹이 급여

물벼룩이 단위시간 동안 먹을 수 있는 양은 한정적이다. 그러므로 적당량을 공급하는 것이 중요한데, 먹이가 수중에서 부패하는 경우 급여 주기를 짧게 하여 일회 급여량을 줄이는 것이 좋다. 녹조 배양법의 경우 용존 산소량, 물벼룩의 섭식 활동과 유영에 악영향을 미치지 않을 정도라면 급여량에 제한은 없다. 어느 배양법이든 간에 물벼룩을 굶기는 것은 좋지 않다. 물벼룩의 창자 속을 자주 관찰하길 바란다.

※ 먹이가 부족한 암컷은 평소보다 난황을 많이 몰아서 큰 알을 낳는다. 이들은 더 많은 영양분을 포함하고 있기 때문에 생존률이 높다.

2. 개체 밀도 조절

너무 높은 개체 밀도는 물벼룩에게 좋지 않은 환경이다. 물벼룩은 개체 밀도가 낮을수록 몸집이 크고 산란량이 많아진다. 그러나 개체 밀도가 너무 낮다면 사료 배양법이 힘들어지며, 먹이 급여량의 조절에 문제가 생긴다. 이때에는 효율적인 먹이 공급을 위해 수조 용적을 줄일 필요가 있으며 잦은 환수가 요구된다. 반대로, 개체 밀도가 너무 높다면 미생물 배양법이 힘들어진다. 산소 공급량을 높이며 많은 미생물의 공급을 위해 수조의 용적을 넓힐 필요가 있다. 녹조 배양법의 경우 뚜렷한 문제는 없으나 역시 고밀도로 인한 저산소를 조심해야 한다.

※ 녹조를 통한 물벼룩의 초고밀도 배양에서 개체 밀도와 산소부족 문제는 물벼룩의 분리배양법으로 어느 정도 해결할 수 있다.

3. 배양조의 환수

물벼룩의 배양에서 환수가 꼭 필요한 상황도 있다. 물벼룩을 배양하다 보면 물은 자연스럽게 맑고 진한 황색을 띄게 된다. 부유물이 발생하더라도 이들은 물벼룩의 여과 활동으로 빠르게 먹히거나 침전된다. 그러나 물벼룩을 고밀도로 배양할 경우 침전이 잘 일어나지 않고 계속하여 부유 중인 입자(배설물과 죽은 녹조 뭉치 등)들이 생겨난다. 물벼룩은 선택적으로 먹이를 먹을 수 없기 때문에 녹조와 함께 부유물들을 먹게 되는데, 이런 부유물로 인해 물벼룩은 상대적으로 영양을 덜 흡수한다. 관찰자 또한 배양조 내부의 관찰이 힘들어지기 때문에 환수가 필요하다. 또는 수질이 급격하게 악화되어 전체 환수가 필요할 수도 있다. 환수를 할 때 주의할 점은 수중에 녹아있는 기체이다. 기체가 많이 녹아있는 맑은 물에서는 물벼룩의 몸에 공기방울이 맺히게 되는데, 새 물은 점성이 거의 없기 때문에 물벼룩이 수면에 떠서 표면장력에 갇히게 된다. 한번 수면으로 떠오른 물벼룩은 계속하여 떠오르기 때문에 사전에 예방하는 것이 좋다. 방법은 간단한데, 정수 과정을 거친 물을 기존 배양조의 물과 반 정도만 섞어주는 것이다. 이렇게 하면 전체 환수에 비해 수중의 용존 기체량과 점성 등이 적당히 유지된다.

※ 물벼룩의 배양은 잦은 환수가 필요 없다. 환수는 배양조 내 환경 변화로 박테리아를 죽이며(유막 발생) 물벼룩의 개체 손실을 일으킨다.

4. 첨가제 - 미생물제제

물벼룩의 배양에 도움을 주는 여러 첨가제가 있다. 대표적인 것이 EM(Effective Microorganisms, 유용미생물군)과 PSB(Phosphate solubilizing bacteria, 인산가용화균)인데, 주로 수질 개선과 물벼룩의 보조 먹이로 쓰인다. 특히 PSB는 물벼룩에게 필요한 여러 필수 단백질과 카로티노이드를 공급하는 양질의 먹이가 된다.

[4] 물벼룩의 전멸 현상과 원인

물벼룩이 갑작스럽게 모두 폐사하는 현상을 흔히 ‘물벼룩 폭탄‘이라고 한다. 이 전멸 현상의 주된 원인은 산소 부족과 수질 악화가 있다. 다음은 각 배양법에서 일어날 수 있는 여러 상황에 대한 간단한 예시이다. 산소 부족과 수질 오염은 대표적인 물벼룩의 폐사 원인이다.

산소 부족

1. 녹조 배양법을 실패한 경우

물벼룩에게 최대한 많은 먹이를 공급하기 위해/잦은 먹이 급여를 줄이기 위해 물이 녹색이 될 때까지 녹조를 넣었다. 물벼룩이 잘 보이지 않는 가운데, 몇 시간이 지나니 죽은 물벼룩이 저면에 쌓여있다. 원인은 역시 산소 부족이다. 녹조는 살아있는 세포로 물 전체의 산소를 통해 호흡한다. 녹조의 농도가 높으면 빛의 투과율이 낮아지고, 광합성도 줄어들게 된다. 전체적으로 용존 산소량이 감소하지만 물벼룩은 수면에 모여들기가 힘들다. 그대로 수중을 유영하다 죽게 된다.

2. 미생물 직접 배양법을 실패한 경우

미생물을 통해 물벼룩을 배양하고자 수조에 EM 발효액과 미생물. 옥수수 껍질 등을 넣었다. 어느 정도 미생물이 배양되자 물벼룩을 넣었더니 전멸했다. 미생물은 잘 자라더니 물벼룩이 죽는 이유는 무엇일까. 바로 미생물과 물벼룩의 산소 요구량이 다르기 때문이다. 여러 균들이 유기물을 분해하며 수중의 용존 산소량은 매우 빠른 속도로 감소하고 이산화탄소가 다량 발생한다. 미생물의 경우 생존에 매우 적은 산소가 필요하지만 물벼룩은 그렇지 않다. 물벼룩은 산소 부족과 이산화탄소 중독으로 죽을 것이다.

3. 사료 배양법을 실패한 경우

사료 배양법은 사료가 부패하기 전에는 특별히 산소가 부족해질 상황이 없다. 수질 악화와 산소 부족이 함께 발생한다.

4. 야간에 물벼룩이 전멸한 경우

별문제 없이 잘 살던 물벼룩이 다음날 조명을 켰을 때 모두 죽어있는 경우가 있다. 원인은 이러하다. 평소 조명에 대한 주광성으로 물벼룩이 수면에 잘 몰려있다면 산소 부족으로 죽는 일은 거의 없을 것이다. 그러나 조명을 끄면 얘기가 달라진다. 물벼룩은 방향성을 잃고 수중을 돌아다닐 가능성이 높다. 결국 산소 부족으로 죽고 만다. 관찰자의 입장에서는 평소 물벼룩이 잘 살았기 때문에 용존 산소량을 크게 신경 쓰지 않았을 것이다. 조명을 24시간 틀어두는 것은 이런 상황을 막기 위해서이다.

수질 오염

1. 녹조 배양법을 실패한 경우

​먹이용 녹조가 부족해지자 물벼룩 배양조에 배양한지 얼마 안 된 녹조를 넣었더니 물벼룩이 모두 유영 저해 상태에 빠졌다. 녹조 배양액에 문제가 있는 것이다. 유기질소원을 통해 녹조를 배양하면 암모니아 등의 많은 독성 물질과 균이 발생한다. 이를 정제하지 않고 그대로 사용하면 민감한 물벼룩은 바로 죽을 수밖에 없다.

2. 미생물 급여 배양법을 실패한 경우

​물벼룩의 개체 밀도가 증가하여 더 많은 발효액을 먹이로 넣어주었더니 며칠 후 물벼룩들이 죽어나갔다. 과도하게 투입된 배양액 때문이다. 배양액은 미생물과 유기물로 이루어져 있다. 아직 분해되지 않은 유기물이 물벼룩 배양조에 과다 유입되고 저면에 침전된다. 이를 분해할 균이 상대적으로 부족한 상태에서 유기물은 서서히 부패하고 수질을 악화시킨다.

3. 사료 배양법을 실패한 경우

​조명을 켜두었고, 물벼룩들은 조명을 따라 수면에 바짝 붙어있다. 저면을 보니 죽은 물벼룩 시체가 쌓여있다. 수질 오염이 원인이다. 보통 잘못된 먹이의 공급이 문제가 된다. 주로 사료가 그러한데, 단백질을 다량 포함한 부패가 쉬운 먹이(콩가루, 우유 등)를 다량 급여하면 수질이 악화되고 암모니아가 발생한다. 배양조 내 물벼룩 전체가 영향을 받고 대부분 죽게 된다.

[5] 물벼룩의 특성

다음은 물벼룩을 배양할 때 알아두면 좋을 물벼룩의 특성이다.

생물적 특성

1. 발생과 생장

물벼룩은 약 2일간 알-배아 상태로 어미의 육아낭에서 지내게 된다. 그 후 육아낭을 벗어나 1령 유생이 된다. 1일 주기로 탈피하며, 5일 후에 탈피하여 6령이 된 물벼룩은 산란이 가능한 성체가 된다. 이때부터 2일 간격으로 탈피 후 산란을 반복한다.

2. 주광성

물벼룩의 가장 큰 특성은 아마도 주광성일 것이다. 물벼룩은 광원의 방향(산소의 농도와는 관계없는)으로 모여드는 특성이 있다. 하지만 단순히 광원을 따라가는 것만은 아니다. 주광성에 영향을 미치는 요인은 상당히 복잡한데, 대체로 산소 부족, 수질 오염 등은 물벼룩의 주광성을 더 강하게 한다. 물벼룩을 배양할 때에는 조명을 수면의 연직 위에 설치할 것을 권장한다. 이는 물벼룩을 수면으로 유도하여 산소부족으로 인한 폐사를 막기 위해서이다. 에어레이션이 없는 물벼룩의 고밀도 배양은 24시간 조명이 필요하다.

3. 수컷과 내구란

일반적으로 물벼룩은 암컷만이 존재하는 단위생식을 한다. 그러나 환경이 악화되면 암컷은 알의 일부를 수컷으로 낳게 되며, 암컷은 수컷과의 교미를 통해 알을 수정시키고 육아낭을 변형시켜 내구란을 만든다. 내구란은 탈피와 함께 몸에서 분리되는데, 이 반달 모양의 알집은 두 개의 알로 구성되어 있으며 말리거나 얼려도 정상적인 환경으로 돌아오면 다시 부화한다. 수컷이 발생하는 환경 조건으로는 수온 하락, 먹이 부족, 개체 밀도 증가 등이 있다. 내구란의 부화율은 상당히 낮기 때문에 종자 확보를 위해서는 많은 양을 모으는 것이 좋다.

4. 카로티노이드​

물벼룩의 창자벽과 난소, 알 등은 카로티노이드를 포함한다. 물벼룩의 몸 부분이 주황색으로 보이는 것은 지방세포의 카로티노이드 단백질 때문이다. 물벼룩은 배양 환경에 빛이 있을 때 몸에 3배 정도의 카로티노이드를 포함한다.

산소와 물벼룩

1. 헤모글로빈

헤모글로빈은 체내에서 산소를 운반한다. D.pulex와 M.macrocopa 등의 일부 물벼룩은 헤모글로빈을 생성할 수 있다. 이는 저산소 환경에 적응하기 위한 것이며, 물벼룩의 산소 부족에 대한 헤모글로빈의 반응 속도는 매우 빠르다. 건강한 물벼룩의 경우 뜰채로 떠내어 모으기만 해도 색이 상당히 붉어질 것이다. 이런 간단한 과정만으로도 물고기에게 시각적인 효과를 줄 수 있다.

2. 용존산소량

물벼룩의 상태를 관찰하는 것으로 수중의 용존 산소량을 대략적으로 짐작할 수 있다. 우선 수중 용존 산소량이 낮다면 물벼룩은 광원을 쫓고, 산소가 부족할 때 헤모글로빈을 생성한다. 만약 고밀도 배양으로 인해 용존 산소량이 더 감소한다면 성체는 수면을 장악하고 수면에서 밀려난 일부 유생은 폐사하게 된다. 전체적으로 물벼룩의 고령화 현상이 일어나는데, 산소부족이 극에 달할 경우 성체의 육아낭이 흰 물질로 차게 된다. 이는 물벼룩이 산란한 알이 산소 부족으로 폐사한 것이다. 개체 수는 더 이상 늘어나지 않지만 곧 전멸한다.

3. 산소부족

갑작스럽게 산소가 부족해진 물벼룩은 유영을 할 수 없어 가라앉는다. 심장에서 먼 외부 기관부터 마비가 시작되며, 마지막으로 심장이 멈춘다. 만약 이 상태로 수 십분 이상 방치한다면 물벼룩은 죽을 것이다. 만약 비정상적인 배양액의 공급 또는 잘못된 광원의 위치 등으로 물벼룩이 갑작스럽게 산소부족에 빠졌다면 바로 꺼내어 맑은 물에 넣어놓자. 5분 정도가 지나면 물벼룩의 외부기관부터 다시 살아나며 1시간 후에는 완전히 되살아나 유영도 가능해질 것이다.

물벼룩의 운동 상태

1. 유영 저해​

물벼룩이 저면에 가라앉아 일부 기관만을 움직이는 것을 유영 저해라고 한다. 육안 상으로 관찰했을 때 유영 저해가 일어나는 경우로는 물벼룩의 다리(여과지)와 촉각(유영지)에 붙은 이물질로 인해 여과와 유영이 힘들어질 때와 물벼룩이 독성물질에 노출된 경우가 있다.

2. 여과지 운동

물벼룩은 갑각 안에 위치한 5쌍의 다리(여과지)를 움직여 수류를 일으키며 여과 섭이를 한다. 수중에 부유 중인 입자를 걸러내어 먹기 때문에 먹이를 선택적으로 골라서 먹을 수가 없다. 이러한 특징 때문에 물벼룩을 다양한 먹이를 통해 배양할 수 있다. 또한 여과지에는 호흡기가 있기 때문에 여과지 운동에 의한 수류는 물벼룩에게 더 많은 산소를 공급하게 한다.

3. 선회운동

물벼룩은 평소 유영지를 통해 톡톡 튀는 호핑운동을 한다. 그러나 소독약 등의 화학물질에 노출되거나 갑작스러운 조명 등 강한 자극을 받았을 때에는 원 궤도를 빠른 속도로 도는 선회운동을 한다. 이러한 비정상적인 운동을 하는 물벼룩은 물고기의 눈에 띄기 더 쉽다.

녹조류 배양

[1] 배양 생물종

Chlorella sp.

클로렐라 

Scenedesmus sp.

스케네데스무스

Chlamydomonas sp.

클라미도모나스

[2] 녹조 배양법의 종류

녹조 배양법은 크게 두 가지로 나뉜다.

- 완전배양액

- 천연배양액

완전배양액

 Bold’s Basal Medium 등의 합성배지

  영향 : 녹조가 매우 빠르게 증식하며 배양 후 처리가 필요 없다.

  공급 : 배양액을 조성하는데 많은 종류의 무기염류가 필요하다.

  용도 : 녹조의 대량 증식에 사용할 수 있다.

   ex) 크놉액, 수경재배, 액체비료

완전배양액은 녹조의 증식에 필요한 무기염류를 통해 만든 합성배지이다. 배양액의 농도는 곧바로 세포의 삼투압과 여러 생명현상에 직결되기 때문에 이를 정확히 조절해줄 필요가 있다. 또한 배양액에는 탄소원이 없기 때문에 이를 통한 녹조의 배양은 탄소원의 공급이 중요하다. 천연배지의 경우 단백질원은 탄소를 포함하고 있지만 합성배지는 질소원으로 무기염류를 사용한다. 그렇기 때문에 탄소는 폭기(이산화탄소) 또는 포도당 등의 유기물을 통해 공급한다. 적당량의 포도당을 배지에 넣는다면 녹조의 증식에 도움을 준다. 하지만 이는 균이 자라기 쉬운 환경이기도 하다. 균은 빠른 속도로 증식하여 수중의 산소를 모두 없애고, 균의 우점에 밀린 녹조는 더 이상 증식하기 힘들며 곧 죽어버린다. 멸균된 배양 환경을 조성하기는 어렵기 때문에 완전배양액을 통한 녹조의 배양은 포도당과 상관없이 폭기를 이용하도록 한다.

천연배양액

 유기태질소로 구성된 천연배지

  영향 : 유기물이 분해되며 녹조가 천천히 증식한다.

  공급 : 일반적인 단백질원은 주변에서 쉽게 구할 수 있다.

  용도 : 장기간에 걸친 녹조의 배양과 보관에 이용된다.

   ex) 혈액, 육류, Tryptone, Yeast extract

천연배양액은 생물의 추출물과 아미노산 등을 소재로 한 천연배지이며, 이 외에도 육류와 혈액 등의 다양한 단백질원을 이용할 수 있다. 녹조는 단백질 함량이 높기 때문에 질소원이 꼭 필요한데, 천연배양액을 구성하는 대부분의 물질은 녹조가 바로 흡수할 수 없으며 균을 통한 분해 산물을 이용한다. 균의 분해과정이 필요하기 때문에 영양분이 천천히 작용하며, 배양액의 농도는 비교적 자유롭다. 하지만 이 과정에서 수질이 심각하게 오염되고 암모니아와 황화수소 등 유독가스가 발생할 수 있다. 기본적으로 악취가 심하기 때문에 페트병과 같은 밀폐 용기에서 배양하는 것을 권장한다. 산소의 공급이 없기 때문에 배양에 상당히 오랜 시간이 소요되며 배양이 끝난 녹조 배양액은 배양액 내 균과 용존 물질을 제거하는 정제작업을 거쳐 사용할 수가 있다.

[3] 녹조의 배양 방법

녹조의 배양 방법을 배양액에 따라 나누어 적었다.

완전배양액

배양에 필요한 합성배지를 구하는 것이 배양법의 90% 이상을 차지한다. 이는 직접 만들거나 구매하면 된다(판매처는 모른다).

1. 합성배지의 조성 성분​

합성배지에는 세포가 증식하는 데에 필요한 많은 종류의 이온을 필요한 만큼 넣어야 하기 때문에 다양한 염들이 복잡한 비율로 들어간다. 그중 가장 중요한 것은 1차 다량원소로서 잘 알려진 N-P-K 인데, 질소(N)은 질산칼륨(KNO3)과 질산나트륨(NaNO3), 질산암모늄(NH4NO3)을 통해 공급하며 인(P)은 인산수소칼륨(K2HPO4)과 인산이수소칼륨(KH2PO4)을 통해 공급한다. 또한 칼륨(K)의 경우 질산염과 인산염에서 함께 공급된다(물론 정량화된 비율을 맞춰준다). 이 세 가지 외에도 다음으로 중요한 것이 2차 다량원소인데, 황산마그네슘(MgSO4)을 통해 공급하는 마그네슘(Mg), 염화칼슘(CaCl2) 등을 통해 공급되는 칼슘(Ca), 그리고 황산이온으로 공급되는 황(S)이 다량원소로서 필요하며, 극소량이지만 꼭 필요한 금속 이온들인 미량원소(붕소, 철, 아연, 몰리브덴, 망간, 염소, 구리, 코발트 등)도 없어서는 안될 중요한 성분이다. 배지의 구성 성분을 보면 미량원소는 굳이 없어도 되지 않을까 싶을 정도로 극미량이 들어가는데, 이들이 결핍되면 녹조는 정상적인 증식이 불가능해질 것이다. 

2. 완전배양액을 통한 녹조 배양 

배양조에 합성배지를 표준 농도 또는 그 이하에 맞추어 넣는다. 녹조를 적당량 넣고 수중모터나 기포기를 통해 에어레이션을 하여 배양액을 교반시킨다. 조명은 강한 것이 좋으며 빛의 투과도에 따라 수위를 적절히 조절하도록 한다. 배지 내 무기염류의 양은 점차 감소하게 되는데, 이 무기염류의 재공급 시점이 문제다. 배양액 안에 잔류 중인 무기염류의 양을 확인할 방법이 없기 때문에 배양이 어느 정도 진행되어 녹조 농도가 높아진 배양액은 새 배양액과 섞어서 배양하도록 한다. 가능하다면 녹조를 침전시켜 분리해내는 것도 방법이다.

간혹 합성배지를 정량에 맞췄음에도 불구하고 녹조가 거의 자라지 않아 무기염류를 더 넣는 경우가 있는데, 자칫하다간 녹조가 삼투압으로 인해 모두 죽을 수가 있다. 그럴 때에는 무기염류보다는 이산화탄소 등의 탄소원을 공급해보는 것이 바람직하다. 만약 탄소원으로 사용한 포도당에 의해 배양액이 희뿌옇게 변했다면 에어레이션을 통해 산소를 공급한다. 그러면 녹조가 매우 빠른 속도로 증식하여 하루 만에도 물이 연녹색으로 변할 것이다. 완전배양액에는 탄소원이 빠져있다는 것과 녹조도 최소한의 산소는 필요로 한다는 것을 잊어서는 안 된다.

완전배양액을 통한 녹조의 배양은 녹조의 증식에 최적화되어있다. 그러므로 완전배양액에서 녹조가 잘 자라지 않는다면 수온과 광량 등의 환경 조건에 문제가 있는 것이다. 녹조류도 식물인 만큼 따듯한 수온과 많은 광량이 배양을 촉진시킬 것이다.

3. 합성배지와 무기비료

​합성배지의 구성 성분을 보면 굉장히 흡사한 것을 본 적이 있을 것이다. 자작 액비 등의 무기비료가 그러하다. 합성배지가 시중의 무기비료와 다른 점은 구성 성분과 정량화이다. 흔히 무기비료는 특정 비율의 N-P-K로 구성되어있다. 이들은 특정 원소만을 위한 것이므로 필수원소를 모두 포함하고 있지 않으며, 정량화되어있지 않기 때문에 녹조의 배양에 적합한 농도 또한 알기 어렵다. 농도를 잘 모르는 무기비료를 잘못 쓰게되면 살아있는 녹조가 순식간에 죽어버릴 수도 있으므로 주의한다. 합성배지의 차선책은 무기비료가 아니라 천연배지이다.

천연배양액

1. 천연 배지의 조성 성분

천연배지는 주로 단백질원을 부패시켜서 만든다. 보통 1회 배양시 육류 2g 정도를 배양액 1ℓ에 넣으면 된다(정량은 없다). 좀 더 빠른 효과를 위해 혈액과 같은 부패가 쉬운 단백질원을 사용할 수도 있다. 가능하다면 트립톤 등의 아미노산을 쓸 수도 있다. 어쨋거나, 이러한 유기태질소원을 밀폐 가능한 병에 넣고 부패시킨다. 배양액의 부패는 빠를수록, 녹조는 많을수록 배양에 걸리는 시간은 짧아진다(아미노산을 통해 고농도의 녹조를 배양할 경우 빠르면 1주일 안에 최대로 증식한다).

2. 천연배양액을 통한 녹조 배양

밀폐가 가능한 용기에 물과 천연배양액을 만들 단백질원과 녹조를 넣는다. 전체 배양액 용량은 배양 전의 녹조 양에 맞추어 적절히 조절한다(녹조 양에 비해 배양액이 너무 많을 경우 균의 우점으로 배양을 할 수 없다).

한 달 가량을 햇빛이 드는 곳 또는 조명 아래 둔다. 녹조가 쌓이기 시작하면 종종 배양병을 흔들어 가라앉은 녹조를 배양액과 섞어준다. 배양 도중에는 녹조의 상태를 유심히 관찰해야 하는데, 배양액의 농도 등 여러 조건에 따라 녹조의 상태가 변하기 때문이다. 천연배양액은 농도가 낮으면 녹조가 증식하긴 하지만 슬러지가 침전된다. 반대로 배양액의 농도가 너무 높으면 녹조는 오염과 삼투압을 견디지 못하고 검게 썩어버린다. 적당한 농도의 배양액은 녹조를 휴면 상태로 만들고 저면에는 졸 상태의 진녹색 녹조가 쌓인다.  

단백질원의 종류에 따라 녹조의 침전 여부와 물의 상태는 다른데, 배양이 끝날 때의 배양액은 반투명한 황색을 띈다. 그전까지는 주로 탁한 백색을 띄므로 종종 녹조를 침전시켜 배양액의 색을 확인한다. 만약 배양이 끝났다면 녹조를 침전시키고 배양액과 분리한 후, 맑은 물에 희석하여 다시 침전시킨다. 이 과정을 두세 번 반복하여 균과 배양액 용존 물질을 제거하면 보관 또는 사용 가능한 녹조를 얻을 수 있다. 만약 녹조를 다시 배양액에 넣어 증식시킬 경우 세척과정은 필요 없다.

※ 천연배양액의 녹조 수확 과정 http://wb235.blog.me/220195970890

[4] 녹조의 상태

비활성 녹조의 발생​

1. 배양액의 오염​

완전배양액의 질산염(질산 이온)과는 달리 천연배양액의 유기태질소는 미생물의 분해과정을 거쳐 암모늄태 질소가 되고 이는 다시 아질산과 질산태 질소가 된다. 암모늄이온과 질산 이온은 식물이 흡수할 수 있지만 아질산 이온은 그렇지 않다. 아질산 이온은 암모늄 이온과 질산 이온의 중간 단계로 독성이며 수질 오염의 지표로 사용한다.

2. 오염이 녹조에 미치는 영향

수질오염은 조류의 생명활동과도 연관이 있다(해조류인 파래는 수질이 오염될수록 증식력이 떨어지며 진한 녹색을 유지하여 생태모니터링 기술에 사용할 수 있다 - 인천대 한태준 교수팀 개발). 녹조류 또한 비슷한 특성을 보이는데, 유기태질소를 통해 배양 중인 녹조는 저면에 침전되어 서서히 증식하며 오랫동안 진녹색을 띈다.

※ 경험에 따르면 포도당 등의 탄수화물에 의한 균의 증식으로 수질이 심하게 오염될 경우 녹조는 폐사한다. 탄수화물에 의한 것은 오염의 정도가 단백질에 의한 것보다 덜하고, 균의 폭발적인 증식으로 발생한 유기물이 녹조의 증식을 방해하기 때문이 아닐까 싶다.   

녹조의 상태 구분

1. 활성 녹조와 비활성 녹조

앞서 언급한 오염에 노출된 녹조를 비활성 녹조라고 한다. 녹조의 상태는 크게 활성 상태와 비활성 상태(휴면 상태)로 나눌 수 있다. 주로 완전배양액에서 배양한 녹조는 활성 상태를 띈다. 잦은 세포 분열로 인해 세포 크기가 작고 가벼워 수중에 오랫동안 부유한다. 반면에, 천연배양액에서 유기태질소를 통해 배양한 녹조는 비활성 상태를 띈다. 이들은 세포가 조금 더 크고 무겁기 때문에 저면에 침전된다. 

[5] 녹조 배양액의 침전물 – 배양 상태의 지표

녹조를 매번 현미경으로 관찰할 수는 없으므로 주로 배양액의 색과 저면의 침전물 등으로 녹조의 상태를 판별한다. 다음은 육안으로 확인 가능한 배양액에 침전된 물질들에 대한 설명이다. 항상 정확한 것은 아니지만 대체로 그렇다는 것이다. 녹조가 세포 단위로 적층되지 않고 다른 형태를 띠거나 슬러지가 쌓인다는 것은 배양에 문제가 있다는 것이다.

완전배양액

완전배양액을 통한 이상적인 배양 환경에서는 침전물이 생기지 않는다.

1. 녹조 침전물

진녹색의 저면에 얕게 깔린 물감 형태. 배양액에 수류가 없을 때 발생한다. 활성상태의 단일 녹조 세포로 만 구성되어 있다. 세포분열이 매우 활발하여 빠른 속도로 증식할 수 있다. 완전배양액에서는 대부분의 녹조 세포가 매우 오랫동안 수중에 부유하기 때문에 극히 일부만 침전된다. 녹조의 입자가 작기 때문에 침전물은 수류에 잘 쓸려가지 않으며 표면부터 물에 풀어진다.

2. 부착성 유기물

배양조 벽면에 부착된 회녹색-회갈색의 짧은 털 뭉치 형태. 포도당과 에어레이션(수류)을 가했을 때 발생한다. 균에 의한 유기물 덩어리로 구성되어 있다. 녹조를 일부 포함하기도 하나 증식력은 없다. 수중에 부유하지 않고 부착되어 있기 때문에 녹조의 배양에는 크게 문제 되지 않는다. 수류에 따라 휩쓸리는 듯 하나 잘 떨어지지 않는다.

3. 사체 침전물

배양조 저면에 침전된 회녹색-회갈색의 슬러지 형태. 포도당을 통한 균의 과다 증식으로 배양액에 산소가 부족할 때 발생한다. 균의 사체와 죽은 녹조의 세포벽 등의 입자로 구성되어 있다. 일부 살아있는 녹조가 비활성화되지 않고 점차 죽지만 산소를 공급해 주면 녹조가 빠르게 증식할 수 있다. 침전은 빠른 편이며 점차 뭉쳐 입자가 커진다. 수류에 의해 매우 쉽게 쓸려나가고 풀어진다. ​

천연배양액

천연배양액에서는 녹조가 다양한 상태로 존재한다.

1. 졸형 녹조 침전물

진녹색의 저면에 쌓인 졸 형태. 배양액이 균에 의해 오염되었을 때 발생한다. 비활성 상태의 단일 녹조 세포와 소량의 균으로 구성되어 있다. 휴면 상태에 가까워 증식 속도가 느리다. 침전 속도는 느리며 세포단위로 적층된다. 점성이 있기 때문에 약한 수류에는 형태가 유지되며 잘 섞이지 않는다. 강한 수류에서는 다시 세포 단위로 잘 풀어진다.   

2. 스펀지형 녹조 침전물

진녹색의 저면에 쌓인 입자가 큰 스펀지 형태. 다량의 졸형 녹조 침전물을 다른 종류의 배양액에 넣었을 때 발생한다. 비활성 녹조 세포 일부와 그 사이의 균이 죽으며 발생하는 유기물에 의해 많은 녹조 세포가 엉긴다. 구조의 특징으로 인해 증식 속도는 느린 편이다. 입자가 크고 무겁기 때문에 매우 빠르게 침전된다. 침전물은 수류에 잘 쓸려가며 강한 교반을 통해 물리적으로 잘게 나눠도 곧 다시 엉겨 붙는다.    

3. 세포벽 침전물

배양조 저면에 침전된 황록색의 졸 또는 작은 입자의 슬러지 형태. 초기 녹조 양이 적을 때 발생한다. 죽은 녹조의 세포벽과 비활성 녹조 등으로  구성되어 있다. 슬러지에 비활성 녹조 세포가 섞여있는 구조이기 때문에 증식이 힘들다. 입자는 고르게 침전되는데 졸형 녹조 침전물에 비해 점성이 떨어진다. 시간이 지나면 서서히 증식하거나 사체 침전물이 된다.

4. 녹조 부패물

검은색의 저면 최하단에 쌓인 점액 형태. 과도한 천연배양액 농도로 수질이 심하게 오염되어 비활성 상태의 녹조가 이를 버티지 못하고 죽으며 썩었을 때 발생한다. 졸형 녹조 침전물이 점차 검게 변하며 최종적으로 침전물 최하단에서 스며나온다. 교반시 배양액이 거뭇해진다. 

[출처] 물벼룩과 녹조류의 배양 - 1|작성자 WB