Hmf와 꿀벌

[우성(旴成) 평택]

Hydroxymethylfurfural which, for very obvious reasons is usually abbreviated to HMF, is an organic compound that forms in sugar-containing foods, often as a result of heating
히드록시메틸푸르푸랄은 매우 명백한 이유로 일반적으로 HMF로 약칭되며, 주로 가열의 결과로 설탕이 함유된 식품에서 형성되는 유기 화합물입니다.

Hydroxymethylfurfural (HMF) Oxygen = red, Hydrogen = white, Carbon = black

HMF is relevant to bees because, at high levels, it is toxic for them. Since beekeepers often heat (or use ready-made feed that has been heated during production) sugar-containing syrups or fondants it’s worth being aware of it.

HMF is also relevant to beekeepers as high levels of it in honey are an indication of prolonged heating during storage and preparation or potential adulteration. For this reason there are legal limits on the levels of HMF in honey sold for human consumption.

I suspect beekeepers in the UK who know about HMF – and many may not – probably worry about it unduly. In tropical countries or regions where high fructose corn syrup is used as a bee food then HMF is likely to be of more immediate importance.
HMF는 높은 수준에서 꿀벌에게 독성이 있기 때문에 꿀벌과 관련이 있습니다. 양봉가들은 설탕이 함유된 시럽이나 퐁당을 가열(또는 생산 과정에서 가열된 기성 사료를 사용)하는 경우가 많으므로 주의해야 합니다.

꿀에 높은 수준의 HMF가 함유되어 있으면 저장 및 제조 과정에서 장시간 가열하거나 오염 가능성이 있다는 것을 의미하므로 양봉가들에게도 중요합니다. 이러한 이유로 식용으로 판매되는 벌꿀의 HMF 함량에 대한 법적 제한이 있습니다.

HMF에 대해 알고 있는 영국의 양봉가들도, 그렇지 않은 사람들도 HMF에 대해 과도하게 걱정하고 있다고 생각합니다. 고과당 옥수수 시럽을 꿀벌 먹이로 사용하는 열대 국가나 지역에서는 HMF가 더 즉각적으로 중요할 수 있습니다.

Natural occurrence of HMF

Hydroxymethylfurfural is essentially absent from fresh foods. However, in sugar-containing foods, particularly those that are acidic, HMF levels can build up. A chemical process called a Maillard reaction is responsible for HMF formation (there are other reactions that generate HMF as well, including caramelisation) and the reaction works about five times faster for every 10°C rise in temperature.

Therefore processes such as drying or cooking result in elevated HMF levels. The precise amount varies depending upon the foodstuff, the amount of heating and other factors; typical figures are bread 3 – 180 mg/kg, prunes 240 mg/kg, sugarcane syrup 100 – 300 mg/kg and roast coffee 900 mg/kg 1.

All of these foods can be consumed perfectly safely (at least in terms of their HMF content … prunes can have some adverse effects 😉 ).

It should therefore be obvious that the 40 mg/ml limit 2 of HMF in honey has nothing to do with its safety for human consumption.

Dietary HMF has been extensively studied as there were concerns it may be carcinogenic for humans. Several studies showed that non-physiological levels and/or prolonged exposure were cytotoxic or inhibited key enzymes in the cell such as DNA polymerase. However, no evidence for in vivo carcinogenic or genotoxic effects have been demonstrated 3.

HMF is currently considered safe and has been shown to have beneficial antioxidant activity, to protect against hypoxic (low oxygen) injury and to counteract the activities of some allergens.

HMF in honey

Readers familiar with the chemistry of honey will be aware that it is often rich in fructose (one of the sugars from which HMF is derived) and is acidic.

Add a little heat and you have near-perfect conditions for the production of HMF.

How much heat?

It’s actually not just heat but a combination of heat and time.

The higher the temperature, the less time is required for the production of a certain amount of HMF. There are several studies of this, but one of the most frequently quoted is from White et al., in 1964 4 which has this slightly skewwhiff, but nevertheless useful, graph of the influence of storage temperature and time on HMF production in honey.

Natural occurrence of HMF

Hydroxymethylfurfural is essentially absent from fresh foods. However, in sugar-containing foods, particularly those that are acidic, HMF levels can build up. A chemical process called a Maillard reaction is responsible for HMF formation (there are other reactions that generate HMF as well, including caramelisation) and the reaction works about five times faster for every 10°C rise in temperature.

Therefore processes such as drying or cooking result in elevated HMF levels. The precise amount varies depending upon the foodstuff, the amount of heating and other factors; typical figures are bread 3 – 180 mg/kg, prunes 240 mg/kg, sugarcane syrup 100 – 300 mg/kg and roast coffee 900 mg/kg 1.
HMF의 자연 발생

히드록시메틸푸르푸랄은 기본적으로 신선한 식품에는 존재하지 않습니다. 그러나 설탕이 함유된 식품, 특히 산성 식품에서는 HMF 수치가 축적될 수 있습니다. 마이야르 반응이라는 화학 반응이 HMF 형성을 담당하며(캐러멜화 등 다른 반응도 HMF를 생성합니다), 온도가 10°C 상승할 때마다 반응이 약 5배 더 빠르게 진행됩니다.

따라서 건조 또는 조리와 같은 공정에서는 HMF 수치가 높아집니다. 정확한 양은 식품, 가열량 및 기타 요인에 따라 다르며, 일반적인 수치는 빵 3~180 mg/kg, 자두 240 mg/kg, 사탕수수 시럽 100~300 mg/kg, 로스트 커피 900 mg/kg 입니다.

이 모든 식품은 완벽하게 안전하게 섭취할 수 있습니다(적어도 HMF 함량 측면에서는... 자두는 약간의 부작용이 있을 수 있습니다 😉 ).

따라서 벌꿀에 함유된 HMF의 40 mg/ml 은 인체 섭취에 대한 안전성과는 아무런 관련이 없다는 것이 분명합니다.

식이성 HMF는 인간에게 발암성을 일으킬 수 있다는 우려가 제기되면서 광범위하게 연구되어 왔습니다. 여러 연구에 따르면 비생리학적 수준 및/또는 장기간 노출 시 세포 독성이 있거나 DNA 중합효소와 같은 세포의 주요 효소가 억제되는 것으로 나타났습니다. 그러나 생체 내 발암성 또는 유전 독성 효과에 대한 증거는 입증되지 않았습니다 .

HMF는 현재 안전한 것으로 간주되며 저산소(저산소) 손상으로부터 보호하고 일부 알레르겐의 활동에 대항하는 유익한 항산화 작용을 하는 것으로 나타났습니다.

꿀에 함유된 HMF

꿀의 화학에 익숙한 독자라면 꿀에 과당(HMF의 원료가 되는 당류 중 하나)이 풍부하고 산성이라는 사실을 잘 알고 계실 것입니다.

약간의 열을 가하면 HMF를 생산할 수 있는 거의 완벽한 조건이 갖춰집니다.

열의 양은 얼마나 되나요?

사실 단순한 열이 아니라 열과 시간의 조합입니다.

온도가 높을수록 일정량의 HMF를 생성하는 데 필요한 시간이 줄어듭니다. 이에 대한 여러 연구가 있지만, 가장 자주 인용되는 연구 중 하나는 1964년 White 등 4의 연구로, 약간 왜곡되어 있지만 그럼에도 불구하고 꿀의 저장 온도와 시간이 HMF 생성에 미치는 영향에 대한 그래프가 있습니다.

HMF production in honey – influence of storage temperature and time(벌꿀의 HMF 생산 - 보관 온도와 시간의 영향)

That’s barely legible – check (and enlarge) the original if needed – but the approximate times/temperatures required to generate 30 mg/kg of HMF in honey 5 are as follows:

30°C ~250 days
50°C ~10 days
70°C ~10 hours
All of which is good news … heating a 15 kg bucket of rock-solid OSR honey overnight at 50°C to melt it before making soft-set honey is unlikely to significantly increase the HMF levels.

How to avoid the generation of HMF in honey

But, if you are worried about HMF levels, you could always produce creamed honey which just requires overnight warming at 33°C.

This is what I now do; not because of any concern over the HMF levels but because it’s:

faster
produces a honey with better batch-to-batch consistency of texture
generates a jarred honey much less susceptible to frosting
Long-term storage of honey results in the formation of HMF. The lower the temperature it is stored (and the shorter the time) the less HMF is produced. For an exhaustive list of HMF levels quantified in honey stored at different temperatures have a look at Table 1 in Shapla et al., (2018).

가독성이 떨어지지만(필요한 경우 원본을 확인(확대)하세요), 꿀이 30 mg/kg의 HMF를 생성하는 데 필요한 대략적인 시간/온도는 다음과 같습니다.

30°C ~250일
50°C ~10일
70°C ~10시간
좋은 소식은 연화 꿀을 만들기 전에 15kg의 단단한 OSR 꿀 통을 50°C에서 하룻밤 가열하여 녹인다고 해서 HMF 수치가 크게 증가하지는 않는다는 점입니다.

벌꿀에서 HMF 생성을 피하는 방법

하지만 HMF 수치가 걱정된다면 33°C에서 하룻밤만 데우면 되는 크림꿀을 만들 수 있습니다.

이것이 바로 제가 지금 하는 일입니다. HMF 수치에 대한 우려 때문이 아니라 그 때문이죠:

더 빨리
배치마다 일관된 질감의 꿀을 생산할 수 있습니다.
성에가 덜 끼는 병꿀을 만들 수 있습니다.
꿀을 장기간 보관하면 HMF가 형성됩니다. 보관 온도가 낮을수록(그리고 보관 시간이 짧을수록) HMF가 적게 생성됩니다. 다양한 온도에서 저장된 벌꿀에서 정량화된 HMF 수치의 전체 목록은 Shapla 외, (2018)의 표 1을 참조하세요.

Store honey carefully in a cool place … or sell, eat or gift it quickly
(꿀을 서늘한 곳에 조심스럽게 보관하거나 빨리 판매, 먹거나 선물하세요.)

It makes senses to store honey in a cool place with a relatively stable temperature.

Quantifying HMF

There are a variety of ways of detecting HMF. Unfortunately, all require laboratory equipment and none are really suitable for home use.

There are spectrophotometric methods – essentially detecting a colour change after adding an indicator that reacts to the presence of HMF – but these can lack both sensitivity and specificity. Some of the chemicals involved are carcinogenic.

More accurate and sensitive are methods use reversed-phase high-performance liquid chromatography. These have been in routine use for years.
꿀은 비교적 온도가 안정된 서늘한 곳에 보관하는 것이 좋습니다.

HMF 정량화하기

HMF를 검출하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 안타깝게도 모두 실험실 장비가 필요하며 가정에서 사용하기에는 적합하지 않습니다.

분광광도법(기본적으로 HMF의 존재에 반응하는 지표를 추가한 후 색상 변화를 감지하는 방법)이 있지만 감도와 특이성이 모두 부족할 수 있습니다. 관련된 화학 물질 중 일부는 발암성 물질입니다.

보다 정확하고 민감한 방법은 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하는 방법입니다. 이 방법은 수년 동안 일상적으로 사용되어 왔습니다.

Orbitrap ID-X Tribrid Mass Spectrometer

Probably the newest and most advanced methods involve the use of time-of-flight mass spectrometry (MS MALDI-TOF). These ionise the constituents of the sample and measure the time they take to reach a detector. Mass spectrometry is exquisitely sensitive and specific … and the equipment is eye-wateringly expensive.

Since you’re unlikely to have one in your honey processing room 6 you’re better off doing your best to avoid conditions that lead to the build-up of HMF in the first place.

OK, enough about honey and humans, what about the bees?

HMF is toxic for both adult bees and developing larvae. The level of toxicity depends upon the concentration of the HMF, the duration of exposure and the developmental stage of the bee.

Krainer and colleagues 7 looked at toxicity of HMF to developing larvae and showed that concentrations up to 750 ppm (i.e. 750 mg/kg) did not reduce larval or pupal mortality.
아마도 가장 최신의 가장 진보된 방법은 비행 시간 질량 분석법(MS MALDI-TOF)을 사용하는 것일 것입니다. 이 방법은 시료의 성분을 이온화하여 검출기에 도달하는 데 걸리는 시간을 측정합니다. 질량 분석은 매우 민감하고 구체적이지만 장비 가격이 엄청나게 비쌉니다.

벌꿀 가공실 6에 이 장비가 있을 가능성은 거의 없으므로 애초에 HMF가 축적되는 조건을 피하기 위해 최선을 다하는 것이 좋습니다.

꿀과 사람에 대한 이야기는 그만하고, 꿀벌은 어떻게 되나요?

HMF는 성충과 애벌레 모두에게 독성이 있습니다. 독성 수준은 HMF의 농도, 노출 기간, 벌의 발달 단계에 따라 달라집니다.

크레이너와 동료 연구자 는 발달 중인 유충에 대한 HMF의 독성을 조사한 결과, 최대 750ppm(즉, 750 mg/kg)의 농도에서는 유충 또는 번데기 사망률이 감소하지 않는 것으로 나타났습니다.

Larval and pupal mortality when exposed to HMF at different concentrations
(다양한 농도의 HMF에 노출되었을 때의 유충 및 번데기 사망률)
They calculated that the LC50 (concentration that produced 50% mortality) at day 7 and day 22 was 4280 ppm and 2424 ppm respectively, with a calculated LD50 (dose per larva that resulted in 50% mortality) of 778 μg and 441 μg at day 7 and day 22 respectively.

Adult bees were less sensitive to HMF in the first week after emergence than during the first week of larval development.
연구팀은 7일째와 22일째의 LC50(50% 폐사를 유발하는 농도)을 각각 4280ppm과 2424ppm으로 계산했으며, 7일째와 22일째의 LD50(50% 폐사를 유발하는 유충당 용량)을 각각 778μg과 441μg으로 계산했습니다.

성충 벌은 애벌레 발달 첫 주보다 출현 후 첫 주에 HMF에 덜 민감했습니다.

Adult bee mortality when fed a diet containing HMF at the levels specified(지정된 수준의 HMF가 포함된 사료를 먹였을 때 성인 꿀벌의 사망률)

What does all this mean?

It means that high levels of HMF are likely to have a significant impact on adult bees, but – at least until the levels are exceptionally high (grams, not milligrams, per kilogram) will probably not adversely impact brood levels.

Further validation of the adverse effects of HMF to adult bees

A similar study was recently conducted by Gregorc and colleagues 8 using lower concentrations of HMF.
이 모든 것이 무엇을 의미할까요?

즉, 높은 수준의 HMF는 성인 꿀벌에게 상당한 영향을 미칠 수 있지만, 적어도 그 수준이 매우 높기 전까지는(킬로그램당 밀리그램이 아닌 그램) 군집 수준에 악영향을 미치지는 않을 수 있다는 뜻입니다.

HMF가 성충 꿀벌에 미치는 악영향에 대한 추가 검증

최근 그레고르크와 그의 동료들이 더 낮은 농도의 HMF를 사용하여 유사한 연구를 수행했습니다.

Survival of adult bees fed with HMF-spike ApifondaHMF (스파이크 아피폰다를 먹인 성충 꿀벌의 생존율)

Again, there was a time/dose response, but note that only about 30% of the control bees survived 30 days and this was only double the number that had been fed the lowest level of HMF-spiked Apifonda. Note the clear evidence of a dose-response with increasing levels of HMF in the diet.

Dysentery

Several studies, dating back at least 50 years, report that high levels of HMF result in dysentery-like symptoms due to ulceration of the gastrointestinal tract of honey bees.

Gregorc and colleagues used immunohistochemistry to investigate the integrity of the gut tissues in the honey bees fed HMF. They stained cells red that were undergoing a process called ‘programmed cell death’ or apoptosis. This is a natural physiological response to damage. The more red staining, the worse the damage.
다시 말하지만, 시간/용량에 따른 반응이 있었지만, 대조군 꿀벌의 약 30%만이 30일 동안 생존했으며, 이는 가장 낮은 수준의 HMF 스파이크 아피폰다를 먹인 꿀벌의 두 배에 불과했습니다. 먹이 내 HMF 농도가 높아질수록 용량 반응이 뚜렷하게 나타난다는 사실에 주목하세요.

이질

최소 50년 전으로 거슬러 올라가는 여러 연구에 따르면, 꿀벌의 위장관 궤양으로 인해 높은 수준의 HMF가 이질과 유사한 증상을 유발하는 것으로 나타났습니다.

그레고르크와 동료들은 면역조직화학을 사용하여 HMF를 먹인 꿀벌의 장 조직이 온전하게 유지되는지 조사했습니다. 그들은 '프로그램된 세포 사멸' 또는 세포 사멸이라고 불리는 과정을 겪고 있는 세포를 붉은색으로 염색했습니다. 이는 손상에 대한 자연스러운 생리적 반응입니다. 붉은 색 염색이 많을수록 손상이 심하다는 것을 의미합니다.

Midgut of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue of worker bees exposed to HMF
(HMF에 노출된 일벌의 포르말린 고정, 파라핀 내장 조직 중 내장)

At higher doses of HMF and/or longer exposure there was increased apoptosis in the gut tissues, presumably accounting for the dysentery-like symptoms often seen (though these were not recorded in this particular study).

Real world beekeeping

All of these bee corpses and fancy-dan immunohistothingamajiggery really just confirm‎ that high levels of HMF are a bad thing™.

In terms of honey processing and storage the allowed levels are nothing to do with human (or bee) health, but everything to do with evidencing overheated, poorly stored or doctored honey.

And since no readers of this blog do these things then there’s no need to be concerned 😉

Assuming your honey starts with low HMF levels (on extraction) then any reasonable levels of heating to liquify honey for filtering, blending or jarring should not result in HMF levels anywhere near to those that would prevent the honey being saleable 9.

Refer to the graph above from the 55 year old paper from White and Co. (shown above) for further validation.

If you’re making thick (2:1 by weight sugar to water) syrup to feed bees perhaps use warm rather than boiling water. However, considering the time involved and the absence of the acidity of honey, even with the latter HMF levels should not get close to high enough levels to endanger the bees.

If you’re making thin (1:1 by weight) syrup then use cold water. Just stir it a bit longer to dissolve it all.

However, take care – or avoid altogether – the use of high fructose corn syrups (HFCS) for feeding bees. I don’t know anyone who does this in the UK and have no experience of it myself. To learn more have a look at this article in Bee Culture. HFCS is high in fructose (the clue is in the name) and acidic, so HMF readily forms.

Studies of commercial HFCS show levels of HMF can start at 30 – 100 mg/kg before any long-term storage.

Oxalic acid

The only time most beekeepers probably need to have concern about HMF levels is in the preparation and storage of oxalic acid solutions for trickle treating colonies in midwinter.

Oxalic acid is, er, acidic. For trickle treating it’s mixed with thin syrup to make a 3.2% solution. The combination of syrup and acidity means that HMF can be produced if stored – for a long time – in unsuitable conditions (under which there is an obvious colour change).
더 높은 용량의 HMF 및/또는 더 오래 노출된 경우 장 조직에서 세포 사멸이 증가했으며, 이는 이질과 유사한 증상이 자주 나타나는 것으로 추정됩니다(이 특정 연구에서는 기록되지 않았지만).

실제 양봉

이 모든 꿀벌 사체와 공상과학적인 면역 조직학은 높은 수준의 HMF가 나쁜 것임을 확인시켜 줍니다™.

벌꿀 가공 및 보관과 관련하여 허용되는 수치는 사람(또는 꿀벌)의 건강과는 아무런 관련이 없으며, 과열되거나 제대로 보관되지 않았거나 조작된 벌꿀을 증명하는 것과만 관련이 있습니다.

이 블로그의 독자 중 이런 일을 하는 사람은 없으니 걱정할 필요는 없습니다 😉.

꿀이 (추출 시) 낮은 HMF 수치로 시작한다고 가정하면, 필터링, 블렌딩 또는 병에 담기 위해 꿀을 액화시키기 위해 적당한 수준의 가열을 해도 꿀의 판매 가능성에 방해가 되는 HMF 수치가 9에 근접해서는 안 됩니다.

추가 검증을 위해 55년 전 White and Co.에서 발표한 위 그래프를 참조하세요(위 그림 참조).

꿀벌에게 먹일 걸쭉한(설탕과 물의 무게 비율이 2:1) 시럽을 만들 때는 끓는 물보다는 따뜻한 물을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 시간이 걸리고 꿀의 산도가 높지 않다는 점을 고려할 때, 후자의 HMF 수치라도 꿀벌을 위험에 빠뜨릴 만큼 높은 수준에 가까워서는 안 됩니다.

묽은(무게 기준 1:1) 시럽을 만들 때는 찬물을 사용하세요. 조금 더 오래 저어주면 모두 녹습니다.

하지만 꿀벌에게 먹이를 줄 때 고과당 옥수수 시럽(HFCS)을 사용하는 것은 주의하거나 아예 피하세요. 영국에서 이를 사용하는 사람을 알지 못하며 직접 사용해 본 경험도 없습니다. 자세한 내용은 꿀벌 문화에서 이 기사를 참조하세요. HFCS는 과당 함량이 높고(이름에 단서가 있음) 산성이므로 HMF가 쉽게 형성됩니다.

상업용 HFCS에 대한 연구에 따르면 장기 보관 시 HMF 수치가 30~100mg/kg에서 시작될 수 있다고 합니다.

옥살산

대부분의 양봉가들이 HMF 수치를 걱정해야 하는 유일한 경우는 한겨울에 벌집을 처리하기 위해 옥살산 용액을 준비하고 보관할 때입니다.

옥살산은 산성입니다. 세류 치료를 위해 묽은 시럽과 혼합하여 3.2% 용액을 만듭니다. 시럽과 산성의 조합은 부적합한 조건(명백한 색상 변화가 있는 조건)에서 장기간 보관할 경우 HMF가 생성될 수 있음을 의미합니다.

Stored OA solution and colour change …
(저장된 OA 솔루션과 색상 변경 ...)

So, if you’re preparing OA solutions for trickle treating either:

use it immediately and safely dispose of the excess
store it at 4°C and use then it as soon as possible (before safely disposing the excess)
Fondant

But what about fondant?

The HMF levels in commercially available fondant have recently been discussed on the Beekeeping Forum. I’m grateful to ‘loyal listener reader’ (to use Radio 4’s More or Less definition) Archie McLellan for bringing this to my attention.

The thread started with the challenging title “The truth behind fondants“.

Like all discussion groups, the contributions are many and varied.

Some wander off-topic.

Others use it as an opportunity to get a little dig in at the opposition.

Or a great big dig 😉

Novices and the naive ask simple questions and hope for straightforward answers 10.

Usernames often give no indication of who the poster actually is.

Is the poster a manufacturer or distributor of BeeCentric fondant™ “The best fondant for bees and a whole lot better than that cr*p they sell for ice buns”?

Does the poster use 5 tonnes of fondant a year and buys anything s/he can get as long as it’s cheap enough?

Or does the contributor have a £576,000 Orbitrap MALDI-TOF mass spectrometer in their basement and a damned good idea of exactly how much HMF is present in every commercial source of fondant?
따라서 트리클 트리트먼트를 위한 OA 솔루션을 준비 중이신 분들도 마찬가지입니다:

즉시 사용하고 남은 양은 안전하게 폐기합니다.
4°C에서 보관하고 가능한 한 빨리 사용하세요(남은 양은 안전하게 폐기하기 전).

퐁당은 어떨까요?
https://theapiarist.org/tag/beecentric-fondant/