퇴화된 흉선 - 교감 신경조절에 대한 과거, 현재, 미래 2025

[문형철]

Front Immunol

. 2025 Feb 19;16:1552979. doi: 10.3389/fimmu.2025.1552979

Neural regulation of the thymus: past, current, and future perspectives

Randall S Carpenter 1,2, Maria K Lagou 3,4,5, George S Karagiannis 3,4,5,6,7,8,*, Maria Maryanovich 1,2,4,6,*

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PMCID: PMC11880003  PMID: 40046055

Abstract

The thymus is a primary lymphoid organ critical for the development of mature T cells from hematopoietic progenitors. A highly structured organ, the thymus contains distinct regions, precise cytoarchitecture, and molecular signals tightly regulating thymopoiesis. Although the above are well-understood, the structural and functional implications of thymic innervation are largely neglected. In general, neural regulation has become increasingly identified as a critical component of immune cell development and function. The central nervous system (CNS) in the brain coordinates these immunological responses both by direct innervation through peripheral nerves and by neuroendocrine signaling. Yet how these signals, particularly direct neural innervation, may regulate the thymus biology is unclear and understudied. In this review, we highlight historical and current data demonstrating direct neural input to the thymus and assess current evidence of the neural regulation of thymopoiesis. We further discuss the current knowledge gaps and summarize recent advances in techniques that could be used to study how nerves regulate the thymic microenvironment.

초록

흉선은

조혈 전구세포로부터

성숙한 T 세포의 발달에 중요한 일차 림프기관이다.

The thymus is a primary lymphoid organ

critical for the development of mature T cells

from hematopoietic progenitors.

고도로 구조화된 기관인 흉선은

흉선생성을 엄격히 조절하는 뚜렷한 영역, 정밀한 세포구조 및 분자 신호를 포함한다.

이러한 점들은 잘 알려져 있지만,

흉선 신경 분포의 구조적·기능적 의미는 대체로 간과되어 왔다.

일반적으로 신경 조절은

면역 세포 발달과 기능의 핵심 구성 요소로 점차 인식되고 있다.

뇌의 중추신경계(CNS)는

말초 신경을 통한 직접적인 신경 분포와 신경내분비 신호 전달을 통해

이러한 면역학적 반응을 조정한다.

그러나 이러한 신호들,

특히 직접적인 신경 분포가 흉선 생물학을 어떻게 조절하는지는 불분명하며

연구가 부족하다.

본 리뷰에서는

흉선에 대한 직접적인 신경 입력을 입증하는 역사적 및 최신 데이터를 강조하고,

흉세포 생성의 신경 조절에 대한 현재 증거를 평가한다.

또한 현재의 지식 격차를 논의하고,

신경이 흉선 미세환경을 어떻게 조절하는지 연구하는 데 활용될 수 있는 최신 기술 발전들을 요약한다.

Keywords: sympathetic nervous system (SNS), thymus aging, beta-adrenergic signaling pathway, innervation of the thymus, age-related thymic involution, thymus involution, T cell development, thymopoiesis

Introduction

The thymus is an encapsulated primary lymphoid organ responsible for T cell development. It is strictly compartmentalized into an outer cortex and an inner medulla, organized into distinct functional units known as thymic lobules. Early thymocyte (T cell) development starts in the cortex of the lobule, the site of thymocyte progenitor homing, T cell lineage commitment, T cell receptor (TCR) chain gene rearrangement, and positive selection (1, 2). These positively selected thymocytes are then chemoattracted and migrate into the medulla, whose primary role is to eliminate self-reactive thymocytes through promiscuous gene expression‎ of endogenous self-antigens and the process of negative selection. Eventually, functionally mature yet still naïve CD4+ or CD8+ T cells emigrate to the peripheral blood and home to secondary lymphoid organs (1).

Early studies found that the education of thymocytes is facilitated by its stroma, primarily via the thymic epithelial cells (TECs) (1). To date, the TEC population has been most extensively studied among thymic niche cells. Single-cell transcriptomic studies have allowed in-depth characterization and identification of heterogeneous cortical and medullary TEC (cTEC and mTEC, respectively) populations in the thymus, highlighting their complexity (1, 3). Elegant in vivo cell fate-mapping studies have identified at least two bipotent TEC progenitors in the adult thymus exerting regenerative capacity, with the first mainly presenting with a cTEC bias during early life, while the second being mTEC-biased and preserved until later in life (3). While the heterogeneity of cortical TECs (cTECs) is still underappreciated, recent evidence has indicated a progressively linear differentiation pathway starting from the bipotent cTEC-biased progenitor and leading to well-differentiated cTEC expressing an abundance of homing chemokines and signals essential for T cell development (1). Mature cTEC can further become terminally differentiated thymic nurse cells (TNCs) that form specialized large three-dimensional cellular microenvironments, encapsulating and nurturing immature thymocytes with higher efficiency during positive selection (1). However, studies have shown that mTECs are highly heterogeneous, dividing into different subsets. Although the mTEC developmental pathway is rather complex, the accepted paradigm identifies an early divergence of bipotent mTEC-biased progenitors into the committed mTEClo and mTEChi subsets, with the former expressing homing chemokines for the positively selected thymocytes, while the latter presenting self-antigens to thymocytes in an autoimmune regulator (AIRE)-dependent manner for the establishment of self-tolerance (1). Remarkably, in-depth molecular characterization of mTEC subsets has also revealed a subset of “terminally differentiated” post-AIRE population, termed “mimetic cells”, which undergo developmental trajectories of and mirror various specialized peripheral cells to highly express narrower repertoires of highly specific tissue-restricted antigens (4).

Besides TECs, the thymic niche also includes other immune cell types such as macrophages, innate lymphoid cells (ILCs), natural killer T (NKT) cells, dendritic cells, and B cells, which play essential roles in positive selection and tolerance induction (5, 6). Moreover, TEC maintenance is supported by thymic stromal cells of mesenchymal origin, such as fibroblasts. More recently, fibroblasts have been described to have diverse and critical roles in the thymic microenvironment (7–9). Divided into capsular and medullary subsets based on their localization, fibroblasts play crucial roles during thymic development, TEC maintenance, and tolerance induction. Recent transcriptomic studies have revealed that by inducing type 2 immune response, fibroblasts can assist in thymic regeneration, showcasing a deeper and more complex positional role in the thymic niche (10).

Despite the significant strides made in understanding the thymic microenvironment and the regulatory networks within, one critical aspect remains relatively unexplored: the neural regulation of the thymus. In many organs and organ systems, peripheral nerves orchestrate both critical and finetuning processes, typically by regulating the structure and function of stromal components. Although the presence of nerves in the thymus has been documented since the early 20th century, their relationship with the aforementioned stromal components and their functional implications in thymopoiesis remain largely enigmatic. In this review, we examine historical and contemporary evidence of thymic innervation and delve into its potential implications for T cell development and self-tolerance. Additionally, we will highlight the current gaps in knowledge and explore emerging technologies poised to unravel how thymic neural networks and their downstream mechanisms contribute to thymopoiesis.

서론

흉선은

T 세포 발달을 담당하는 캡슐화된 1차 림프기관이다.

이 기관은 외피질과 내수질로 엄격하게 구획되어 있으며,

흉선 소엽으로 알려진 뚜렷한 기능 단위로 구성됩니다.

초기 흉세포(T 세포) 발달은

소엽의 피질에서 시작되며,

이곳은 흉세포 전구세포의 귀소, T 세포 계통 결정,

T 세포 수용체(TCR) 사슬 유전자 재배열 및 양성 선택이 일어나는 부위입니다(1, 2).

이러한 양성 선택된 흉선 세포는 화학유인에 의해 수질로 이동하며,

수질의 주요 역할은 내인성 자가 항원의 광범위한 유전자 발현과

음성 선택 과정을 통해 자가 반응성 흉선 세포를 제거하는 것이다.

결국 기능적으로 성숙했지만

여전히 미경험 상태인 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 말초 혈액으로 이주하여

이차 림프 기관으로 귀소한다(1).

초기 연구에 따르면

흉선 상피 세포(TECs)를 통한 기질 세포가 흉선 세포의 성숙을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다(1).

현재까지 흉선 니치 세포 중 TEC 집단이

가장 광범위하게 연구되었다.

단일 세포 전사체 연구를 통해

흉선 내 이질적인 피질 및 수질 TEC(각각 cTEC 및 mTEC) 집단의 심층적 특성화 및 식별이 가능해졌으며,

이들의 복잡성이 부각되었다(1, 3).

우아한 생체 내 세포 운명 매핑 연구를 통해

성체 흉선에서 재생 능력을 발휘하는 최소 두 가지의 이중능성 TEC 전구세포가 확인되었는데,

첫 번째는 생애 초기에는 주로 cTEC 편향을 보이며,

두 번째는 mTEC 편향을 보이며 생애 후반까지 보존됩니다(3).

피질 TEC(cTEC)의 이질성은 아직 제대로 평가받지 못하고 있지만,

최근 증거에 따르면 이중능력을 가진 cTEC 편향 전구세포에서 시작하여

T 세포 발달에 필수적인 풍부한 호밍 케모카인과

신호를 발현하는 잘 분화된 cTEC로 이어지는

점진적인 선형 분화 경로가 존재하는 것으로 나타났습니다(1).

성숙한 cTEC는 최종적으로 분화된 흉선 간호 세포(TNC)로 전환될 수 있으며,

이는 특화된 대형 3차원 세포 미세환경을 형성하여

양성 선택 과정에서 미성숙 흉선 세포를 더 효율적으로 포획하고 양육한다(1).

그러나 연구에 따르면

mTEC는 매우 이질적이며 서로 다른 하위 집합으로 분화된다.

mTEC 발달 경로는 상당히 복잡하지만,

정립된 패러다임은 이중분화능을 가진 mTEC 편향 전구세포가

초기 단계에서 mTEClo 및 mTEChi 하위 집합으로 분화하는 것을 확인한다.

전자는 양성 선택된 흉선 세포를 위한 귀소 케모카인을 발현하는 반면,

후자는 자가 내성 확립을 위해 자가항원 조절자(AIRE) 의존적 방식으로 흉선 세포에 자가항원을 제시한다 (1).

주목할 점은

mTEC 하위 집합에 대한 심층 분자적 특성화 연구를 통해

“미메틱 세포(mimetic cells)”라 명명된 “종말 분화된” AIRE 후(post-AIRE) 집단이 발견되었다는 것이다.

이 세포들은 다양한 특화된 말초 세포의 발달 경로를 모방하며,

좁은 범위의 고도로 특이적인 조직 제한 항원(tissue-restricted antigens)을 고도로 발현한다(4).

TEC 외에도

흉선 미세환경에는

대식세포, 선천성 림프구(ILC), 자연살해 T(NKT) 세포, 수지상 세포, B 세포 등

다른 면역 세포 유형이 포함되며,

이들은 양성 선택과 내성 유도에서 필수적인 역할을 수행한다(5, 6).

흉선에는 다양한 수지상 세포(DC)가 존재하며, 이들은 특정 위치에 분포하고 서로 다른 항원 처리 및 제시 특성을 지닌다. 이는 흉선 세포 선택을 매개하는 데 중복되지 않는 역할을 수행함을 시사한다. SIRPα+ 고전적 DC2 하위 집합을 제거하기 위한 노력에서, 우리는 흉선 내 상당 부분이 표면 렉틴인 CD301b를 발현한다는 사실을 발견했습니다. 이 세포들은 피부 배액 림프절에 존재하는 CD301b+ 2형 면역 반응 촉진 DC와 유사합니다. 흉선의 다른 DC 하위집단과의 전사체 및 표현형 비교를 통해, 흉선 CD301b+ cDC가 항원 처리 및 제시 능력이 강화된 활성화 상태를 나타냄을 확인했습니다. 또한 CD301b+ cDC2 하위집단은 2형 사이토카인 서명을 보였으며, 정상 상태에서 인터루킨-4 수용체 신호전달이 필요했습니다. CD301b+ cDC2 하위 집합의 선택적 제거는 조절 T 세포(Treg 세포)에 영향을 미치지 않으면서 클론 삭제 기능을 손상시켰다. T 세포 수용체 α 레퍼토리 시퀀싱은 cDC2 하위 집합이 Treg 세포 선택에 최소한의 영향만을 주면서 일반 T 세포의 삭제를 촉진함을 확인했다. 종합하면, 이러한 결과들은 흉선 내 DC의 사이토카인 유도 활성화가 중추적 내성을 실질적으로 강화함을 시사한다.

또한

TEC 유지에는 섬유아세포와 같은

중간엽 기원 흉선 기질 세포가 기여한다.

최근 연구에서는

섬유아세포가 흉선 미세환경에서 다양하고 중요한 역할을 수행한다는 사실이 밝혀졌다(7–9).

위치에 따라 피막부 섬유아세포와 수질부 섬유아세포로 구분되는 이들은

흉선 발달, TEC 유지, 내성 유도 과정에서 핵심적 기능을 수행한다.

최근 전사체 연구에 따르면,

섬유아세포는 제2형 면역 반응을 유도함으로써 흉선 재생을 보조할 수 있으며,

이는 흉선 틈새에서 더 깊고 복잡한 위치적 역할을 보여준다(10).

흉선 미세환경과 그 내부의 조절 네트워크에 대한 이해가 크게 진전되었음에도 불구하고,

한 가지 중요한 측면은 상대적으로 덜 탐구된 상태로 남아 있다:

흉선의

신경 조절이다.

많은 장기 및 장기 시스템에서 말초 신경은

일반적으로 기질 구성 요소의 구조와 기능을 조절함으로써

핵심적 과정과 미세 조정 과정을 조율한다.

비록 흉선에 신경이 존재한다는 사실은

20세기 초부터 기록되어 왔지만,

앞서 언급한 기질 구성 요소들과의 관계 및 흉선 발생에서의 기능적 함의는

여전히 대부분 미스터리로 남아 있다.

본 리뷰에서는

흉선 신경 분포에 관한 역사적 및 현대적 증거를 검토하고,

T 세포 발달과 자가 내성에 미치는 잠재적 함의를 심층적으로 탐구한다.

또한 현재의 지식 격차를 강조하고,

흉선 신경망과 그 하류 메커니즘이 흉선 발생에 어떻게 기여하는지 규명할 수 있는 신기술을 살펴본다.

Evidence of direct neural innervation of the thymus

In 1929, Pine & Majman reported on the direct innervation of the thymus, characterizing nerve bundles running along large vessels and forming plexuses that envelop the vascular wall (11). They characterized these nerves as sympathetic in origin due to their lack of myelination and size. Nearly fifty years later, in the 1980s, Williams & Felten (12) described “varicose fibers” that associated with arteries and arterioles, with “plexuses which lay in the adventitia outside of the external limiting membrane.” Sparse innervation of the parenchyma was also noted without any vascular association. Soon after, Bulloch & Pomerantz observed acetylcholinesterase (AChE)-positive fibers on the surface of the thymus, while catecholamine-positive fibers from the sympathetic nervous system (SNS) were noted along large blood vessels, the capsule, and intralobular septa of the thymus (13). Further noted were the many nerve fibers associated with the vasculature of the cortico-medullary junction (CMJ), with vasculature-free fibers in the parenchyma of both the medulla and cortex. Felten & colleagues followed up with an in-depth assessment of the SNS innervation to the thymus (14). Their studies demonstrated that sympathetic nerve fibers run along the capsule, entering the thymic parenchyma into the cortex and along vessels that dive into the thymus directly from the capsule. They then hypothesized that these nerves release neurotransmitters into the thymus to regulate blood flow, directly activate adrenergic receptors on lymphocytes, or indirectly influence thymocytes by activating adrenergic receptors on supporting cells.

These early studies demonstrated the presence of SNS fibers in the thymus, although their origin was not resolved. At first, retrograde tracing labeled neurons in the spinal cord and brainstem (15). However, a later study refuted this, demonstrating that SNS nerves were derived from the sympathetic chain, including the superior cervical ganglia (16). Indeed, retrograde labeling observed in the spinal cord or brainstem was caused by contaminating nearby muscle tissue and other structures with retrograde tracer (16). However, another tracing study by Tollefson & Bulloch using fluorogold again demonstrated labeling in the cervical spinal cord and brainstem, concluding actual labeling of efferent projections of the vagus nerve (17). Other studies have not detected gross anatomical connections between the vagus/phrenic nerves and the thymus (16), although connections between the thymus and the stellate ganglia of the sympathetic chain were also reported (13). Thus, the relative contribution of the cervical and stellate ganglia to thymic SNS innervation is currently unclear, although they both partially contribute ( Figure 1A ). Importantly, the study by Tollefson & Bulloch did not address two issues brought up by Nance and colleagues: 1. the lack of gross anatomical connections between the thymus and vagus/phrenic nerves, and 2. the unaltered AChE labeling within the thymus following unilateral cervical vagotomy (16). These observations imply an absence of direct parasympathetic input via the vagus nerve. Tollefson & Bulloch did cede that small amounts of tracer could traverse lymphatics or leak to other tissues, possibly causing the labeling in the brain stem and cervical spinal cord, but remained adamant regarding parasympathetic input to the thymus.

흉선의 직접적 신경 분포 증거

1929년 Pine & Majman은 흉선의 직접적 신경 분포를 보고하며,

대혈관을 따라 달리며 혈관벽을 감싸는 신경총을 형성하는 신경 다발을 특성화하였다(11).

이들은 수초화가 없고 크기가 작다는 점에서

이 신경들을 교감신경 기원으로 특성화하였다.

거의 50년이 지난 1980년대에 Williams & Felten(12)은 동맥 및 세동맥과 연관된 “정맥류 섬유”와 “외부 제한막 바깥쪽 외막에 위치한 신경총”을 기술했습니다. 혈관과 연관되지 않은 실질 조직의 드문 신경 분포도 관찰되었습니다. 곧이어 불로크와 포메란츠(Bulloch & Pomerantz)는 흉선 표면에서 아세틸콜린에스테라제(AChE) 양성 섬유를 관찰했으며, 교감신경계(SNS)의 카테콜아민 양성 섬유는 흉선의 대혈관, 피막, 소엽간 격막을 따라 분포하는 것으로 확인되었다(13).

추가로 피질-수질 접합부(CMJ) 혈관과 연관된 다수의 신경 섬유가 확인되었으며,

수질과 피질 실질 모두에서 혈관과 무관한 섬유가 존재함이 밝혀졌다.

펠텐(Felten)과 동료들은

흉선으로의 교감신경계(SNS) 신경 분포에 대한 심층 평가를 후속 연구로 수행하였다(14).

그들의 연구는

교감 신경 섬유가 캡슐을 따라 진행하여

흉선 실질 내 피질로 진입하고,

캡슐에서 직접 흉선으로 침투하는 혈관을 따라 진행함을 입증했다.

이후 그들은 이러한 신경들이 흉선 내로 신경전달물질을 방출하여 혈류를 조절하거나,

림프구 상의 아드레날린성 수용체를 직접 활성화하거나,

지지 세포 상의 아드레날린성 수용체를 활성화함으로써 흉선 세포에 간접적으로 영향을 미친다는 가설을 제시했다.

이러한 초기 연구들은 기원의 규명은 이루어지지 않았지만 흉선에 교감신경계 섬유가 존재함을 입증했다. 초기 역행적 추적법은 척수와 뇌간의 뉴런을 표지했다(15). 그러나 후속 연구는 이를 반박하며, 교감신경계 신경이 상부 경추 신경절을 포함한 교감신경 사슬에서 유래함을 입증했다(16). 실제로 척수나 뇌간에서 관찰된 역행성 표지는 근접한 근육 조직 및 기타 구조물에 역행성 추적자가 오염되어 발생한 것이었다(16).

그러나

Tollefson & Bulloch가 플루오로골드를 사용한 또 다른 추적 연구에서는

경추 척수와 뇌간에서 표지가 다시 관찰되어

미주 신경의 원심성 투사 신경의 실제 표지를 입증하였다(17).

다른 연구들에서는

미주/횡격막 신경과 흉선 사이의 거시적 해부학적 연결을 발견하지 못했습니다(16).

다만 흉선과 교감 신경계의 성상 신경절 사이의 연결은 보고된 바 있습니다(13).

따라서

경추 신경절과 성상 신경절이

흉선의 교감신경계(SNS) 신경 분포에 기여하는 상대적 비율은 현재 불분명합니다.

다만 양쪽 모두 부분적으로 기여하는 것으로 알려져 있습니다( 그림 1A ).

중요한 점은 Tollefson & Bulloch의 연구가 Nance와 동료들이 제기한 두 가지 문제를 다루지 않았다는 것이다:

1. 흉선과 미주/횡격막 신경 사이의 거시적 해부학적 연결 부재,

2. 일측 경부 미주절제술 후 흉선 내 AChE 표지 변화 없음 (16).

이러한 관찰 결과는 미주 신경을 통한 직접적인 부교감 신경 입력의 부재를 시사한다. Tollefson & Bulloch는 소량의 추적자가 림프관을 통과하거나 다른 조직으로 누출되어 뇌간 및 경추 척수에서의 표지 현상을 유발할 가능성은 인정했으나, 흉선으로의 부교감 신경 입력에 대해서는 여전히 확고한 입장을 고수했다.

Figure 1.

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Innervation of the thymus. (A) Diagrams of the brain, brain stem, spinal cord, and sympathetic ganglia summarizing the origin of neural innervation of the thymus. The thymus is innervated by sympathetic nerves that arise from the cervical and stellate ganglia of the sympathetic trunk, which are connected to cells in the intermediolateral cell column (IML) of the thoracic spinal cord from T1 to T7 (peak connectivity at the T2 spinal level). Other brain regions connected functionally to thymic sympathetic neurons include the pons, medulla oblongata (med. obl.), and hypothalamus. (B) Diagram of a thymic lobule, demonstrating sympathetic innervation along large vessels that reside in the cortico-medullary junction (CMJ), with some fibers branching into the cortical parenchyma. Sympathetic nerves also innervate the capsule, projecting individual nerve fibers into the subcapsular cortex, and along the trabeculae. (C, D) Confocal images showing sympathetic innervation (β3-Tubulin+/TH+ nerves) of blood vessels (CD31+/CD144+) in a young adult mouse thymus. Scale bar = 25μm. Panels (A, B) created with BioRender.com.

흉선의 신경 분포. 

(A) 흉선의 신경 분포 기원을 요약한 뇌, 뇌간, 척수 및 교감 신경절의 도식도. 흉선은 교감 신경총의 경부 및 별상 신경절에서 기원한 교감 신경에 의해 신경 분포를 받으며, 이는 T1부터 T7까지(T2 척추 수준에서 연결성이 최고점) 흉추의 중간측 세포 기둥(IML)에 있는 세포들과 연결된다. 흉선 교감 신경 세포와 기능적으로 연결된 다른 뇌 영역으로는 뇌교, 연수(med. obl.), 시상하부가 포함된다. 

(B) 흉선 소엽의 도면으로, 피질-수질 접합부(CMJ)에 위치한 큰 혈관을 따라 교감 신경 분포가 이루어지며, 일부 섬유는 피질 실질로 분기되는 것을 보여준다. 교감 신경은 또한 캡슐을 신경 분포하며, 개별 신경 섬유를 피막하 피질과 골격 구조를 따라 투사합니다. 

(C, D) 젊은 성인 마우스 흉선에서 혈관(CD31+/CD144+)의 교감 신경 분포(β3-Tubulin+/TH+ 신경)를 보여주는 공초점 이미지. 척도 막대 = 25μm. 패널 (A, B)는 BioRender.com으로 제작되었습니다.

Viral tracing of thymic sympathetic nerves demonstrated connectivity to the intermediolateral cell column of the spinal cord between T1 and T7 thoracic segments ( Figure 1A ), with the highest density occurring at the T2 thoracic segment (18). Longer periods of tracing labeled cells in the intercalated nucleus and central autonomic nucleus of the spinal cord and labeled brainstem neurons in the pons and medulla oblongata ( Figure 1A ). The vagus nerve nuclei were not labeled, further supporting that the thymus receives little to no input from the parasympathetic nervous system (PNS). Tracer labeling was also found in multiple hypothalamic nuclei ( Figure 1A ), including the paraventricular nucleus, a master regulator of autonomic function (19).

In summary, early anatomical studies revealed that sympathetic nerves enter the thymus along the vascular network, with singular nerves occasionally extending from vessel branches into the adjacent cortical parenchyma ( Figure 1B ). Indeed, many innervated vessels strictly localize to the CMJ. Conversely, capsular nerves project from the capsule into the subcapsular cortex, some by following along the septa and vessels, while others by circumventing the vasculature and penetrating directly into the cortical parenchyma. Kendall and Al-Shawaf have also shown that the subcortical region is densely innervated by finely varicose fibers that often do not associate with capillaries (20). While some studies found fibers potentially related to parasympathetic innervation (13, 17, 20), many others suggest that parasympathetic innervation is non-existent, attributing the positive results to unintended technical errors (12, 14, 16, 18).

Interestingly, some nerves, established as SNS nerves from these prior studies, also express peptidergic neurotransmitters neuropeptide Y (NPY), vasoactive intestinal peptide (VIP), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) (12, 14, 20–22). While sympathetic nerves can produce NPY, VIP is usually associated with the brain and digestive system, and as such, the neural source of VIP in the thymus is currently unclear. VIP and NPY both regulate gut immunity and may similarly act on developing T cells in the thymus (23, 24). Finally, CGRP is typically associated with nociceptive nerves, but no direct evidence of sensory/nociceptive innervation of the thymus is available besides positive CGRP immunoreactivity (21, 22).

A recent immunohistological study using the common neuronal/axonal marker neurofilament (NF) reported remarkable labeling in the cortex and medulla of the thymus (25). While some NF signal colocalized with large CD31+ blood vessels, much of the labeling in both cortex and medulla formed a ramified cellular pattern similar to intermediate filament (e.g., cytokeratin) labeling of TECs. Therefore, whether these NF-expressing structures are indeed nerves or define other thymic cells expressing NF as part of their normal developmental program remains unclear. In the same study, the authors did not incorporate other general or axon-specific markers to verify the precise cellular source of NF immunolabeling. These results are in contrast with previous literature as well as with our observations demonstrating that the general axon marker β3-Tubulin and the SNS-specific marker tyrosine hydroxylase (TH), both labeled sympathetic nerves associated with large blood vessels in murine thymic tissue ( Figures 1C, D ).

흉선 교감 신경의 바이러스 추적 결과, Viral tracing of thymic sympathetic nerves

T1과 T7 흉추 사이의 척수 중간측 세포 기둥( 그림 1A )과의 연결성이 확인되었으며,

가장 높은 밀도는 T2 흉추에서 나타났습니다(18).

더 긴 추적 기간 동안 척수의 intercalated nucleus 및 central autonomic nucleus에서 세포가 표지되었으며, 뇌교 및 연수에서 뇌간 뉴런이 표지되었습니다 ( 그림 1A ). 미주신경핵은 표지되지 않았으며, 이는 흉선이 부교감신경계(PNS)로부터 거의 또는 전혀 입력을 받지 않음을 추가로 뒷받침한다. 추적자 표지는 또한 자율신경 기능의 주요 조절인자인 시상하부 내측핵을 포함한 여러 시상하부 핵( 그림 1A )에서도 발견되었다(19).

요약하면, 초기 해부학적 연구에서

교감 신경이 혈관 네트워크를 따라 흉선으로 진입하며,

일부 신경은 혈관 분지에서 인접한 피질 실질로 확장되는 경우가 있음을 밝혀냈다( 그림 1B ).

실제로 많은 신경 분포 혈관은 CMJ에 엄격히 국한된다. 반대로, 피막 신경은 피막에서 피막하 피질로 투사되며, 일부는 격막과 혈관을 따라 이동하는 반면, 다른 일부는 혈관을 우회하여 피질 실질로 직접 침투한다. 켄달(Kendall)과 알-샤와프(Al-Shawaf)는 또한 피질하 영역이 종종 모세혈관과 연관되지 않는 미세하게 정맥류화된 섬유들에 의해 조밀하게 신경 분포된다는 것을 보여주었다(20). 일부 연구에서는 부교감 신경 분포와 잠재적으로 관련된 섬유를 발견했지만(13, 17, 20), 다른 많은 연구들은 부교감 신경 분포가 존재하지 않으며, 양성 결과는 의도하지 않은 기술적 오류에 기인한다고 제안합니다(12, 14, 16, 18).

흥미롭게도,

이전 연구에서 교감신경계 신경으로 확인된 일부 신경들은

펩타이드성 신경전달물질인

신경펩타이드 Y(NPY), 혈관활성 장펩타이드(VIP), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)도 발현한다(12, 14, 20–22).

교감 신경은 NPY를 생성할 수 있지만,

VIP는 일반적으로 뇌 및 소화 기관과 연관되어 있으므로,

현재 흉선 내 VIP의 신경학적 기원은 불분명하다.

VIP와 NPY는 모두 장 면역을 조절하며, 흉선에서 발달 중인 T 세포에 유사하게 작용할 수 있다(23, 24). 마지막으로, CGRP는 일반적으로 통각 신경과 연관되지만, 흉선에 대한 감각/통각 신경 분포의 직접적인 증거는 CGRP 면역반응성 양성 결과 외에는 존재하지 않는다(21, 22).

신경섬유(NF)라는 일반적인 신경/축삭 표지자를 사용한 최근 면역조직학적 연구에서는 흉선의 피질과 수질에서 현저한 표지 반응이 보고되었다(25). 일부 NF 신호는 큰 CD31+ 혈관과 공위소화되었으나, 피질과 수질 모두에서 관찰된 표지 반응의 상당 부분은 T 세포 상피세포(TECs)의 중간 필라멘트(예: 사이토케라틴) 표지와 유사한 분지형 세포 패턴을 형성하였다.

따라서 이러한 NF 발현 구조가 실제로 신경인지, 아니면 정상 발달 과정의 일부로 NF를 발현하는 다른 흉선 세포를 정의하는지는 여전히 불분명하다. 동일한 연구에서 저자들은 NF 면역표지의 정확한 세포적 기원을 확인하기 위해 다른 일반적 또는 축삭 특이적 표지자를 포함시키지 않았다. 이러한 결과는 일반 축삭 표지자 β3-튜불린과 교감신경계 특이적 표지자 티로신 하이드록실라제(TH)가 모두 생쥐 흉선 조직에서 대혈관과 연관된 교감신경을 표지했다는 우리의 관찰 결과 및 기존 문헌과 대조된다( 그림 1C, D ).

Non-neural sources of neurotransmitter production and signaling

Given that some neurotransmitters can be generated by non-neuronal cells, including lymphocytes, to modulate immune cell functions (26–28), it is important to consider neurotransmitter production and signaling within the thymic environment in the absence of parental nerves. This possibility may justify why certain neuronal markers are identified in the thymus without clear input from nerve structures. For example, acetylcholine may be locally synthesized within the thymus by thymocytes and other cell types (29, 30), which could further explain the positive labeling of AChE and choline acetyltransferase (ChAT) without documented existence of the corresponding nerves. Indeed, using ChAT-GFP mice, a subset of TECs expressing the epithelial marker cytokeratin were also identified to be cholinergic (31). These cells were closely associated with nicotinic acetylcholine receptor-expressing cells and denuded from direct neural innervation, indicating a paracrine signaling mechanism. However, immunolabeling for neural markers within TECs could be due to the presence of thymic mimetic cells, a subset of TECs that express tissue-restricted antigens (32). Indeed, a previous report found a small but significant population of TECs expressing neural markers (33).

Interestingly, the murine thymus expresses high levels of phenylethanolamine N-methyltransferase (PNMT), the key enzyme involved in the conversion of norepinephrine (NE) to epinephrine (34). PNMT levels in the cortex were doubled than those in the medulla, and overall PNMT levels were equivalent to those seen in the brainstem of the CNS. Thus, it is intriguing to speculate that cells in the thymus can uptake NE released from sympathetic nerves, convert it to epinephrine autonomously, and subsequently utilize epinephrine as a secondary signaling cascade throughout the thymic parenchyma.

Isolated thymocytes stimulated with concanavalin A or IL-2 show a concentration and time-dependent increase in intracellular and extracellular CGRP (35). Stimulated thymocytes increase CGRP mRNA expression‎. Notably, exogenous CGRP increased proliferation and IL-2 production during concanavalin A stimulation, demonstrating that CGRP can enhance thymocyte responses. Serotonergic and dopaminergic signaling components have also been found in the thymus, with potential roles for their signaling in mediating T cell development (36–38). Thymocytes and thymic niche cells can also express metabotropic glutamate receptors, exhibiting differential levels of surface expression‎ depending on the stage of thymocyte development (39). Thymocytes also express α- and β-adrenergic receptors (40, 41). Together, these studies indicate that neurotransmitters are likely co-opted by cells in the thymus to coordinate T cell development even in the absence of the corresponding parental nerves. However, whether paracrine neurotransmitter production or release in the thymus is influenced by brain activity, either through direct neural or indirect neuroendocrine signals, is largely unknown.

신경전달물질 생성 및 신호전달의 비신경원적 기원

일부 신경전달물질이

림프구를 포함한 비신경세포에 의해 생성되어

면역세포 기능을 조절할 수 있다는 점(26–28)을 고려할 때,

부모 신경이 존재하지 않는 흉선 환경 내에서의 신경전달물질 생성 및 신호전달을 고려하는 것이 중요하다.

이러한 가능성은 신경 구조로부터의 명확한 입력 없이도

흉선에서 특정 신경 표지자가 확인되는 이유를 설명할 수 있다.

예를 들어,

아세틸콜린은 흉선 세포 및 기타 세포 유형에 의해

흉선 내에서 국소적으로 합성될 수 있다(29, 30).

이는 해당 신경의 존재가 기록되지 않았음에도

AChE 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 양성 표지가 관찰되는 현상을 추가로 설명할 수 있다.

실제로 ChAT-GFP 마우스를 사용한 연구에서 상피 마커인 사이토케라틴을 발현하는 일부 TEC 세포가 콜린성 세포로 확인되기도 했다(31). 이 세포들은 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 발현하는 세포들과 밀접하게 연관되어 있었으며, 직접적인 신경 분포가 없는 상태였는데, 이는 파라크린 신호 전달 기전을 시사한다. 그러나 TEC 내 신경 마커에 대한 면역표지는 조직 특이적 항원을 발현하는 TEC의 하위 집합인 흉선 모방 세포(thymic mimetic cells)의 존재 때문일 수 있다(32). 실제로, 이전 보고에서는 신경 마커를 발현하는 소수이지만 유의미한 TEC 집단을 발견했다(33).

흥미롭게도, 생쥐 흉선은 노르에피네프린(NE)을 에피네프린으로 전환하는 핵심 효소인 페닐에탄올아민 N-메틸트랜스퍼라제(PNMT)를 높은 수준으로 발현한다(34). 피질의 PNMT 수준은 수질보다 두 배 높았으며, 전체 PNMT 수준은 중추신경계(CNS)의 뇌간에서 관찰되는 수준과 동등했다. 따라서 흉선 세포가 교감신경에서 방출된 NE를 흡수하여 자율적으로 에피네프린으로 전환한 후, 흉선 실질 전체에 걸쳐 이차 신호 전달 경로로 에피네프린을 활용할 수 있다는 가설은 흥미롭다.

콘카나발린 A 또는 IL-2로 자극된 분리된 흉선 세포는 세포 내외부 CGRP 농도가 시간 의존적으로 증가하는 양상을 보인다(35). 자극된 흉선 세포는 CGRP mRNA 발현을 증가시킵니다. 특히, 외인성 CGRP는 콩카나발린 A 자극 중 증식과 IL-2 생산을 증가시켜 CGRP가 흉선 세포 반응을 증강시킬 수 있음을 입증했습니다. 세로토닌성 및 도파민성 신호 전달 구성 요소도 흉선에서 발견되었으며, 이들의 신호 전달은 T 세포 발달을 매개하는 데 잠재적 역할을 할 수 있습니다 (36–38).

흉선 세포와 흉선 니치 세포는 또한 대사성 글루타메이트 수용체를 발현할 수 있으며, 흉선 세포 발달 단계에 따라 표면 발현 수준이 차이를 보인다(39). 흉선 세포는 또한 α- 및 β-아드레날린 수용체를 발현한다(40, 41). 이러한 연구들은 흉선 내 세포들이 해당 부모 신경이 존재하지 않더라도 신경전달물질을 활용하여 T 세포 발달을 조율할 가능성이 있음을 시사한다. 그러나 흉선 내 파라크린 신경전달물질 생성 또는 방출이 직접적인 신경 신호나 간접적인 신경내분비 신호를 통해 뇌 활동의 영향을 받는지는 대부분 알려지지 않았다.

A functional role for neural signals in regulating thymopoiesis

What is the role of extensive neural innervation in the thymus? While many anatomical studies speculate on potential functions, few experimental studies exist. Thymic sympathetic nerves were shown to release NE in response to field stimulation in rats (42). This stimulation was ablated in calcium-free conditions and in the presence of the sodium channel blocker tetrodotoxin, indicating that NE release was axonal in origin. Patch-clamp recording of thymocytes demonstrated that NE inhibits voltage-gated potassium channels in a dose-dependent manner (42). Thus, NE is likely released through sympathetic nerve terminals in response to increased neuronal activity, where it acts locally through diffusion to nearby cell types, including thymocytes and other stromal cells, such as TECs. Interestingly, the muscarinic acetylcholine receptor agonist oxotremorine and prostaglandin E2 were both able to inhibit stimulation-dependent NE release in rat thymus sections (43), suggesting that other signals within the thymus may modulate sympathetic activity. Another critical discovery from these studies is that NE released by sympathetic nerves within the thymus binds to α2c-adrenergic receptors directly on the nerves, generating a tonic inhibitory feedback loop that may help mediate sympathetic tone.

Although stress-mediated thymic atrophy is typically associated with glucocorticoid-mediated apoptosis of DP thymocytes (44), there is critical evidence that activation of SNS nerves may also independently contribute to this phenotype via NE release and its direct impact on thymocytes. Isoprenaline, a β1 and β2 adrenergic receptor-specific agonist, induced apoptosis in double-positive (DP) thymocytes freshly isolated from adult thymus through the activation of Src tyrosine kinases (45). Thymocyte gene expression‎ may also be altered by catecholamines, as Thy-1 expression‎ on thymocytes is reduced by NE signaling through β-adrenergic receptor signaling, suggesting mRNA destabilization is rapidly influenced by these signals (46, 47). Catecholamines may also inhibit thymocyte activation by concanavalin A, although the reported mechanism seems independent of classical receptor activation, as catecholamine-mediated inhibition was not blocked using adrenergic receptor antagonists (48). In addition, neuropeptide Y was reported to alter chemotaxis and adherence of thymocytes in in vitro conditions (49). As discussed above, most studies examine a direct effect of NE and other neurotransmitter signaling on thymocytes and neglect potential interactions within the thymic microenvironment involving epithelial and non-epithelial stromal cells. In one prominent study, isolated rat TECs responded to NE by increasing IL-6, suggesting the ability to alter their cytokine production in response to adrenergic signaling (50). In another study, in vivo and in vitro treatment with the muscarinic acetylcholine antagonist atropine promoted apoptosis of thymocytes, which only occurred in the presence of TECs (29). Thymocytes may directly produce acetylcholine as they express high levels of ChAT mRNA, a key enzyme that produces acetylcholine (29). Thus, thymocytes may use acetylcholine to signal TECs to promote their survival. A major limitation to many of the discussed experiments is the use of isolated primary thymocytes, extracted from the thymic microenvironment and relevant signals that regulate thymopoiesis and treated in vitro with supraphysiological levels of neurotransmitters and/or respective agonists/antagonists. To understand their physiological roles, neurotransmitter signaling should be studied in the in vivo complex structure of the thymic microenvironment. While little is known, a few studies point to their possible importance in thymus function and T cell development.

A study using a mouse model of Krabbe disease, a progressive demyelinating disease resulting in autonomic denervation of lymphoid organs, demonstrated that while lymphoid organs were normal at postnatal day 15, rapid thymic involution occurred, primarily due to thymocyte apoptosis (51). This was associated with the loss of sympathetic nerve fibers and altered β-adrenergic receptor expression‎, suggesting that thymic SNS innervation may be critical in regulating thymopoiesis. The depletion of neural crest-derived cells, which include sympathetic nerves in addition to a subset of mesenchymal cells (expressing platelet-derived growth factor receptors α and β, and α-smooth muscle actin) typically involving fibroblasts and pericytes, also results in rapid thymic involution (52). However, this model used a Wnt1-Cre deletion line, which recombines in non-neural cells throughout the body and, as such, is not specific to the thymus. Along the same lines, using 6-hydroxydopamine (6-OHDA), known to induce global peripheral sympathectomy, also resulted in significant loss of thymocytes. However, this was likely not due to the specific loss of β-adrenergic signaling, as two week-long daily injections of propranolol and cyanopindolol did not replicate this phenotype. Indeed, 6-OHDA primarily impacted the cortex by inducing apoptosis in DP thymocytes (20, 53, 54). These studies suggest a potential beneficial role for catecholamine signaling in the thymus that, when lost through disease or genetic deletion, may impair thymus function.

How neural innervation and activity are altered in physiological aging or a diseased context is vastly understudied. Studies utilizing cuprizone treatment and experimental autoimmune encephalitis models of multiple sclerosis have shown that these models are associated with thymic atrophy and thymocyte apoptosis (55–59). Whether this is due to altered CNS-thymus crosstalk is unclear. However, a recent publication examined thymic innervation in response to experimental autoimmune encephalitis (60). The authors used multiple markers of neurons and axons, with data reporting increased nerve fiber density in diseased mice. In this study, however, immunostaining often does not appear to be axonal, and retrograde tracing was performed with an unidentified tracer, raising concerns about data interpretation. Nevertheless, the study reported reduced tracer uptake in diseased mice, further implying changes in the intrathymic innervation networks or the retrograde transport capacity, although the possibility of technical artifacts cannot be excluded.

흉선생성 조절에서 신경 신호의 기능적 역할

흉선의 광범위한 신경 분포는 어떤 역할을 하는가?

많은 해부학적 연구가 잠재적 기능을 추측하지만, 실험적 연구는 거의 존재하지 않는다. 쥐에서 흉부 교감 신경은 전계 자극에 반응하여 NE를 방출하는 것으로 나타났다(42). 이 자극은 칼슘이 없는 조건과 나트륨 채널 차단제 테트로도톡신 존재 하에서 소멸되었는데, 이는 NE 방출이 축삭 기원이 됨을 시사한다. 흉선 세포의 패치 클램프 기록을 통해 NE가 용량 의존적으로 전압 의존성 칼륨 채널을 억제한다는 사실이 입증되었다(42). 따라서 NE는 신경 활동 증가에 반응하여 교감 신경 말단을 통해 분비되며, 확산을 통해 흉선 세포 및 TEC(흉선 상피세포)와 같은 주변 간질 세포를 포함한 인근 세포 유형에 국소적으로 작용할 가능성이 높다. 흥미롭게도, 무스카린성 아세틸콜린 수용체 작용제인 옥소트레모린과 프로스타글란딘 E2는 모두 쥐 흉선 절편에서 자극 의존적 NE 방출을 억제할 수 있었습니다(43). 이는 흉선 내부의 다른 신호가 교감신경 활동을 조절할 수 있음을 시사합니다. 이러한 연구에서 밝혀진 또 다른 중요한 발견은 흉선 내 교감 신경에 의해 방출된 NE가 신경에 직접 존재하는 α2c-아드레날린성 수용체에 결합하여 교감 신경 긴장도를 조절하는 데 도움이 될 수 있는 강장성 억제 피드백 루프를 생성한다는 점이다.

스트레스 매개 흉선 위축은 일반적으로 DP 흉선 세포의 글루코코르티코이드 매개 세포 사멸과 관련이 있지만(44), SNS 신경의 활성화가 NE 방출과 흉선 세포에 대한 직접적인 영향을 통해 이 표현형에 독립적으로 기여할 수도 있다는 중요한 증거가 있습니다. β1 및 β2 아드레날린 수용체 특이적 작용제인 이소프렌알린은 Src 티로신 키나아제 활성화를 통해 성인 흉선에서 신선하게 분리된 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 세포 사멸을 유도했습니다(45). 가슴샘 세포의 유전자 발현도 카테콜아민에 의해 변화될 수 있는데, 가슴샘 세포의 Thy-1 발현은 β-아드레날린성 수용체 신호를 통한 NE 신호에 의해 감소되어, mRNA 불안정화가 이러한 신호에 의해 빠르게 영향을 받는다는 것을 시사합니다 (46, 47). 카테콜아민은 또한 콘카나발린 A에 의한 흉선세포 활성화를 억제할 수 있으나, 보고된 기전은 고전적 수용체 활성화와 무관한 것으로 보인다. 카테콜아민 매개 억제는 아드레날린성 수용체 길항제를 사용해도 차단되지 않았기 때문이다(48). 또한, 신경펩타이드 Y는 in vitro 조건에서 흉선세포의 화학주성과 부착을 변화시키는 것으로 보고되었다(49). 앞서 논의한 바와 같이, 대부분의 연구는 NE 및 기타 신경전달물질 신호가 흉선 세포에 미치는 직접적 효과만을 조사하고, 상피세포 및 비상피성 기질세포가 관여하는 흉선 미세환경 내 잠재적 상호작용은 간과한다. 한 주요 연구에서, 분리된 쥐 흉선 상피세포(TECs)는 NE에 반응하여 IL-6를 증가시켰는데, 이는 아드레날린성 신호에 반응하여 사이토카인 생산을 변화시킬 수 있음을 시사한다(50). 또 다른 연구에서는, in vivo 및 in vitro에서 무스카린성 아세틸콜린 길항제인 아트로핀으로 처리했을 때 흉선 세포의 세포 사멸이 촉진되었으며, 이는 흉선 상피 세포가 존재할 때만 발생했습니다(29). 흉선 세포는 아세틸콜린을 생성하는 핵심 효소인 ChAT mRNA를 높은 수준으로 발현하므로 직접 아세틸콜린을 생성할 수 있습니다(29). 따라서 흉선 세포는 아세틸콜린을 이용해 흉선 상피 세포에 신호를 보내 생존을 촉진할 수 있다. 논의된 많은 실험의 주요 한계는 흉선 미세환경과 흉선생성을 조절하는 관련 신호로부터 분리된 1차 흉선세포를 사용하고, 생리학적 수준을 초과하는 신경전달물질 및/또는 해당 작용제/길항제로 in vitro 처리했다는 점이다. 신경전달물질 신호전달의 생리적 역할을 이해하려면 흉선 미세환경의 in vivo 복합 구조 내에서 연구해야 한다. 비록 알려진 바는 적지만, 몇몇 연구들은 흉선 기능과 T 세포 발달에서 신경전달물질의 잠재적 중요성을 시사한다.

림프계 기관의 자율신경 분리를 초래하는 진행성 탈수초 질환인 크라베병 마우스 모델을 이용한 연구에서, 생후 15일째 림프계 기관은 정상이었으나 주로 흉선세포 사멸(apoptosis)로 인해 급속한 흉선 퇴축(involution)이 발생함이 입증되었다(51). 이는 교감 신경 섬유의 손실 및 β-아드레날린 수용체 발현 변화와 관련이 있어, 흉선의 SNS 신경 분포가 흉선 생성을 조절하는 데 중요할 수 있음을 시사한다. 신경교세포 유래 세포의 고갈은 교감 신경과 함께 (혈소판 유래 성장 인자 수용체 α 및 β, α-평활근 액틴을 발현하는) 중간엽 세포의 하위 집합을 포함하며, 일반적으로 섬유아세포와 주변 세포를 포함하며, 또한 급속한 흉선 퇴화를 초래한다 (52). 그러나 이 모델은 Wnt1-Cre 결손 계통을 사용했는데, 이는 전신 비신경 세포에서 재조합되어 흉선 특이적이지 않습니다. 마찬가지로, 전신 말초 교감신경절제술을 유발하는 것으로 알려진 6-하이드록시도파민(6-OHDA)을 사용해도 흉선 세포의 상당한 손실이 발생했습니다. 그러나 프로프라놀롤과 시아노핀돌롤을 2주간 매일 주사해도 동일한 표현형이 재현되지 않았으므로, 이는 β-아드레날린성 신호 전달의 특이적 상실 때문은 아닌 것으로 보인다. 실제로 6-OHDA는 주로 DP 흉선 세포에서 세포 사멸을 유도하여 피질에 영향을 미쳤다(20, 53, 54). 이러한 연구들은 질병이나 유전자 결손을 통해 상실될 경우 흉선 기능을 손상시킬 수 있는 흉선에서 카테콜아민 신호 전달의 잠재적 유익한 역할을 시사한다.

생리적 노화나 질병 상황에서 신경 분포와 활동이 어떻게 변화하는지는 크게 연구가 부족한 상태이다. 쿠프리존 처리 및 다발성 경화증의 실험적 자가면역 뇌염 모델을 활용한 연구들은 이러한 모델들이 흉선 위축 및 흉선 세포 사멸과 연관되어 있음을 보여주었다(55–59). 이것이 중추신경계-흉선 간 교신 변화 때문인지는 불분명하다. 그러나 최근 발표된 논문은 실험적 자가면역 뇌염에 대한 흉선 신경 분포 반응을 조사하였다(60). 저자들은 신경세포와 축삭의 다중 표지자를 사용했으며, 질병 마우스에서 신경 섬유 밀도가 증가했다는 데이터를 보고하였다. 그러나 이 연구에서 면역염색은 종종 축삭 특이적이지 않은 것으로 보이며, 역행 추적은 미확인 추적자를 사용하여 수행되어 데이터 해석에 대한 우려를 제기한다. 그럼에도 불구하고, 이 연구는 병리 마우스에서 추적자 흡수가 감소했다고 보고하여, 기술적 오류 가능성을 배제할 수 없지만, 흉선 내 신경망 또는 역행 수송 능력의 변화를 시사한다.

Aging is associated with altered neural innervation of several hematopoietic and lymphoid organs. Alterations in bone marrow innervation was reported to be associated with hematopoietic aging (61–63). In particular, we and others have shown that loss of bone marrow innervation drives aging-like phenotypes in HSCs (61). How aging alters thymic innervation and function is less known, but several studies of nerve fiber density and catecholamine measurements exist. For instance, nerve fiber density is increased in the aged thymus (64–66). This increase in density is likely a result of thymic involution due to progressive loss of cellularity. Yet, one study found a potential increase in total innervation with unchanged sympathetic innervation (67), raising the possibility that specific nerve subsets may have different responses to aging. Catecholamine measurements in the aged rat and mouse thymus are either maintained (65) or elevated (64, 66, 67), suggesting that nerves continue functioning to some degree in the aged thymus. However, whether any increases in NE content are due to heightened sympathetic tone, impaired NE reuptake, non-neuronal sources, or modulation by other means is currently unclear.

Changes in thymus structure during aging could contribute to altered neural signaling and thymic involution. However, only a few functional studies assess the role of NE signaling in the aged thymus. In one such study, long-term β-adrenergic blockade with nadolol increased DN and SP8 cells but decreased DP cells in aged mice (68). In another study, 14-day treatment with the non-selective beta blocker propranolol increased the numbers of SP4 and SP8 thymocytes and improved Thy-1 surface expression‎ (41). Whether blockade of adrenergic signaling in the aged thymus leads to improved T cell development and function is uncertain, especially as neither study provides mechanistic and further phenotypic insights.

Models and methods to study thymic neural anatomy and function

The past couple of decades have seen the emergence of new technologies to study neural function in vivo, many of which can be adapted to the study of neural regulation of the thymus ( Figure 2 ). However, proper implementation of these techniques and understanding their limitations is important. Here, we provide pertinent information to understand their benefits, limitations, and how these methodologies have been used to study neuro-immune interactions.

노화는

여러 조혈 및 림프 기관의 신경 분포 변화와 연관된다.

골수 신경 분포의 변화는

조혈 노화와 연관된 것으로 보고되었다(61–63).

특히,

우리 연구팀을 비롯한 여러 연구에서 골수 신경 분포 상실이

조혈모세포(HSCs)에서 노화 유사 표현형을 유발함을 보여주었다(61).

노화가 흉선 신경 분포와 기능을 어떻게 변화시키는지 덜 알려져 있지만,

신경 섬유 밀도와 카테콜아민 측정에 관한 여러 연구가 존재한다.

예를 들어,

노화된 흉선에서는 신경 섬유 밀도가 증가한다(64–66).

이러한 밀도 증가는

세포 밀도의 점진적 감소로 인한 흉선 위축의 결과일 가능성이 높다.

그러나

한 연구에서는 교감 신경 분포는 변화 없이 총 신경 분포가 증가할 수 있음을 발견했다(67).

이는 특정 신경 하위 집합이 노화에 대해

서로 다른 반응을 보일 가능성을 시사한다.

노화 쥐와 생쥐의 흉선에서 측정된 카테콜아민 수치는

유지되거나(65) 증가하는(64, 66, 67) 것으로 나타났는데,

이는 노화 흉선에서도 신경이 어느 정도 기능을 지속함을 시사한다.

그러나

노르에피네프린(NE) 함량의 증가가

교감신경 긴장도 상승, NE 재흡수 장애, 비신경성 기원, 또는

다른 매개체에 의한 조절 중 어느 것에 기인하는지는 현재 불분명하다.

노화 과정 중 흉선 구조의 변화는

신경 신호 전달의 변화와 흉선 퇴화에 기여할 수 있다.

그러나

노화 흉선에서 NE 신호 전달의 역할을 평가한 기능적 연구는 극소수에 불과하다.

한 연구에서는 노화 마우스에서 나돌롤을 이용한 장기 β-아드레날린 차단이 DN 세포와 SP8 세포를 증가시켰으나 DP 세포는 감소시켰다(68). 또 다른 연구에서는 비선택적 베타 차단제인 프로프라놀롤을 14일간 투여했을 때 SP4 및 SP8 흉선 세포 수가 증가하고 Thy-1 표면 발현이 개선되었다(41). 노화된 흉선에서 아드레날린성 신호 전달을 차단하는 것이 T 세포 발달 및 기능 개선으로 이어지는지는 불확실하다. 특히 두 연구 모두 기전적 및 추가적인 표현형적 통찰력을 제공하지 않기 때문이다.

Figure 2.

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Techniques & tools to study thymic neural anatomy and function. Many neurotransmitter receptors can be targeted by treating mice with agonists or antagonists. Thymic neurocircuitry tracing and expression‎ of optogenetic and chemogenetic receptors requires Intrathymic injections to selectively target nerves within the thymus. Next-generation optical tissue clearing and imaging techniques will provide tissue-wide mapping of neural innervation of the thymus. Finally, chemical or surgical denervation techniques may target thymic innervation systemically or locally. Created with BioRender.com.

흉선 신경 해부학 및 기능 연구를 위한 모델과 방법

지난 수십 년간 생체 내 신경 기능 연구를 위한 새로운 기술들이 등장했으며, 이들 중 다수는 흉선의 신경 조절 연구에 적용될 수 있다( 그림 2 ). 그러나 이러한 기법들의 적절한 적용과 한계에 대한 이해가 중요하다. 본고에서는 그 장점과 한계, 그리고 신경-면역 상호작용 연구에 이러한 방법론들이 어떻게 활용되어 왔는지를 이해하는 데 필요한 정보를 제공한다.

그림 2.

흉선 신경 해부학 및 기능 연구를 위한 기법 및 도구. 많은 신경전달물질 수용체는 마우스에 작용제 또는 길항제를 투여하여 표적화할 수 있습니다. 흉선 신경회로 추적 및 광유전학·화학유전학 수용체 발현을 위해서는 흉선 내 신경 선택적 표적화를 위한 흉선 내 주사가 필요합니다. 차세대 광학 조직 투명화 및 이미징 기법은 흉선의 신경 분포를 조직 전체적으로 매핑할 수 있게 해줄 것입니다. 마지막으로, 화학적 또는 외과적 신경절제 기법은 전신적 또는 국소적으로 흉선의 신경 분포를 표적할 수 있습니다. BioRender.com으로 제작.

Chemical sympathetic denervation

As previously discussed, 6-OHDA is a neurotoxin used to cause sympathectomy through oxidative stress and apoptosis of peripheral sympathetic neurons. The benefit of this technique is the ease of use, typically requiring two doses split by a couple of days (69–73). Proper handling of 6-OHDA is critical, as it oxidizes quickly, and denervation is temporary in adult mice. Adding subsequent doses every 6 days may maintain peripheral sympathetic denervation (71). Permanent denervation can also be achieved by injecting mouse pups every other day starting at postnatal day 2 for five total doses (72, 73). One weakness of this method is that denervation occurs during development, and some effects could be attributed to improper development or adaptation of tissues. As previously discussed, 6-OHDA can also have direct toxic effects on DP thymocytes (53). Thus, careful interpretation of data must be considered to understand whether the effects of 6-OHDA are indeed due to loss of innervation or other direct/indirect effects.

화학적 교감 신경절제

앞서 논의한 바와 같이,

6-OHDA는 산화 스트레스와 말초 교감 신경 세포의 세포 사멸을 통해

교감 신경절제를 유발하는 신경독소입니다.

이 기법의 장점은 사용이 용이하다는 점으로, 일반적으로 며칠 간격으로 두 번의 투여가 필요합니다(69–73). 6-OHDA는 빠르게 산화되며 성인 생쥐에서는 신경절제가 일시적이므로 적절한 취급이 매우 중요합니다. 6일마다 추가 투여를 하면 말초 교감 신경절제를 유지할 수 있습니다(71). 영구적 탈신경은 생후 2일차부터 총 5회 용량을 격일로 주사하는 방식으로 마우스 새끼에게 시행할 수도 있습니다(72, 73). 이 방법의 한 가지 한계는 탈신경이 발달 기간 중 발생하여 일부 효과가 조직의 부적절한 발달이나 적응에 기인할 수 있다는 점입니다. 앞서 논의한 바와 같이, 6-OHDA는 DP 흉선 세포에 직접적인 독성 효과를 미칠 수도 있습니다(53). 따라서 6-OHDA의 효과가 실제로 신경 분포 상실 때문인지, 아니면 다른 직접적/간접적 효과 때문인지 이해하기 위해서는 데이터 해석에 신중을 기해야 합니다.

Chemical sensory denervation

Resiniferatoxin (RTX) is a potent TRPV1 agonist that results in the death of peripheral sensory neurons due to calcium overload (74, 75). Mice are subcutaneously injected with three increasing doses of RTX at approximately four weeks of age to induce long-term sensory denervation (76, 77). Mice are typically used for experiments after a 3-4 week resting period. As with 6-OHDA, whether RTX can directly affect thymocytes or other TRPV1-expressing cells in the thymus is currently unknown. Further, while CGRP can be detected in the thymus, it is unclear if its source is derived from sensory nerves. In this case, RTX may be a way to deplete this specific subset of nerves, although further mechanistic insights are still required with this agent for safer data interpretation.

화학적 감각 신경절제

레지니페라톡신(RTX)은 강력한 TRPV1 작용제로, 칼슘 과부하로 인해 말초 감각 신경세포의 사멸을 유발합니다(74, 75). 생후 약 4주령 쥐에게 RTX를 세 단계로 증가시키는 용량을 피하 주사하여 장기 감각 신경절제를 유도한다(76, 77). 일반적으로 3-4주간의 휴식 기간 후 실험에 사용된다. 6-OHDA와 마찬가지로, RTX가 흉선 내 흉선세포나 기타 TRPV1 발현 세포에 직접 영향을 미치는지는 현재 알려지지 않았다. 또한, CGRP가 흉선에서 검출될 수 있지만, 그 기원이 감각 신경에서 유래하는지는 불분명하다. 이 경우 RTX는 이 특정 신경 하위 집합을 고갈시키는 방법이 될 수 있으나, 더 안전한 데이터 해석을 위해서는 이 약제에 대한 추가적인 기전적 통찰이 여전히 필요하다.

Chemical agonists & antagonists

Today, many exogenous and potent agonists/antagonists are used to target neurotransmitter receptors. Some are used clinically, while others only experimentally. Some of the oldest drugs developed are β- and α-adrenergic receptors, used to control blood flow through contractility of large arteries (78, 79). Intraperitoneal injection into rodents is the standard used in pre-clinical research and may be useful in short-term experiments. However, long-term use may require long-release pellets or osmotic pumps (61) to prevent stress associated with repeated injections and uneven pharmacodynamics. Other drugs may act indirectly on specific adrenergic or cholinergic receptors, promote or prevent the release of neurotransmitters, prevent neurotransmitter reuptake by cells, or break the neurotransmitters down into inactive or partially active metabolites. A downside to using chemical agonists or antagonists in vivo is that they act systemically, so determining direct effects is difficult. However, these agents can be useful for ex vivo or in vitro culture systems, and many second and third-generation drugs are longer-acting and more stable than the natural neurotransmitter.

Knockout and transgenic mice

Neural components, including neurotransmitter receptors, can be modified using genetically engineered mouse models. Germline knockout models exist for many adrenergic receptors, including α- and β-adrenergic receptors. Some receptors have floxed (gene-flanked loxP site) models that can be crossed with cell-specific Cre or Cre-ER (estrogen receptor) deleter lines. The benefit of these models is in conditionally identifying neurotransmitter-receptor interactions on specific thymic cells. However, they may not showcase the overall role of nerves within the thymus, which simultaneously signal to many cell types throughout the microenvironment. Other models, such as diphtheria toxin receptor mice, may allow targeted killing of specific cells (80), although this would also be systemic and not specific to the thymus. A recent publication used tyrosine hydroxylase specific cre (TH-Cre) mice crossed with a tropomyosin receptor kinase A (TrkA) mouse harboring a mutation that allows for the timed inactivation of the nerve growth factor (NGF) binding TrkA receptor, using the chemical 1NMPP1 (81). This caused a reduction in sympathetic innervation to the spleen, ultimately altering splenic immune responses. Whether this model could also result in denervation of the thymus is unclear.

화학적 작용제 및 길항제

현재 신경전달물질 수용체를 표적으로 하는 수많은 외인성 강력 작용제/차단제가 사용된다. 일부는 임상적으로, 다른 일부는 실험적으로만 사용된다. 가장 오래된 약물 중 일부는 대동맥 수축성을 통해 혈류를 조절하는 데 사용되는 β- 및 α-아드레날린성 수용체 작용제이다(78, 79). 설치류에 대한 복강 내 주사는 전임상 연구에서 표준으로 사용되며 단기 실험에 유용할 수 있다. 그러나 장기 사용 시 반복 주사로 인한 스트레스와 불균일한 약력학을 방지하기 위해 서방형 펠릿이나 삼투 펌프(61)가 필요할 수 있다. 다른 약물들은 특정 아드레날린성 또는 콜린성 수용체에 간접적으로 작용하거나, 신경전달물질의 방출을 촉진 또는 억제하거나, 세포에 의한 신경전달물질 재흡수를 차단하거나, 신경전달물질을 비활성 또는 부분 활성 대사산물로 분해할 수 있다. 생체 내(in vivo)에서 화학적 작용제나 길항제를 사용할 때의 단점은 전신적으로 작용하기 때문에 직접적인 효과를 판단하기 어렵다는 점이다. 그러나 이러한 약제는 생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 배양 시스템에 유용할 수 있으며, 많은 2세대 및 3세대 약물은 천연 신경전달물질보다 작용 시간이 길고 안정적이다.

노크아웃 및 트랜스제닉 마우스

신경전달물질 수용체를 포함한 신경 구성 요소는 유전자 조작 마우스 모델을 사용하여 수정할 수 있습니다. α- 및 β-아드레날린 수용체를 포함한 많은 아드레날린성 수용체에 대해 생식세포 노크아웃 모델이 존재합니다. 일부 수용체는 플록스드(loxP 사이트로 유전자 양측을 둘러싼) 모델을 가지고 있어 세포 특이적 Cre 또는 Cre-ER(에스트로겐 수용체) 삭제 계통과 교배할 수 있습니다. 이러한 모델의 장점은 특정 흉선 세포에서 신경전달물질-수용체 상호작용을 조건부로 규명할 수 있다는 점이다. 그러나 흉선 내 신경의 전반적인 역할, 즉 미세환경 전반에 걸쳐 다양한 세포 유형에 동시에 신호를 전달하는 기능을 보여주지 못할 수 있다. 디프테리아 독소 수용체 마우스와 같은 다른 모델은 특정 세포를 표적 제거할 수 있으나(80), 이는 전신적이며 흉선에 특이적이지 않다. 최근 발표된 연구에서는 티로신 하이드록실레이즈 특이적 cre (TH-Cre) 마우스를, 신경성장인자(NGF) 결합 TrkA 수용체를 화학물질 1NMPP1(81)로 시간 조절적 비활성화가 가능한 돌연변이를 보유한 트로포미오신 수용체 키나아제 A(TrkA) 마우스와 교배시켰다. 이로 인해 비장로의 교감신경 분포가 감소하여 궁극적으로 비장 면역 반응이 변화하였다. 이 모델이 흉선의 신경 분절도 유발할 수 있는지는 불분명하다.

Surgical approaches

One approach to studying neural innervation of immune tissues is through direct surgical manipulation of nerve bundles or involved ganglia. Surgical denervation techniques have been described for bone marrow (61, 69), lymph nodes (82), and spleen (83). Nerves can be directly excised, while phenol/ethanol solutions can also be used to promote nerve denervation when applied directly to nerve bundles (as in the case of the spleen, where the splenic sympathetic nerve is difficult to manually excise due to its proximity of the splenic artery). The key challenge with surgical denervation of the thymus is the precise location of the afferent nerves or the associated ganglia, particularly in the mouse, and the relative inaccessibility of the thymus and stellate ganglia, which are both located inside the thoracic cavity. Further, surgical procedures require anesthesia, may induce inflammation, and may require post-surgical care that could disrupt normal physiology, requiring a recovery period before experimentation. To date, only one study suggests that, in rat, removal of the superior cervical ganglia can result in the loss of sympathetic nerves within the thymus (84).

수술적 접근법

면역 조직의 신경 분포를 연구하는 한 가지 접근법은

신경 다발이나 관련 신경절을 직접 수술적으로 조작하는 것이다.

골수(61, 69), 림프절(82), 비장(83)에 대한 수술적 신경 분절 기법이 보고된 바 있다.

신경은 직접 절제할 수 있으며,

페놀/에탄올 용액을 신경 다발에 직접 도포하여

신경 신경절 제거를 촉진할 수도 있다(비장의 경우, 비장 동맥과 근접하여 비장 교감 신경이 수동으로 절제하기 어려운 점이 대표적이다).

흉선의 외과적 신경절제술에서 핵심 과제는 특히 생쥐에서 구심성 신경이나 관련 신경절의 정확한 위치 파악과, 흉강 내부에 위치하여 접근이 상대적으로 어려운 흉선 및 성상 신경절이다. 또한 수술 절차는 마취를 필요로 하며 염증을 유발할 수 있고, 정상 생리 기능을 방해할 수 있는 수술 후 관리가 필요하여 실험 전 회복 기간이 요구될 수 있다. 현재까지 단 한 건의 연구만이 쥐에서 상경부 신경절 제거가 흉선 내 교감 신경의 소실을 초래할 수 있음을 시사한다(84).

Optogenetic and DREADD manipulation of neural activity

Understanding structure-function relationships in neuroscience was long limited to field stimulation and broad dissection of brain regions. Optogenetics revolutionized the ability to activate or silence specific brain structures, implementing microbial opsins that can be photoactivated or silenced using light (85, 86). These tools, used to study neuron-function relationships in awake mice, have been rapidly implemented in the field. Similarly, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADD receptors) are another recent advance in altering neuronal function (87, 88). These receptors bind to physiologically inert chemicals and can also be used to selectively activate or silence specific neuronal populations (87, 88). Optogenetic models are challenging to implement as they require specialized fiber optic equipment but allow finely tuned stimulation paradigms. DREADD models are relatively easy to use, only requiring intraperitoneal injections of DREADD agonists but lacking the temporal precision of optogenetics. Both models often require retroviral transfection to selectively express these receptors in their specific neurons or tissues. However, they represent significant advances in studying neural signaling within the thymus, as they can be expressed exclusively by the neurons innervating it. These techniques can be used as alternatives to, or in conjunction with, surgical/chemical denervation, transgenic mice, and systemic agonist/antagonist administration.

Anterograde & retrograde tracers

A long-standing technique for labeling neurons and their projections, anterograde and retrograde tracers, have been used to trace the innervation of the thymus as described above. Anterograde tracing labels neuronal cell bodies to examine afferent projections (where those neurons project to), while retrograde labeling is used to identify where axons and nerve terminals arise from. Wheatgerm agglutinin (WGA) conjugated to horseradish peroxidase (HRP), Cholera toxin B subunit (CTB), and Fluorogold are common retrograde tracers, allowing easy visualization of neuronal cell bodies that project axons into the region of interest. The major limitation is that they only label neurons that take up the tracer and cannot resolve the synaptic network. To this end, certain viral tracers, including pseudorabies viruses, may be used to label synaptic networks as these viruses can “jump” from cell to cell based on their synaptic connections. A more in-depth guide to neuronal tracing is summarized elsewhere (89).

Imaging of thymic nerves using optical tissue clearing techniques

OTC whole-tissue imaging methodologies have helped neuroscientists identify neural networks that span the entire nervous system and throughout the body (90). Such techniques incorporate tissue processing and refractive index matching to make whole tissues and, in some cases, whole animals nearly transparent for imaging (91). The number of different clearing techniques has grown exponentially, leading to improvements in methodology. However, there is no “one-size-fits-all” approach, and understanding the nuances of each technique and their potential applications can be challenging. OTC-based imaging techniques have begun to be incorporated to visualize the thymus. For example, one recent study demonstrated a way to visualize nerves in peripheral immune tissues (based on iDISCO clearing methods), including the thymus (81). This study reported vast TH+ sympathetic innervation and scarcity of VChAT+ parasympathetic nerves; however, no in-depth characterization of innervation was performed. Another study used an ethyl-cinnamate-based method to visualize the vascular architecture of the thymus (92). Incorporating these techniques alongside standard microscopy techniques will help provide a whole view of the thymus, identify which nerves are present, and determine the extent of thymic innervation in normal and disease states.

Neurotransmitter quantification

Direct quantification of neurotransmitter levels in tissues can be done by a few different means. Larger neuropeptides, such as CGRP and neuropeptide Y, can be readily quantified by ELISA as these are relatively stable proteins. However, catecholamines are difficult to measure by ELISA. The preferred method for many biogenic amines, including catecholamines, is high-performance liquid chromatography (HPLC) or liquid chromatography-mass spectrometry (LCMS) (93–95). Catecholamines are also highly sensitive to rapid degradation due to high levels of monoamine oxidases in cells/tissues. Thus, samples should be isolated rapidly and flash-frozen in liquid nitrogen. One challenge with these neurotransmitter quantification techniques is that they typically require whole thymus homogenization, and as such, they do not provide any spatial information. The interpretation of the results may thus be confounded by neurotransmitter molecules stored inside cells or nerves, in addition to those released into the extracellular compartment.

광유전학 및 DREADD를 통한 신경 활동 조작

신경과학에서 구조-기능 관계를 이해하는 것은 오랫동안 뇌 영역의 광범위한 해부 및 현장 자극에 국한되어 왔다. 광유전학은 특정 뇌 구조를 활성화하거나 억제하는 능력을 혁신적으로 발전시켰으며, 빛을 이용해 광활성화되거나 억제될 수 있는 미생물 옵신을 구현했습니다(85, 86). 깨어 있는 생쥐에서 신경-기능 관계를 연구하는 데 사용되는 이러한 도구들은 해당 분야에서 빠르게 적용되었습니다. 마찬가지로, 설계된 약물(DREADD 수용체)에 의해 독점적으로 활성화되는 설계된 수용체는 신경 기능을 변경하는 또 다른 최근의 발전입니다(87, 88). 이 수용체들은 생리적으로 무해한 화학 물질에 결합하며, 특정 신경 세포 집단을 선택적으로 활성화하거나 억제하는 데에도 사용될 수 있습니다(87, 88). 광유전학 모델은 특수 광섬유 장비가 필요하여 구현이 까다롭지만 정밀하게 조정된 자극 패러다임을 가능하게 합니다. DREADD 모델은 DREADD 작용제를 복강 내 주사하기만 하면 되어 상대적으로 사용이 용이하지만, 광유전학의 시간적 정밀도는 부족합니다. 두 모델 모두 특정 신경세포나 조직에서 선택적으로 이러한 수용체를 발현시키기 위해 레트로바이러스 형질 도입이 필요한 경우가 많다. 그러나 흉선을 신경 분포하는 신경세포에 의해 독점적으로 발현될 수 있기 때문에, 흉선 내 신경 신호 전달 연구에 있어 상당한 진보를 나타낸다. 이러한 기술들은 외과적/화학적 신경절제, 형질전환 마우스, 전신적 작용제/길항제 투여의 대안으로 또는 이와 병행하여 사용될 수 있다.

전행성 및 역행성 추적자

신경세포와 그 투사 경로를 표지하는 오랜 기법인 전행성 및 역행성 추적자는 앞서 설명한 대로 흉선의 신경 분포를 추적하는 데 사용되어 왔다. 전행성 추적은 신경세포체를 표지하여 구심성 투사(해당 신경세포가 투사되는 곳)를 조사하는 반면, 역행성 표지는 축삭과 신경말단이 어디에서 발생하는지 확인하는 데 사용된다. 고추냉이 과산화효소(HRP)에 결합된 밀배아 응집소(WGA), 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 플루오로골드(Fluorogold)는 흔히 사용되는 역행성 추적제로, 관심 영역으로 축삭을 투사하는 신경 세포체를 쉽게 시각화할 수 있게 합니다. 주요 한계는 이러한 추적제가 추적제를 흡수하는 신경세포만 표지할 뿐 시냅스 네트워크를 분해할 수 없다는 점이다. 이를 위해 가성광견병 바이러스 등 특정 바이러스 추적제를 사용하여 시냅스 네트워크를 표지할 수 있는데, 이러한 바이러스는 시냅스 연결을 따라 세포 간에 “점프”할 수 있기 때문이다. 신경 추적에 대한 보다 심층적인 안내는 별도의 문헌(89)에 요약되어 있다.

광학 조직 투명화 기법을 이용한 흉선 신경 영상화

OTC(광학 조직 투명화) 전조직 영상화 방법론은 신경과학자들이 신경계 전체와 신체 전반에 걸쳐 있는 신경망을 식별하는 데 기여해 왔습니다(90). 이러한 기법은 조직 처리 및 굴절률 일치를 통해 전조직, 경우에 따라서는 전동물을 영상화를 위해 거의 투명하게 만듭니다(91). 다양한 투명화 기법의 수가 기하급수적으로 증가하면서 방법론이 개선되었습니다. 그러나 ‘만능’ 접근법은 존재하지 않으며, 각 기법의 미묘한 차이와 잠재적 적용 가능성을 이해하는 것은 어려울 수 있다. OTC 기반 영상 기법이 흉선을 시각화하는 데 활용되기 시작했다. 예를 들어, 최근 한 연구에서는 흉선을 포함한 말초 면역 조직 내 신경(iDISCO 투명화 기법 기반)을 시각화하는 방법을 제시했다(81). 이 연구는 광범위한 TH+ 교감 신경 분포와 VChAT+ 부교감 신경의 희소성을 보고했으나, 신경 분포에 대한 심층적 특성화는 수행되지 않았다. 다른 연구에서는 에틸-신나메이트 기반 방법을 사용하여 흉선의 혈관 구조를 시각화하였다(92). 이러한 기법들을 표준 현미경 기법과 병행하면 흉선의 전체적인 모습을 파악하고, 존재하는 신경들을 식별하며, 정상 및 질병 상태에서의 흉선 신경 분포 정도를 결정하는 데 도움이 될 것입니다.

신경전달물질 정량화

조직 내 신경전달물질 농도를 직접 정량화하는 데는 몇 가지 다른 방법이 사용될 수 있습니다. CGRP 및 신경펩타이드 Y와 같은 더 큰 신경펩타이드들은 상대적으로 안정적인 단백질이기 때문에 ELISA로 쉽게 정량화할 수 있습니다. 그러나 카테콜아민은 ELISA로 측정하기 어렵습니다. 카테콜아민을 포함한 많은 생체 아민의 경우, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LCMS)이 선호되는 방법입니다(93–95). 카테콜아민은 세포/조직 내 높은 수준의 모노아민 산화효소로 인해 급속한 분해에 매우 민감합니다. 따라서 시료는 신속하게 분리하여 액체 질소로 급속 냉동해야 합니다. 이러한 신경전달물질 정량 기법의 한 가지 어려움은 일반적으로 흉선 전체를 균질화해야 한다는 점이며, 이로 인해 공간적 정보를 제공하지 못합니다. 따라서 결과 해석은 세포외 공간으로 방출된 신경전달물질 외에도 세포 내 또는 신경 내에 저장된 신경전달물질 분자에 의해 혼란스러워질 수 있습니다.

Outstanding questions

The importance of neural signaling to immune function has become clear over the past 20-30 years (96). Hematopoietic and lymphoid tissues, such as the spleen, bone marrow, and lymph nodes, are under the direct control of the nervous system. The majority of studies have focused on mature immune cell function in specific disease states, whereas less is known about neural regulation of T cell development in the thymus. While extensive advances have been made in characterizing the thymic microenvironment through single-cell technologies, this approach typically lacks data from nerves and their signals. Below, we summarize key research areas that could help move the field forward ( Figure 3 ).

미해결 문제

신경 신호전달이 면역 기능에 미치는 중요성은

지난 20-30년간 명확해졌습니다(96).

비장, 골수, 림프절과 같은 조혈 및 림프 조직은

신경계의 직접적인 통제를 받습니다.

대부분의 연구는

특정 질환 상태에서 성숙 면역 세포 기능에 집중되어 왔으며,

흉선 내 T 세포 발달의 신경 조절에 대해서는 상대적으로 덜 알려져 있다.

단일 세포 기술을 통한 흉선 미세환경 특성화에는 상당한 진전이 있었으나,

이 접근법은 일반적으로 신경 및 그 신호에 대한 데이터를 포함하지 않는다.

아래에서는 해당 분야 발전을 도울 수 있는 핵심 연구 영역을 요약한다( 그림 3 ).

그림 3.

Figure 3.

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Roles for neural signaling in the thymic microenvironment. Close association of sympathetic nerves with thymic vasculature suggests potential roles in cell migration, such as ETP recruitment and mature thymocyte egress. Neural signals may also regulate blood flow and nutrient exchange at the blood-thymus barrier. Neurotransmitters may signal to thymic niche cell types, including fibroblasts, cTECs, mTECs, dendritic cells, and macrophages, and alter their associated functions. Further, nerves may signal directly to thymocytes at specific stages of development. Neural signals may participate in thymic involution during aging or chemotherapy treatment and contribute to endogenous regeneration. Created with BioRender.com.

In-depth characterization of neural innervation in thymic compartments

The thymus microenvironment is highly organized, with distinct cell types and regions responsible for specific aspects of T cell development (see above). Early characterization experiments did a remarkable job demonstrating the distribution of sympathetic innervation in the thymus, including its contextual association with large blood vessels, the thymic capsule, and the subcapsular cortex. However, additional characterization would help uncover more in-depth structural and functional relationships with the heterogenous intrathymic components. One controversy is the precise trajectories and the depths to which SNS, and possibly sensory or PNS, innervation, and signaling networks extend within the thymus. It is also unclear if the nerves of the thymus that project into the subcortical parenchyma are the same as those that innervate the large blood vessels. Combined with genetic reporter models for more accurate nerve representation, new methods for whole tissue immunolabeling and imaging (discussed above) will provide definitive evidence of nerve-thymic stromal cell interactions.

Neural regulation of thymic vasculature

The vascular network within the thymus is intricate, dense, and diverse, composed of large arteries and veins, medium arterioles and venules, smaller capillaries, and auxiliary and anastomosing vasculature systems (97). Although innervation has been generally observed in larger vessels, the precise nature and functions of these vessels are not well-established, nor how they maintain their innervation. The close association of sympathetic nerves with vessels and their biased/preferential extension toward the cortical zones suggests a potential role in regulating blood flow, the thymus-blood barrier, nutrient exchange, and cellular trafficking into and out of the thymus. Neural signals may control influx of ETP homing and efflux of mature thymocytes to secondary lymphoid organs, two processes tightly controlled by blood vessels and their unique perivascular niches in the thymus (98, 99). The SNS has an established role in mobilizing hematopoietic progenitors from the bone marrow (69, 72, 73, 100), the recruitment of leukocytes to peripheral tissues (101), and the function of mature lymphocytes in lymph nodes (82, 102, 103). Thus, SNS innervation of the thymic vasculature may serve similar roles.

Neural regulation of the thymic microenvironment

The thymus contains a growing diversity of cell types within the thymic microenvironment. cTECs are critical for early T cell development, forming a niche where direct cell contact and paracrine signals contribute to T lineage restriction (1). T cells then undergo specific differentiation and maturation steps, including T cell receptor gene rearrangement and positive/negative selection that requires TECs and other antigen-presenting cells, including dendritic cells (6). Neural signals could help promote or inhibit some of these key roles by TECs, dendritic cells, or other thymic niche cells. For example, thymic mast cells and macrophages have been suggested to have a functional relationship with nerves due to their localization near sympathetic and peptidergic nerves (84, 104). Yet, whether these cell types respond to nerve signals is speculative, with little or no data demonstrating a functional role. Furthermore, the thymic microenvironment may also signal back to nerves, affecting innervation, axon degeneration/regeneration, or neuronal activity (43).

Direct neural signaling to developing T cells

Many in vitro experiments have suggested direct neural signaling to thymocytes. As discussed, the major issue with these studies is the lack of niche signals provided by other cell types. Further, neurotransmitter receptor expression‎ may differ depending on the stage of thymocyte differentiation. Understanding how each stage of T lineage differentiation responds to neural signals is a critical area of investigation moving forward. Using new technologies to separate specific thymocyte subsets or single-cell technologies may help generate refined and granular data. The challenging questions are how alterations in T cell development in the thymus due to changes in neural tone affect T cell function and how intrathymic neural signaling coordinates T cell development and long-term systemic immunity.

Innervation and function during aging, thymic involution, and endogenous regeneration

Most studies of the thymus focus on preventing aging-related changes, particularly thymic involution (105), to preserve an increased TCR repertoire diversity immune system competence later in life. Recent studies have emphasized the occurrence of epithelial cell defects in thymic aging and regeneration (106). Previous studies have shown that neural innervation is maintained in the aged thymus (see above), but whether functional neural signaling remains intact is unclear. For example, some studies find altered neurotransmitter levels in the aged thymus (64, 66, 67), suggesting that neural signaling networks within the aged thymus may be altered. Furthermore, genotoxic treatments, such as chemotherapy given to cancer patients or irradiation in the context of hematopoietic stem cell transplantation, promote early thymic involution and subsequent regeneration (107). Given that SNS nerves are critical for hematopoietic regeneration in the bone marrow (70), assessing whether it functions similarly in the thymus will be essential.

흉선 미세환경에서 신경 신호의 역할. 교감 신경과 흉선 혈관의 밀접한 연관성은 ETP 모집 및 성숙 흉선 세포의 이탈과 같은 세포 이동에 잠재적 역할을 시사한다. 신경 신호는 또한 혈액-흉선 장벽에서의 혈류 및 영양소 교환을 조절할 수 있다. 신경전달물질은 섬유아세포, cTEC, mTEC, 수지상 세포, 대식세포 등 흉선 니치 세포 유형에 신호를 전달하여 관련 기능을 변화시킬 수 있습니다. 또한 신경은 발달의 특정 단계에서 흉선세포에 직접 신호를 전달할 수 있습니다. 신경 신호는 노화나 항암 치료 중 흉선 퇴화에 관여하고 내인성 재생에 기여할 수 있습니다. BioRender.com으로 제작.

흉선 구획 내 신경 분포의 심층적 특성 분석

흉선 미세환경은 고도로 조직화되어 있으며, T 세포 발달의 특정 측면을 담당하는 고유한 세포 유형과 영역을 지닙니다(상기 참조). 초기 특성 분석 실험은 흉선 내 교감 신경 분포의 분포를 탁월하게 입증했으며, 이는 대혈관, 흉선 캡슐, 피막하 피질과의 맥락적 연관성을 포함합니다. 그러나 추가적인 분석을 통해 이질적인 흉선 내 구성 요소들과의 구조적·기능적 관계를 더 깊이 규명할 수 있을 것이다. 논란의 여지가 있는 부분은 교감신경계(SNS) 및 감각신경계(PNS)의 신경 분포와 신호 전달 네트워크가 흉선 내에서 정확히 어떤 경로로, 어느 깊이까지 확장되는지이다. 또한 피질하 실질로 투사되는 흉선 신경들이 대혈관을 신경 분포하는 신경들과 동일한지 여부도 불분명하다. 신경 표현을 더 정확하게 파악하기 위한 유전자 리포터 모델과 결합하여, 전체 조직 면역표지 및 영상화(위에서 논의됨)를 위한 새로운 방법들은 신경-흉선 기질 세포 상호작용에 대한 결정적인 증거를 제공할 것이다.

흉선 혈관계의 신경 조절

흉선 내 혈관 네트워크는 복잡하고 밀집되어 있으며 다양하게 구성되어 있다. 이는 대동맥과 대정맥, 중간 크기의 세동맥과 세정맥, 더 작은 모세혈관, 그리고 보조 및 문합 혈관계로 이루어져 있다(97). 일반적으로 큰 혈관에서 신경 분포가 관찰되지만, 이들 혈관의 정확한 특성과 기능은 잘 확립되지 않았으며, 신경 분포를 유지하는 방식 역시 명확하지 않다. 교감 신경이 혈관과 밀접하게 연관되어 있으며, 피질 영역을 향해 편향적/선호적으로 확장된다는 점은 혈류, 흉선-혈액 장벽, 영양소 교환, 그리고 흉선으로의 세포 이동 및 흉선 밖으로의 세포 이동을 조절하는 데 잠재적인 역할을 시사한다. 신경 신호는 ETP 호밍의 유입과 성숙한 흉선 세포의 이차 림프 기관으로의 유출을 제어할 수 있으며, 이 두 과정은 혈관과 흉선의 독특한 혈관 주위 틈새에 의해 엄격하게 제어됩니다 (98, 99). 교감신경계(SNS)는 골수에서 조혈 전구세포의 동원(69, 72, 73, 100), 말초 조직으로의 백혈구 모집(101), 림프절 내 성숙 림프구의 기능(82, 102, 103)에 확립된 역할을 가지고 있습니다. 따라서 흉선 혈관계에 대한 SNS 신경 분포는 유사한 역할을 수행할 수 있습니다.

흉선 미세환경의 신경 조절

흉선 미세환경 내에는 점점 더 다양한 세포 유형이 존재한다. cTECs는 초기 T 세포 발달에 필수적이며, 직접적인 세포 접촉과 파라크린 신호가 T 계통 제한에 기여하는 틈새를 형성한다(1). T 세포는 이후 T 세포 수용체 유전자 재배열 및 T 세포 상피세포(TECs)와 수지상 세포(dendritic cells)를 포함한 기타 항원제시세포(APCs)가 필요한 양성/음성 선택을 포함한 특정 분화 및 성숙 단계를 거칩니다(6). 신경 신호는 TEC, 수지상 세포 또는 기타 흉선 틈새 세포에 의한 이러한 핵심 역할 중 일부를 촉진하거나 억제하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 흉선 비만 세포와 대식세포는 교감 신경 및 펩타이드 신경 근처에 위치하기 때문에 신경과 기능적 관계가 있는 것으로 제안되었습니다 (84, 104). 그러나 이러한 세포 유형이 신경 신호에 반응하는지는 추측에 불과하며, 기능적 역할을 입증하는 데이터는 거의 없거나 전혀 없습니다. 또한 흉선 미세환경은 신경으로 신호를 되돌려 보내 신경 분포, 축삭 퇴화/재생 또는 신경 세포 활동에 영향을 미칠 수도 있습니다(43).

발달 중인 T 세포에 대한 직접적인 신경 신호 전달

많은 in vitro 실험들은 흉선 세포에 대한 직접적인 신경 신호 전달을 시사해왔다. 앞서 논의한 바와 같이, 이러한 연구들의 주요 문제점은 다른 세포 유형들이 제공하는 니치 신호의 부재이다. 또한, 신경전달물질 수용체 발현은 흉선 세포 분화 단계에 따라 다를 수 있다. T 계통 분화의 각 단계가 신경 신호에 어떻게 반응하는지 이해하는 것은 앞으로의 연구에서 중요한 영역이다. 특정 흉선 세포 하위 집단을 분리하거나 단일 세포 기술을 활용하는 신기술을 통해 정교하고 세분화된 데이터를 생성할 수 있을 것이다. 핵심적인 질문은 신경 긴장도 변화로 인한 흉선 내 T 세포 발달의 변이가 T 세포 기능에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 흉선 내 신경 신호 전달이 T 세포 발달과 장기적 전신 면역 반응을 어떻게 조율하는지이다.

노화, 흉선 퇴화 및 내인성 재생 과정에서의 신경 분포 및 기능

흉선에 대한 대부분의 연구는 노화 관련 변화, 특히 흉선 퇴화(105)를 방지하여 노년기에 증가된 TCR 레퍼토리 다양성과 면역 체계 역량을 유지하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 최근 연구들은 흉선 노화와 재생 과정에서 상피 세포 결함의 발생을 강조하고 있습니다(106). 기존 연구들은 노화된 흉선에서 신경 분포가 유지된다는 점을 보여주었으나(상기 참조), 기능적 신경 신호 전달이 온전하게 유지되는지는 불분명하다. 예를 들어, 일부 연구에서는 노화된 흉선에서 신경전달물질 수치의 변화를 발견했으며(64, 66, 67), 이는 노화된 흉선 내 신경 신호 전달 네트워크가 변형되었을 가능성을 시사한다. 또한 암 환자에게 시행되는 화학요법이나 조혈모세포 이식 시 방사선 조사와 같은 유전독성 치료는 조기 흉선 퇴축과 후속 재생을 촉진한다(107). 교감신경계(SNS) 신경이 골수 내 조혈 재생에 중요하다는 점을 고려할 때(70), 흉선에서도 유사한 기능을 하는지 평가하는 것이 필수적일 것이다.

요약

흉선은 생애 전반에 걸쳐 T 세포 발달에 필수적인 핵심 1차 림프기관이다. 20세기 초로 거슬러 올라가는 역사적 연구들은 흉선의 신경 분포를 기록해왔으나, 현재까지 이 분포의 생리학적 중요성은 충분히 연구되지 않았다. 교감신경계(SNS)는 흔히 급성 스트레스 반응과 연관되지만, 이러한 관점은 조직 항상성에서 그 더 광범위한 역할을 지나치게 단순화한다. 교감 신경은 모든 조혈 및 림프 조직에 존재하여 비스트레스 상태에서도 면역 발달과 기능에 기여함을 시사한다. 이러한 증거에도 불구하고, 흉선 기능, 특히 T 세포 발달에서 신경 신호의 역할은 여전히 많은 미해결 질문이 있는 미개척 분야이다. 본 리뷰에서는 흉선 미세환경의 신경 조절을 뒷받침하는 증거와 지속되는 논쟁 및 공백을 다루는 방대한 문헌을 종합하였다. 이러한 수수께끼를 풀기 위해서는 고해상도 전체 조직 이미징, 광유전학 또는 화학유전학, 단일 세포 전사체학 등 신경과학과 면역학의 첨단 기술과 기법을 활용해야 합니다. 이 분야의 진전은 학제 간 협력, 자원 공유, 학문 간 가교 역할을 하는 전문성 함양에 달려 있습니다. 이러한 노력은 신경계와 흉선 기능 간의 복잡한 상호작용을 규명하고, 건강과 질병 상태에서의 신경면역 조절에 대한 이해를 심화하는 데 필수적일 것입니다.

Summary

The thymus is a critical primary lymphoid organ necessary for developing T cells throughout life. Historical studies dating back to the early 20th century have documented thymic neural innervation, but to date, the physiological significance of this innervation has been understudied. While the SNS is often associated with the acute stress response, this perspective oversimplifies its broader role in tissue homeostasis. Sympathetic nerves reside in all hematopoietic and lymphoid tissues, suggesting they contribute to immune development and function, even during non-stress conditions. Despite these indications, the role of neural signaling in thymic function, particularly in T cell development, remains a frontier with many unanswered questions. In this review, we summarized a large body of literature, addressing the evidence supporting neural regulation of the thymic microenvironment and the controversies and gaps that persist. Unlocking these mysteries will require harnessing advanced technologies and techniques from neuroscience and immunology, such as high-resolution whole-tissue imaging, optogenetics or chemogenetics, and single-cell transcriptomics. Progress in this field hinges on interdisciplinary collaboration, sharing of resources, and cultivating expertise that bridges disciplines. These efforts will be essential to unravel the complex interplay between the nervous system and thymic function, deepening our understanding of neuroimmune regulation in health and disease.

Acknowledgments

All figures were generated with BioRender.com.

Funding Statement

The author(s) declare that financial support was received for the research, authorship, and/or publication of this article. RC is supported by a Gottesman Stem Cell Institute Paul S. Frenette Scholars Award and a Cancer Research Institute Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI4994). GK is supported by the Montefiore-Einstein Comprehensive Cancer Center (MECCC) through its support grant (P30 CA013330). MM is supported by the MECCC and the American Society of Hematology (ASH) Scholar Award.

Author contributions

RC: Conceptualization, Writing – original draft, Writing – review & editing. ML: Conceptualization, Writing – original draft, Writing – review & editing. GK: Conceptualization, Writing – original draft, Writing – review & editing, Supervision, Funding acquisition, Resources. MM: Conceptualization, Writing – original draft, Writing – review & editing, Supervision, Funding acquisition, Resources.

Conflict of interest

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

The author(s) declared that they were an editorial board member of Frontiers, at the time of submission. This had no impact on the peer review process and the final decision.

Generative AI statement

The author(s) declare that no Generative AI was used in the creation of this manuscript.

Publisher’s note

All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be eval‎uated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher.

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