단백질 정량 method 4가지( od참고사항은 없음당....)

단백질 정량 1. Micro-Kjeldahl법 1. 원리 일정량의 시료에 진한 황산과 분해제를 가하고 가열하면 분해 및 산화, 환원이 동시에 일어나며 시료에 포함되어 있던 질소는 일단 NH3로 변해서 H2SO4와 반응하여 황산암모늄으로 되고 분해액 속에 남게 된다. 분해액에 과잉의 알칼리를 가하여 증류시키면 암모니아가 다시 방출된다. 이 가스를 boric acid로 흡수하여 규정알칼리 용액으로 역적정하면 전질소량을 산출할 수 있다. 그리고 여기에 각 시료에 해당하는 질소환산계수(nitrogen conversion factor)를 곱하여 단백질 함량을 구할 수 있다. ① 분해반응 : 시료 + H2SO4 → (NH4)2SO4 + CO2 +SO2 + H2O ② 증 류 : (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O ③ 중화반응 : 2NH3 + 2H3BO3 → 2NH4H2BO3 ④ 적 정 : 2NH4H2BO3 + 2HCl → 2NH4Cl + 2H3BO3 2. 시약 ① Sodium hydroxide-sodium thiosulfate 용액 : NaOH (60g)＋증류수(일정량)→완전히 녹인다.→Na2S2O3·5H2O(5g)＋증류수→100mL ② 지시약 : methyl red(0.12g)＋methylene blue(0.06g)＋95% ethyl alcohol(90mL) ③ Saturated boric acid 3. 방법 ① 시료 0.02g 을 재서 30ml 분해 flask에 넣는다. ② 분해제 (K2SO4 0.4g, CuSO4 0.013g, TiO2 0.013g)를 넣고, hood에서 c-H2SO4 2.1mL를 넣는다. ③ boiling chip을 넣고 켈달 분해장치에서 3시간동안 분해한다. (연녹색을 띠면 종료) ④ 냉각시키고, 모든 시료에 각각 증류수 2.1mL정도를 천천히 첨가한다. 증류하기 전에 시료가 굳으면 분해장치를 이용하여 녹인 후에 진행한다. ⑤ 증류 장치를 설치한다. (장치내의 물이 미지근한 상태) +- Still내의 물의 양은 가열장치의 하단 곡선 부분이 잠기도록 한다. +- 역류부 cock 와 시료 주입구 cock에 vaseline을 바르고 cock는 잠금 위치에 놓는다. +- 증류부에 냉각수가 흐르도록한다. ⑥ 5mL 포화 H3BO3 용액 (＋지시약 2∼4 방울)을 100mL 삼각 flask에 담고 끝이 용액 의 표면에 잠기도록 설치. ⑦ 주입구 cock를 열고 still에 분해용액을 넣는다. 아연을 소량 뿌린 다음 분해 flask를 증류수로 헹궈서 아연을 씻어내린다. Heater switch를 켜고 still내에 적당한 증기압이 유지되도록 heater controller 를 약 3-4 위치에 놓는다. ⑧ Cock를 잠그고 8∼10ml NaOH-Na2S2O3 용액을 추가하고 cock를 조금씩 열어 반시킨다. +- 가열부의 물이 끓기 전에 주입을 완료시킨다. +- 주입시 주입부나 역류부로 시료가 손실되는 것에 특히 주의하여 주입한다. +- 주입완료 후 heater controller를 8-9위치에 놓고 증류를 계속한다. +- Distillate를 15mL 모은 후, 증류수로 50mL를 만든다.(희석) +- Distillate의 양을 약 50mL 받은 경우 희석과정은 생략 +- 다음 시료 증류를 위해서 distillate beaker를 제거하고, heater를 끈다. 역류부 cock를 열고 냉각수를 강하게 튼 다음 주입구 cock를 열고 증류수로 씻어준다. cock는 다시 vaseline을 바르고 조립해 놓는다. ⑨ Factor를 알고있는 0.02N HCl로 적정한다. ⑩ Blank는 dextrin을 사용하여 위와 동일 방법으로 정량한다. ⑪ 연속적으로 측정시 still 가열부 내의 물을 일정량 냉각수와 교환하여 미지근한 상태로 만들어 다음 순서를 진행한다. ⑫ 계산 NCF = 쌀 : 5.95, 보리 : 5.83, 밀가루 : 5.83, 콩 : 5.91, 우유 : 6.38 Ⅱ. Lowry법 1. 서론 - 가장 널리 사용되는 단백질 정량법이다. - 알칼리 조건하에서 Cu2+는 단백질의 peptide bonds와 complex를 형성하고, Cu+로 환원된다. 이 Cu+는 tyrosine, tryptophan, cystein residue의 R group과 같이 Folin reagent와 반응한다. - Folin 시약을 첨가 후 빨리 vortexing 하는 것이 매우 중요하다. - 측정 범위 : 5∼100㎍/mL 1) 장점 - 정확한 단백질 정량 방법이다. - 단백질 종류에 따른 편차가 적다. 2) 단점 - 단백질이 비가역적으로 변성된다. - 반응속도가 느리다. - Sucrose, lipids, buffers, monosaccharides 와 hexosamines는 시약과 반응한다. - Ammonium sulfate, EDTA, mercaptoethanol, dithiothreitol 와 phosphate concentrations는 반응에 방해가 된다. 2. 시약 Reagent A : Na2CO3 100g을 0.5N NaOH에 용해하여 1L로 만든다. Reagent B : CuSO4-5H2O 1g을 증류수에 용해하여 100mL로 만든다. Reagent C : Na-K tartarate(Rochelle salt) 2g을 증류수로 용해하여 100mL로 만든다. 2N Folin-phenol reagent(stable only at acidic pH) : 첨가 후 빨리 혼합한다. Standard protein solution : 0.3 mg/mL bovine serum albumin (Reagent A, B, C는 오랜 동안 보관할 수 있다.) 3. 방법 표준곡선 그리기 ① 20개의 16 × 150mm test tubes에 BSA 용액 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 1.0mL 를 각각 넣는다. → 증류수를 넣어서 전체 부피가 1mL 되게 한다. ② Reagent A 15mL, Reagent B 0.75mL, Reagent C 0.75mL를 Erlenmeyer flask에서 완전히 혼합한다. ③ ②번에서 만든 용액을 1mL씩 각 tube에 넣고 vortex로 완전히 혼합한다. ④ 실온에서 15분간 방치한다. ⑤ 2N Folin-phenol reagent 5mL를 50mL 증류수와 완전히 섞는다.(Erlenmeyer flask이용) ⑥ ⑤번 용액을 3mL씩 각 tube에 넣고 바로 vortex로 혼합한다. ⑦ 실온에서 45분간 방치한다. ⑧ 540nm에서 흡광도를 측정한다. → 흡광도 측정은 45분 방치 후 바로 해야 한다. ⑨ 표준곡선을 그린다. *. 시료용액을 1mL 취하여 ②이하와 동일한 방법으로 실험을 한다. 표준곡선을 이용하여 단백질의 양을 계산한다. 3. Bicinchoninic Acid(BCA) Assay 1. 원리 biuret 반응 : Prot. + Cu2+ → Cu+ Cu+ + BCA → BCA-Cu+complex (purple color) 측정 범위 : standard assay : 10∼1200㎍/mL microassay : 0.5∼10㎍/mL 1) 장점 - BCA는 Cu+ capture reagent로 알칼리에 안정하다. - single reagent → one-step procedure - 반응생성물이 안정하다. - 세제(detergent), 단백질 변성제(urea, guanidinium chloride)의 영향을 받지 않는다. 2) 단점 - 단백질의 아미노산 조성에 따라 반응이 상이하다. - 지방 존재시 높은 흡광도를 보인다. - 환원당 존재시 더 민감해진다. - EDTA와 같은 chelate제의 영향을 받는다. → 시료를 희석하여 측정한다. 2. 시약 Reagent A : 1g sodium bicinchoninate, 2g Na2CO3, 0.16g sodium tartrate, 0.4g NaOH and 0.95g NaHCO3 brought to 100mL with water. Adjust the pH to 11.25 with 10M NaOH Reagent B : 0.4g CuSO4·5H2O in 10mL water. Solutions A and B are stable. SWR(standard working solution) : Mix 100 vol reagent A with 2 vol reagent B. This should be green in color. 3. 방법 ① 20μL의 시료에 1 mL SWR을 가하여 섞는다. ② 60℃에서 30분 동안 유지한 다음 실온으로 냉각한다. ③ 562nm에서 흡광도를 측정하다. 4.Bradford Assay 1. 원리 - Lowry법보다 더 정밀하고 빠르며 일반적인 시약들에 의한 간섭효과도 더욱 작다. - 염색약인 Coomassie blue G250이 단백질에 결합하는 것에 근거한 방법이다. 염색약이 산성인 assay solution에서는 양이온의 형태로 470nm에서 최대흡광도를 나타내나, 단백질과 결합하면 음이온의 형태로 595nm에서 최대흡광도를 나타내는 성질을 이용하여 단백질에 결합된 염색약의 양을 595nm에서 흡광도를 재어 정량할 수 있다. 염색약은 자유 아미노산과는 결합하지 않고 단백질의 arginyl residue에 가장 잘 결합하는데, 이러한 이유로 단백질간의 반응성이 차이가 난다는 것이 결점이다. - 측정 범위 : 25㎍/㎖ ∼ 200㎍/㎖ 2. 시약 Bradford stock solution: ① Coomassie brilliant blue G-250 100mg을 50mL 96% EtOH에 녹인다.(overnight). ② ①에 85% phosphoric acid 100mL을 가한후 증류수 850mL로 1L를 맞춘다. *. Whatman filterpaper로 걸러준 후 갈색병에 넣어서 4℃에서 보관 3. 방법 ① 시험관에 단백질 양이 10내지 100㎍로 되도록 시료를 넣고 전체 부피를 100㎕가 되도록 증류수를 첨가한다. ② Blank로는 100μL의 증류수를 시험관에 넣는다. ③ 5mL의 시약을 각각의 시험관에 넣고 vortexing한다.. 이때 거품이 나면 재현성이 떨어지므로 주의한다. ④ 5분 후 595nm에서 흡광도를 측정한다.