법이 공포된 다음 날, 친일 인사들은 '반공구국궐기대회'를 열어 방해공작을 했으나, 반민특위는 예정대로 구성됐다.
1949년 1월 5일 반민특위는 중앙청 205호실에 사무실을 차리고 8일 박흥식을 체포함으로써 본격적인 활동에 들어갔다. 그러나 친일파 처벌에 회의적이었던 이승만은 반민특위의 활동을 방해하고 무력화시키려고 애썼으며 결국 이루게 된다.
이승만은 담화를 통하여 견제하기 시작했는데, 그 요지는 반민특위가 삼권분립의 원칙에 위반되며 안보상황이 위급한 때 경찰을 동요시켜서는 안 된다는 것이었다. 이에 대하여 대법원장이면서 반민특위특별재판부장였던 김병로는 반민특위활동이 불법이 아니라는 담화를 발표하고 정부의 협조를 촉구하였으며 국회 역시 반민특위의 김상덕 위원장과 김상돈 부위원장을 불러 의견을 묻고 대통령담화의 철회를 요구하였다. 그러나 이승만은 계속 비협조로 일관하다 2월 24일 반민법을 유명무실하게 만드는 반민법 법률개정안을 제2회 39차 본회의에 상정하였다. 결과는 부결되었으며, 특위의 활동은 계속되었다.
반민특위는 국권피탈에 협력한 자, 독립운동가들을 고문하고 탄압한 자, 작위를 받은 자, 직간접적으로 협력한 자를 징역에 처하도록 하는 반민족행위 처벌법(반민법)을 1948년 9월에 국회에서 통과시킨다. 그러나, 친일반민족행위자들은 "친일파를 처단하자고 하는 놈은 빨갱이"라는 논리를 내세워 반민특위를 직접적, 간접적으로 방해하였다. 대표적으로, 노덕술 등은 백민태를 통해 반민특위 및 정부요인의 암살을 계획했으나, 백민태가 자수함으로써 미수에 그쳤다.(반민특위 및 정부요인 암살 음모 사건)
이승만 정권은 반민특위의 활동을 비난하는 담화를 다섯 차례나 발표하는 등 반민특위의 활동을 저지하려 하였다.
국회에 침투할 목적으로 북한의 공작원 정재한이 공작을 벌이다가, 암호를 발견하게 되어 1949년 5월에 국회 프락치 사건이 발생하자 이문원 의원 등 소장파 의원 3명을 구속했다. 이에 국회는 세 의원의 석방동의안으로 맞섰지만, 6월 초부터 친일 인사들도 집회를 열며 국회를 습격했다.
1949년 6월 6일 오전 8시 30분, 이승만 대통령의 지시를 받은 윤기병 서울중부경찰서장의 지휘로 시내 각 경찰서에서 차출된 경찰관 80여 명이 반민특위 청사를 습격했다. 이들은 특위 조사관들을 폭행하고 친일파 관련 조사서류와 집기들을 강탈했다. 그 날의 오후에는 서울특별시청의 경찰국에서 사찰과에 속한 440명의 경찰관들이 반민특위 간부 교체, 특별경찰대 해산, 경찰의 신분보장 등을 요구하면서 집단사표를 제출했다. 국회는 6월 9일 책임자 처벌과 반민특위 원상 복귀를 정부에 요구했으나, 이승만 대통령은 6월 11일 반민특위 활동으로 민심이 소요되어 부득이하게 특경대를 해산했다는 담화를 발표했다.
하지만 국회는 이에 반발해 위원장이었던 김상덕은 사퇴하고 이후 반민특위 활동은 급속도로 위축됐다. 그렇게 공석이 된 자리에 법무부 장관 이인을 위원장으로 앉히고(부위원장에는 송필만), 사퇴한 위원들 자리에는 친일파 청산을 반대해온 인사들로 채워 그들로 하여금 내부에서 반민특위를 무력화하여 해체시키는 일을 맡겼다. 결국, 반민특위는 이인 장관이 결정적으로 와해시킨거나 다름없는 셈이다. 한술 더 떠 이승만 본인도 외신기자들에게 자신이 반민특위 습격을 지시했다고 밝혔다.
1949년 6월 6일 반민특위 습격 사건으로 반민특위의 실제적인 활동은 중단되었으며 반민특위의 폐기법안을 통과시키게 함으로써 민족반역자에 대한 처벌을 불가능하게 하였다.
1949년 9월 반민법 개정안이 통과됨으로써 임기가 축소된 반민특위는 그해 10월 4일 반민법의 폐지로 인해 특별검찰부, 특별재판부와 함께 와해되었다. 이 기능은 대법원과 대검찰청으로 이관되었다.