근막의 신경지배(만성요통의 이해를 위한 필수지식) 2021년 nature

[문형철]

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Evidence of a new hidden neural network into deep fasciae

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• Published: 16 June 2021

Evidence of a new hidden neural network into deep fasciae

• Caterina Fede, 
• Lucia Petrelli, 
• Diego Guidolin, 
• Andrea Porzionato, 
• Carmelo Pirri, 
• Chenglei Fan, 
• Raffaele De Caro & 
• Carla Stecco 

Scientific Reports volume 11, Article number: 12623 (2021) Cite this article

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Abstract

It is recognized that different fasciae have different type of innervation, but actually nothing is known about the specific innervation of the two types of deep fascia, aponeurotic and epymisial fascia. In this work the aponeurotic thoracolumbar fascia and the epymisial gluteal fascia of seven adult C57-BL mice were analysed by Transmission Electron Microscopy and floating immunohistochemistry with the aim to study the organization of nerve fibers, the presence of nerve corpuscles and the amount of autonomic innervation. The antibodies used were Anti-S100, Anti-Tyrosine Hydroxylase and Anti-PGP, specific for the Schwann cells forming myelin, the sympathetic nerve fibers, and the peripheral nerve fibers, respectively.

The results showed that the fascial tissue is pervaded by a rhomboid and dense network of nerves. The innervation was statistically significantly lower in the gluteal fascia (2.78 ± 0.6% of positive area, 140.3 ± 31.6/mm2 branching points, nerves with 3.2 ± 0.6 mm length and 4.9 ± 0.2 µm thickness) with respect to the thoracolumbar fascia (9.01 ± 0.98% of innervated area, 500.9 ± 43.1 branching points/mm2, length of 87.1 ± 1.0 mm, thickness of 5.8 ± 0.2 µm). Both fasciae revealed the same density of autonomic nerve fibers (0.08%). Lastly, corpuscles were not found in thoracolumbar fascia. Based on these results, it is suggested that the two fasciae have different roles in proprioception and pain perception: the free nerve endings inside thoracolumbar fascia may function as proprioceptors, regulating the tensions coming from associated muscles and having a role in nonspecific low back pain, whereas the epymisial fasciae works to coordinate the actions of the various motor units of the underlying muscle.

근막fascia마다 다른 유형의 신경 분포가 있다는 것은 알려져 있지만,

실제로 두 가지 유형의 심부 근막,

아포네로틱 근막과 epimisial fascia의 특정 신경 분포에 대해서는 알려진 바가 없습니다.

 aponeurotic and epymisial fascia

이 연구에서는

신경 섬유의 조직,

신경 소체의 존재 및 자율 신경의 양을 연구하기 위해

7마리의 성인 C57-BL 마우스의 아포네로틱 흉요추 근막과 부동 면역 조직 화학을

투과 전자 현미경과 부동 면역 조직 화학으로 분석했습니다.

사용된 항체는 각각 미엘린, 교감 신경 섬유 및 말초 신경 섬유를 형성하는 슈반 세포에 특이적인 항-S100, 항-티로신 하이드록실라제 및 항-PGP였습니다.

그 결과

근막 조직에는

마름모꼴의 촘촘한신경 네트워크가

퍼져 있는 것으로 나타났습니다.

rhomboid and dense network of nerves

gluteal fascia(양성 면적 2.78 ± 0.6%, 140.3 ± 31.6/mm2 분지점, 신경 길이 3.2 ± 0.6mm, 두께 4.9 ± 0.2 µm)은

흉요근막(9.01 ± 0.98%, 500.9 ± 43.1 분지점/mm2, 길이 87.1 ± 1.0mm, 두께 5.8 ± 0.2 µm)에 비해

통계적으로 유의하게 낮은 신경 분포도를 나타냈습니다.

--> 둔부 근막은 흉요건막에 비해 통계적으로 유의하게 낮은 신경분포도

--> 흉요건막이 허리통증의 주요원인이라는 의미!!

두 근막 모두

동일한 자율신경 섬유 밀도(0.08%)를 나타냈습니다.

마지막으로,

흉요추 근막에서는 소체가 발견되지 않았습니다.

corpuscles were not found in thoracolumbar fascia

이러한 결과를 바탕으로

두 근막은

고유 수용성과 통증 인식에서 서로 다른 역할을 하는 것으로 추정됩니다.

흉요추 근막 내부의 자유 신경 종말은

고유 수용체proprioceptors로 기능을 하는데,

관련 근육에서 오는 긴장을 조절regulating하고

비특이적 요통에 역할을 하는 반면,

epimysial fascia은

기저 근육의 다양한 운동 단위의 작용을 조정corodinate하는 역할을 할 수 있습니다.

Based on these results, it is suggested that the two fasciae have different roles in proprioception and pain perception:

the free nerve endings inside thoracolumbar fascia may function as proprioceptors,

regulating the tensions coming from associated muscles and having a role in nonspecific low back pain,

whereas the epymisial fasciae works to coordinate the actions of the various motor units of the underlying muscle.

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Introduction

For many years fascia was considered as an inert tissue, which wraps and gives mechanical support to muscles and other organs. The first demonstrations that fascia is innervated date back to 1957: Stilwell reported some histological findings about sensory nerves in deep fasciae1. In 1974, Sakada and co-authors studied the masticatory area but without giving a specific meaning to the presence of mechanoreceptors in the fascia2. The first event in which many Authors described a huge presence of sensory nerves in the fasciae with a role in proprioception and nociception was the First International Fascia Congress (2007, Harvard Medical School, Boston)3. It is now demonstrated that the different fasciae have different type of innervation: the visceral fascia is rich in autonomic innervation4, the superficial fascia shares with the skin mechano- and thermic-receptors, and the deep fascia has a role in proprioception5. Furthermore, also different areas show different density and type of innervation. The superficial fascia is the second most highly innervated soft tissue after the skin, with a density of nerve structures of 33.0 ± 2.5/cm2 and 64.0 ± 5.2/cm2, respectively, and a mean size of 19.1 ± 7.2 μm; the deep fascia has a nerve density of 19 ± 5.0/cm2 and presents a thin but huge network of small nerve fibers (mean diameter 15.5 ± 9.4 μm)6. Tesarz demonstrated that the different sublayers of thoracolumbar fascia (TLF) have different amounts of nerve fibers, more numerous in the superficial and deep sublayers rather than the middle one7.

The two types of deep fascia, aponeurotic and epimysial, have totally different functions and mechanical properties: the aponeurotic fascia envelops various muscles and keep in place and connect them, whereas the epymisial fascia is specific for each muscle and strongly connected with them, defining their form and volume5. But despite that, the two type of fasciae are usually considered together and nothing is known about their specific innervation. One of the most studied aponeurotic fasciae is the TLF, being related to non-specific low back pain8,9,10,11. After chronic inflammation, the density of nociceptive fibers in TLF increased, from 4 to 15%12. Schilder13 demonstrated that the free nerve endings of TLF are more sensitive to chemical stimulation by injections of hypertonic saline, compared to the underlying muscles and subcutis, maintaining a long lasting hypersensitivity and a longer pain duration. Yahia found corpuscular receptors in human TLF8, unlike Mense, who demonstrated in rat TLF the only presence of free nerve endings: they can have both nociceptive and proprioceptive functions, due to a low mechanical threshold14. The increase of calcitonin gene related peptides (CGRP) and substance P (SP) positive nociceptive fibers in the inner and outer layers of the inflamed TLF can explain the mechanism of low back pain10.

소개

수년 동안 근막은

근육과 다른 장기를 감싸고 기계적 지지력을 제공하는

불활성 조직으로 간주되었습니다.

근막에 신경이 있다는 최초의 증거는

1957년으로 거슬러 올라갑니다:

스틸웰은 심부 근막의 감각 신경에 대한 조직학적 발견을 보고했습니다1.

1974년 Sakada와 공동 저자들은 저작 부위를 연구했지만

근막에 기계 수용체가 있다는 사실에 구체적인 의미를 부여하지 않았습니다2.

많은 저자들이

근막에

고유 감각과 통각 수용에 중요한 역할을 하는 감각 신경이 존재한다는 사실을

처음으로 설명한 것은 제1회 국제 근막 학회(2007, 보스턴 하버드 의과대학)3였습니다.

이제 근막마다

다른 유형의 신경이 존재한다는 것이 입증되었습니다:

내장 근막은 자율 신경이 풍부하고4

표재성 근막은 피부 기계 및 열 수용체와 공유하며5

심층 근막은 고유 감각에 역할을 합니다6 .

the visceral fascia is rich in autonomic innervation4,

the superficial fascia shares with the skin mechano- and thermic-receptors, and

the deep fascia has a role in proprioception

또한 부위마다

신경 분포의 밀도와 유형이 다릅니다.

표재성 근막은

피부 다음으로 신경 구조 밀도가 높은 연조직으로

각각 33.0 ± 2.5/cm2 및 64.0 ± 5.2/cm2의 신경 밀도와 19.1 ± 7.2 μm의 평균 크기를 가지고 있으며,

심부 근막은 19 ± 5.0/cm2의 신경 밀도와 얇지만

거대한 작은 신경 섬유 네트워크(평균 직경 15.5 ± 9.4 μm)6 를 가지고 있습니다6.

Tesarz는

흉요추 근막(TLF)의 여러 하위 층마다 신경 섬유의 양이 다르며,

중간 층보다는 표층과 심층 하위 층에 더 많다는 것을 입증했습니다7.

심부 근막의 두 가지 유형인 aponeurotic and epimysial 은 기능과 기계적 특성이 완전히 다른데,

aponeurotic fascia 은 다양한 근육을 감싸고 제자리를 유지하며 연결하는

반면  epymisial fascia  은 각 근육에 특이적이고 강하게 연결되어 근육의 형태와 부피를 defining한다. 5.

The two types of deep fascia, aponeurotic and epimysial,

have totally different functions and mechanical properties:

the aponeurotic fascia envelops various muscles and keep in place and connect them,

whereas the epymisial fascia is specific for each muscle and strongly connected with them, defining their form and volume

하지만 두 가지 유형의 근막은 일반적으로 함께 고려되며 구체적인 신경 분포에 대해서는 알려진 바가 없습니다.

가장 많이 연구된

아포네로틱 근막 중 하나는 비특이적 요통8,9,10,11 과 관련된

흉요추 건막 TLF입니다.

만성 염증 후,

흉요추건막(TLF)의 통각 섬유 밀도는 4에서 15%로 증가했습니다12.

Schilder13는

TLF의 자유 신경 종말이 기저 근육과 피하에 비해

고장성 식염수 주사에 의한 화학 자극에 더 민감하여

오래 지속되는 과민증과 더 긴 통증 지속 시간을 유지한다는 것을 입증했습니다.

야히아는

쥐 TLF에서 유일하게 자유 신경 종말의 존재를 입증한 Mense와 달리

인간 TLF8 에서 기계적 역치가 낮기 때문에

통각 및 고유 수용성 기능을 모두 가질 수 있는 코르푸스 수용체를 발견했습니다14.

염증이 있는 TLF의 내층과 외층에서

칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)와 물질 P(SP) 양성 통각 섬유의 증가는

요통의 메커니즘을 설명할 수 있습니다10.

On the contrary, up to now, no studies exist about the innervation of the epimysial fasciae.

The aim of this work was to deeply study the organization of nerve fibers in the deep fasciae: in TLF as aponeurotic fascia, and in gluteal fascia, as epimysial fascia. The use of mouse tissues permitted an exclusive analysis of innervation in a tridimensional way, to better understand the differences in various areas and the presence of autonomic innervation and nerve corpuscles. First of all this work aims to demonstrate that the fasciae are richly innervated tissues, then it allows to evidence for the first time differences in the density of innervation and the presence of corpuscles according to the type of fascia, aponeurotic or epymisial, and the role it plays in proprioception or in coordination of the actions of the motor units.

반대로 지금까지

둔근근막 epimysial fasciae 의 신경 분포에 대한 연구는

존재하지 않습니다.

이 연구의 목적은 심부 근막의 신경 섬유 조직을 심도 있게 연구하는 것이었습니다.

 TLF에서는 아포네로틱 근막으로, 

둔근 근막에서는 epimysial fasciae 으로. 마우스 조직을 사용하여 

다양한 영역의 차이와 자율 신경 분포 및 신경 소체의 존재를 더 잘 이해하기 위해 

3차원적인 방식으로 신경 분포에 대한 독점적인 분석이 가능했습니다. 

우선 이 연구는 

근막이 풍부한 신경을 가진 조직임을 입증하는 것을 목표로 하며, 

근막의 유형, 아포네로틱 또는 근내막에 따른 신경 분포의 밀도와 피질의 존재,

고유 수용성 또는 운동 단위의 작용 조정에서 수행하는 역할의 차이를

처음으로 증거할 수 있게 해줍니다.

Results

The mean thickness of the posterior layer of TLF was 34.3 µm ± 12.3 µm, whereas the mean thickness of the gluteal region was 21.3 µm ± 10.4 µm (Fig. 1, analysis performed in seven semithin sections stained with toluidine blue, 5 < areas < 10 for each section, using Image J software). The analysis of density innervation per area or per side (right/left) of TLF and gluteal fascia didn’t highlight any significant difference comparing random areas stained with the same antibody (data not shown): all the areas of TLF, from thoraco to sacral region (identified in Fig. 2), exhibited the same distribution of innervation and the same density; on the other side also the gluteal fascia didn’t show any difference according to the mapped region. Figure 3A shows that the fascial tissue is pervaded entirely by a dense network of nerves individualized by S100 antibody, ending on the border with the muscle, which is not at all equally innervated. The specificity of the staining was demonstrated by the absence of reaction in the negative control (Fig. 3B).

결과

TLF 후층의 평균 두께는 34.3 µm ± 12.3 µm인 반면

둔부 부위의 평균 두께는 21.3 µm ± 10.4 µm였습니다(그림 1,

톨루이딘 블루로 염색한 7개의 반박절편에서 분석, 각 섹션당 5 <영역 <10, Image J 소프트웨어 사용). TLF와 둔근 근막의 부위별 또는 측면별(오른쪽/왼쪽) 밀도 신경 분포 분석 결과, 동일한 항체로 염색한 임의의 부위를 비교했을 때 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음):

흉부에서 천골 부위까지(그림 2에서 확인) TLF의 모든 부위는

동일한 신경 분포와 동일한 밀도를 보였고,

반대쪽에서도 매핑된 영역에 따라 차이가 나타나지 않았습니다(그림 2 참조). 그림 3A는 근막 조직 전체에 S100 항체에 의해 개별화된 조밀한 신경 네트워크가 퍼져 있으며, 근육과의 경계에서 끝나는데, 이는 전혀 동일하게 신경이 분포되어 있지 않음을 보여줍니다. 염색의 특이성은 음성 대조군에서 반응이 나타나지 않음으로써 입증되었습니다(그림 3B).

Figure 1

Thickness of thoracolumbar and gluteal fascia: (A) 5 µm section of fascia, spine and muscle, stained with ematoxylin and eosin; arrows indicate the thoracolumbar fascia (TLF); scale bar: 1000 µm; (B) 0.5 µm semithin section of thoracolumbar fascia stained with Toluidine Blue; scale bar: 50 µm; (C) 0.5 µm semithin section of gluteal fascia stained with Toluidine Blue; a: adipocytes; f: gluteal fascia; m: muscle; scale bar: 50 µm.

흉요추 및 둔부 근막의 두께: (A) 에마톡실린과 에오신으로 염색한 근막, 척추 및 근육의 5µm 단면; 화살표는 흉요추 근막(TLF); 눈금 막대를 나타냅니다: 1000 µm; (B) 톨루이딘 블루로 염색한 흉요추 근막의 0.5 µm 반박절 단면; 눈금 막대: 50 µm; (C) 톨루이딘 블루로 염색한 둔근 근막의 0.5 µm 반박막 단면; a: 지방세포; f: 둔근 근막; m: 근육; 눈금 막대: 50 µm.

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Figure 2

Analysis of density innervation per area and side (right and left): “ × ” indicate each area analyzed after immunohistochemical stains: from thoraco to sacral region of thoracolumbar fascia (both right and left side), and gluteal fascia (right and left side).

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Figure 3

Different density of innervation of fascia and muscle: A: S100 immunohistochemistry reaction of thoracolumbar fascia (f) and latissimus dorsi muscle (m). B: negative control with the omission of the primary antibody. (a): adypocytes; (f): fascia; (m): muscle. Scale bar: 300 µm.

근막과 근육의 신경 분포 밀도가 다릅니다:

A: 흉요근막(f)과 배근(m)의 S100 면역조직화학 반응. B: 1차 항체를 생략한 음성 대조군. (a): 지방 세포; (f): 근막; (m): 근육. 스케일 막대: 300 µm.

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Tyrosine Hydroxylase showed less positivity (Fig. 4E–F), with only some positive single nerve filaments. On the contrary, the distribution of PGP 9.5 and S100 reaction were qualitatively similar (Fig. 4C–D,A–B, respectively), with a rhomboid and dense thin network of nerves homogeneously distributed in all the samples area analyzed. The reaction with PGP 9.5 antibody showed, however, thinner positive filaments less contrasted: for this reason the quantitative and morphometric analysis to compare TLF and gluteal fascia were performed on S100-stained images. The results are reported on Figs. 4 and 5. Both by qualitative (Fig. 4B,D,F) and quantitative (Fig. 5) analysis emerged in a clear and evident way that the gluteal fascia was less innervated with respect to the TLF. All the analyzed parameters (percentage of innervated area, density of branching points, length and thickness of the nerve structures) were statistically significantly lower in the epymysial gluteal fascia with respect to the aponeurotic thoracolumbar fascia. In particular, the latter showed a percentage of innervated area equal to 9.01 ± 0.98%, with 500.9 ± 43.1 branching points per mm2. Instead in the gluteal fascia the positive area was equal to 2.78 ± 0.6%, with a number of branching points of 140.3 ± 31.6/mm2 (p < 0.01, t-test gluteal fascia vs. TLF). Moreover, the length of the nerves in the gluteal fascia was 3.2 ± 0.6 mm, showing a very statistically significant difference (p < 0.01) with respect to the TLF (mean length 87.1 ± 1.0 mm). In the latter one, also the thickness of the nerve structures was higher (5.8 ± 0.2 µm in TLF vs 4.9 ± 0.2 µm in gluteal fascia, p-value < 0.05).

티로신 하이드 록 실라 제는 양성이 적었고 (그림 4E-F) 일부 단일 신경 필라멘트 만 양성으로 나타났습니다. 반대로 PGP 9.5와 S100 반응의 분포는 질적으로 유사했으며(각각 그림 4C-D, A-B), 분석된 모든 샘플 영역에 마름모꼴의 조밀하고 얇은 신경망이 균일하게 분포되어 있었습니다. 그러나 PGP 9.5 항체와의 반응은 더 얇은 양성 필라멘트가 덜 대비되는 것으로 나타났습니다. 이러한 이유로 TLF와 둔근 근막을 비교하기 위한 정량적 및 형태학적 분석을 S100 염색 이미지에서 수행했습니다. 결과는 그림 4와 5에 나와 있습니다. 정성적(그림 4B,D,F) 및 정량적(그림 5) 분석 모두에서 둔근 근막이 TLF에 비해 덜 신경화되어 있다는 것이 명확하고 분명하게 나타났습니다. 분석된 모든 매개 변수(신경 분포 면적 비율, 분기점 밀도, 신경 구조의 길이 및 두께)는 아신경성 흉요추 근막에 비해 골근막 둔근에서 통계적으로 유의하게 낮았습니다. 특히 후자의 경우 신경 분포 면적의 비율이 9.01 ± 0.98%에 달했으며, mm2당 500.9 ± 43.1개의 분기점이 있었습니다. 반면 둔근 근막의 양성 면적은 2.78 ± 0.6%, 분기점 수는 140.3 ± 31.6/mm2였습니다(p <0.01, t-검정 둔근 근막 대. TLF). 또한 둔근 근막의 신경 길이는 3.2 ± 0.6mm로 TLF(평균 길이 87.1 ± 1.0mm)와 비교하여 통계적으로 매우 유의미한 차이(p <0.01)를 보였습니다(평균 길이 87.1 ± 1.0mm). 후자의 경우 신경 구조의 두께도 더 높았습니다(TLF 5.8 ± 0.2 µm 대 둔근 근막 4.9 ± 0.2 µm, p-값 <0.05).

Figure 4

Innervation of thoracolumbar and gluteal fascia: Thoracolumbar fascia (A,C,E) and gluteal fascia (B,D,F) samples stained with S100 (A,B), PGP 9.5 (C,D) and Tyrosine Hydroxylase (E,F) antibodies. Scale bars: 100 µm.

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Figure 5

Morphometric analysis of the pattern of S-100 positive fibers in thoracolumbar and gluteal fascia: positive area (%), branching points (BP) density (number/mm2), length of nerve structures (mm), thickness of nerve structures (µm) in thoracolumbar fascia (TLF) and gluteal fascia. *p < 0.05; **p < 0.01, t test.

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The TH immunohistochemistry showed that in both the fasciae the positive area is around 0.08%, thus leading to a ratio S100/TH positivity of 112.1 in the thoracolumbar fascia and 34.6 in the gluteal fascia (Fig. 6).

Figure 6

Autonomic innervation in thoracolumbar and gluteal fascia: fraction of area (IR area %) positive to Tyrosine Hydroxylase (TH) and values of S100/TH ratio, in thoracolumbar fascia (TLF) and gluteal fascia, expressed as mean ± standard error mean.

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A deeper analysis by TEM of the nerves that cross the fascia permitted us to highlight that the majority of the nerve structures (with both myelinic and amyelinic axons) are in the midst of collagen bundles, and not in the muscle (Fig. 7B–C–D) or in the adipose tissue (Fig. 7A).

Figure 7

Analysis of nerves inside the fascial tissue: (A) Floating thoracolumbar fascia stained with anti-S100 antibody and ematoxylin: the nervous structures are S100 positive (n: small nerve, arrows indicate single nerve fibers), whereas blood vessels are not stained (v: vessel; *: endothelial cells; a: adipocytes). (B) Semithin section of thoracolumbar fascia, whose boxes show nerve structures in the midst of collagen bundles of the fascial layers. (C) and (D): TEM images of a small nerve fiber in the inner layer (C) or in the outer layer (D) of the TLF, with both myelinc and unmyelinic axons. m: muscle; TLF: thoracolumbar fascia; mAx: myelinic axon; unAx: unmyelinic axon. Scale bars: (A) and (B) 30 µm; (C) 3 µm; (D) 2 µm.

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Lastly, the analysis found no presence of any corpuscle in all of the thoracolumbar samples analyzed. In the gluteal fascia, and more specifically in the perimysium and endomysium closely connected to this fascia, Golgi tendon organs (Fig. 8A), neuromuscular junctions (Fig. 8B) and muscle spindles (Fig. 8C–D) have been identified.

마지막으로,

분석 결과 분석된 모든 흉요추 샘플에서

어떤 소체도 존재하지 않는 것으로 나타났습니다.

둔근 근막, 특히 이 근막과 밀접하게 연결된 근막 주위와 내근에서

골지 힘줄 기관(그림 8A),

신경근 접합부(그림 8B),

근육 방추(그림 8C-D)가 확인되었습니다.

Figure 8

S100-positive corpuscles in gluteal fascia: Golgi tendon organ (A), neuromuscular junction (B) and muscle spindles (C) in gluteal fascia. In (D) is shown the TEM analysis of the muscle spindle: a connective tissue capsule (c) wraps a small group of muscle fibers (*) and nerve fibers (#). Scale bars: 50 µm (A,B,C), 5 µm (D).

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Discussion

This work highlights for the first time the concept that we cannot consider all muscular fasciae as a similar structure. Indeed the TLF and the gluteal fasciae present different densities of innervation with nerve structures of different thicknesses. However, according to our results, both the gluteal and TLF have the same density of autonomic nerve fibers (0.08%). Among all the possible mediators of the autonomic nervous system, we have checked tyrosine hydroxylase that catalyzes the rate limiting step in this synthesis of catecholamines. The positive finding of these fasciae to this enzyme suggests a possible role of the autonomic nervous system in the opening and closing of the vessels inside fasciae, and consequently, it can play a role in the ischemia of fascial tissue. As the amount of sympathetic nerve elements are similar in the two fasciae, we can hypothesize that they are sensitive to ischemia in a similar way. Furthermore, the finding of sympathetic nerve fibers in TLF and gluteal fascia allows to consider that people subjected to a state of chronic stress may have increased levels of pain in those areas, as sympathetic activity is greater under psychological stress15. Indeed, it is well recognized that chronic stress can alter the physiological cross-talk between brain and biological systems, leading to compromised functions on the nervous, immune, endocrine, and metabolic systems16. This result can help to explain the increased levels of low back pain in patients with chronic stressfull state, a known effect but the mechanisms of which are not yet fully understood17.

Although the gluteal and TL fascia present the same density of autonomic innervation, they show a totally different amount of free nerve endings, leading to hypothesize that the major amount is due to the presence of sensitive free nerve endings and suggesting that they can have a different role in proprioception and pain perception. This study also confirm‎s the absence of mechanoreceptors, like Pacini and Ruffini corpuscles, in the thoracolumbar fascia and gluteal fascia, as already demonstrated by Tesarz et al.7. It is probable that these receptors are usually localized in the superficial adipose tissue and superficial fascia, with the function of perceiving mechanical stimuli6, and where the superficial fascia joints the deep fascia, as in the retinacula surrounding joints, in the palmar and plantar fascia18,19,20,21, to increase the proprioception of these areas.

The fascial tissue showed a greater and homogeneous distribution of the nerve network with respect to the adjacent muscular tissue (Fig. 3-A). These results are in line with an our previous work about the innervation of the human hip joint, which showed that muscles (vasto-lateral and gluteus medius) were crossed by large nerves bundles (mean number 12 ± 6.1/cm2, mean diameter 36.4 ± 13.4 μm), presumably motor nerves, whereas the fasciae were invaded by networks of small nerve fibers (33 ± 2.5/cm2, mean size 19.1 ± 7.2 μm in the superficial fascia, and 19.0 ± 5.0/cm2, mean diameter 15.5 ± 9.4 μm, in the deep fascia)22. These findings lead to the revealing that the pain perception is higher in the fascia with respect to the muscle, highlighting the importance to preserve the fascial structures during surgery and to target to the fascial structures during a manual treatment. It is well know that the TLF could be a source of pain, as demonstrated by Langevin et al.9, Tesarz et al.7, Schilder et al.23, e. g., probably because it can feel the tensions coming from different muscles. Indeed the TLF is not related to a specific muscle, but gives insertions to both the latissimus dorsi, gluteus maximus and external oblique muscles24, and also on the inner side it adheres to the serrati posteriors fascia and to the erector spinae aponeurosis5. All these muscles stretch the TLF and can create a deformation of the network of the free nerve endings that we have just described. They form a thin and delicate net, strongly connected with the extracellular matrix of the fascial tissue, and consequently are particularly responsive to stretch, shear loading and mechanical stimuli. According to Hoheisel and coauthors25 the free nerve endings inside TLF may function as proprioceptors, in the absence of Pacini and Ruffini receptors. Based on this information, we can consider the thoracolumbar fascia as a large proprioceptive element that merges all the tensions coming from its associated muscles. Due to trauma, overuse, poor posture etc., these tensions can become unbalanced, resulting in an anomalous deformation of the free nerve endings, creating deficient motor patterns and eventual pain perceived by the CNS. Bednar et al.26 found an alteration in both the histological structure and the degree of innervation of TLF in patients with chronic low back pain. This possibility has surely to be further studied to better explain the possible role of TLF in nonspecific low back pain.

There are minimal studies about the possible role of the gluteal fascia in pain, but the density and type of innervation found in this work suggest that this gluteal fascia is probably less sensitive and consequently plays a minor role as pain generator. The gluteal fascia is totally adherent to the underlying muscle and is connected with some muscle spindles and Golgi corpuscles. These nerve corpuscles are specialized to feel the state of contraction of the various muscular bundles and to regulate them. It is well known that their capsules are totally in continuity with the perimysium and endomysium of the muscle27, and consequently any alteration of the intramuscular connective tissue can alter the sensitivity of these receptors, as demonstrated for dystrophy28. We also know that the intrafusal spindle muscular fibers can stretch the surrounding connective tissue, and consequently through fascial continuity among endomysium, perimysium and epimysium affect the tension of the gluteal fascia. Therefore, we can hypothesize that the nerve network in the gluteal fascia can unify all the tensions coming from the muscle spindles of the gluteus maximus muscle and transmit by way of the Central Nervous System a decoded input about the state of contraction of the gluteus maximus. So, we can suggest that the epymisial fasciae works more to coordinate the actions of the various motor units present in the underlying muscle, rather than just regulating the tensions originating from many directions as the TLF does.

토론

이 연구는 모든 근육 근막을 유사한 구조로 간주할 수 없다는 개념을 처음으로 강조합니다.

실제로 TLF와 둔근 근막은

서로 다른 두께의 신경 구조로

서로 다른 신경 분포 밀도를 나타냅니다.

그러나 연구 결과에 따르면

둔근과 TLF는 모두 동일한 자율 신경 섬유 밀도(0.08%)를 가지고 있습니다.

자율 신경계의 모든 가능한 매개체 중에서 우리는 카테콜아민 합성의 속도 제한 단계를 촉매하는 티로신 하이드 록 실라 제를 확인했습니다. 이 효소에 대한 근막의 양성 반응은 근막 내부 혈관의 개폐에 자율신경계의 역할이 있을 수 있으며, 결과적으로 근막 조직의 허혈에 관여할 수 있음을 시사합니다. 두 근막에서 교감 신경 요소의 양이 비슷하기 때문에 비슷한 방식으로 허혈에 민감하다는 가설을 세울 수 있습니다.

또한,

TLF와 둔근 근막에서

교감 신경 섬유가 발견되면

만성 스트레스 상태에 처한 사람들은 심리적 스트레스 하에서 교감 활동이 더 커지기 때문에

해당 부위의 통증 수준이 증가 할 수 있다고 생각할 수 있습니다15.

실제로

만성 스트레스는

뇌와 생물학적 시스템 간의 생리적 상호 작용을 변화시켜

신경계, 면역계, 내분비계 및 대사계의 기능을 손상시킬 수 있다는 사실은 잘 알려져 있습니다16.

이 결과는

만성 스트레스 풀 상태의 환자에서

요통이 증가하는 것을 설명하는 데 도움이 될 수 있으며,

이는 알려진 효과이지만 그 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않은 상태입니다17.

둔근과 흉요추 근막은

자율 신경 분포 밀도는 동일하지만,

자유 신경 종말의 양이 완전히 다른 것으로 나타나

민감한 자유 신경 종말이 존재하기 때문이라는 가설을 세우고

고유 감각과 통증 지각에서 다른 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

이 연구는 또한 Tesarz 등이 이미 입증한 바와 같이

흉요추 근막과 둔근 근막에 파치니 및 루피니 소체와 같은 기계 수용체가 없다는 것을 확인했습니다.7 

이러한 수용체는

일반적으로 표재성 지방 조직과 표재성 근막에 국한되어 기계적 자극을 감지하는 기능을 가지고 있으며6,

표재성 근막이 관절을 둘러싼 망막, 손바닥 및 발바닥 근막18,19,20,21 에서와 같이

깊은 근막과 결합하여 이러한 부위의 고유 수용성을 증가시키는 것으로 추정됩니다.

근막 조직은

인접한 근육 조직에 비해 신경 네트워크가

더 크고 균일하게 분포하는 것으로 나타났습니다(그림 3-A).

이러한 결과는

인간 고관절의 신경 분포에 대한 이전 연구와 일치하며,

근육(대둔근 및 중둔근)이 큰 신경 다발(평균 수 12 ± 6.1/cm2, 평균 직경 36.4 ± 13. 4 μm),

운동 신경으로 추정되는 작은 신경 섬유 네트워크 (표재성 근막에서 33 ± 2.5 / cm2, 평균 크기 19.1 ± 7.2 μm, 심부 근막에서 19.0 ± 5.0 / cm2, 평균 직경 15.5 ± 9.4 μm)22 에 의해 침범 된 반면,

근막은 작은 신경 섬유 네트워크에 의해 침범되었습니다.

이러한 결과는 근육에 비해 근막에서 통증 지각이 더 높다는 것을 밝혀내어 수술 시 근막 구조를 보존하고 도수 치료 시 근막 구조를 타겟팅하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다.

TLF가 통증의 원인이 될 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다.

Langevin 등.9, Tesarz 등.7, Schilder 등.23, 예를 들어, 다른 근육에서 오는 긴장을 느낄 수 있기 때문일 수 있습니다.

실제로 TLF는

특정 근육과 관련이 없지만

배등근, 대둔근 및 외사근24 에 모두 삽입되며

안쪽에는 세라티 후방 근막과 척추 기립근 아포뉴로시스5 에도 부착됩니다.

이 모든 근육은 TLF를 늘리고 방금 설명한 자유 신경 종말 네트워크의 변형을 일으킬 수 있습니다.

이들은

얇고 섬세한 그물을 형성하고 근막 조직의 세포 외 기질과 강하게 연결되어 있으며

결과적으로 스트레치, 전단 하중 및 기계적 자극에 특히 민감하게 반응합니다.

호하이젤과 공동 저자에 따르면25 

TLF 내부의 자유 신경 종말은

파치니 및 루피니 수용체가 없는 경우 고유 수용체 역할을 할 수 있다고 합니다.

이 정보를 바탕으로 흉요추 근막을

관련 근육에서 오는 모든 긴장을 통합하는

큰 고유 수용 요소로 간주할 수 있습니다.

외상, 과도한 사용, 자세 불량 등으로 인해

이러한 긴장이 불균형해지면

자유 신경 종말의 비정상적인 변형이 발생하여

운동 패턴에 결함이 생기고

결국 중추 신경계에서 통증을 감지할 수 있습니다.

Bednar등26은 

만성 요통 환자에서

TLF의 조직학적 구조와 신경 분포 정도가

모두 변화하는 것을 발견했습니다.

이러한 가능성은

비특이적 요통에서 TLF의 가능한 역할을 더 잘 설명하기 위해

더 연구되어야 합니다.

통증에서 둔근 근막의 가능한 역할에 대한 연구는 거의 없지만,

이 연구에서 발견 된 신경 분포의 밀도와 유형은

이 둔근 근막이 덜 민감하여

결과적으로 통증 생성자로서 사소한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

둔근 근막은

기저 근육에 완전히 밀착되어 있으며

일부 근육 스핀들 및 골지체와 연결되어 있습니다.

이러한 신경 소체는 다양한 근육 다발의 수축 상태를 느끼고 이를 조절하는 데 특화되어 있습니다. 이들의 캡슐은 근육의 근내 및 근외와 완전히 연속되어 있다는 것은 잘 알려져 있으며27, 따라서 근육 내 결합 조직의 변화는 영양 장애에서 입증된 것처럼 이러한 수용체의 민감도를 변화시킬 수 있습니다28.

우리는 또한 근육 내 스핀들 근섬유가

주변 결합 조직을 늘릴 수 있으며,

결과적으로 근막, 근막 및 에피미시움 사이의 근막 연속성을 통해

둔근 근막의 긴장에 영향을 미친다는 것을 알고 있습니다.

따라서

둔근 근막의 신경 네트워크가 대둔근의 근육 스핀들에서 오는 모든 긴장을 통합하고

중추 신경계를 통해 대둔근의 수축 상태에 대한 해독된 입력을 전달할 수 있다는 가설을 세울 수 있습니다.

따라서

대둔근막은 TLF처럼 여러 방향에서 발생하는 긴장을 조절하는 것이 아니라

기저 근육에 존재하는 다양한 운동 단위의 작용을 조정하는 데 더 많은 역할을 한다고 볼 수 있습니다.

Methods

Samples collection

The experiments were performed on seven adult C57-BL mice (all males, mean age 8 weeks). All animal procedures were approved by the ethical committee of the University of Padova, in agreement with the guidelines of the Italian Department of Health, and in compliance with the ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) guidelines. The specimens were collected from Thoracolumbar Fascia (TLF), as an example of the aponeurotic fascia, and gluteal fascia (GF), as an example of epimysial fascia. The posterior layer of the TLF, from the sacral to the thoracic region was separated from the spine (Fig. 9A) and maintained as an unique specimen with its orientation during all the steps. The gluteal fascia layer was removed from the sacral column to the gluteal region (Fig. 9B).

The fascia collected from one mice was fixed for 24 h in 10% formalin solution and for two weeks in 10% EDTA, then embedded in paraffin and cut in four-μm-thick sections for classical histological analysis and ematoxylin stains (Fig. 1-A). The fascia tissues from the others six mices were divided in three parts: one small piece of tissue (2 × 5 mm) was collected, subdivided in 15 small fragments and processed for semithin sections analysis and TEM analysis (see Transmission Electron Microscopy paragraph), and two were processed for Immunohistochemistry floating reaction (Fig. 9C), using randomly one of these for S100 staining (total of six samples), and one for TH or PGP stainings (three samples for each antibody), following the protocol described in the paragraph below.

Figure 9

Samples collection and macroscopic images of thoracolumbar fascia and gluteal fascia: (A) collection of thoracolumbar fascia; (B) collection of gluteal fascia (#); (C) floating samples of thoracolumbar fascia (*) and gluteal fascia (#).

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Immunohistochemical method

The floating fascia samples of thoracolumbar and gluteal region were fixed in formalin 10% in Phosphate Buffer Saline (PBS). After repeated washings in PBS, endogen peroxidases were blocked with 1% H2O2 in PBS for 20 min at room temperature. The floating tissues were then pre-incubated with a blocking buffer (BSA 0.1% in PBS) for 60 min at room temperature and then incubated in rabbit polyclonal Anti S100 (Dako, dilution 1:4000), Rabbit Anti Tyrosine Hydroxylase (TH, GeneTex, dilution diluited 1:700), Rabbit Anti PGP (GeneTex, dilution 1:500) in the same pre-incubation buffer and maintained overnight at 4 °C. We selected these antibodies because S100 is specific for Schwann cells forming myelin, TH stains the sympathetic nerve fibres, the anti-PGP is widely used as a marker for all peripheral nerve fibers. After repeated PBS washing, the floating thoracolumbar and gluteal fasciae were incubated for 1 h in goat anti rabbit HRP (Jackson ImmunoResearch—Laboratories, Inc., Cambridge -UK) diluted 1:300 in the same pre-incubation buffer and washed in PBS. Negative controls underwent the same protocol steps, with the omission of the primary antibodies. The reaction was then developed with 3,3′-diaminobenzidine (Liquid DAB + substrate Chromogen System kit Dako Corp, Carpinteria, CA, USA) and stopped with distilled water.

Image acquisition

The images were acquired by using Leica DMR microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).

For the image processing at least 10 pictures for each sample were acquired at 40X enlargement, to analyze the pattern of nerve fibers. Each sample was also entirely analyzed under light microscope to visualize any corpuscles.

Image processing and analysis

To morphometrically characterize the pattern of nerve fibers, the images of S100-stained samples of thoracolumbar and gluteal fascia underwent steps of image processing and analysis performed with ImageJ software as illustrated in Fig. 10.

Figure 10

Images processing and morphometric analysis of the pattern of nerve fibers: (A) original picture of one S100 reaction; (B) top-hat filter applied in picture A to enhance the contrast; (C) binary image of nerve network; (D) final binary skeleton derived from picture C and identification of the branching points. Scale bar: 100 µm.

Full size image

Briefly, after shading correction, removal of background signals and manual adjustment of each image to eliminate non-nervous structures, a top-hat filter29 was applied (Fig. 10B) to enhance the contrast between the pattern of nerve fibers and the background. An adaptive discrimination procedure30 was then applied to select nerve profiles. This method operated with a local threshold: the mean grey value of a neighboring region was calculated for every pixel (by a 15 × 15 pixel low-pass filter) and this value plus an offset threshold constant defined the local threshold for that pixel. After interactive editing of the remaining artifacts, a binary image of the nerve network was then obtained (see Fig. 10C). By using binary thinning procedures31 the binary skeleton of this image was finally derived (Fig. 10D) and the branching points identified32. Nerve density was estimated from the binary image by eval‎uating the area fraction covered by the fibers, while from the binary skeleton image the total length of the nerve network and the density of branching points were estimated. From these primary morphometric parameters, the mean thickness of the nerve fibers was also derived as the ratio between the area of the network and its length.

Furthermore, nerve density was estimated also from images of TH-stained samples to estimate the fraction of area (%) positive to Tyrosine Hydoxylase and to calculate the S100/TH ratio.

Statistical analysis

Student’s t test was used to verify significant differences when comparing data of area of positivity to S100 (%), branching points density (number/mm2), length (mm) and thickness (µm) of the nerve structures, and relative percentage of positivity of tyrosine hydroxylase of the thoracolumbar fascia and the gluteal fascia.

Transmission electron microscopy (TEM)

The specimens of thoracolumbar and gluteal fasciae were fixed in 2.5% glutaraldehyde (Serva Electrophoresis, Heidelberg, Germany) in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.3, and post-fixed in 1% osmium tetroxide (Agar Scientific Elektron Technology, Stansted, UK) in 0.1 M phosphate buffer, dehydrated in a graded alcohol series and then embedded in Epoxy Embedding Medium Kit (45349, Sigma-Aldrich, St. Gallen, Switzerland). Semithin (0.5 µm) and ultrathin (60 nm) sections were cut with the ultramicrotome RMC-PTX PowerTome (Boeckeler Instruments, Arizona –USA). Semithin sections were stained with 1% Toluidine blue solution. Ultrathin sections were collected on 300-mesh copper grids, counterstained with 1% uranyl acetate and then with Sato’s lead. Specimens were observed by a Hitachi H-300 Transmission Electron Microscope (Japan).

Data availability

All data generated or analysed during this study are included in this published article.

References

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