시료제작
순서
1. 시료의 채취
목적부위의 조직을 신속하게 적출한다. 2. 세절
1㎣ 크기 기준을 세절한다. 3. 고정 1차
고정 - 2.5% Glutaraldehyde액/0.1M Phosphate 완충액, pH7.4, 1∼4℃,
2시간 수세
- 0.1M Phosphate 완충액, pH7.4, 2시간 2차
고정 - 1% Osmium Tetroxide액/0.1M Phosphate 완충액, pH7.4, 1∼4℃,
1∼2시간 수세
- 0.1M Phosphate 완충액, pH7.4, 30분
4. 탈수 30% Ethanol → 50% Ethanol →
70% Ethanol → 80% Ethanol → 90% Ethanol → →
95% Ethanol → 100% Ethanol (2회)로 각 20분씩 진탕, 실온
5. 치환 Propylene Oxide (P.O) 또는 QY-1에서 30분간
2회 6. 침투 P.O 또는 QY-1 : Epoxy 혼합액 =
1:1에서 3시간, 1:2에서 3시간, 순수 Epoxy 혼합액에서 하룻밤(12시간)
7. 포매 조직 번호표를 넣고 조직을 포매시킨다.
(Capsule 또는 Flat Mould) 8. 중합 37℃
EM Oven에서 12시간 → 45∼50℃에서 12시간 → 60℃에서 48시간 열중합시킨다.
9. 삭정 브록을 조직부위가 전면에 나오도록
삭정한다.
10.박절 1) Semith 절편(0.5∼2㎛)을 유리
Slide에 놓고, 건조시킨 후 toluidine blue 단염색 실시 2)
광학현미경으로 절편을 관찰하고 적절한 부위를 선정하여 그림으로 표시한다.
3)
초박절편(ultrathin section : 50-80㎚)으로 절편한다.
11.염색 Uranyl Acetate & Lead Citrate로
이중 염색한다. 12.관찰 투과 전자현미경으로
검경하고 사진을 촬영한다. 13.현상 필름을 현상하고
필름상태를 점검한다. 14.인화 초점이 잘맞는
필름을 선별하고, 적당한 규격의 인화지로 인화한다. 15.결과 인화지를
정돈하고 결과를 판독한 후 보고서를 작성한다. → 파일로 정리
광학현미경용과 전자현미경용의 시료제작의
비교
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광학현미경 |
전자현미경 |
시료의 크기 고정액
완충액 탈수제 치환제
포매제 중합 박절기 절편
염색 봉입 관찰
결과
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목적으로 하는 부위가 크다 10%
Formalin pH만 중성으로 맞춘다.
Ethanol Xylene Paraffin
실온 Microtome 4-6㎛
Hematoxylin & Eosin Cabada
Balsam 광학현미경 보고서
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시료위 크기가 제한되어 있다. (1㎣
정도) 전고정액 : 2.5% Glutaraldehyde 또는
Paraformaldehyde 후고정액 : OsO4 Phosphate
또는 Cacodylate Buffer 사용 Propylene
Oxide Epoxy Resin 혼합물 37℃∼60℃에서
장시간 Ultramicrome semithin
: 1-2㎛ ultrathin : 50-80㎛ semithin
: toluidine blue, methylene blue (multiple stail sol.)
ultrathin : uranyl acetate & lead citrate
Canada Balsam 또는 Epon 혼합액
전자현미경 사진
및 보고서 |
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