imvic test 및 catl, oxidasw test

[김희중]

 

1. IMViC Test

Enterobacteriaceae의 groups는 biochemical properties와 특정 기질이 있을 때의 enzymatic reaction에 근거하여 분류될 수 있다. 이때 IMViC test가 이용된다. (IMViC은 Indole, methyl-red, Voges-Proskauer, citrate utilization의 약자이다)

1) Indole Production Test

   Tryptophan은 일부 bacteria의 enzymatic activities에 의해 산화될 수 있는 필수 amino acid이다. Tryptophan을 metabolic products로 conversion할 때 tryptophanase가 관여한다. Tryptophan을 가수분해하여 indole을 만들어내는 것은 모든 미생물의 특징이 아니기 때문에 biochemical marker로 이용될 수 있다. 이 실험에서는 tryptophan을 포함하는 SIM agar가 사용되고, Kovac's reagent를 가하여 indole을 검출해낸다. 만약 indole이 있으면 indole은 reagent중의 p-dimethylaminobenzaldehyde와 complex를 이루어 cherry red color를 만들어 낸다. 따라서 positive reaction에서는 red coloration 되고, negative reaction에서는 red coloration이 일어나지 않고 yellow로 남아있게 된다.

2) Methyl Red Test

   Hexose monosaccharide인 glucose는 모든 enteric organisms에서 energy production을 위해 산화되는 major substrate이다. 이 산화 과정의 end-products는 각 bacteria에 있는 enzymatic pathway에 따라 다를 것이다. 이 test에서는 pH indicator인 methyl red가 고농도의 acid end products를 검출한다. 모든 enteric microorganisms가 glucose를 발효시켜 organic acids를 만들어내지만, 이 test는 E. coli와 E. aerogenes를 구분하는데에만 가치가 있다.  이 두 organisms는 초기 incubation period 동안에 organic acid end products를 만들어내기 때문에 pH는 4정도까지 떨어진다. E. coli에서는 pH 4가 배양이 끝날 때까지 유지되지만, E. aerogenes는 효소를 이용하여 이 산을 ethanol이나 acetone등과 같은 nonacidic end products로 바꾸기 때문에 pH는 대략 6정도까지 상승한다. Methyl red는 pH 4 부근에서 red, pH 6 부근에서는 yellow가 되는데, red가 positive reactiom이고 yellow가 negative reaction이다.

  3) Voges-Proskauer Test

   Voges-Prokauer test는 어떤 organisms이 glucose metabolism의 결과로 생기는 유기산으로부터 acetylmethylcarbinol 등과 같은 nonacidic or neutral end product를 만드는 능력을 결정한다. 이 test에 사용되는 시약은 alcoholic alpha-naphthol 과 40% potassium hydroxide 용액이다. Acetylmethylcarbiol을 검출하기 위해서는 이 end product가 diacetyl compound로 산화되어야한다. 이 반응은 alpha-naphthol catalyst와 MR-VP medium의 peptone에 있는 guanidine group의 존재하에서 일어난다. 반응의 결과로 pink complex가 생성되어 배지에 부분적인 rose color를 만들어낼 것이다. Barritt's reagent를 넣고 15분이 지난 뒤 deep rose color가 생기면 acetylmethylcarbinol이 있음을 나타내며, 이것이 positive reaction이다. Rose coloration이 없으면 negative reaction이다.

4) Citrate Utilization Test

   발효가능한 glucose나 lactose가 없을 때, 어떤 microorganisms는 탄소원, 에너지원으로서 citrate를 이용할 수 있다. 이 능력은 citrate를 cell 안으로 수송하는 것을 촉진하는 citrate permease의 존재유무에 달려있다. Citrate는 Krebs cycle에서의 첫 번째 major intermediate이며, acetyl-CoA와 oxaloacetic acid의 condensation에 의해 생성된다. Citrate는 citrase에 의해 oxaloacetic acid와 acetic acid로 분해되며, 이 산물들은 효소들에 의해 pyruvic acid와 carbon dioxide로 바뀐다. 이 반응동안 배지는 alkaline으로 된다. 생성된 carbon dioxide가 물과 sodium과 결합하여 alkaline인 sodium carbonate를 만들기 때문이다. Sodium carbonate의 존재는 배지에 있는 bromothymol blue indicator를 green에서 deep Prussian blue로 바꾼다. 배양 후 slant 표면에서 blue coloration된 colony가 자라고 있으면 citrate-positive culture이다. Citrate negative culture는 자라지 못하므로 배지는 그대로 green일 것이다.

2. Catalase Test

  Aerobic respiration동안 microorganism에서는 hydrogen peroxide나 superoxide등과 같은 독성물질이 만들어지며, 이러한 물질은 효소에 의해 빨리 분해되지 않으면 organism을 죽게 만든다. 이러한 과정에 참여하는 효소로는 hydrogen peroxide를 분해하는  catalase와 peroxidase, superoxide를 처리하는 superoxide dismutase(SOD) 등이 있다.

Catalase는 hydrogen peroxide를 물과 산소로 분해한다.

  

  Catalase 생성은 기질인 hydrogen peroxide를 적절하게 배양된 trypticase soy agar slant culture에 가함으로써 결정될 수 있다. 만약 catalase가 존재한다면, 산소가스의 발생으로 인해 거품이 생길 것이며, 이것이 positive reaction이다. 반면 거품이 생기지 않으면 negative reaction으로써, catalase를 만들지 못함을 나타내게 된다.

3. Oxidase Test

  Oxidase enzymes는 aerobic respiration동안 electron transport system의 작동에 중요한 역할을 한다. Cytochrome oxidase는 환원된 cytochrome을 O₂로 산화하는 것을 촉매하며, 그 결과 H₂O 또는 H₂O₂가 만들어진다. Oxidase test는 oxidase-positive인 genera Neisseria, Pseudomonas과 oxidase-negative인 Enterobacteriaceae를 구분하는데 도움을 준다.

  Bacteria가 cytochrome oxidase를 만드는 능력은 test reagent인 tetramethyl-p-phenylene

-diamine dihydrochloride를 plate medium에서 자라는 colonies에 넣음으로써 결정된다. Artificial substrate로 작용하는 이 밝은 분홍색의 시약은, cytochrome oxidase와 free oxygen이 있을 경우 전자를 잃으면서 산화되어 검은색의 화합물로 된다. 시약을 넣었을 때, colonies 표면의 색깔이 분홍색에서 밤색을 거쳐 검은색으로 변하면 positive reaction이며, cytochrome oxidase가 있음을 나타내고, 색이 변하지 않으면 negative reaction이며 oxidase activity가 없음을 나타낸다.