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텔로 머라 아제, GV1001에 대한 T 세포 면역을 유도하기위한 펩타이드 백신은 세포 신호 전달 경로를 조절하고 열 충격 단백질 (HSP) (90) 여기서 (70)과의 상호 작용을 통해 직접적인 항암 효과를 부여하는 것으로 도시되어 있으며, 본 발명자들은 그 GV1001은 HSP90 의존적으로 전이 활성화 단백질 매개 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) -1 전이 활성화를 변조 할 수있다. GV1001 treatment resulted in significant suppression of HIV-1 replication and rescue of infected cells from death by HIV-1. GV1001의 치료는 HIV-1에 의해 HIV-1 복제 및 죽음에 감염된 세포의 구조의 중요한 억제 결과. Transactivation of HIV-long terminal repeat (LTR) was inhibited by GV1001, indicating that GV1001 suppressed the transcription from proviral HIV DNA. HIV-긴 터미널 반복 (LTR)의 전이 활성화는 GV1001은 프로 바이러스 HIV DNA의 전사를 억제 것을 나타내는, GV1001에 의해 억제되었다. The anti-HIV-1 activity of GV1001 was completely abrogated by an HSP90-neutralizing antibody, indicating that the antiviral activity depends on HSP90. GV1001의 항 HIV-1 활성이 완전히 바이러스 활성은 HSP90에 의존한다는 것을 나타낸다 HSP90 중화 항체에 의해 폐기되었다. Further mechanistic studies revealed that GV1001 suppresses basal NF-κB activation, which is required for HIV-1 LTR transactivation in an HSP90-dependent manner. 또한 역학적 연구는 GV1001은 HSP90 의존적으로 HIV-1 LTR의 전이 활성화에 필요한 기초 NF-κB 활성화를 억제하는 것으로 나타났습니다. Inhibition of LTR transactivation by GV1001 suggests its potential to suppress HIV-1 reactivation from latency. GV1001에 의해 LTR의 전이 활성화의 억제는 대기 시간에서 HIV-1 활성화를 억제하는 가능성을 제시한다. Indeed, PMA-mediated reactivation of HIV-1 from latent infected cells was suppressed by GV1001. 잠복 감염된 세포에서 HIV-1의 사실, PMA 중재 활성화는 GV1001에 의해 억제되었다. The results suggest the potential therapeutic use of GV1001, a peptide proven to be safe for human use, as an anti-HIV-1 agent to suppress the reactivation from latently infected cells. 결과는 잠재적으로 감염된 세포의 활성화를 억제하는 항 HIV-1 제로서, GV1001 인간 사용에 안전한 것으로 입증 된 펩티드의 잠재적 인 치료 용도를 제시한다.
Human reverse transcriptase subunit of telomerase (hTERT) is highly expressed in various cancer tissues and it has been considered as an attractive target for the development of effective cancer vaccines 1 . 텔로 머라 아제 (는 hTERT) 인간 역전사 효소 서브 유닛은 매우 다양한 암 조직에서 발현되고, 이는 효과적인 암 백신 개발에 대한 매력적인 표적으로 고려 된 하나 . A peptide vaccine, encompassing the 16mer MHC class II epitope (611-EARPALLTSRLRFIPK-626) of hTERT, GV1001, has been developed as a therapeutic vaccine to induce T-cell immune responses 2 . 펩티드 백신,의 hTERT, GV1001의 16mer MHC 클래스 II 항원 (611-EARPALLTSRLRFIPK-626)를 포괄 T 세포 면역 반응을 유도하는 치료 백신으로 개발되었다 (2) . Several phase I/II clinical trials have confirmed the safety and capability of inducing specific T-cell responses in patients with pancreatic cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC), melanoma and hepatocellular carcinoma 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . 여러 단계 I / II 임상 췌장암, 비소 세포 폐암 (NSCLC), 흑색 종 및 간세포 암종 환자에서 특정 T 세포 반응을 유도하는 안전 기능이 확인 된 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . In addition, a clear positive correlation between induced immune responses and prolonged survival of advanced pancreatic cancer patients has been shown in a phase II study 3 . 또한, 유도 된 면역 반응 및 고급 췌장암 환자의 장기 생존율 사이에 명확한 상관 관계는 단계 II 연구에서 밝혀졌다 3 .
In previous studies, we have shown that GV1001 interacts with extracellular heat shock protein 90 (HSP90) and penetrates into the cytoplasm of cells 8 . 이전의 연구에서는, GV1001는 세포의 열 충격 단백질 90 (HSP90)과 상호 작용하는 세포의 세포질 내로 침투 것으로 나타났다 8 . Moreover, GV1001 exerted a strong anti-cancer effect through the interaction with HSP90 under hypoxic conditions by modulating the HIF-1α-VEGF signaling axis 9 . 또한, GV1001 축 시그널링 HIF-1α-VEGF를 변조함으로써 저산소 조건 HSP90과의 상호 작용을 통해 강력한 항암 효과를 발휘 9 . These studies indicate that GV1001 can regulate intracellular signaling pathways through the interaction with HSP90. 이 연구는 GV1001은 HSP90과의 상호 작용을 통해 세포 내 신호 전달 경로를 조절 할 수 있음을 나타냅니다.
HSPs are molecular chaperones, and they play crucial roles in maintaining protein homeostasis and cell homeostasis, particularly under stress conditions 10 . HSP는 분자 샤프롱이며, 그들은 특히 스트레스 조건 하에서 단백질 항상성과 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을한다 (10) . HSP90 has been associated with several pathological conditions such as cancer, atherosclerosis and virus infection 11 , 12 , 13 , 14 . HSP90은 암, 동맥 경화증 및 바이러스 감염과 같은 여러 병리 적 상태와 연관되었다 11 , 12 , 13 , 14 . The HSP90 client list includes numerous proteins related to tumorigenesis, invasiveness and metastasis 15 . HSP90 클라이언트 목록 종양, 침입 및 전이에 관련된 많은 단백질을 포함 15 . Thus, HSP90 has emerged as a promising target for cancer therapeutics, and several HSP90 inhibitors have been developed and are undergoing clinical trials 16 . 따라서, HSP90은 암 치료를위한 유망한 대상으로 등장, 그리고 여러 HSP90 억제제가 개발되어 임상 시험 진행된다 (16) . Interestingly, secreted HSP90 and cell surface HSP90 have been observed in cancer cells, and these extracellular HSP90 (eHSP90) proteins promote cancer growth and angiogenesis 17 , 18 . 흥미롭게도, HSP90 분비 세포 표면 HSP90 암 세포에서 관찰되었고, 이들 세포 HSP90 (eHSP90) 단백질은 암의 성장과 혈관 형성 촉진 (17) , (18) . Noncancerous cells also produce eHSP90 under various environmental conditions, including heat, hypoxia and starvation 17 . 암성 세포는 열, 저산소증과 기아 등 다양한 환경 조건에서 eHSP90 생산 17 . eHSP90 plays distinct functions from those of intracellular HSP90, and it can regulate cell signaling pathways by interacting with various cell surface proteins 17 . eHSP90 세포 내 HSP90의 그 별개의 기능을 담당하고, 다양한 세포 표면 단백질과 상호 작용하여 세포 신호 전달 경로를 조절할 수있다 (17) . Upon virus infection, robust production of viral proteins also requires HSP functions, and the list of viruses suppressed by HSP90 inhibitors continues to grow 19 . 바이러스 감염시, 바이러스 단백질의 생산을 강력하고 또한 HSP 기능을 필요로하고, HSP90 억제제에 의해 억제 바이러스의리스트는 성장을 계속하고 (19) . Recent studies have shown that human immune deficiency virus-1 (HIV-1) infection also resulted in increased expression of HSP90 in mononuclear cells and T-cells 20 , 21 . 최근의 연구는 인간 면역 결핍 바이러스 1 (HIV-1) 감염은 또한 단핵 세포 및 T 세포에서 HSP90의 발현 증가를 초래 것을 보여 주었다 (20) , (21) . Indeed, HSP90 plays a pivotal role in HIV replication by acting at multiple steps of the life cycle of the virus. 실제로, HSP90은 바이러스의 생활주기의 여러 단계에서 작용하여 HIV 복제에 중요한 역할을한다. HSP90 involvement in HIV viral transcription and HIV replication in acutely infected cells was suppressed by HSP90 inhibitors 22 . 심하게 감염된 세포에서 HIV 바이러스 전사 및 HIV 복제에 HSP90의 참여는 HSP90 억제제에 의해 억제되었다 (22) . Moreover, HSP90 regulates HIV reactivation from latency by modulating NF-κB signaling 23 . 또한, HSP90은 NF-κB가 신호를 변조하여 대기 시간에서 HIV의 활성화를 조절한다 (23) .
Considering that GV1001 interacts with HSP90 and modulates cell signaling, we explored the possible antiviral role of GV1001 against HIV-1 in the current study. GV1001은 HSP90과 상호 작용 및 세포 신호를 변조 점을 감안하면, 우리는 현재의 연구에서 HIV-1에 대한 GV1001의 가능한 항 바이러스 역할을 탐구.
Prior to examination of the role of GV1001, we analyzed the cell cytotoxicity of GV1001 to exclude the possibility that GV1001 affects the replication of HIV-1 due to its nonspecific cell cytotoxicity. GV1001의 역할을 조사하기 전에, 우리는 인해 비특이적 세포 독성에 GV1001은 HIV-1의 복제에 영향을 미치는 가능성을 배제하기 GV1001의 세포 독성을 분석 하였다. GV1001 does not exert significant cytotoxic activity against MT-4, IG5 and ACH-2 cells up to 25 μM ( Fig. 1A ). GV1001-2 ACH 세포를 25 μM (에 MT-4, IG5과에 중요한 세포 독성 활성을주지 않는 그림. 1A ). First, the anti-HIV-1 activity of GV1001 was determined by analyzing its effect on HIV-1 (pBR_HIV-1-M-NL4-3_IRES_eGFP) replication in MT-4 cells. 먼저, GV1001의 항 HIV-1 활성은 MT-4 세포에서 HIV-1 (pBR_HIV-1-M-NL4-3_IRES_eGFP) 복제에 미치는 영향을 분석하여 측정 하였다. As determined by p24 ELISA, production of viral particles in MT-4 cells was significantly inhibited by GV1001 in a dose-dependent manner, and the mean 50% inhibitory concentration (IC 50 ) value was approximately 0.85 μM ( Fig. 1B ). P24 ELISA 크게 용량 의존적 방식으로 GV1001 의해 억제되었다 MT-4 세포에서 바이러스 입자의 제조, 평균 50 % 억제 농도 (IC 50)에 의해 결정되는 값은 약 0.85 μM (이었다 .도 1B ). Additionally, eGFP production, which depends on the activation of HIV-1 LTR, was also diminished by treatment with GV1001 ( Fig. 1C ). 또한, HIV-1 LTR의 활성화에 따라 eGFP는 생산은 또한 GV1001 (처리함으로써 감소되었다 .도 1C ). Inhibition of viral particle production by GV1001 was further confirmed by determining the HIV-1 genomic RNA levels of produced viral particles. GV1001 의하여 바이러스 입자 생성의 억제는 상기 생성 된 바이러스 입자의 게놈 HIV-1 RNA 수준을 결정함으로써 확인 하였다. GV1001 showed a dose-dependent suppressive effect ( Fig. 1D ). GV1001은 용량 의존적 억제 효과 (보였다 .도 1D를 ). A peptide derived from HBV polymerase did not exert any significant effect on HIV virion production and eGFP production, indicating that the anti-HIV function of GV1001 is not non-specific ( Fig. S1 ). HBV 중합 효소로부터 유도 된 펩티드 GV1001의 항 HIV 기능 비특이적 (아님을 나타내는 HIV 비리 온 생산 및 eGFP는 생산에 어떤 중요한 영향을주지 않았다 .도가 S1 ).
In line with the suppression of HIV-1 replication by GV1001, the latter displayed a cell protective effect on HIV-1-infected MT-4 cells. GV1001에 의한 HIV-1 복제 억제에 맞춰, 후자는 HIV-1에 감염된 MT-4 세포에 대한 세포 보호 효과를 표시. As depicted in Fig. 에 도시 된 바와 같이 도. 1E,F , AZT and GV1001 showed a significant cell protective effect in a dose-dependent manner. 1E, F , AZT 및 GV1001은 용량 의존적으로 유의 한 세포 보호 효과를 보였다. Similar to AZT, 5 μM GV1001 was sufficient to confer almost 100% cell protection from HIV-1-mediated cell death. AZT와 마찬가지로, 5 μM의 GV1001은 HIV-1 매개 된 세포 사멸에서 거의 100 %의 세포 보호를 부여하기에 충분했다. Its cell protective effect was inversely correlated with a decreased supernatant p24 level, suggesting that GV1001 can protect cells by suppressing viral replication. 그것의 세포 보호 효과가 역 바이러스 복제를 억제하여 세포를 보호 할 수 GV1001을 제안, 감소 상층 P24 수준의 상관 관계를 보였다. Furthermore, GV1001 treatment resulted in decreased intracellular HIV viral genomic RNA, p24 protein synthesis and eGFP expression in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) infected with HIV-1 ( Figs 1G and S2). 또한, GV1001 처리 결과 HIV-1 (감염된 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서, 세포 내 HIV 바이러스 게놈 RNA, P24 단백질을 합성하고 eGFP는 발현 감소 도 1G 및 S2).
Considering that eGFP production from the HIV-1 genome is under the same control as Nef, decreased expression of eGFP in HIV-1-infected cells by GV1001 indicates the suppression of HIV-1 transcription by GV1001 ( Fig. 1C ). 에이즈-1 게놈에서 eGFP는 생산 네프와 같은 통제하에 있음을 고려할 때, GV1001에 의해 HIV-1에 감염된 세포에서 eGFP는의 발현 감소는 GV1001 (기준 HIV-1 전사의 억제를 나타내는 그림. 1C을 ). To further delineate the underlying mechanism of HIV-1 inhibition by GV1001, a time-of-addition (TOA) study was performed using GV1001 and several anti-HIV drugs covering different stages of HIV replication. 더 GV1001에 의해 HIV-1 억제의 기본 메커니즘을 묘사하기 위해, 시간의 첨가 (TOA) 연구는 HIV 복제의 여러 단계를 포함하는 GV1001 여러 항 HIV 약물을 사용하여 수행 하였다. The results of each reagent in the TOA assay have shown that the inhibition of HIV replication was well represented to a time point corresponding to the occurrence of the replication step targeted by the drugs, and GV1001 started to lose its activity at the time point between 11 hours and 13 hours after HIV-1 infection ( Fig. 2A ). 최상부 분석에서의 각 시약의 결과는 HIV 복제의 억제가 아니라 약물의 표적이 복제 단계의 발생에 대응하는 시점을 나타내는 것을 보여 주었다 및 GV1001 11의 시점에서 활성을 상실하기 시작 시간 및 HIV-1 감염 (후 13시간 그림. 2A ). Analysis of eGFP expression confirmed that the inhibitory activity of GV1001 is weakened when treated for 12 hours after infection ( Fig. 2B ). eGFP는 발현 분석 감염 (후 12 시간 동안 처리 한 경우 GV1001의 저해 활성이 약화되는 것을 확인할 .도 2B ). According to the typical result from a time-of-addition assay, the viral transcription of HIV from the integrated HIV genome occurs from 11 to 13 hours after infection 24 . 시간의 첨가 분석의 전형적인 결과에 따르면, 집적 HIV 게놈에서 HIV 바이러스의 전사는 감염 후 11 내지 13 시간에서 발생하는 24 . Thus, this result suggests that the mode of action of GV1001 in the MT-4 cells infected with HIV is to inhibit HIV proliferation through suppressing the transcription activity. 따라서, 이러한 결과는 HIV로 감염된 MT-4 세포에서 GV1001의 작용 모드는 전사 활성을 억제 통하여 HIV 증식을 억제하는 것으로 나왔다. Furthermore, GV1001 efficiently suppressed the production of the viral mRNA of HIV-1 when cells were treated with it for up to 9 hours after infection, while it lost its activity to lower the viral mRNA when it was treated 13 hours after infection ( Fig. 2C ). 그것은이 감염 후 13시간를 처리하여 바이러스의 mRNA (낮은 활성 손실하면서 또한 GV1001 효율적 HIV-1 세포를 감염 후 9 시간 동안 처리 하였다 바이러스 mRNA의 생성을 억제하는 도면. 2C ). At the same time, there was no significant change in the housekeeping host GAPDH mRNA synthesis, suggesting that GV1001 specifically regulates HIV-1 viral transcription. 동시에, GV1001 구체적으로 HIV-1 바이러스 전사를 조절하는 것이 제안 가사 호스트 GAPDH mRNA의 합성에 큰 변화가 없었다.
HIV-1 transactivating protein (Tat) enhances HIV-1 transcription through the interaction with the tat-transactivation-responsive region (TAR). HIV-1 transactivating 단백질 (문신)는 문신 - 전이 활성화 응답 지역 (TAR)과의 상호 작용을 통해 HIV-1 전사를 향상시킵니다. Because GV1001 is likely to specifically regulate HIV-1 transcription, we have tested whether GV1001 affects the transactivating role of HIV-1 Tat. GV1001은 특히 HIV-1 전사를 조절 가능성이 있기 때문에, 우리는 GV1001은 HIV-1 문신의 transactivating 역할에 영향을 미치는지 여부 테스트했습니다. We exploited 1G5, which is a Jurkat derivative cell line containing a stably integrated HIV-LTR-luciferase construct. 우리는 안정적으로 통합 된 HIV-LTR-루시퍼 라제 구조를 포함하는 주르 케트 파생 셀 라인 1G5을 악용. After 1G5 cells were infected with HIV-1 or transduced with a tat-retroviral vector (pSV2tat72) in the presence of AZT and GV1001, luciferase activity was analyzed. 1G5 세포가 HIV-1 감염 또는 AZT와 GV1001의 존재하에 TAT 레트로 바이러스 벡터 (pSV2tat72) 형질 도입시킨 후, 루시퍼 라제 활성을 분석 하였다. 1G5 cells infected with HIV-1 showed a dramatic increase in luciferase activity, and AZT or GV1001 treatment significantly reduced the effect of HIV-1 infection on HIV-LTR-Luciferase activity by fivefold ( Fig. 3A ). HIV-1 감염 1G5 세포는 루시퍼 라제 활성의 극적인 증가를 보였고, AZT 또는 GV1001 처리 크게 다섯 배 (의해 HIV-LTR-루시퍼 라제 활성에 대한 HIV-1 감염의 영향을 감소 .도 3A ). Consistently, GV1001 suppressed the activation of HIV-LTR luciferase activity induced by ectopic expression of Tat, suggesting its capability to regulate the transactivating role of tat during HIV-1 infection ( Fig. 3B ). 지속적으로, GV1001은 HIV-1 감염 (동안 문신의 transactivating 역할 조절의 기능을 제안, 문신의 이소성 표현에 의해 유도 된 HIV-LTR의 루시 페라 제 활동의 활성화를 억제 그림. 3B를 ).
Given that GV1001 regulates Tat-dependent transcriptional activity, the role of GV1001 in HIV-1 reactivation was investigated. GV1001은 문신에 의존하는 전사 활성을 조절 점을 감안, HIV-1 활성화에 GV1001의 역할을 조사했다. ACH-2 cells, a human T cell line encompassing a single copy of proviral HIV-1 DNA, were treated with PMA along with vehicle, AZT or GV1001. ACH-2 세포, 프로 바이러스 HIV-1 DNA의 단일 복사본을 포괄 인간 T 세포주, 자동차, 또는 AZT GV1001 함께 PMA 처리 하였다. PMA treatment significantly increased the supernatant p24 level, and GV1001 almost abolished the effect, whereas AZT did not change the effect of PMA ( Fig. 4A ). AZT는 PMA (효과 변경하지 않은 반면, PMA 처리 크게 상청액 P24 레벨이 증가하고, GV1001 거의 효과를 폐지 .도 4a 내지 ). This result indicates that GV1001 suppresses the PMA-induced HIV-1 reactivation and production of viral particles. 이 결과는 GV1001은 바이러스 입자의 PMA에 의한 HIV-1 활성화 및 생산을 억제 함을 나타냅니다. Similarly, HIV-1 viral RNA genome levels were also significantly decreased in the supernatants from PMA-treated cells following treatment with GV1001 in a dose-dependent manner, supporting the previous data ( Fig. 4B ). 유사하게, HIV-1 바이러스 성 RNA 게놈 수준은 상당히 또한 있던 이전 데이터 (지원 용량 의존적 방식으로 처리 GV1001 다음 PMA 처리 된 세포로부터의 상등액에서 감소 도.도 4b ).
Next, it has been examined whether GV1001 modulates HIV-1 replication via its interaction with HSPs. 다음으로,이 GV1001이의 HSP과의 상호 작용을 통해 HIV-1 복제를 변조 여부를 조사하고있다. Surprisingly, GV1001-mediated suppression of HIV-1 production in MT-4 cells was completely restored by treatment with an anti-HSP90 neutralizing antibody, while AZT-mediated suppression was not affected at all ( Fig. 5A ). AZT 매개 억제 모든 (에 영향을받지 동안 놀랍게도, MT-4 세포에서 HIV-1 생산의 GV1001 매개 억제는 완전히 방지 HSP90 중화 항체로 처리하여 복원 도. 5A ). Anti-HSP70-neutralizing antibody treatment resulted in partial restoration, and an isotype control anti-GAPDH antibody showed no significant effect ( Fig. 5A ). 안티 HSP70 중화 항체 치료는 부분 복원 결과 및 이소 제어 안티 - GAPDH 항체는 유의 한 효과 (보이지 않았다 그림. 5A를 ). Suppression of eGFP expression, which depends on HIV-1 transcriptional activity by GV1001, was also reverted by the anti-HSP90 antibody, whereas the effect of AZT was not affected ( Fig. 5B ,C). AZT의 효과 (영향을받지 않았다 반면 GV1001에 의해 HIV-1 전사 활성에 따라 eGFP는 발현 억제는 또한, 항 HSP90 항체로 복귀 하였다 .도 5B , C). These results show that GV1001 can regulate HIV-1 transcriptional activity through its interaction with HSP90. 이러한 결과는 GV1001 HSP90과의 상호 작용을 통하여 HIV-1 전사 활성을 조절할 수 있음을 보여준다.
Given that NF-κB can trigger HIV transcription by interacting with HIV-LTR, we tested the hypothesis that GV1001 modulates NF-κB activity in an HSP90-related manner to regulate HIV-1 transcriptional activity. NF-κB는 HIV-LTR과 상호 작용에 의해 HIV의 전사를 트리거 할 수 있음을 감안할 때, 우리는 GV1001은 HIV-1의 전사 활성을 조절하는 HSP90 관련 방식으로 NF-κB의 활성을 조절하는 가설을 테스트했다. Treatment with GV1001 resulted in a dramatic decrease in basal NF-κB activity regardless of HIV-1 infection in MT-4 cells ( Fig. 6A ). GV1001과 치료는 MT-4 세포에 관계없이 HIV-1 감염의 기초 NF-κB 활성이 크게 감소 (결과 도. 6A ). By contrast, AZT showed no significant effect on NF-κB activity in MT-4 cells. 대조적으로, AZT는 MT-4 세포에서 NF-κB 활성에 큰 영향을 보이지 않았다. AZT showed a moderate suppressive effect in MT-4 cells infected with HIV-1, a finding that might be due to the low level of HIV replication ( Fig. 6A ). AZT는 HIV 복제의 낮은 수준 (때문일 수도 발견 HIV-1에 감염된 MT-4 세포에서 중간 억제 효과를 나타냈다 도. 6A를 ). The suppressive effect on basal NF-κB activity of GV1001 was further confirmed by EMSA. GV1001의 기저 NF-κB 활성의 억제 효과가 더욱 EMSA에 의해 확인 하였다. As shown in Fig. 도시 된 바와 같이 도. 6B , GV1001-treated cells showed clear reduction of p65 NF-κB activation, indicating that GV1001 suppresses the basal level of NF-κB DNA binding in the nucleus. 도 6b는 , GV1001 처리 된 세포는 GV1001이 핵에 결합 NF-κB DNA의 기초 수준을 억제하는 것을 나타내는, P65 NF-κB 활성화의 명확한 감소를 보였다. GV1001 treatment also leads to reduced NF-κB (p65) phosphorylation, indicating that GV1001 suppresses the cytosolic activation of NF-κB and subsequent nuclear translocation ( Fig. 6C ). GV1001의 치료는 GV1001은 NF-κB 및 후속 핵 전좌 (의 세포질 활성화를 억제하는 것을 나타내는, 감소 된 NF-κB (P65) 인산화에 이르게 도. 6C를 ). A similar result was obtained from ACH-2 cells latently infected with HIV-1 ( Fig. 6C ). 유사한 결과는 잠복 HIV-1 (감염 ACH-2 세포로부터 얻은 그림. 6C ). As expected, treatment with GV1001 resulted in decreased nuclear localization of NF-κB (p65) in PMA-treated ACH-2 cells compared with DMSO-treated control cells ( Fig. 6D ). 예상대로, GV1001 치료는 DMSO 처리 대조군 세포 (비교 PMA 처리 ACH-2 세포에서 NF-κB (P65)의 감소 핵 이행 결과 도. 6D ). Because we have shown that the anti-HIV effect of V1001 depends on HSP90, we tested whether the NF-κB suppressive effect is dependent on HSP90. 우리 V1001의 항 HIV 효과 HSP90에 의존한다는 것을 보여 주었다 때문에, 우리는 NF-κB 억제 효과가 HSP90에 의존적인지 여부를 테스트 하였다. Consistent with the anti-HIV activity data, the NF-κB suppressive activity of GV1001 was also completely reversed by treatment with an HSP90 blocking antibody or HSP90 inhibitor, while treatment with an anti-GAPDH antibody showed no significant effect ( Fig. 7 ). 항 GAPDH 항체 치료가 더 큰 영향 (없었다 동안 항 HIV 활성 데이터와 일관되게, GV1001의 NF-κB 억제 활성은 완전 항체 또는 HSP90 억제제 블로킹 HSP90 처리함으로써 역전되었다 .도 7 ).
Previously, we have shown that GV1001 interacts with extracellular HSP90 and is internalized into cells. 이전에, 우리는 GV1001은 세포 외 HSP90과 상호 작용 및 세포로 내재화되는 것으로 나타났습니다. In Hepatitis C virus (HCV)-infected cells, GV1001 suppressed the replication of HCV through the interaction with HSP90 8 , 25 . C 형 간염 바이러스 (HCV) -infected 세포, GV1001은 HSP90과의 상호 작용을 통하여 HCV의 복제를 억제 8 , 25 . Given that HSP90 plays crucial roles in the HIV-1 life cycle and that GV1001 interacts with HSP90, it was very tempting to examine the possible antiviral activity of GV1001 against HIV-1. HSP90은 HIV-1의 라이프 사이클에서 중요한 역할을한다는 것을 감안할와 GV1001은 HSP90와 상호 작용, HIV-1에 대한 GV1001의 가능한 항 바이러스 활성을 조사하는 것은 매우 유혹했다. To our surprise, GV1001 displayed potent anti-HIV-1 activity. 놀랍게도, GV1001은 강력한 항 HIV-1 활성을 표시. Our Time-of-addition study suggested that GV1001 suppresses the replication of HIV-1 at the level of viral transcription. 우리의 시간의 첨가 연구는 GV1001은 바이러스 성 전사의 수준에서 HIV-1의 복제를 억제하는 것이 좋습니다. Indeed, GV1001 suppressed TAT-dependent transcriptional activity and decreased the level of HIV-1 RNA ( Figs 2 C and 3 A,B). 사실, GV1001은 TAT에 의존하는 전사 활성을 억제 HIV-1 RNA 수준 감소 ( 도 2 C와 3 을, B). Inhibition of TAT-dependent viral transcription by GV1001 suggests that it might be able to suppress the reactivation of latently infected HIV-1. GV1001에 의해 TAT에 의존하는 바이러스 성 전사의 억제는 잠재적으로 감염된 HIV-1의 활성화를 억제 할 수 있습니다 제안합니다. Despite the successful suppression of HIV replication by highly active antiretroviral therapy (HAART), current therapeutic strategies cannot eradicate latently infected HIV-1, and reactivation of the virus is a cause of treatment failure 26 , 27 . 고 활성 항 레트로 바이러스 치료 (HAART)를 기준으로 HIV 복제의 성공 억제에도 불구하고, 현재의 치료 전략은 잠복 감염 HIV-1을 근절 할 수없고 바이러스의 재활 치료 실패의 원인이된다 (26) , (27) . Because GV1001 has already been proven to be safe by several clinical trials, it is worthwhile to further evaluate the potential use of GV1001 as an anti-HIV agent to suppress the reactivation. GV1001 이미 여러 임상 시험에 의해 안전한 것으로 입증 되었기 때문에, 상기 활성화를 억제하는 항 HIV 제로서 GV1001의 잠재적 인 사용을 평가할 가치가있다. As expected, GV1001 efficiently suppressed the HIV-1 reactivation from latently infected cells, suggesting its potential use as a therapeutic agent. 예상대로, GV1001 효율적 치료제로서의 잠재적 인 용도를 제안 잠복 감염된 세포에서 HIV-1 활성화를 억제 하였다.
Of note, treatment with an anti-HSP antibody resulted in the loss of anti-HIV-1 activity of GV1001 suggesting that the anti-HIV-1 activity of GV1001 is largely due to its interaction with HSP90. 참고로, 항 HSP 항체로 처리 인해 HSP90과의 상호 작용에 GV1001의 항 HIV-1 활성이 크게임을 시사 GV1001의 항 HIV-1 활성의 손실을 초래. Since antibodies against HSP90 cannot penetrate cell membranes and interact with intracellular HSP90, the result suggests that GV1001 interact with cell surface HSP90 and modulates HIV-1 transcription. HSP90에 대한 항체는 세포막을 관통 HSP90 세포와 상호 작용할 수 없기 때문에, 그 결과 GV1001은 세포 표면과 상호 작용 HSP90 및 HIV-1의 전사를 조절하는 것이 제안한다. Although the partial inhibition of anti-HIV-1 function of GV1001 by an anti-HSP70 antibody suggests that HSP70 also be participated in the suppression by GV1001, complete abrogation of the GV1001 activity by the anti-HSP90 antibody treatment indicates that HSP90 is the major factor. 항 HSP70 항체 의해 GV1001의 항 HIV-1 함수의 부분 억제 HSP70도 GV1001 의한 억제에 참여하는 것을 제안했지만, 항 HSP90 항체 처리에 의해 GV1001 활성의 완전한 폐지은 HSP90의 주요임을 나타낸다 인자. Recently, it has been shown that cell surface HSP90 serves as a co-factor for NF-κB activation and involved in cellular pathogenesis by latently infected Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KHSV) 28 . 최근에는 세포 표면 HSP90는 NF-κB 활성화에 대한 보조 인자로서 작용하고 잠복 감염 카포시 육종 관련 헤르페스 (KHSV)에 의한 세포 병인에 관여하는 것으로 밝혀졌다 (28) . In addition, several studies have shown that eHSP90 regulates several cellular signaling pathways, including the NF-κB pathway 29 . 또한, 여러 가지 연구가 eHSP90은 NF-κB 경로를 포함한 여러 세포 신호 전달 경로, 조절하는 것으로 나타났다 (29) . NF-κB can trigger HIV transcription by interacting with NF-κB binding sites within HIV-LTR, and it enhances TAT-mediated LTR transactivation 30 . NF-κB는 NF-κB가 HIV-LTR 내 결합 부위와 상호 작용에 의해 HIV의 전사를 실행할 수 있으며, TAT 매개 LTR의 전이 활성화 향상 30 . In addition, Tat can directly activate NF-κB 31 . 또한, 문신 직접 NF-κB 활성화 할 수 있습니다 (31) . We showed that treatment with GV1001 resulted in suppression NF-κB activation and subsequent down-regulation of TAT-dependent transcription. 우리는 GV1001 치료가 억제 NF-κB 활성화 및 TAT에 의존하는 전사의 후속 하향 조절의 결과 것으로 나타났다. Moreover, suppression of NF-κB activation by GV1001 was restored by the treatment with an anti-HSP90 antibody. 또한, GV1001 의한 NF-κB 활성화의 억제는 항 HSP90 항체 처리에 의해 복원한다.
Collectively, we show that GV1001 suppresses the basal level of NF-κB activity, leading to the suppression of HIV-LTR transactivation. 종합적으로, 우리는 GV1001은 HIV-LTR의 전이 활성화의 억제로 이어지는 NF-κB 활동의 기초 수준을 억제하는 것으로 나타났다. Although the underlying molecular mechanisms of NF-κB suppression remain elusive, the results clearly indicate that HSP90 is implicated in the activity. NF-κB를 억제 기본 분자 메커니즘은 애매 남아 있지만, 그 결과는 분명히 HSP90의 활동에 관련되어 있는지 나타낸다. An elegant previous study showed that intracellular HSP90 plays a crucial role in HIV reactivation by directly regulating NF-κB 23 . 우아한 이전의 연구는 세포 내 HSP90 직접 NF-κB 조절함으로써 HIV의 재 활성화에 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다 (23) . In the current study, nullification of the GV1001 effects by an anti-HSP90 antibody strongly suggests that eHSP90 or cell surface HSP90 may also be involved in NF-κB signaling and HIV-LTR activation. 현재 연구에서, 항 - 항체 HSP90 의해 GV1001 효과 무효화 강력 eHSP90 또는 세포 표면 HSP90 또한 NF-κB 신호 전달 및 HIV-LTR 활성화에 관여 될 수 있다는 것을 시사한다. Indeed, recent studies have shown that extracellular HSP90 can enhance the NF-κB signaling pathway in various cell types 28 , 32 , 33 . 사실, 최근의 연구들은 세포 HSP90 다양한 종류의 세포에서 NF-κB 신호 전달 경로를 향상시킬 수있는 것으로 나타났다 (28) , (32) , (33) . Investigating the roles of extracellular HSP90 in NF-κB signaling and HIV replication in T-cells are currently underway. T - 세포에서 NF-κB 신호 및 HIV 복제에 세포 외 HSP90의 역할을 조사 현재 진행되고있다.
A 16-amino acid human telomerase reverse transcriptase (hTERT)-derived peptide, GV1001, and a 13-amino acid HBV polymerase derived control peptide (Pol-LQHGRLVFQTSTR) were synthesized and characterized as described previously 34 . 16 아미노산 인간 텔로 머라 아제 효소는 (의 hTERT) 유래 펩타이드 GV1001 역방향 및 전술 한 바와 같이 13 아미노산 HBV 중합 효소 유도 제어 펩티드 (POL-LQHGRLVFQTSTR)를 특징으로하는 합성 하였다 (34) . T-20, Raltegravir, Flavopiridol, and Rinonavir were obtained from the NIH/AIDS Research and Reference Reagent Program (NIH, Bethesda, MD). T-20, Raltegravir, Flavopiridol 및 Rinonavir는 NIH / AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 (NIH, 베데스다, MD)에서 얻었다. Azidothymidine (3-Azido-3-deoxythymidine, AZT) was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 아지도 티미 딘 (3- 아지도 -3- 데 옥시 티미 딘, AZT)는 알드리치 (세인트루이스, MO)로부터 구입 하였다. Antibodies against HSP90 (#4877S), phospho-NF-κB (p65, #3033S), IκB (#4814S) and phopho-IκB (#2859S) were obtained from Cell Signaling (Cell Signaling, Danvers, MA), and anti-p24 antibody (Ab9071) was bought from Abcam (Abcam, Cambridge, MA). HSP90 (# 4877S)에 대한 항체는, 포스 NF-κB (P65, # 3033S), IκB (# 4814S) 및 phopho-IκB (# 2859S)는 (세포 신호, 덴 버스, MA), 및 항 세포 신호로부터 얻었다 P24 항체 (Ab9071)는 압캠 (압캠, 캠브리지, MA)에서 구입 하였다. Antibodies against HSP70 (sc32239), GFP (sc81045), GAPDH (sc25778) and NF-kB (p65, sc372) were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Dallas, TX). HSP70 (sc32239)에 대한 항체는, GFP (sc81045)는, GAPDH (sc25778)와 NF-kB (P65, sc372)는 산타 크루즈 생명 공학 (산타 크루즈, 달라스, TX)에서 구입 하였다.
The human T-cell leukemia cell line MT-4, the ACH-2 cell line latently infected with HIV-1, and a Jurkat derivative 1G5 cell line containing a stably integrated HIV-LTR-luciferase construct were obtained from the NIH/AIDS Research and Reference Reagent Program. 인간 T 세포 백혈병 세포주 MT-4, 잠복 HIV-1 감염된 ACH-2 세포주 및 안정 집적 HIV-LTR-루시페라아제 구조체 함유 된 Jurkat 유도체 1G5 세포주 NIH / AIDS 연구로부터 수득 된 및 참조 시약 프로그램. The pSV2tat72 plasmid (Cat. No. 294, provided by Dr. Alan Frankel) producing Tat protein (residues 1–72) was obtained from the NIH/AIDS Research and Reference Reagent Program 35 . pSV2tat72 플라스미드 (고양이. 번호 294, 박사 앨런 프랭클에서 제공) 생산 문신 단백질 (잔기 1-72)는 NIH / AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램에서 얻은 35 . To produce HIV-1, 293FT cells were transfected with the pBR_HIV-1_M_NL4-3_IRES_eGFP vector which co-expresses Nef and enhanced green fluorescence protein (eGFP) from a single bicistronic RNA (Cat. No. DS441, provided by Dr. Daniel Sauter and Dr. Frank Kirchhoff) using Lipofectamine 2000 reagent (Life Technologies) 36 . HIV-1을 생산하기 위해 293FT 세포가 pBR_HIV-1_M_NL4-3_IRES_eGFP 벡터로 형질 전환 된 네프 단일 bicistronic RNA에서 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) (고양이를 공동으로 표현한다. 박사 다니엘 사우과에서 제공하는 번호 DS441을, 리포 펙 타민 2000 시약 (생명 기술)을 사용하여 박사 프랭크 키르히 호프) 36 . Forty-eight hours after transfection, virus-containing medium was harvested and the viral titer was determined using p24 ELISA (ABL, city, MD). 48 시간 후, 형질 전환, 바이러스 - 함유 배지를 수확하고, 바이러스 역가 P24 ELISA (ABL,시, MD)를 사용하여 측정 하였다. For amplification of infectious HIV-1, MT-4 cells were infected with generated HIV-1 (MOI = 0.5) for 48 hours. 감염성 HIV-1를 증폭 들어, MT-4 세포를 48 시간 동안 생성 된 HIV-1 (MOI = 0.5)로 감염시켰다. After brief centrifugation, the supernatant was filtered and subjected to titration using p24 ELISA. 간단한 원심 분리 후, 상등액을 여과 및 P24 ELISA를 사용하여 적정을 실시.
To evaluate the anti-HIV-1 effect of GV1001, the cell-based anti-viral effect assay was performed. GV1001의 항 HIV-1 효과를 평가하기 위해, 세포 기반 항 바이러스 효과 분석을 실시 하였다. MT-4 cells (4 × 10 5 cells) were infected with HIV-1 (4 × 10 5 CCID 50 ) for 1 hour. MT-4 세포 (4 × 105 세포)를 1 시간 동안 HIV-1 (4 × 105 CCID 50)에 감염되었다. After washing, infected cells were seeded and treated with GV1001 or anti-HIV-1 drugs. 세척 후, 감염된 세포를 접종하고 GV1001 또는 항 HIV-1 약물로 치료. After 2 days of incubation, the images of MT-4 cells expressing EGFP were obtained using fluorescence microscopy. 배양 2 일 후에, EGFP 발현 MT-4 세포의 이미지는 형광 현미경을 사용하여 얻어졌다. The relative GFP intensity was determined using ImageJ software program (National Institutes of Health) in pixels per area. 상대 GFP 강도는 ImageJ에 소프트웨어 프로그램 (국립 보건원) 면적당 픽셀을 사용하여 측정 하였다. The collected supernatant was subjected to p24 ELISA or RNA extraction for reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) to determine the extracellular viral amount. 회수 한 상청액을 세포 외 바이러스 양을 측정하는 ELISA P24 또는 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR에)에 대한 RNA 추출 하였다. The cell pellets were used for the cell viability assay. 세포 펠렛은 세포 생존 분석을 위해 사용 하였다. To examine the role of HSP90 in the antiviral action of GV1001, MT-4 cells were infected with HIV for 1 hour and treated with anti-HSP70 (10 ng) or anti-HSP90 (10 ng). GV1001의 항 바이러스 작용에 HSP90의 역할을 조사하기 위해, MT-4 세포를 1 시간 동안 HIV 감염 및 바이러스 HSP70 (10 NG) 또는 항 HSP90 (10 NG)으로 처리 하였다. HIV-LTR-dependent synthesis of eGFP was also confirmed by immunoblotting using an anti-GFP antibody with cell lysates. eGFP는 HIV-LTR의 종속 합성은 세포 용 해물과 항 GFP 항체를 이용한 면역 블에 의해 확인 하였다. For antiviral assays using normal human PBMCs, separated PBMCs were activated with 1 μg/ml phytohemaggulutinin (PHA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for 3 days in the presence of IL-2 (100 U/ml) (PEPROTECH, Rocky Hill, NJ). 정상적인 인간 PBMC를을 사용하는 항 바이러스 분석의 경우, 분리 된 PBMC를 1 μg의 / ㎖ phytohemaggulutinin (PHA) (시그마 - 알드리치, 세인트루이스, MO) IL-2의 존재하에 3 일간 (100 U / ㎖) (PEPROTECH로 활성화 된 , 바위 언덕, NJ). PHA-stimulated PBMCs were infected with HIV-1 at a multiplicity of infection (MOI) of 0.1 and treated with indicated reagents for 3 days and subjected to fluorescent microscopy. PHA 자극 된 PBMC를 0.1의 감염 (MOI)에서 다수의 HIV-1 감염 및 형광 현미경으로 3 일간 표시된 시약으로 처리하여 실시한다. To determine the viral replication in PBMCs, intracellular viral RNAs were isolated and analyzed by RT-qPCR as described below. 후술 한 PBMC에서 바이러스 복제를 결정하기 위해, 세포는 바이러스 RNA를 RT-qPCR에 의해 단리하고 분석 하였다. All studies were performed following protocols approved by the Seoul National University Hospital Institutional Review Board (IRB, No 1605-056-761). 모든 연구는 서울 대학교 병원 임상 시험 심사위원회 (IRB, 아니 1605-056-761)의 승인을 다음과 같은 프로토콜을 수행 하였다.
MT-4, 1G5 or ACH-2 cells were seeded (1 × 10 4 cells/well) in 96-well microplates and incubated with increasing concentrations of GV1001 for 5 days. MT-4, 1G5 또는 ACH-2 세포를 시딩 하였다 (1 × 104 세포 / 웰)을 96 웰 마이크로 플레이트 5 일간 GV1001의 농도 증가와 함께 배양 하였다. Cell viability was determined using CellTiter96 kit (Promega, WI). 세포 생존율은 CellTiter96 키트 (Promega 사, WI)를 사용하여 측정 하였다. To analyze the cell protective effect of GV1001 from HIV-1-induced cell death, MT-4 cells (1 × 10 4 cells) were infected with HIV-1 virus (4 × 10 5 CCID 50 ) for five days with or without GV1001 and subjected to cell viability assays. 에이즈-1에 의한 세포 사멸에서 GV1001의 세포 보호 효과, MT-4 세포 (1 × 10 4 세포) 또는 GV1001없이 5 일 동안 HIV-1 바이러스 (4 × 10 5 CCID 50)와 감염을 분석하려면 세포 생존 분석을 실시.
To measure HIV-1 viral titers, HIV-1 p24 antigen capture ELISA (p24 ELISA, ABL) and RT-qPCR assay were conducted. HIV-1 바이러스 역가를 측정하기 위해, HIV-1 P24 항원 캡처 ELISA (P24 ELISA, ABL) 및 RT-qPCR에 분석을 실시 하였다. ELISA was performed according to the manufacturer's protocol. ELISA는 제조사의 프로토콜에 따라 수행 하였다. HIV-1 RNA genomes from cell culture supernatants and pellets were purified using the QIAamp Ultrasens Virus kit (Qiagen, Hilden, Germany) and quantitated by RT-qPCR using a primer pair specific to gag of HIV-1 31 . 세포 배양 상층 액과 펠렛에서 HIV-1 RNA 게놈은 QIAamp Ultrasens 바이러스 키트 (Qiagen 사, 힐덴, 독일)를 사용하여 정제 및 HIV-1의 개그에 특정 프라이머 쌍을 이용하여 RT-qPCR에 의해 정량 하였다 (31) . Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a reference gene for normalization 37 . 글리 세르 알데히드 인산 탈수소 효소 (GAPDH)를 표준화하기위한 기준 유전자로서 사용 하였다 (37) . The following primer pairs were used for real time qPCR: GagF, GCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAG (sense) and GagR, TCCCCTTGGTTCTCTCATCTGG (antisense); ; GagF, GCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAG (감각)과 GagR, TCCCCTTGGTTCTCTCATCTGG (안티센스) 다음 프라이머 쌍에 대한 실시간 qPCR에 사용되었다 and GAPDH-F, AATCCCATCACCATCTTCCA (sense) and GAPDH-R, TGGACTCCACGACGTACTCA (antisense). 및 GAPDH-F, AATCCCATCACCATCTTCCA (감각) 및 GAPDH-R, TGGACTCCACGACGTACTCA (안티센스). The HIV type 1 Genesig Standard kit (Primer design, Southampton, UK) was used to calibrate the viral titers. 에이즈 유형 1 Genesig 표준 키트 (프라이머 디자인, 사우 샘프 턴, 영국) 바이러스 역가를 보정하기 위해 사용되었다.
1G5 cells harboring an HIV-LTR luciferase reporter system were used to analyze the TAT-mediated transactivation of HIV-LTR. 에이즈-LTR 루시페라아제 기자 시스템을 품고 1G5 세포는 HIV-LTR의 TAT 매개 전이 활성화를 분석하는 데 사용되었다. Cells were transfected with pSV2tat72 plasmid by electroporation or infected with HIV (1 × 10 5 CCID 50 ) along with polybrene (final concentration: 4 μg/ml). 세포는 일렉트로 pSV2tat72 플라스미드로 형질 감염 또는 폴리 브렌과 함께 HIV (1 × 105 CCID 50)에 감염되었다 (최종 농도 : 4 μg의 / ㎖). Then, cells were treated with vehicle (DMSO), AZT or GV1001 as indicated followed by further incubation for 4 days. 4 일 동안 더 배양 한 다음 바와 같이 다음, 세포 차량 (DMSO), AZT 또는 GV1001 처리 하였다. Cell lysates were subjected to the luciferase assay, and LTR-dependent luciferase production was analyzed using a luciferase assay kit (Promega, WI). 세포 용 해물은 루시퍼 라제 분석을 실시하고, LTR 의존적 루시퍼 라제 생산은 루시 페라 제 분석 키트 (Promega, WI)를 사용하여 분석 하였다.
To induce HIV reactivation from ACH-2 cells, 50 nM phorbol myristyl acetate (PMA) was added to cells for 1 hour. ACH-2 세포에서 HIV의 활성화를 유도하기 위하여, 50 nM의 포르 볼 미리 스틸 아세테이트 (PMA)를 1 시간 동안 세포에 첨가 하였다. After washing with D-PBS twice, ACH-2 cells were seeded at a concentration of 1 × 10 5 cells/ml in 48-well plates. 번 D-PBS로 세척 한 후, ACH-2 세포를 48- 웰 플레이트에 1 × 105 세포 / ml의 농도로 시딩 하였다. Increasing concentrations of AZT or GV1001 were added to cells and further incubated for 24 hours. AZT GV1001 또는 증가하는 농도가 세포에 첨가하고 추가로 24 시간 동안 배양 하였다. The collected supernatants were subjected to p24 ELISA to determine the extracellular viral amounts. 수집 된 상등액은 세포의 바이러스 양을 결정 P24 ELISA를 실시 하였다.
To investigate the effect of GV1001 on NF-κB signaling in MT-4 cells, the NF-κB luciferase assay and electromobility shift assay (EMSA) were utilized. MT-4 세포에서 NF-κB 신호에 GV1001의 효과를 조사하기 위해, NF-κB 루시 페라 제 분석 및 전기차 변화 분석 (EMSA)를 사용 하였다. For the NF-kB luciferase assay, MT-4 cells were transfected with NF-kB firefly luciferase plasmid together with the CMV-promoter Renilla luciferase reporter plasmid by electroporation and infected with HIV (1 × 10 6 CCID 50 ), followed by treatment with the designated compounds. 함께 처리하여 상기 NF-kB 루시퍼 라제 분석을 위해, MT-4 세포를 전기 천공에 의해 CMV 프로모터 레 닐라 루시퍼 라제 리포터 플라스미드로 개똥 벌레 루시페라아제 플라스미드 함께 NF-kB로 형질 감염시키고, HIV (1 × 106 CCID 50)에 감염된 지정된 화합물을들 수있다. Twenty-four hours after infection, cells were harvested and subjected to the Dual-luciferase assay. 24 시간의 감염 후 세포를 수확하고, 이중 루시퍼 라제 분석을 실시. For EMSA analysis, MT-4 cells (1 × 10 6 cells) were infected with HIV (1 × 10 5 CCID 50 ) for 1 hour and incubated with DMSO, AZT and GV1001 as indicated. EMSA 분석을 위해, MT-4 세포 (1 × 106 세포)를 1 시간 동안 HIV (1 × 105 CCID 50)에 감염시키고 표시된 바와 같이 DMSO, AZT 및 GV1001 배양. Cells were harvested at 24 hours post-infection, and the nuclear fractions were extracted, followed by EMSA using the Gel Shift Assay system (Promega, Madison, WI). 세포를 24 시간 감염 후 수확하고, 핵 분획 겔 쉬프트 분석 시스템 (프로 메가 메디슨, WI)을 사용하여 EMSA 추출 관찰 하였다. Briefly, NF-κB-specific oligonucleotide (5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′) probes were radiolabeled with [γ- 32 P]ATP (3,000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) and separated from unlabeled [γ- 32 P]ATP. 간략하게, NF-κB 특정 올리고 뉴클레오티드 (5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 ') 프로브 [32 γ- P] ATP (10 mCi의 / ㎖ 3,000 CI / 밀리몰)로 방사성 표지하고 비 표지로부터 분리시켰다 [γ- 32 P] ATP. In super-shift and competition assays, nuclear extract was incubated with unlabeled competitor (NF-κB oligo) and noncompetitor (AP-2 oligo, 5′-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3′) oligonucleotides (1.75 pmol) before adding [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB probe for 10 minutes at room temperature. 슈퍼 변화 및 경쟁 분석에서 핵 추출물은 레이블이없는 경쟁 (NF-κB 올리고) 및 noncompetitor (AP-2 올리고, 5'-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3 ') 올리고 뉴클레오타이드 (1.75 pmol의)와 함께 배양 하였다 실온에서 10 분 동안 [γ- 32 P] ATP 표지 된 NF-κB 프로브를 추가하기 전에. Nuclear protein (10 μg) was incubated with [γ- 32 P]ATP-labeled NF-κB probe (20,000 cpm) for 20 minutes at room temperature and the reaction mixtures were analyzed using 6% DNA retardation gel separation and autoradiography. 핵 단백질 (10 μg의)은 20 분 동안 실온에서 반응 혼합물 ATP 표지 된 NF-κB 프로브 (20000 CPM) 32 P γ-] 6 %를 DNA 위상차 겔 분리하고 오토 라디오 그래피를 이용하여 분석 하였다 함께 배양 하였다. Activation of NF-κB was also analyzed by immunoblotting and confocal microscopy. NF-κB의 활성화는 면역 및 공 초점 현미경으로 분석 하였다. For immunoblotting analysis, MT-4 cells and ACH-2 cells were treated with vehicle (DMSO, 0.5%), AZT (1 nM) or GV1001 (10 μM) for 24 hours, and the lysates were subjected to immunoblotting using anti-NF-κB and anti-pNF-κB (p65) antibodies. 분석, MT-4 세포 ACH-2 세포를 면역 블 들어 차량 (DMSO, 0.5 %), AZT (1 ㎚) 또는 24 시간 동안 GV1001 (10 μM)로 처리하고,이 용 해물을 안티 NF를 이용하여 발현 수준을 실시 -κB 및 안티 PNF-κB (P65) 항체. Relative band intensities were analyzed by ImageJ software. 밴드의 상대 강도를 ImageJ에 소프트웨어에 의해 분석 하였다. For confocal analysis, ACH-2 cells were incubated with DMSO (0.5%), AZT (1 nM) and GV1001 (10 μM) for 24 hours after stimulation with PMA (50 nM) and hTNF-alpha (30 ng/ml) for 1 hour. 촛점 분석을 위해, ACH-2 세포를 PMA (50 ㎚)과의 밀도로 재현 탁 알파 (30 NG / ㎖)에 대한로 자극 한 후 24 시간 동안 DMSO (0.5 %), AZT (1 ㎚)하고 GV1001 (10 μM)와 함께 배양 하였다 1 시간. After fixation with 4% paraformaldehyde and permeabilization with 0.1% Triton-X-100, the cells were stained with anti-NF-kB (p65) antibody and secondary Alexa Flour 594-conjugated antibody. 4 % 파라 포름 알데히드 및 0.1 % 트리톤 X-100 permeabilization과 고정 후, 세포를 항 NF-kB (P65) 항체 및 이차 렉 밀가루 594 공역 항체로 염색 하였다. After brief nuclear staining with DAPI, cells were observed under a laser scanning confocal microscope (Nikon A1, Japan). DAPI로 핵 염색 후 짧은 셀은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (니콘 A1, 일본)으로 관찰 하였다. Scale bar, 10 μm. 스케일 바, 10 μm의. Colocalization of p65 and DAPI was determined by Manders' overlap coefficient analysis using NIS-Elements Ver 4.2 image software 38 . P65 및 DAPI의 colocalization을 NIS는 요소 버전 4.2 소프트웨어를 사용하여 화상은 Manders '중첩 계수 분석으로 측정 하였다 (38) .
Statistical comparisons between the control and treated groups were analyzed using the Student's t -test. 제어 및 치료 그룹 간의 통계적 비교는 학생의 t의 -test를 이용하여 분석 하였다. The level of statistical significance was set at either p < 0.05 (*), 0.01 (**), or 0.001 (***). 통계적 유의 수준은 어느 쪽 설정 하였다 <0.05 (*), 0.01 (**), 0.001 (***). All experiments were independently repeated three times. 모든 실험은 독립적으로 3 회 반복 하였다.