시료제작 순서 (전자현미경과 광학현미경비교)

[이현승]

시료제작 순서

1.  시료의 채취   목적부위의 조직을 신속하게 적출한다.
2.  세절   1㎣ 크기 기준을 세절한다.
3.  고정   1차 고정 - 2.5% Glutaraldehyde액/0.1M Phosphate 완충액, pH7.4, 1∼4℃, 2시간
              수세 - 0.1M Phosphate 완충액, pH7.4, 2시간
              2차 고정 - 1% Osmium Tetroxide액/0.1M Phosphate 완충액, pH7.4, 1∼4℃, 1∼2시간
              수세 - 0.1M Phosphate 완충액, pH7.4, 30분

4.  탈수   30% Ethanol → 50% Ethanol → 70% Ethanol → 80% Ethanol → 90% Ethanol →
               → 95% Ethanol → 100% Ethanol (2회)로 각 20분씩 진탕, 실온
5.  치환   Propylene Oxide (P.O) 또는 QY-1에서 30분간 2회
6.  침투   P.O 또는 QY-1 : Epoxy 혼합액 = 1:1에서 3시간, 1:2에서 3시간, 순수 Epoxy 혼합액에서
              하룻밤(12시간)
7.  포매   조직 번호표를 넣고 조직을 포매시킨다. (Capsule 또는 Flat Mould)
8.  중합   37℃ EM Oven에서 12시간 → 45∼50℃에서 12시간 → 60℃에서 48시간 열중합시킨다.
9.  삭정   브록을 조직부위가 전면에 나오도록 삭정한다.

10.박절   1) Semith 절편(0.5∼2㎛)을 유리 Slide에 놓고, 건조시킨 후 toluidine blue 단염색 실시
              2) 광학현미경으로 절편을 관찰하고 적절한 부위를 선정하여 그림으로 표시한다.
              3) 초박절편(ultrathin section : 50-80㎚)으로 절편한다.

11.염색   Uranyl Acetate & Lead Citrate로 이중 염색한다.
12.관찰   투과 전자현미경으로 검경하고 사진을 촬영한다.
13.현상   필름을 현상하고 필름상태를 점검한다.
14.인화   초점이 잘맞는 필름을 선별하고, 적당한 규격의 인화지로 인화한다.
15.결과   인화지를 정돈하고 결과를 판독한 후 보고서를 작성한다. → 파일로 정리


광학현미경용과 전자현미경용의 시료제작의 비교

	광학현미경	전자현미경
시료의 크기  고정액  완충액  탈수제  치환제  포매제  중합  박절기  절편  염색  봉입  관찰  결과	목적으로 하는 부위가 크다  10% Formalin  pH만 중성으로 맞춘다.  Ethanol  Xylene  Paraffin  실온  Microtome  4-6㎛  Hematoxylin & Eosin  Cabada Balsam  광학현미경  보고서	시료위 크기가 제한되어 있다. (1㎣ 정도)  전고정액 : 2.5% Glutaraldehyde 또는 Paraformaldehyde  후고정액 : OsO4   Phosphate 또는 Cacodylate Buffer 사용   Propylene Oxide   Epoxy Resin 혼합물   37℃∼60℃에서 장시간   Ultramicrome   semithin : 1-2㎛   ultrathin : 50-80㎛   semithin : toluidine blue, methylene blue (multiple stail sol.)   ultrathin : uranyl acetate & lead citrate   Canada Balsam 또는 Epon 혼합액   전자현미경   사진 및 보고서