아세트아미노펜 간독성으로 탐구하는 활성산소 제거..

[문형철]

Redox Biol. 2016 Dec; 10: 148–156.

Published online 2016 Oct 4. doi: 10.1016/j.redox.2016.10.001

PMCID: PMC5065645

PMID: 27744120

Oxidative stress during acetaminophen hepatotoxicity: Sources, pathophysiological role and therapeutic potential

Kuo Du, Anup Ramachandran, and Hartmut Jaeschke⁎

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Abstract

Acetaminophen (APAP) hepatotoxicity is characterized by an extensive oxidative stress. However, its source, pathophysiological role and possible therapeutic potential if targeted, have been controversially described. Earlier studies argued for cytochrome P450-generated reactive oxygen species (ROS) during APAP metabolism, which resulted in massive lipid peroxidation and subsequent liver injury. However, subsequent studies convincingly challenged this assumption and the current paradigm suggests that mitochondria are the main source of ROS, which impair mitochondrial function and are responsible for cell signaling resulting in cell death. Although immune cells can be a source of ROS in other models, no reliable evidence exists to support a role for immune cell-derived ROS in APAP hepatotoxicity. Recent studies suggest that mitochondrial targeted antioxidants can be viable therapeutic agents against hepatotoxicity induced by APAP overdose, and re-purposing existing drugs to target oxidative stress and other concurrent signaling events can be a promising strategy to increase its potential application in patients with APAP overdose.

아세트아미노펜(APAP) 간독성은 

광범위한 산화 스트레스가 특징입니다. 

그러나

 그 원인, 병태생리학적 역할 및 표적화할 경우 

가능한 치료 잠재력은 논란의 여지가 있습니다. 

초기 연구에서는 

APAP 대사 과정에서 

사이토크롬 P450이 생성하는 활성 산소종(ROS)이 

대량 지질 과산화와 그에 따른 간 손상을 일으킨다고 주장했습니다. 

그러나 

후속 연구에서 이 가정이 설득력 있게 반박되었고, 

현재 패러다임은 

미토콘드리아가 미토콘드리아 기능을 손상시키고 

세포 사멸을 초래하는 세포 신호 전달을 담당하는 

ROS의 주요 공급원이라는 것을 시사합니다. 

면역 세포가 다른 모델에서 ROS의 원천이 될 수 있지만, 

APAP 간독성에서 

면역 세포 유래 ROS의 역할을 뒷받침하는 신뢰할 수 있는 증거는 

존재하지 않습니다. 

최근 연구에 따르면 

미토콘드리아 표적 항산화제는 

APAP 과다 복용으로 유발되는 간독성에 대한 치료제가 될 수 있으며, 

산화 스트레스 및 기타 동시 신호 이벤트를 표적으로 삼기 위해 

기존 약물의 용도를 변경하는 것은 

APAP 과다 복용 환자에게 잠재적 적용 가능성을 높이는 유망한 전략이 될 수 있다고 합니다.

Keywords: Acetaminophen hepatotoxicity, mitochondria, oxidant stress; Antioxidants; Lipid peroxidation; Innate immunity; Peroxynitrite

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Highlights

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• 산화 스트레스는 아세트아미노펜 간독성에서 중요한 역할을 합니다.
• -미토콘드리아는 독성을 유발하는 ROS와 RNS의 주요 공급원입니다.
• -사이토크롬 P450과 염증 세포는 독성과 관련된 ROS의 공급원이 아닐 수 있습니다.
• -미토콘드리아 산화 스트레스는 APAP 과다 복용에 대한 유망한 치료 표적입니다.

1. Introduction

Acetaminophen (APAP) hepatotoxicity is the leading cause of acute liver failure in many Western countries [1], [2]. A key mechanism of the toxicity is the cytochrome P450-catalyzed metabolic activation of APAP, which generates the reactive metabolite N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) and initiates toxicity in both rodents and humans [3]. Excessive NAPQI formation after APAP overdose depletes cellular glutathione (GSH), adducts proteins including mitochondrial proteins, and induces mitochondrial oxidant stress and dysfunction. This results in nuclear DNA fragmentation and necrotic cell death and a subsequent inflammatory response, including the release of pro-inflammatory cytokines and activation of immune cells [3]. Currently, APAP-induced liver injury has served as the most popular, mechanistically well studied and clinically relevant model for testing of phytotherapeutics and other hepato-protective interventions. In spite of significant evidence pointing towards the existence of a general oxidative stress during APAP hepatotoxicity, the cellular or intracellular sources and the nature of the ROS in this context remain debatable. This has led to controversial conclusions and ultimately jeopardized the translation of new therapeutic approaches to the human pathophysiology [4], [5]. In particular, the pathophysiological role of ROS in the mechanism of toxicity has not been clearly discussed and still requires further investigation. This review will provide an updated overview of the potential sources of ROS in APAP hepatotoxicity. The corresponding pathophysiological role of each source in the toxicity will be also summarized and discussed. We propose that mitochondrial targeted antioxidants or re-purposing of existing drugs which target mitochondrial ROS may have therapeutic potential for APAP poisoning in animals and potentially in humans.

아세트아미노펜(APAP) 간독성은

많은 서구 국가에서 급성 간부전의 주요 원인입니다 [1], [2].

독성의 핵심 메커니즘은

APAP의 시토크롬 P450 촉매에 의한 대사 활성화로,

이는 반응성 대사산물인 N-아세틸-p-벤조퀴논 이민(NAPQI)을 생성하고

설치류와 사람 모두에서 독성을 유발합니다 [3].

APAP 과다 복용 후 과도한 NAPQI 형성은

세포 글루타치온(GSH)을 고갈시키고

미토콘드리아 단백질을 포함한 단백질을 부가하며

미토콘드리아 산화 스트레스와 기능 장애를 유도합니다.

이로 인해

핵 DNA 단편화와 괴사성 세포 사멸,

전 염증성 사이토카인 방출 및

면역 세포 활성화를 포함한 후속 염증 반응이 발생합니다 [3].

현재 APAP에 의한 간 손상은

식물 치료제 및 기타 간 보호 중재를 테스트하기 위한

가장 인기 있고,

기계적으로 잘 연구되었으며,

임상적으로 관련성이 높은 모델로 사용되고 있습니다.

APAP 간독성 동안

일반적인 산화 스트레스의 존재를 가리키는 중요한 증거에도 불구하고,

이러한 맥락에서 세포 또는 세포 내 공급원과 ROS의 특성은

여전히 논쟁의 여지가 있습니다.

이로 인해 논란의 여지가있는 결론이 도출되었으며 궁극적으로 인간 병리 생리학에 대한 새로운 치료 접근법의 번역을 위태롭게했습니다 [4], [5]. 특히 독성 메커니즘에서 ROS의 병태생리학적 역할은 명확하게 논의되지 않았으며 여전히 추가 연구가 필요합니다. 이 리뷰에서는 APAP 간독성에서 ROS의 잠재적 원인에 대한 최신 개요를 제공합니다. 독성에서 각 공급원의 해당 병리 생리학적 역할도 요약하고 논의할 것입니다.

미토콘드리아 표적 항산화제 또는

미토콘드리아 ROS를 표적으로 하는 기존 약물의 용도 변경이

동물과 잠재적으로 인간에서 APAP 중독에 대한

치료 잠재력을 가질 수 있다고 제안합니다.

2. Sources and relevance of oxidant stress in acetaminophen hepatotoxicity

2.1. Cytochrome P450-mediated oxidant stress

In the 1980's, it was recognized that cytochrome P450-mediated drug metabolism in microsomes can generate ROS (mainly superoxide and hydrogen peroxide) [6]. Cytochrome P450 2E1-mediated ROS production has been suggested to play a role in alcohol-induced liver injury [7], although recent evidence suggests that mitochondria and immune cell-derived oxidant stress can also contribute to the progression of the injury (Fig. 1) [8], [9], [10]. A mitochondrial oxidant stress has also been implicated in the progression of I/R injury [11]. Since APAP is also metabolized by P450 enzymes in microsomes, it was assumed that P450-mediated metabolism of APAP generated ROS in APAP hepatotoxicity, leading to subsequent lipid peroxidation and liver injury [12]. This hypothesis was mainly based on the use of inducers and inhibitors of cytochrome P450, which enhanced and attenuated APAP-induced lipid peroxidation, respectively [12]. However, this conclusion was soon challenged by the fact that glutathione disulfide (GSSG) formation, a sensitive indicator of hepatic oxidant stress, was not increased during APAP metabolism in a rat model [13], and this was subsequently confirmed in a mouse study [14]. The original observations in the rodent models were later supported in vitro. In primary mouse hepatocytes, 2′,7′-dichlorofluorescein fluorescence, a marker of intracellular oxidant stress, did not change during drug metabolism but rapidly increased after APAP was metabolized and GSH was depleted [15]. Furthermore, in metabolically competent human HepaRG cells, ROS and peroxynitrite were only detectable after 6 h post-APAP, which is after APAP metabolism [16]. Another interesting finding is that although in rats P450-mediated metabolism of APAP also causes GSH depletion and even significant protein adducts formation, no increased oxidant stress or liver injury was detected [17]. Taken together, these studies did not find direct evidence of APAP-induced oxidant stress during the metabolism phase. However, recent fluorescence measurements using highly sensitive semiconducting polymer–based nanosensors provided evidence for H2O2 formation during the metabolism phase of APAP in vivo [18]. The fact that this signal could be attenuated by P450 inhibitors suggests that the oxidant stress was dependent on the drug metabolism [18]. However, given the extensive evidence that many interventions are highly effective when given after the metabolism phase indicate that these nanosensors are detecting a sub-toxic oxidant stress that may have limited relevance for cell death.

2.1. 시토크롬 P450 매개 산화 스트레스
1980년대에 마이크로솜에서 사이토크롬 P450 매개 약물 대사가 ROS(주로 슈퍼옥사이드 및 과산화수소)를 생성할 수 있다는 것이 인식되었습니다 [6]. 최근 증거에 따르면 미토콘드리아와 면역 세포 유래 산화 스트레스도 간 손상의 진행에 기여할 수 있다고 하지만 [7], [ 8], [9], [10], 사이토크롬 P450 2E1 매개 ROS 생성은 알코올로 인한 간 손상에서 역할을하는 것으로 제안되었습니다. 미토콘드리아 산화 스트레스도 I/R 손상의 진행과 관련이 있습니다 [11].

APAP도 마이크로솜에서 P450 효소에 의해 대사되기 때문에,

APAP 간독성에서 P450 매개 대사가 ROS를 생성하여

후속 지질 과산화 및 간 손상을 유발한다고 가정했습니다 [12].

이 가설은

주로 사이토크롬 P450의 유도제와 억제제의 사용에 근거한 것으로,

각각 APAP에 의한 지질 과산화를 강화 및 약화시켰습니다 [12].

그러나 이 결론은 곧 간 산화 스트레스의 민감한 지표인 글루타티온 디설파이드(GSSG) 형성이 쥐 모델에서 APAP 대사 중에 증가하지 않는다는 사실에 의해 도전받았고 [13], 이는 이후 마우스 연구에서 확인되었습니다 [14]. 설치류 모델에서의 원래 관찰 결과는 나중에 시험관 내에서도 뒷받침되었습니다. 원발성 마우스 간세포에서 세포 내 산화 스트레스 마커인 2′,7′-디클로로플루오레세인 형광은 약물 대사 중에는 변하지 않았지만 APAP가 대사되고 GSH가 고갈된 후에는 급격히 증가했습니다 [15].

또한, 대사적으로 유능한 인간 HepaRG 세포에서 ROS와 퍼옥시니트라이트는 APAP 대사 후 6시간 후에야 검출이 가능했습니다 [16]. 또 다른 흥미로운 발견은 쥐에서 P450 매개 APAP 대사가 GSH 고갈과 심지어 상당한 단백질 부가물 형성을 유발하지만 산화 스트레스나 간 손상 증가는 감지되지 않았다는 것입니다 [17].

이러한 연구 결과를 종합하면,

대사 단계에서 APAP에 의한

산화 스트레스에 대한 직접적인 증거는 발견되지 않았습니다.

그러나

최근 고감도 반도체 폴리머 기반 나노 센서를 사용한 형광 측정은

생체 내 APAP의 대사 단계 동안

H2O2 형성에 대한 증거를 제공했습니다 [18].

이 신호가

P450 억제제에 의해 감쇠될 수 있다는 사실은

산화 스트레스가 약물 대사에 의존한다는 것을 시사합니다 [18].

그러나

많은 중재가 대사 단계 이후에 투여될 때 매우 효과적이라는 광범위한 증거를 고려할 때

이러한 나노 센서가 세포 사멸과 관련성이 제한적일 수 있는

아독성 산화 스트레스를 감지하고 있음을 나타냅니다.

Fig. 1

Sources of ROS in APAP hepatotoxicity in comparison to other forms of liver injury. The cytochrome P450 enzyme system can generate free radicals during metabolism of various compounds. Cyp2E1-mediated ROS formation during metabolism of alcohol has been show to play an important role in alcohol-induced liver injury, while the involvement of mitochondria- and immune cell-derived ROS has also been implicated. With regards to acetaminophen (APAP)-induced liver injury, the reactive intermediate NAPQI generated during APAP metabolism forms mitochondrial protein adducts, which cause oxidative stress within the organelle and subsequently initiate signaling cascades resulting in programmed necrosis. In contrast to APAP injury, immune cells mediated oxidative stress is critical in liver injury-induced by conditions such as ischemia-reperfusion, where damage associated molecular patterns (DAMPS) released from hepatocytes instigate free radical and chemokine production from Kupffer cells in the sinusoids, which then results in infiltration of neutrophils into the space of Disse and further oxidant stress close to the hepatocyte, which ultimately produces mitochondrial oxidant stress and results in cell necrosis.

다른 형태의 간 손상과 비교한 APAP 간독성에서 ROS의 원인. 

시토크롬 P450 효소 시스템은 다양한 화합물의 대사 과정에서 자유 라디칼을 생성할 수 있습니다. 알코올 대사 중 Cyp2E1 매개 ROS 형성은 알코올로 인한 간 손상에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으며, 미토콘드리아 및 면역 세포 유래 ROS의 관여도 관련되어 있는 것으로 밝혀졌습니다. 아세트아미노펜(APAP)에 의한 간 손상과 관련하여, APAP 대사 과정에서 생성된 반응성 중간체 NAPQI는 미토콘드리아 단백질 부가물을 형성하여 세포 소기관 내에서 산화 스트레스를 유발하고 이후 프로그램된 괴사를 유발하는 신호 전달 캐스케이드를 시작합니다. APAP 손상과 달리 면역 세포 매개 산화 스트레스는 허혈-재관류와 같은 조건에 의해 유발되는 간 손상에서 중요한데, 간세포에서 방출되는 손상 관련 분자 패턴(DAMPS)이 사인 곡선의 쿠퍼 세포에서 자유 라디칼 및 케모카인 생산을 유도하고, 그 결과 호중구가 Disse 공간으로 침투하고 간세포에 가까운 산화 스트레스를 유발하여 궁극적으로 미토콘드리아 산화 스트레스를 생성하고 세포 괴사를 초래합니다.

2.2. Lipid peroxidation as mechanism of cell death

Lipid peroxidation (LPO) has been a frequently invoked mechanism in ROS-induced cell death and liver injury [19], [20], [21]. Common initiators of the peroxidation process are HO·and HOO·, which can be generated through the Fenton Reaction. In addition, LPO can be caused by peroxynitrite and heme dependent lipid peroxide decomposition [22]. The abstraction of H· from lipid molecules (mostly from polyunsaturated fatty acids) produces fatty acid radicals. This initiates a free-radical chain reaction that triggers the peroxidation of a large number of target molecules, which would ultimately severely destroy the integrity of cell membranes, damage the function of membrane bound enzymes and even impair nuclear DNA. The involvement of LPO in the pathophysiology of cell injury is typically assumed when parameters of LPO (e.g., malondialdehyde, ethane and pentane exhalation, formation of hydroxyfatty acids, hydroxynonenal, etc.) are increased in the injured tissue, but decreased after an intervention that is thought to act as an antioxidant. This is normally accompanied by improved liver injury, leading to the conclusion that LPO is responsible for the cell death [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. Experimental evidence for the hypothesis that APAP hepatotoxicity is caused by LPO was first suggested by Wendel and coworkers [31]. The recognition that the P450-mediated metabolism of xenobiotics can release ROS in microsomes [6], [32], and the fact that inducers and inhibitors of P450 enzymes modulate APAP-induced LPO and liver injury in mice in vivo supported the idea that P450 enzymes were responsible for the oxidant stress [12]. Although there was no doubt that there was severe LPO in the livers of these animals as indicated by extensive ethane and pentane exhalation and high levels of thiobarbituric acid-reactive substances (TBARs) [12], [31], [33]), the widely overlooked fact was that the animals were fed a vitamin E-deficient diet high in polyunsaturated fatty acids, which made them exquisitely sensitive to LPO induced by APAP or allyl alcohol [12], [31], [33], [34]. Importantly, the massive LPO that occurred under these conditions (>50-fold increase of ethane exhalation and TBARS levels) caused massive liver injury and acute liver failure within 4 h after APAP overdose [12], [33], and pretreatment with vitamin E or iron chelators dramatically reduced those LPO parameters and protected against the injury [34], [35], [36]. Based on this evidence, it was concluded that APAP triggers massive LPO, which is responsible for liver injury. However, this only applies to animals with vitamin E-deficiency and cell membranes high in polyunsaturated fatty acids. In contrast, when animals were fed regular rodent chow, APAP caused severe liver injury within 6–24 h, which was accompanied by no or very limited LPO [36]. Importantly, vitamin E treatment did not protect, suggesting that LPO is not a relevant mechanism of cell death in APAP toxicity under normal conditions [36].

Nevertheless, many recent studies on protection of natural products with antioxidant effects, still conclude that the LPO detected is responsible for APAP-induced liver injury [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [37], [38], [39]. However, since LPO is generally very limited in these studies, alternative explanations for the protection can be off-target effects of the natural product, e.g. inhibition of drug metabolism [40]. Thus, under relevant in vivo conditions, endogenous antioxidant defense systems including vitamin E, glutathione peroxidase (GPx), thioredoxins and iron chelation are generally sufficient to limit LPO after APAP overdose.

2.2. 세포 사멸의 메커니즘으로서의 지질 과산화

지질 과산화(LPO)는

ROS에 의한 세포 사멸 및 간 손상에서 자주 호출되는 메커니즘입니다 [19], [20], [21].

과산화 과정의 일반적인 개시제는

펜톤 반응을 통해 생성될 수 있는 HO 및 HOO-입니다.

또한,

LPO는

퍼옥시니트라이트 및 헴 의존성 지질 과산화물 분해에 의해 발생할 수 있습니다 [22].

지질 분자(주로 고도 불포화 지방산에서)에서 H-를 추상화하면

지방산 라디칼이 생성됩니다.

이는 많은 표적 분자의 과산화를 유발하는

자유 라디칼 연쇄 반응을 시작하여

궁극적으로 세포막의 완전성을 심각하게 파괴하고

막 결합 효소의 기능을 손상시키며

심지어 핵 DNA를 손상시킬 수 있습니다.

세포 손상의 병리 생리학에서 LPO의 관여는 일반적으로 손상된 조직에서 LPO의 파라미터(예: 말론다이알데히드, 에탄 및 펜탄 배출, 하이드 록시 지방산 형성, 하이드 록시노넨 등)가 증가하지만 항산화제로 작용하는 것으로 생각되는 개입 후에는 감소할 때 가정됩니다. 이것은 일반적으로 간 손상의 개선을 동반하여 LPO가 세포 사멸에 대한 책임이 있다는 결론으로 이어집니다 [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30].

APAP 간독성이

LPO에 의해 발생한다는 가설에 대한 실험적 증거는

Wendel과 동료들에 의해 처음 제안되었습니다 [31].

이종 생물의 P450 매개 대사가 마이크로솜에서 ROS를 방출할 수 있다는 인식 [6], [32],

그리고 P450 효소의 유도제와 억제제가 생체 내 마우스에서 APAP 유발 LPO 및 간 손상을 조절한다는 사실은

P450 효소가 산화 스트레스에 대한 책임이 있다는 생각을 뒷받침했습니다 [12].

광범위한 에탄 및 펜탄 배출과 높은 수준의 티오바르비투르산 반응성 물질(TBAR) [12], [31], [33]),

이 동물들의 간에 심각한 LPO가 있다는 것은 의심의 여지가 없었지만,

널리 간과된 사실은 다불포화지방산이

많은 비타민 E 결핍 식이를 먹여서 APAP 또는 알릴 알코올에 의해 유도된

LPO에 정교하게 민감하다는 것이었습니다 [12], [31], [33], [ 34].

중요한 것은

이러한 조건에서 발생한 대규모 LPO(에탄 호기 및 TBARS 수치의 50배 이상 증가)는

APAP 과다 복용 후 4시간 이내에 대규모 간 손상과 급성 간부전을 유발했으며 [12], [33],

비타민 E 또는 철 킬레이터로 전처리하면

이러한 LPO 매개 변수가 극적으로 감소하고 손상으로부터 보호된다는 것입니다 [34], [35], [36].

이러한 증거를 바탕으로

APAP가 간 손상의 원인이 되는 대량의 LPO를 유발한다는 결론을 내렸습니다.

그러나

이는 비타민 E가 결핍되고

세포막에 고도불포화지방산이 많은 동물에게만 해당되는 이야기입니다.

대조적으로, 동물에게 일반 설치류 사료를 먹였을 때 APAP는 6-24 시간 이내에 심각한 간 손상을 일으켰으며, 이는 LPO가 없거나 매우 제한적으로 동반되었습니다 [36]. 중요한 것은 비타민 E 치료는 보호 효과가 없었으며, 이는 LPO가 정상 조건에서 APAP 독성에서 세포 사멸의 관련 메커니즘이 아님을 시사합니다 [36].

그럼에도 불구하고

항산화 효과가 있는 천연물 보호에 대한 최근의 많은 연구는

여전히 검출된 LPO가 APAP 유발 간 손상의 원인이라는 결론을 내리고 있습니다

[23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [37], [38], [39].

그러나 이러한 연구에서는 일반적으로 LPO가 매우 제한적이기 때문에 보호에 대한 대체 설명은 천연물의 표적 외 효과(예: 약물 대사 억제)일 수 있습니다 [40].

따라서

관련 생체 내 조건에서

비타민 E, 글루타치온 퍼옥시다제(GPx), 티오레독신 및 철 킬레이트화를 포함한

내인성 항산화 방어 시스템은

일반적으로 APAP 과다 복용 후 LPO를 제한하기에 충분합니다.

2.3. Mitochondrial oxidant stress

In recent years, mitochondria have been gradually recognized as the main source of oxidant stress after an APAP overdose (Fig. 1) [3]. It is well established that excessive NAPQI formation after APAP overdose depletes GSH and binds to sulfhydryl groups of cellular proteins [41], [42]. Comparison of the subcellular protein adduct formation between APAP versus its non-toxic regioisomer, 3′-hydroxyacetanilide (AMAP) identified mitochondrial proteins as critical targets of NAPQI in the initiation of toxicity, as indicated by the presence of mitochondrial adducts after APAP treatment but not after non-toxic AMAP exposure in mice [43], [44], [45]. This concept is further supported by the observation that AMAP toxicity in human hepatocytes is correlated with mitochondrial adducts [46]. A number of mitochondrial proteins, including GPx and ATP synthase α-subunit, have been shown to be adducted by NAPQI (Fig. 2) [47]. Modification of GPx reduced the enzyme activity by 60% [48] while adduction of the ATP synthase α-subunit might impair the ATP synthase function and cause the cessation in ATP synthesis [48], [49], [50]. Though insufficient to cause direct cell death, cellular protein binding, especially mitochondrial protein adduction, impairs mitochondrial respiration and causes oxidant stress (Fig. 2) [49], [51], [52]. Although the direct molecular events that trigger mitochondrial oxidant stress remain to be identified in APAP hepatotoxicity, it is known that they interfere with the mitochondrial electron transport chain (ETC), which causes leakage of electrons from the chain and thus results in ROS formation (Fig. 2) [53]. Mitochondrial complex I is a crucial site of ROS formation in mitochondria [54], [55], [56]. Interestingly, it was found that an overdose of APAP significantly increased complex I activity in mitochondria in APAP-treated mice, and there was a strong positive correlation between complex I activity and the severity of liver injury [57]. Metformin significantly inhibited complex I activity and resulted in a reduced oxidative stress and injury [57]. In HepaRG cells, it was also observed that APAP induced proton leakage from the ETC and impaired coupled respiration, and both were inhibited by metformin treatment [57]. These observations support the hypothesis that complex I is a critical source of ROS leakage in APAP hepatotoxicity.

2.3. 미토콘드리아 산화 스트레스

최근 몇 년 동안 미토콘드리아는

APAP 과다 복용 후 산화 스트레스의 주요 원인으로

점차 인식되고 있습니다 (그림 1) [3].

APAP 과다 복용 후

과도한 NAPQI 형성은

GSH를 고갈시키고 세포 단백질의 설프 하이 드릴 그룹에 결합한다는 것이

잘 알려져 있습니다 [41], [42].

APAP와

그 무독성 이성질체인 3′-하이드록시아세타닐라이드(AMAP) 사이의 세포 내 단백질 부가체 형성을 비교한 결과,

미토콘드리아 단백질이

독성 개시에서 NAPQI의 중요한 표적으로 확인되었으며,

이는 APAP 처리 후 미토콘드리아 부가체가 존재하지만

마우스에서 무독성 AMAP 노출 후에는 나타나지 않음에 따라 [43], [44], [45] 으로 나타났습니다.

이 개념은

인간 간세포에서 AMAP 독성이

미토콘드리아 부가물과 상관관계가 있다는 관찰에 의해

더욱 뒷받침됩니다 [46].

GPx 및 ATP 신타제 α- 서브유닛을 포함한 많은

미토콘드리아 단백질이

NAPQI에 의해 부가되는 것으로 나타났습니다 (그림 2) [47].

GPx의 변형은

효소 활성을 60%까지 감소시켰으며 [48]

ATP 합성 효소 α- 서브유닛의 첨가는

ATP 합성 효소 기능을 손상시키고

ATP 합성을 중단시킬 수 있습니다 [48], [49], [50].

직접적인 세포 사멸을 유발하기에는 불충분하지만

세포 단백질 결합,

특히 미토콘드리아 단백질 부가 결합은

미토콘드리아 호흡을 손상시키고

산화 스트레스를 유발합니다 (그림 2) [49], [51], [52].

미토콘드리아 산화 스트레스를 유발하는 직접적인 분자적 사건은

APAP 간독성에서 아직 밝혀지지 않았지만,

미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)을 방해하여

사슬에서 전자가 누출되어 ROS가 형성되는 것으로 알려져 있습니다 (그림 2) [53].

미토콘드리아 복합체 I은

미토콘드리아에서 ROS 형성의 중요한 부위입니다 [54], [55], [56].

흥미롭게도 APAP를 과다 투여하면

APAP 처리 된 생쥐의 미토콘드리아에서 복합체 I 활동이 크게 증가했으며

복합체 I 활동과 간 손상의 심각성 사이에는

강한 양의 상관 관계가 있음이 밝혀졌습니다 [57].

메트포르민은

복합체 I 활성을 유의하게 억제하여

산화 스트레스와 손상을 감소시켰습니다 [57].

HepaRG 세포에서 APAP가

ETC에서 양성자 누출을 유도하고 결합 호흡을 손상시키는 것도 관찰되었으며,

둘 다 메트포르민 처리에 의해 억제되었습니다 [57].

이러한 관찰은

복합체 I이

APAP 간독성에서 ROS 누출의 중요한 원인이라는 가설을

뒷받침합니다.

Fig. 2

Mitochondrial oxidative stress and signaling in APAP hepatotoxicity. Metabolism of APAP forms the reactive metabolite NAPQI, which targets proteins, especially mitochondrial proteins. Adduction of ATP synthase and glutathione peroxidase compromises generation of ATP through the electron transport chain and interferes with mitochondrial anti-oxidant capacity. The enhanced generation of superoxide results in its reaction with nitric oxide to produce peroxynitrite, which ultimately produces oxidative/nitrosative stress. This then activates the MAP kinase c-jun-N-terminal kinase (JNK), resulting in its phosphorylation and translocation to the mitochondria, which amplifies the initial oxidative stress.

미토콘드리아 산화 스트레스와 APAP 간독성 신호. 

APAP의 대사는 

단백질, 특히 미토콘드리아 단백질을 표적으로 하는 

반응성 대사산물인 NAPQI를 형성합니다. 

ATP 합성 효소와 글루타치온 퍼옥시다아제의 첨가는 

전자 수송 사슬을 통한 ATP 생성을 손상시키고 

미토콘드리아의 항산화 능력을 방해합니다. 

슈퍼옥사이드의 생성 증가는 

산화 질소와 반응하여 과산화 아질산염을 생성하고, 

이는 궁극적으로 산화/질소 스트레스를 유발합니다. 

그러면 

MAP 키나아제 c-jun-N-말단 키나아제(JNK)가 활성화되어 인산화되고 

미토콘드리아로 전위되어 초기 산화 스트레스가 증폭됩니다.

Electrons released from the ETC react with oxygen to form superoxide, which could either be dismutated to hydrogen peroxide and molecular oxygen by manganese superoxide dismutase (MnSOD, SOD2) in mitochondria or react with nitric oxide (NO) to form peroxynitrite. The hydrogen peroxide produced by MnSOD can directly react with GSH [58], [59] or more likely be enzymatically detoxified by a number of antioxidant enzymes in hepatocytes, such as catalase, GPx or peroxiredoxins [60]. In contrast, peroxynitrite serves as a much more potent oxidant and nitrating species in APAP hepatotoxicity [58], [61], [62]. Consistent with this, a selective APAP-induced mitochondrial oxidant stress has been supported by multiple lines of evidence including a specific increase of mitochondrial GSSG levels [49], [50], [62] and the selective formation of nitrotyrosine protein adducts in mitochondria and the oxidative loss of mitochondrial DNA in APAP-treated mice [63]. In addition, MitoSox Red staining, which specifically detects mitochondrial superoxide, was observed in primary mouse hepatocytes and in metabolically competent human HepaRG cells treated with APAP [16], [64]. Furthermore, isolated mitochondria from APAP-treated mice were also shown to have elevated superoxide formation [57]. These observations together strongly support the existence of a selective mitochondrial oxidant stress after APAP exposure.

The pathophysiological relevance of this mitochondrial oxidant stress has also been extensively documented. It was shown that female mice were less susceptible to APAP hepatotoxicity compared to males due to the faster recovery of GSH in mitochondria, which detoxifies ROS and peroxynitrite resulting in less mitochondrial dysfunction [65]. Promoting the replenishment of hepatocellular GSH levels including the mitochondrial content with exogenous GSH or its precursors was shown to enhance the detoxification of peroxynitrite and hydrogen peroxide and effectively protect against hepatotoxicity after APAP overdose [50], [58], [66], [67]. In contrast, mice with partial MnSOD-deficiency (MnSOD+/–) showed a much higher susceptibility to APAP toxicity with increased peroxynitrite and protein carbonyl formation [68], [69]. Interestingly, MnSOD was shown to be nitrated and partially inactivated by peroxynitrite after APAP [70], which might concurrently increase the susceptibility of hepatocytes to ROS damage, especially considering that the antioxidant GSH is severely depleted shortly after APAP overdose [42]. Furthermore, the mitochondrial targeted antioxidant Mito-Tempo, which serves as a MnSOD mimetic [71], was highly effective in preventing APAP-induced oxidant stress and liver injury [72]. Scavenging peroxynitrite with the natural product resveratrol also effectively protected against APAP hepatotoxicity [73]. Furthermore, iron translocation from disrupted lysosomes into mitochondria promotes the oxidant stress-induced mitochondrial permeability transition pore opening and necrotic cell death [74], [75]. Taken together, this suggests that targeting mitochondrial oxidant stress can be a promising therapeutic target for treatment of APAP overdose in the clinic. Indeed, one of the protective mechanisms of NAC, which is the only currently available antidote for APAP overdose patients, is thought to be by detoxifying ROS and reducing the oxidant stress in the liver [50]. Other effective antioxidants, especially mitochondrial targeted antioxidants such as Mito-Tempo, would certainly be worth further investigation in the clinical setting if its safety in humans can be verified.

ETC에서 방출된 전자는

산소와 반응하여 과산화물을 형성하고,

이는 미토콘드리아의 망간 과산화물 디스뮤타제(MnSOD, SOD2)에 의해

과산화수소와 분자 산소로 분해되거나

산화질소(NO)와 반응하여 과산화아질산염을 형성할 수 있습니다.

MnSOD에 의해 생성된 과산화수소는

GSH [58], [59] 와 직접 반응하거나

카탈라아제, GPx 또는 퍼옥시레독신 [60] 과 같은

간세포의 여러 항산화 효소에 의해 효소적으로 해독될 가능성이 더 큽니다.

대조적으로,

과산화 아질산염은

APAP 간독성에서 훨씬 더 강력한 산화제 및 질산염 종으로 작용합니다 [58], [61], [62].

이와 일관되게,

미토콘드리아 GSSG 수준의 특정 증가 [49], [50], [62] 및 미토콘드리아에서

니트로티로신 단백질 부가체의 선택적 형성 및 APAP 처리 마우스에서

미토콘드리아 DNA의 산화적 손실 [63] 을 포함한 여러 증거에 의해

선택적 APAP 유발 미토콘드리아 산화 스트레스 가 뒷받침되고 있습니다.

또한, 미토콘드리아 슈퍼옥사이드를 특이적으로 검출하는 미토삭스 레드 염색은 일차 마우스 간세포와 APAP로 처리된 대사적으로 유능한 인간 HepaRG 세포에서 관찰되었습니다 [16], [64]. 또한, APAP로 처리한 마우스에서 분리한 미토콘드리아에서도 슈퍼옥사이드 형성이 증가하는 것으로 나타났습니다 [57]. 이러한 관찰 결과는 APAP 노출 후 선택적 미토콘드리아 산화 스트레스의 존재를 강력하게 뒷받침합니다.

이러한 미토콘드리아 산화 스트레스의 병리 생리학적 관련성 또한 광범위하게 문서화되어 있습니다. 암컷 마우스는 미토콘드리아에서 GSH의 빠른 회복으로 인해 수컷에 비해 APAP 간독성에 덜 취약한 것으로 나타났는데, 이는 ROS와 퍼옥시나이트르라이트를 해독하여 미토콘드리아 기능 장애를 감소시킵니다 [65]. 외인성 GSH 또는 그 전구체로 미토콘드리아 함량을 포함한 간세포 GSH 수준의 보충을 촉진하면 과산화질소 및 과산화수소의 해독을 강화하고 APAP 과다 복용 후 간독성으로부터 효과적으로 보호하는 것으로 나타났습니다 [50], [58], [66], [67 ]. 대조적으로, 부분적인 MnSOD 결핍(MnSOD+/-)을 가진 마우스는 과산화지질 및 단백질 카르보닐 형성이 증가하여 APAP 독성에 훨씬 더 높은 감수성을 보였습니다 [68], [69]. 흥미롭게도 MnSOD는 APAP 후 과산화아질산염에 의해 질화되고 부분적으로 비활성화되는 것으로 나타났습니다 [70], 이는 특히 항산화제 GSH가 APAP 과다 복용 직후 심각하게 고갈된다는 점을 고려하면 간세포의 ROS 손상에 대한 감수성을 동시에 증가시킬 수 있습니다 [42]. 또한, 미토콘드리아 표적 항산화제인 미토템포는 MnSOD 모방체 역할을 하며 [71], APAP에 의한 산화 스트레스와 간 손상을 예방하는 데 매우 효과적이었습니다 [72]. 천연 제품인 레스베라트롤로 퍼옥시나이트르라이트를 제거하면 APAP 간독성으로부터 효과적으로 보호할 수 있었습니다 [73]. 또한, 파괴된 리소좀에서 미토콘드리아로의 철 전위는 산화 스트레스에 의한 미토콘드리아 투과성 전환 기공 개방과 괴사성 세포 사멸을 촉진합니다 [74], [75]. 이를 종합하면 미토콘드리아 산화 스트레스를 표적으로 삼는 것이 임상에서 APAP 과다 복용을 치료하는 데 유망한 치료 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 실제로 현재 APAP 과다 복용 환자를 위한 유일한 해독제인 NAC의 보호 메커니즘 중 하나는 ROS를 해독하고 간에서 산화 스트레스를 줄이는 것으로 생각됩니다 [50]. 다른 효과적인 항산화제, 특히 미토콘드리아 표적 항산화제인 미토템포와 같은 항산화제는 인체에서의 안전성이 검증된다면 임상 환경에서 더 연구할 가치가 있을 것입니다.

2.4. Immune cell-derived oxidant stress

Another potential source of oxidant stress could be resident macrophages (Kupffer cells) and inflammatory cells recruited into the liver (monocytes/macrophages, neutrophils) (Fig. 1). Macrophages and neutrophils mainly kill targets by reactive oxygen using NADPH oxidase (NOX2) to generate superoxide and hydrogen peroxide, and, in the case of neutrophils, use of myeloperoxidase to form the very potent oxidant hypochlorous acid [76], [77]. Direct cytotoxicity of immune cell-derived ROS including hypochlorite has been implicated in many liver pathologies, e.g., hepatic ischemia-reperfusion injury [78], [79], endotoxemia [80], and obstructive cholestasis [81]. Many of these pathologies involve a sterile inflammatory component [82]. Similarly, the extensive necrotic cell death after APAP overdose also triggers the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs), which includes high-mobility group box 1 protein (HMGB1) [83], [84], mitochondrial DNA and nuclear DNA fragments [85], heat shock proteins [84], uric acid [86] and others. DAMPs mediate the activation of resident macrophages (e.g., Kupffer cells) via toll-like receptors, which lead to increased cytokine and chemokine formation and immune cell accumulation in the liver (e.g., neutrophils and monocyte-derived macrophages) [77], [87]. Kupffer cells reside in sinusoids and the generated ROS (e.g., NOX2-derived superoxide and hydrogen peroxide) can cause cell injury in stressed hepatocytes [78]. However, an involvement of Kupffer cells in the pathophysiology of APAP hepatotoxicity has been highly controversial. Although it was originally reported that mice pretreated with gadolinium chloride (GdCl3), an intervention that inactivates Kupffer cells, had reduced peroxynitrite formation and were protected against APAP-induced liver injury [88], neither of these results could be reproduced by subsequent studies [89], [90], [91]. In support of these later reports, mice functionally deficient in NADPH oxidase activity (gp91phox-/- mice) did not show a decreased oxidative stress or reduced liver injury [92], [93]. In addition, even complete elimination of Kupffer cells by clodronate liposomes could not protect against the injury [89]. Further evidence against the importance of a Kupffer-derived oxidant stress during APAP toxicity would be the fact that the most active Kupffer cells reside around the periportal area [94], which cannot be responsible for cell death after APAP where the necrotic cells are exclusively located in the centrilobular areas of the liver. Taken together, these very diverse approaches consistently argue against an involvement of a Kupffer cell-induced oxidant stress in the pathophysiology.

Another potential source of oxidant stress after APAP overdose is the infiltrating neutrophil. These phagocytes are the first immune cells to respond to the extensive APAP-induced necrosis [95]. However, neutrophils do not only produce superoxide and hydrogen peroxide by NADPH oxidase, but due to the presence of myeloperoxidase, these cells can generate hypochlorite. Furthermore, in contrast to Kupffer cells, neutrophils are mobile and can extravasate from sinusoids and adhere to the targeted hepatocytes to be fully activated [96]. The adherence to hepatocytes triggers a long-lasting oxidant stress in close proximity to the target, which allows oxidants such as hydrogen peroxide [97] and hypochlorous acid [79], [80], [81] to diffuse into hepatocytes and induce cell death (Fig. 1). The assumption for the involvement of neutrophils in APAP hepatotoxicity came from studies showing that the neutropenia-inducing antibody Gr-1 protected against APAP hepatotoxicity [98], [99]. However, it was recognized that the protection was due to additional effects of the antibody when the animal was pretreated for 24 h [100]. Importantly, there was no direct evidence for a neutrophil-derived oxidant stress in APAP hepatotoxicity [101]. Hypochlorite-modified proteins, which are markers of neutrophil-derived oxidant stress, were not detectable after APAP in the liver [101]. The hepatic or peripheral neutrophils were not activated or primed for ROS formation at 6 h after APAP in mice [102] or 24–48 h in humans [93], at which time liver injury is in full progress or has even peaked. In addition, neither NADPH oxidase inhibitors nor deletion of gp91phox, a subunit of NADPH oxidase, protected against APAP hepatotoxicity [92], [93], [101]. Furthermore, neither increasing neutrophil infiltration by administration of endotoxin or IL-1β nor preventing its infiltration with antibodies against β2 integrins (CD18), or use of mice deficient in adhesion molecules such as intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) or CD18, affected APAP hepatotoxicity [92], [95], [101], [102], [103]. Together, these data suggest that neutrophils, despite their early infiltration, are unlikely a relevant source of the oxidant stress after APAP overdose.

Similar to neutrophils, monocytes are also recruited into the liver after APAP hepatotoxicity [104]. Monocytes are recruited to the necrotic area through an interaction of C-C chemokine receptor 2 (CCR2) on its membrane with monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) generated by injured hepatocytes [105], [106]. In contrast to the relatively early recruitment of neutrophils, monocytes are typically recruited into the liver within 12–24 h after an APAP overdose in mice, which is past the peak of injury [106], suggesting that the infiltrating monocytes (M2 macrophages) are not responsible for the injury but might be important for the injury resolution. In support of this, M2 macrophages were shown to have a high capacity for phagocytosis and can generate cytokines such as IL-10, which can stimulate tissue repair [76], [105], [107]. In addition, mice deficient in CCR2 or MCP-1 had unaffected liver injury compared to wild type animals, but experienced a reduced hepatic M2 macrophage recruitment and a substantial delay in tissue repair [105], [106], [107], [108], [109]. These data suggest that M2 macrophages are involved in cell debris removal in the injury resolution phase after APAP hepatotoxicity, which is a prerequisite for liver regeneration [105], [106], [110]. Interestingly, this repair was not affected in gp91phox-deficient mice, suggesting that ROS generated by macrophages or neutrophils was not required for the cell debris removal process [93]. Of note, the findings in mice are consistent with clinical studies suggesting a predominant repair and regenerative role for monocyte-derived macrophages in APAP overdose patients [111]. Since it is well known that there is a close link between oxidative stress and cell proliferation [112], [113], [114], [115], it will be particularly interesting to elucidate the pathophysiological role of oxidative stress in the injury resolution process after APAP hepatotoxicity in future investigations.

2.5. Xanthine oxidase and NAD(P)H quinone dehydrogenase 2 as sources of ROS formation

Another potential source of ROS in the liver after APAP overdose could be the enzyme xanthine oxidase. Indeed, it was observed that xanthine dehydrogenase was converted to the oxidase in the liver after APAP overdose, and mice pretreated with the xanthine oxidase inhibitor allopurinol attenuated the oxidative stress and liver injury [48], [49], arguing for a potential involvement of xanthine oxidase in the pathophysiology of APAP hepatotoxicity. However, careful analysis of the data revealed that the dose of allopurinol required to protect against APAP is 5–10-fold higher than the dose needed to completely inhibit the enzyme, and a lower dose that completely inactivates the enzyme could not reduce the oxidant stress or protect against the toxicity [49]. Our follow-up studies demonstrated that the protection by the high doses was actually caused by a preconditioning effect during aldehyde oxidase-mediated metabolism of allopurinol, which induced metallothionein expression‎ that can react with NAPQI and ROS [116], [117]. This is supported by evidence that neither 1 h allopurinol pretreatment nor 18 h or 1 h oxypurinol (primary metabolite of allopurinol) pretreatment protects against APAP-induced injury [116]. These data argue against xanthine oxidase as a relevant source of ROS in APAP hepatotoxicity.

Another source of superoxide during APAP toxicity was recently proposed. The cytosolic protein NAD(P)H quinone dehydrogenase 2 (NQO2) can bind and metabolize APAP and generate superoxide thereby causing a cellular oxidant stress [118]. Since NQO2 is highly expressed in liver and kidney, it was hypothesized that this enzyme might be a relevant source of the intracellular oxidant stress induced by APAP [118]. Although these studies were performed in HeLa cells and not in hepatocytes, there are additional issues to consider. The fact that there is no biliary GSSG export during APAP toxicity argues against a relevant oxidant stress in the cytosol [14], [49]. In addition, as discussed previously, the most relevant oxidant stress occurs after the metabolism phase when mitochondrial protein adducts are formed [15], [49] and interventions that selectively affect mitochondrial oxidant stress are highly protective [68], [69], [72]. Thus, even if it can be verified that NQO2 can generate superoxide in hepatocytes, it is unlikely that NQO2 will be a pathophysiologically relevant source of oxidant stress during APAP hepatotoxicity.

2.5. ROS 형성의 원인인 크산틴 산화효소 및 NAD(P)H 퀴논 탈수소효소 2

APAP 과다 복용 후 간에서 ROS의

또 다른 잠재적 원인은 효소인 크산틴 산화효소일 수 있습니다.

실제로, APAP 과다 복용 후 간에서

잔틴 탈수소 효소가 산화 효소로 전환되는 것이 관찰되었으며,

잔틴 산화 효소 억제제 알로퓨리놀로 전처리 된 마우스는 산화 스트레스와 간 손상을 약화시켰다 [48], [49],

APAP 간독성의 병리 생리학에 잔틴 산화 효소가 잠재적으로 관여 할 수 있다고 주장합니다.

그러나 데이터를 면밀히 분석 한 결과 APAP로부터 보호하는 데 필요한 알로퓨리놀의 용량은 효소를 완전히 억제하는 데 필요한 용량보다 5-10 배 높으며 효소를 완전히 비활성화하는 저용량은 산화 스트레스를 줄이거 나 독성으로부터 보호 할 수 없었습니다 [49]. 우리의 후속 연구에 따르면 고용량에 의한 보호는 실제로 알로퓨리놀의 알데히드 산화효소 매개 대사 중 전처리 효과에 의해 발생하며, 이는 NAPQI 및 ROS와 반응할 수 있는 메탈로티오네인 발현을 유도합니다 [116], [117]. 이는 1시간 알로퓨리놀 전처리나 18시간 또는 1시간 옥시퓨리놀(알로퓨리놀의 주요 대사산물) 전처리가 APAP로 인한 손상으로부터 보호하지 못한다는 증거에 의해 뒷받침됩니다 [116]. 이러한 데이터는 APAP 간독성에서 ROS의 관련 공급원으로서 크산틴 산화효소를 반대합니다.
APAP 독성 중 과산화물의 또 다른 공급원이 최근에 제안되었습니다. 세포질 단백질 NAD(P)H 퀴논 탈수소효소 2(NQO2)는 APAP와 결합 및 대사하여 과산화물을 생성하여 세포 산화 스트레스를 유발할 수 있습니다 [118]. NQO2는 간과 신장에서 많이 발현되기 때문에 이 효소가 APAP에 의해 유도되는 세포 내 산화 스트레스의 관련 원인이 될 수 있다는 가설이 제기되었습니다 [118]. 이러한 연구는 간세포가 아닌 HeLa 세포에서 수행되었지만 고려해야 할 추가 문제가 있습니다. APAP 독성 동안 담도 GSSG 배출이 없다는 사실은 세포질에서 관련 산화 스트레스에 반대합니다 [14], [49]. 또한 앞서 논의한 바와 같이, 가장 관련성이 높은 산화 스트레스는 미토콘드리아 단백질 부가물이 형성되는 대사 단계 이후에 발생하며 [15], [49] 미토콘드리아 산화 스트레스에 선택적으로 영향을 미치는 개입은 매우 보호 적입니다 [68], [69], [72]. 따라서 NQO2가 간세포에서 슈퍼옥사이드를 생성할 수 있다는 것이 확인되더라도 NQO2가 APAP 간독성 동안 병리 생리적으로 관련된 산화 스트레스의 원인이 될 가능성은 낮습니다.

3. The therapeutic potential of targeting mitochondrial oxidant stress

N-acetylcysteine (NAC) was introduced as a clinical antidote against APAP poisoning in 1970's [119]. Even today, it is still the only pharmacological treatment option for APAP overdose patients. The extensive mechanistic insights from the preclinical models have proposed multiple protective mechanisms for NAC treatment (Fig. 3). If it is given shortly after APAP overdose, i.e. within the metabolism phase of APAP, NAC supplements the GSH pool as it is a synthetic precursor and thus protects by detoxifying the reactive metabolite NAPQI [120], [121]. During the injury progression phase, the newly synthesized GSH can also be transported into mitochondria, where it can detoxify ROS and peroxynitrite [58], [63]. Interestingly, it was also reported that the surplus NAC in the circulation can be converted to Krebs cycle intermediates, which support mitochondrial energy metabolism and recovery of mitochondrial function [50]. These protective mechanisms are supported by the varied efficacy of NAC in overdose patients. It is very obvious that the patients who benefit most are those receiving NAC within 8 h after APAP overdose, in which the replenished GSH can detoxify NAPQI in the metabolism phase and prevent the initiation of the injury [122], [123]. Although the effectiveness of NAC declines at later times, the delayed administration is still beneficial in the clinic [122], [123], probably by detoxifying ROS and supporting mitochondrial energy metabolism. Unfortunately, in the clinic most APAP overdose patients only seek medical attention during or after the peak of injury [124], [125], at which time the effectiveness of NAC has already significantly decreased [122], [123]. Therefore, a pharmaceutical intervention that still works during this late period would surely have therapeutic potential and greatly help those late-presenting patients..

3. 미토콘드리아 산화 스트레스 표적 치료의 치료 잠재력

N-아세틸시스테인(NAC)은

1970년대에 APAP 중독에 대한 임상 해독제로 도입되었습니다 [119].

오늘날에도 여전히

APAP 과다 복용 환자를 위한 유일한 약리학적 치료 옵션입니다.

전임상 모델에서 얻은 광범위한 메커니즘적 통찰력은

NAC 치료에 대한 여러 가지 보호 메커니즘을 제안했습니다(그림 3).

APAP 과다 복용 직후,

즉 APAP의 대사 단계에 N-아세틸 시스테인을 투여하면 합성 전구체로서

GSH 풀을 보충하여

반응성 대사산물인 NAPQI를 해독함으로써 보호합니다 [120], [121].

손상 진행 단계에서 새로 합성된 GSH는

미토콘드리아로 운반되어

ROS와 퍼옥시니트라이트 [58], [63] 를 해독할 수 있습니다.

흥미롭게도,

순환계의 잉여 NAC는 미토콘드리아 에너지 대사와 미토콘드리아 기능 회복을 지원하는

크렙스 주기 중간체로 전환될 수 있다는 보고도 있습니다 [50].

이러한 보호 메커니즘은

과다 복용 환자에 대한 NAC의 다양한 효능으로 뒷받침됩니다.

가장 큰 혜택을받는 환자는

APAP 과다 복용 후 8 시간 이내에 NAC를 투여받은 환자이며,

보충 된 GSH는 대사 단계에서

NAPQI를 해독하고 손상의 시작을 예방할 수 있습니다 [122], [123].

NAC의 효과는

나중에 감소하지만 지연된 투여는

클리닉에서 여전히 유익합니다 [122], [123],

아마도

ROS를 해독하고 미토콘드리아 에너지 대사를 지원함으로써.

안타깝게도

병원에서 대부분의 APAP 과다 복용 환자는

손상이 절정에 달하는 동안 또는 그 이후에야 치료를 받습니다 [124], [125],

이때 NAC의 효과는 이미 크게 감소했습니다 [122], [123].

따라서

이 늦은 시기에도 여전히 효과가 있는 약학적 개입은

분명히 치료 잠재력이 있으며

늦게 증상이 나타난 환자들에게 큰 도움이 될 것입니다.

Fig. 3

Phases of hepatotoxicity after APAP overdose: Liver toxicity of APAP is initiated after a metabolism phase, where the drug is metabolized by cytochrome P450 to generate the reactive metabolite NAPQI. Excessive formation of NAPQI results in formation of protein adducts, especially on mitochondrial proteins, which initiates the injury phase. Mitochondrial protein adduct formation results in generation of reactive oxygen species (ROS) within the organelle, which ultimately leads to activation of the mitochondrial permeability transition and release of mitochondrial proteins such as apoptosis inducing factor and endonuclease G and translocation to the nucleus. This then causes nuclear DNA fragmentation and subsequently cell necrosis. Necrotic cells release damage associated molecular patterns (DAMPs), which initiate the regeneration phase, with infiltration of immune cells, and ultimately liver repair. Interventions which inhibit APAP metabolism, as seen with a number of natural products, would consequently prevent NAPQI generation and thus prevent hepatotoxicity. However, these types of therapeutics would not be clinically beneficial, since most patients present much later, i.e., at which time the injury phase has already been initiated. N-acetylcysteine (NAC), which is the current standard of care, protects by replenishing glutathione stores and scavenging NAPQI, as well as supporting mitochondrial recovery. However, since it is effective only early during the injury phase, it may not be as beneficial for patients who present late after APAP consumption. Mitochondrial targeted antioxidants such as Mito Tempo, or repurposed drugs such as Metformin, robustly prevent mitochondrial oxidative stress, which attenuates downstream signaling and cell necrosis, and could be a future therapeutic option. The effect of ROS and antioxidants on the repair phase remains unclear and deserves further investigation.

APAP 과다 복용 후 간 독성 단계: 

APAP의 간 독성은 약물이 시토크롬 P450에 의해 대사되어 반응성 대사산물인 NAPQI를 생성하는 대사 단계 이후에 시작됩니다. NAPQI가 과도하게 형성되면 특히 미토콘드리아 단백질에 단백질 부가물이 형성되어 손상 단계가 시작됩니다. 미토콘드리아 단백질 부가체 형성은 세포 소기관 내에서 활성 산소종(ROS)을 생성하여 궁극적으로 미토콘드리아 투과성 전환을 활성화하고 세포 사멸 유도 인자 및 엔도뉴클레아제 G와 같은 미토콘드리아 단백질의 방출 및 핵으로의 전위를 유도합니다. 그러면 핵 DNA 단편화와 그에 따른 세포 괴사가 발생합니다. 괴사된 세포는 손상 관련 분자 패턴(DAMP)을 방출하여 재생 단계를 시작하고 면역 세포의 침윤을 통해 궁극적으로 간을 복구합니다. 

여러 천연물에서 볼 수 있듯이 APAP 대사를 억제하는 개입은 결과적으로 NAPQI 생성을 방지하여 간독성을 예방할 수 있습니다. 그러나 이러한 유형의 치료제는 대부분의 환자가 훨씬 늦게, 즉 이미 손상 단계가 시작된 시점에 증상이 나타나기 때문에 임상적으로 유익하지 않습니다. 현재 표준 치료법으로 사용되는 N-아세틸시스테인(NAC)은 글루타치온 저장소를 보충하고 NAPQI를 제거하며 미토콘드리아 회복을 지원하여 보호합니다. 그러나 손상 초기에만 효과가 있기 때문에 APAP 섭취 후 늦게 증상이 나타난 환자에게는 그다지 유익하지 않을 수 있습니다. 미토 템포와 같은 미토콘드리아 표적 항산화제 또는 메트포르민과 같은 용도 변경된 약물은 미토콘드리아 산화 스트레스를 강력하게 예방하여 하류 신호와 세포 괴사를 약화시키므로 향후 치료 옵션이 될 수 있습니다. ROS와 항산화제가 복구 단계에 미치는 영향은 아직 명확하지 않으며 추가 연구가 필요합니다.

The protective effect of NAC by detoxifying ROS encouraged the use of antioxidants for late treatment of APAP poisoning. Indeed, numerous interventions that can act as antioxidants have been shown to be protective in preclinical models of APAP toxicity. For example, delayed treatment with exogenous GSH or natural product resveratrol after APAP metabolism significantly decreased oxidative stress and protected against the injury [50,58,73]. In addition, pharmacological inhibition of the JNK signaling pathway, which amplifies the mitochondrial oxidant stress in APAP hepatotoxicity, reduced oxidant stress and the subsequent injury [126], [127]. However, despite massive evidence in preclinical studies supporting a beneficial potential of antioxidants, no drugs that specifically target ROS are available clinically for APAP overdose patients. There are several reasons for this problem. First, due to the high efficacy of the current standard-of-care antidote NAC, any promising antioxidant has to be compared with NAC, and only those that can provide additive protection to NAC possess therapeutic potential. Interestingly in our recent studies, the mitochondrial targeted antioxidant Mito-Tempo, either as a late treatment alone or together with NAC offered better protection than NAC alone, which supports it as a therapeutic option for late treatment of APAP overdose in patients (Fig. 3) [72]. Comparison of its efficacy to its analog Tempo highlights not only the importance of the mitochondrial oxidant stress in the development of APAP toxicity but also the therapeutic potential of other mitochondrial targeted antioxidants [72]. It would be interesting to test the efficacy of other antioxidants, e.g. the mitochondria-targeting peptide Elamipretide [128], which is currently in multiple clinical trials with FDA approval pending for primary mitochondrial myopathy. Second, due to the high costs of de novo drug development and the limited number of patients, it is unlikely that a pharmaceutical company develops a drug specifically for APAP poisoning. Therefore, a better strategy for getting a new antidote against APAP overdose would be by re-purposing an existing drug. For example, an earlier study identified benzyl alcohol, a marketed drug for treatment of head lice, as a promising intervention in APAP hepatotoxicity [129], though a follow-up study revealed that the protection of benzyl alcohol is mainly caused by inhibition of APAP metabolism and thus is unlikely a realistic therapeutic option for treatment of APAP overdose in patients [130]. Methylene blue, a clinical used drug for diseases including methemoglobinemia and psychiatric disorders, was shown to target to mitochondria and reduce mitochondrial oxidant stress [131]. It also restored the compromised ETC function and thus protected against APAP hepatotoxicity [131]. Recently, it was reported that metformin, a first line drug for type 2 diabetes, attenuated the mitochondrial oxidant stress and protected against APAP hepatotoxicity even as a late treatment (Fig. 3) [57]. In addition, its effectiveness can be reproduced in human HepaRG cells, a clinically relevant model for APAP overdose [16], further supporting metformin as a therapeutic option for patients [57]. Nevertheless, more studies are still needed to establish its effective therapeutic dose in humans and assess potential side effects of high doses of metformin before its application in overdose patients.

ROS를 해독하는 NAC의 보호 효과는 APAP 중독의 후기 치료에 항산화제를 사용하도록 장려했습니다. 실제로 항산화제 역할을 할 수 있는 수많은 개입이 APAP 독성의 전임상 모델에서 보호 효과가 있는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, APAP 대사 후 외인성 GSH 또는 천연물 레스베라트롤로 지연 치료를 하면 산화 스트레스가 크게 감소하고 손상으로부터 보호됩니다[50,58,73]. 또한, APAP 간독성에서 미토콘드리아 산화 스트레스를 증폭시키는 JNK 신호 경로의 약리학 적 억제는 산화 스트레스와 후속 손상을 감소 시켰습니다 [126], [127]. 그러나 항산화제의 유익한 잠재력을 뒷받침하는 전임상 연구의 방대한 증거에도 불구하고, APAP 과다 복용 환자에게 임상적으로 사용할 수 있는 ROS를 표적으로 하는 약물은 없습니다. 이 문제에는 몇 가지 이유가 있습니다. 첫째, 현재 표준 치료 해독제인 NAC의 효능이 높기 때문에 유망한 항산화제는 NAC와 비교해야 하며, NAC에 추가적인 보호 기능을 제공할 수 있는 항산화제만이 치료 잠재력을 지니고 있습니다. 최근 연구에서 흥미롭게도 미토콘드리아 표적 항산화제인 미토-템포는 단독으로 또는 NAC와 함께 후기 치료제로서 NAC 단독보다 더 나은 보호를 제공하여 환자의 APAP 과다 복용 후기 치료를 위한 치료 옵션으로 지원되었습니다 (그림 3) [72]. 그 효능을 아날로그인 템포와 비교하면 APAP 독성 발생에서 미토콘드리아 산화 스트레스의 중요성뿐만 아니라 다른 미토콘드리아 표적 항산화제의 치료 잠재력도 강조됩니다 [72]. 미토콘드리아 표적 펩타이드 엘라미프레타이드 [128] 와 같은 다른 항산화제의 효능을 테스트하는 것은 흥미로울 것이며, 현재 원발성 미토콘드리아 근병증에 대해 FDA 승인을 기다리고 있는 여러 임상시험이 진행 중입니다. 둘째, 신약 개발의 높은 비용과 제한된 환자 수로 인해 제약 회사가 APAP 중독에 특화된 약물을 개발할 가능성은 낮습니다. 따라서 APAP 과다 복용에 대한 새로운 해독제를 개발하기 위한 더 나은 전략은 기존 약물의 용도를 변경하는 것입니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 머릿니 치료제로 시판되는 벤질 알코올이 APAP 간독성에 대한 유망한 개입으로 확인되었지만 [129], 후속 연구에 따르면 벤질 알코올의 보호는 주로 APAP 대사의 억제로 인해 발생하므로 환자의 APAP 과다 복용 치료를위한 현실적인 치료 옵션이 아닐 가능성이 높습니다 [130]. 메트헤모글로빈혈증 및 정신 질환을 포함한 질병에 임상적으로 사용되는 약물인 메틸렌 블루는 미토콘드리아를 표적으로 하여 미토콘드리아 산화 스트레스를 감소시키는 것으로 나타났습니다 [131]. 또한 손상된 ETC 기능을 회복시켜 APAP 간독성으로부터 보호합니다 [131]. 최근에는 제2형 당뇨병의 1차 치료제인 메트포르민이 후기 치료제로도 미토콘드리아 산화 스트레스를 약화시키고 APAP 간독성으로부터 보호하는 것으로 보고되었습니다 (그림 3) [57]. 또한, 그 효과는 APAP 과다 복용에 대한 임상 관련 모델인 인간 HepaRG 세포에서 재현될 수 있으며 [16], 환자를 위한 치료 옵션으로서 메트포르민을 더욱 뒷받침합니다 [57]. 그럼에도 불구하고 메트포르민을 과다 복용한 환자에게 적용하기 전에 인간에게 효과적인 치료 용량을 설정하고 고용량 메트포르민의 잠재적 부작용을 평가하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다.

4. Caveats of testing antioxidants in preclinical models

Research into natural products isolated from plants has revealed a large number of potential drug candidates that may act as antioxidants. The therapeutic potential of such interventions can only be assessed in clinically relevant experimental models such as APAP hepatotoxicity [4], [132]. However, the frequent use of suboptimal preclinical models in testing the efficacy of antioxidants or other interventions has been a significant issue in recent years as experimental data from such studies can lead to controversial mechanistic conclusions and thus hampering the progress of translational research in testing antioxidants. For example, the rat is widely regarded as a poor model since even high overdoses of APAP do not cause relevant oxidant stress and liver injury in these animals [17]. However, large numbers of studies testing phytotherapeutics or other antioxidant interventions are still being conducted in this model [4], [40]. Furthermore, several human hepatoma cell lines (e.g. HepG2, Hep3B, Huh7) are frequently used as in vitro models in APAP studies. However, their human pathophysiological relevance is questionable because of the lack of P450 enzymes for the metabolic activation of APAP in these cells [133], which initiates the toxicity in mice and humans. Even if an intervention, including an antioxidant, shows protection in these cell lines, it may not be therapeutically relevant for APAP overdose patients. In contrast, the mouse model closely resembles the human pathophysiology and so far has served as one of the most physiologically relevant models. The most successfully applied in vitro model is primary mouse hepatocytes. Although it has some limitations, such as the lack of non-parenchymal cells and loss of P450 enzyme activity over time in culture, for an acute model such as APAP-induced cell death, it generally reproduces most aspects of the in vivo pathophysiology [132], [134]. The HepaRG cell model has been shown to closely resemble the human pathophysiology for APAP overdose (except the requirement for JNK) [16], [125]. Freshly isolated primary human hepatocytes (PHH) are considered as gold standard for drug toxicity studies and a recent investigation has documented their relevance for the human pathophysiology in APAP hepatotoxicity [135]. However, due to their limited availability and high cost if commercially acquired, the use of PHH is still very limited in APAP toxicity studies. Cryopreserved PHH have been introduced to overcome these disadvantages, and currently more advanced PHH culture systems like 3D culture or sandwich culture systems are being developed to more closely represent the normal liver tissue architecture [134]. Based on these caveats, any testing of new therapeutic interventions should be performed in human pathophysiologically relevant models including primary mouse or human hepatocytes, HepaRG cells, or the in vivo mouse model.

4. 전임상 모델에서 항산화제 테스트 시 주의사항
식물에서 분리된 천연물에 대한 연구를 통해 항산화제로 작용할 수 있는 수많은 잠재적 약물 후보가 밝혀졌습니다. 이러한 개입의 치료 잠재력은 APAP 간독성 [4], [132] 과 같은 임상적으로 관련된 실험 모델에서만 평가할 수 있습니다. 그러나 항산화제 또는 기타 중재의 효능을 테스트할 때 최적이 아닌 전임상 모델을 자주 사용하는 것은 이러한 연구의 실험 데이터가 논란의 여지가 있는 기계적 결론을 도출하여 항산화제 테스트의 중개 연구 진행을 방해할 수 있기 때문에 최근 몇 년간 중요한 문제로 대두되어 왔습니다. 예를 들어, 쥐는 APAP를 과다 투여해도 관련 산화 스트레스와 간 손상을 일으키지 않기 때문에 쥐는 열악한 모델로 널리 알려져 있습니다 [17]. 그러나 이 모델에서 식물 치료제 또는 기타 항산화 개입을 테스트하는 많은 연구가 여전히 수행되고 있습니다 [4], [40]. 또한, 여러 인간 간암 세포주(예: HepG2, Hep3B, Huh7)가 APAP 연구에서 시험관 내 모델로 자주 사용됩니다. 그러나 이러한 세포에서 APAP의 대사 활성화를 위한 P450 효소가 없기 때문에 인간 병리 생리학적 관련성은 의문입니다 [133], 이는 마우스와 인간에게 독성을 유발합니다. 항산화제를 포함한 개입이 이러한 세포주에서 보호 효과를 보이더라도 APAP 과다 복용 환자에게는 치료적 효과가 없을 수 있습니다. 반면, 마우스 모델은 인간의 병리 생리와 매우 유사하며 지금까지 가장 생리적으로 관련성이 높은 모델 중 하나로 사용되어 왔습니다. 가장 성공적으로 적용된 시험관 내 모델은 원발성 마우스 간세포입니다. 비실질 세포의 부족과 배양 중 시간이 지남에 따라 P450 효소 활성의 손실과 같은 몇 가지 한계가 있지만, APAP에 의한 세포 사멸과 같은 급성 모델의 경우 일반적으로 생체 내 병리 생리의 대부분의 측면을 재현합니다 [132], [134]. HepaRG 세포 모델은 APAP 과다 복용에 대한 인간 병리 생리와 매우 유사한 것으로 나타났습니다(JNK 요구 사항 제외) [16], [125]. 갓 분리한 일차 인간 간세포(PHH)는 약물 독성 연구의 표준으로 간주되며, 최근 조사에 따르면 APAP 간독성에서 인간 병리 생리와 관련성이 입증되었습니다 [135]. 그러나 상업적으로 구입하는 경우 가용성이 제한적이고 비용이 비싸기 때문에 APAP 독성 연구에서 PHH의 사용은 여전히 매우 제한적입니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 동결 보존 PHH가 도입되었으며, 현재 3D 배양 또는 샌드위치 배양 시스템과 같은 보다 발전된 PHH 배양 시스템이 개발되어 정상적인 간 조직 구조를 더 가깝게 재현하고 있습니다 [134]. 이러한 주의 사항에 따라 새로운 치료적 개입에 대한 모든 테스트는 일차 마우스 또는 인간 간세포, HepaRG 세포 또는 생체 내 마우스 모델을 포함한 인간 병리 생리학적 관련 모델에서 수행해야 합니다.

5. Summary and conclusions

Current experimental evidence demonstrates that neither drug metabolism-induced oxidative stress nor extracellular ROS from inflammatory cells are relevant sources of the oxidant stress in APAP hepatotoxicity. In contrast, P450-mediated metabolism of APAP generates excessive amounts of the reactive metabolite NAPQI, which targets mitochondrial proteins for adduct formation. This impairs mitochondrial respiration and results in ROS formation, leading to an overwhelming mitochondrial oxidant stress and mitochondrial dysfunction. Despite the identification of numerous potential therapeutic targets in mechanistic studies during the last decades, only very few are likely to have clinical relevance. One of the therapeutic targets that consistently comes up in many different preclinical models including human hepatocytes is the mitochondrial oxidant stress. Thus, interventions that prevent or scavenge mitochondrial ROS and peroxynitrite are currently the most promising therapeutic targets against APAP hepatotoxicity in patients.

5. 요약 및 결론
현재의 실험적 증거에 따르면 약물 대사에 의한 산화 스트레스나 염증 세포의 세포 외 ROS는 APAP 간독성에서 산화 스트레스의 관련 원인이 되지 않습니다. 이와는 대조적으로, APAP의 P450 매개 대사는 미토콘드리아 단백질을 표적으로 부가물 형성을 위한 반응성 대사산물인 NAPQI를 과도하게 생성합니다. 이는 미토콘드리아 호흡을 손상시키고 ROS 형성을 초래하여 미토콘드리아 산화 스트레스와 미토콘드리아 기능 장애를 유발합니다. 지난 수십 년 동안 기계론적 연구에서 수많은 잠재적 치료 표적이 확인되었지만, 임상적 관련성이 있는 표적은 극소수에 불과합니다. 인간 간세포를 포함한 다양한 전임상 모델에서 일관되게 나타나는 치료 표적 중 하나는 미토콘드리아 산화 스트레스입니다. 따라서 미토콘드리아 ROS와 퍼옥시나이트르라이트를 예방하거나 제거하는 중재는 현재 환자에서 APAP 간독성에 대한 가장 유망한 치료 표적입니다.

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Conflict of interest disclosure

The authors have no conflict to disclose.

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Acknowledgements

Work in this laboratory was supported in part by the National Institutes of Health grants R01 DK102142 and R01 AA12916, and by grants from the National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103549-09 and 1P30 GM118247-01) from the National Institutes of Health. Additional support came from an award from the Biomedical Research Training Program (BRTP) from the University of Kansas Medical Center (to K.D).

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