형질전환기술(7)

[산똘뱅이]

2) 사슬종결돌연변이(chain-termination mutation)

돌연변이에 의해 생긴 새로운 코돈이 세 종류의 종결코돈 중 하나일 경우 염기치환

번역을 미리 종결시키기 때문에 아무런 기능을 하지 못하는 폴리펩티드 형성

3) 첨가, 결실, 격자이동

1) 치환(substitution)

ㆍ염기치환(base substitution) 돌연변이 : 하나의 염기쌍이 치환되거나 대치되는 것

ex) 베타-글로빈 유전자 : 헤모글로빈을 구성하는 단백질 중 하나를 암호화

① 침묵돌연변이(silent mutation) - 단백질 구조에 영향을 미치지 않음

베타-글로빈 유전자의 류신을 지정하는 세번째 코돈은 UUG이지만 세번째 염기에서 치 환이 일어나도 단백질의 구조는 변화하지 않는다.(류신 지정 코돈은 UUG, UUA 등이 있기 때문)

② 중립돌연변이(neutral mutation) - 단백질 구조는 변화시키나 기능에는 영향을 주지 않음. 히스티딘으로 발현되는 두번째 코돈의 첫 번째 염기에서 치환이 일어나 티로신이 지정 → 치환된 아미노산은 헤모글로빈 단백질 기능에는 영향을 주지 않음

③ 베타-글로빈의 겸형 적혈구 대립유전자 - 여섯번째 아미노산의 코돈이 GAA(글루탐 산)에서 GUA(발린)로 돌연변이 → 헤모글로빈의 구조와 기능에 심각한 영향을 끼쳐 겸형적혈구빈혈증을 유발시킴

ㆍ첨가(addition) : 염기가 뉴클레오티드 서열에 끼어 들어가는 것

ㆍ결실(deletion) : 염기가 뉴클레오티드 서열에서 빠져나가는 것

⇒ 이러한 돌연변이가 유전자 발현 서열 내에서 발생하면 번역 격자를 변화시키기 때문에 치환 현상보다 더 심각한 결과 초래

ㆍ격자이동돌연변이(frameshift mutation) : 첨가와 결실이 정보의 번역 격자를 변경시킴

4) ㆍDNA의 비암호화 부위에서의 점돌연변이 - 틸라세미아(thalassemia) 글로빈 유전자의 점돌연변이

ㆍ인트론 내의 점돌연변이 : 틸라세미아는 30개의 점돌연변이에 의해 발생되는데 이중 몇 개는 인트론에 존재하며 인트론 접합 효율을 떨어뜨려 헤모글로빈 형성이 저하 → 빈혈 증상

ㆍ프로모터 부위의 치환돌연변이 : 틸라세미아의 30개 치환 중 5개는 유전자의 프로모터 부위에 존재 → 프로모터의 기능을 약화시켜 헤모글로빈의 양을 감소시킴

5. CHROMOSOMAL MUTATIONS

ㆍDNA 분자에서 이중 나선이 완전히 절단되고, 그 후 회복 과정도 실패하는 경우에 발생

1) 결실(deletion)

절단된 두 절편 중 하나는 동원체를 갖고 있는 동원체(centric) 절편이지만 다른 하나는 그렇지 않은 비동원체(acentric) 절편인 경우가 있는데 세포분열 후기에 이르러 동원절편은 정상적으로 이동하나, 비동원체 절편은 딸세포에 도달하지 못함

⇒ 염색체의 일부 절편을 갖지 못하는 딸세포는 염색체 결실(chromosomal deletion) 발생 한 염색체가 두 번 절단된 경우 첫째와 셋째 절편이 재연결되는 경우 결실 발생

ㆍ원염색체(ring chromosome) : 양 끝이 절단된 중간 절편이 자신의 끝을 연결해 원 형성

2) 역위(inversion) : 중간 절편이 양 끝 절편과 거꾸로 재결합되는 것

3) 중복(duplication) : 상동 염색체가 서로 다른 위치에서 절단되어 비정상적인 융합회복이 일어나면 한 염색체는 결실이 생기고 긴 염색체는 중복이 발생

4) 전좌(translocation)

: 두 개의 비상동 염색체가 절단된 후, 융합 회복이 잘못일어나 한 염색체의 절편이 다른 염색체에 붙는 현상. ex) 전좌 다운증후군(translocation Down's syndrome)

14번과 21번 염색체에서 일어나는 현상으로 염색체 비분리에 의한 다운증후군과 같으나

유전된다는 점에서 다르다.

6. TRANSPOSITIONS

DNA 절편의 사본이 게놈상의 새로운 위치로 삽입되는 것

DNA 조각이 염색체의 한 장소에서 다른 장소로 이동하며 발생

1) 트란스포존의 구조 - B. McClintock

트란스포존(transposon;jumping gene) : 게놈의 한 장소에서 다른 장소로 이동할 수 있는 DNA 절편. 중앙 부위에는 트란스포존으로 하여금 자신의 사본을 다른 곳에 삽입할 수 있 게 해 주는 효소인 트란스포사아제(transposase)를 암호화하는 유전자가 있고, 양옆 부위는 역반복(inverted repeat라는 뉴클레오티드 서열은 동일하지만 방향이 반대인 염기사슬이 있 다.

2) 돌연변이원으로서의 트란스포존

프로모터내에 삽입되면 전사를 완전히 불활성화 시킴

큰 트란스포존이 삽압되면 프로모터를 암호화 부위로부터 멀리 분리시킬 수 있음

엑손에 삽입되면 격자 이동을 일으키거나 완전히 새로운 아미노산을 삽입시킬 수 있다.

B. McClintock - 세포가 위험한 상황에 놓여 있을 때 전위의 비율이 더욱 증가하는 것으 로 보아 전위는 새로운 다양성을 모색하기 위한 최후의 방법이라고 제안

Experiment 5

1. 실험제목: 유전자 조작 실험 1, Plasmid 및 DNA의 순수분리와 재조합 DNA 분자 제조

2. 실험목적: 유전공학에서 사용되는 기초실험인 plasmid DNA의 분리기술을 습득하고, 재조합 DNA 분자의 제조방법을 이해한다.

3. 실험원리

☐plasmid preparation

-플라스미드를 정제한다.

E.coli는 genomic DNA이외에 독립적으로 복제가 가능한 Plasmid DNA를 가질 수 있는데 이러한 플라스미드를 가진 E.coli로부터 플라스미드DNA를 분리 정제하는 과정.

☐plasmid

-플라스미드는 박테리아의 세포안에 존재하는 박테리아 크로모좀 이외의 작은 원형의 DNA분자 입니다. 형태는 원형이고, 이중 나선으로 되어 있으며, 박테리아의 유전자와는 독립적으로 분열할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 그러한 이유로 유전자 클로닝을 위한 벡터로 많이 사용되는 것 중 하나입니다. 벡터란 유전자 클로닝시에 우리가 원하는 유전자를 숙주 세포안으로 이동시켜 그 안에서 다량으로 복제 가능하도록하는 일종의 운반체를 말하며, 플라스미드는 그를 위한 조건을 가지고 있습니다. 우선 자가 복제를 위한 복제 기점 (origin of replication)을 가지고 있으며, 유전자의 발현, 즉 삽입된 유전자의 전사를 유도하는 promoter, 나중에 세포 배양에 의한 대량 생산후에 플라스미드가 들어간 세포와 그렇지 않은 세포를 구별해 내기위한 selective marker, 그리고 숙주안에서의 copy number 를 조절하는 replicon, 그리고 원하는 유전자를 끼워 넣을 수 있는 insertion site 등을 가지고 있습니다. insertion site는 제한 효소에 의해 잘려질 수 있는 부위인데요. 거기로 우리가 복제를 원하는 유전자를 삽입할 수 있습니다. 플라스미드와 항생제의 관계를 selection 에 있습니다. 유전자 클로닝 시에 플라스미드가 들어간 숙주세포와 그렇지 않은 세포를 가려낼 때 이용하는 것 중 하나가 플라스미드가 가지는 항생제 저항성 유전자 입니다. 플라스미드는 한개 또는 2개 이상의 항생제 저항성 유전자를 가집니다. 이 유전자는 항생제를 분해할 수 있는 물질을 생산해 내며, 플라스미드를 숙구 세포에 넣은 후에 항새제가 들어간 배지에서 배양을 하면, 숙주 세포 중에서 플라스미드가 들어간 것은 플라스미드의 항생제 저항 유전자 덕분에 살아남을 수 있지만, 플라스미드가 들어가지 않은 숙주 세포는 항생제 저항 물질을 생산하지 못하기 때문에 죽게 됩니다. 또한 플라스미드의 inseertion site가 항생제 저항 유전자의 가운데에 위치하는 경우에는 원하는 유전자의 플라스미드 내 삽입이 안전하게 되면 항생제 저항 유전자가 갈라지기 때문에 그 활성을 할 수가 없게 되어, 항생제 첨가 배지에서 죽게 됩니다. 이런 식으로도 selection이 가능합니다. 플라스미드는 필요에 따라서 인공적으로 생산되기도 합니다. 원활한 selection을 위해서 다른 유전자를 집어넣거나, 하는 등입니다.

☐Plasmid의 구성

Plasmid는 크게 다음과 같은 세 부분으로 구성되어 있습니다.

1) Replication origin

이 부분은 plasmid가 자가복제할 때 처음 인식하는 부위이므로 모든 plasmid에 꼭 필요한 부분입니다. 그림에서 보이는 ColE1 ori라고 씌여진 부분입니다.

다른 곳에서 설명할 기회가 없을 것 같아 여기에서 설명하는데, f1(+) origin이라는 것이 보이지요? 이것은 사실 plasmid의 origin of replication이 아니라 bacteriophage의 origin입니다. 이걸 여기에 삽입해 놓으면 이 plasmid가 때로는 bacteriophage처럼 행동하기도 합니다. Bacteriophage의 장점은 life cycle 중에서 single stranded DNA로 존재할 때가 있다는 것인데, 이런 성질이 유용할 때가 있습니다. 어느 쪽 strand가 single strand 상태로 존재하는가에 따라 f1(+) 혹은 f1(-) origin을 이용합니다.

2) Antibiotics resistance gene

이것은 항생제에 내성을 나타내는 유전자입니다. 대개는 ampicillin resistance gene이 들어 있는데, 이 경우 여기서 나오는 단백질은 그 유명한 beta-lactamase입니다. AmpR이라고 씁니다. 때로는 kanamycin resistance gene을 쓰기도 하고, eukaryote expression‎ vector에는 주로 neomycin resistance gene이 들어 있습니다.

3) Multiple cloning site(MCS)와 LacZ'

이 부위는 제한효소로 잘릴 수 있는 부위를 한꺼번에 모아놓은 부분입니다. 제한효소로 잘라서 다른 DNA를 삽입시킬 때 위에서 설명한 중요한 부분들이 같이 잘리면 곤란하겠지요. 그래서 다른 부분은 절대 잘리지 않고 이 부분에만 잘릴 수 있도록 열 몇가지 제한효소 절단부위를 인위적으로 조작해 놓은 것입니다. 이 MCS 부위는 길어야 100 - 150 bp 정도이며 앞 뒤 부분에 SP6, T3, T7 promoter 등이 붙어있게 됩니다. 이런 부위는 RNA를 시험관에서 만들거나 단백질 발현을 시킬 때, 그리고 DNA sequencing 같은 실험을 할 때 쓰이는 부위입니다. 여기에 써 있는 제한효소는 실험실에서 고추장 된장 간장 등에 해당하는 것으로 이름을 반드시 알아야 하겠습니다. 때로는 절단부위까지도 대개 외우고 있게 됩니다.LacZ'는 꼭 필요한 것은 아니지만 대개는 있으며 반드시 MCS(multiple cloning site)를 포함하고 있습니다.

4. 실험방법

♣alkaline lysis method

alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리 될 수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균 되어 진다(여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다). 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며(SDS는 potassium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.

☐plasmid prep 시 사용되는 solution I,II,II 의 성분들의 역할

solution1: EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여

          세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의

          외형을 유지시켜준다. 이 과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가

          완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와

          구분할 수 없게 된다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는

          것이다.

solution2 : SDS는 ionic detergent로 세포막을 깨는 일을 합니다. NaOH는 DNA를

           denaturation시킵니다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게

           처리한다.

solution3 : Renature시키는 산성용액이다. 이렇게 해서 Chromosomal DNA는 SDS와

           potassium과 함께 엉기게 된다.

♣Polymerase chain reaction

주형이 되는 double strand DNA의 표적 부분의 양끝 염기 배열 정보로부터 상류와 하류의 DNA primer를 합성하고 내열성 DNA polymerase(Taq polymerase)와 thermocycler를 이용해 PCR반응에 따른 특정 유전자 영역의 증폭을 실시한다. 이론적으로는 반응 사이클의 2n으로 증폭이 가능하다.

1.Denaturation temperature(보통 94℃)

2.Hybridization or annealing temperature

3.Extension temperature(보통 74℃, 이는 Taq polymerase의 최적 활성 온도보다 약간 낮은 온도임)

중합효소 연쇄반응이 이용되는 실험

1) Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭

2) 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning

3) DNA sequencing

4) 돌연변이 검사

5) 병인성 바이러스 및 박테리아 검출

6) 유전자의 footprinting

7) 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)

중합효소 연쇄반응의 의학적 응용

1) HLA형의 결정

2) 법의학: 특정인의 유전자 검출

3) 암유전자의 검출: ras, myc, fos 등

4) 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy (Duchenne type)등

5) 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등

중합효소 연쇄반응은 다음과 같이 세 단계로 이루어진다.

1) DNA의 변성(denaturation)

90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.

2) Primer의 결합(annealing)

50°C∼65°C에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 표 1과 같다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.

3) DNA의 합성(polymerization)

70°C∼74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.

위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.

☐ PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점

1. 10x PCR 완충용액

1) Magnesium

다음과 같은 여러가지에 영향을 주는 중요한 요소이다.

A, Primer가 template DNA에 결합하는 능력

B. Template 및 PCR 산물의 변성온도

C. Product specificity

D. dNTP와의 결합

E. Taq DNA polymerase의 활동성

F. Primer-dimer artefact의 형성

a) 반응물내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려 주어야 하고, dNTP나 template의 농도가 높으면 MgCl2의 농도를 높게 변화시켜야 한다.

b) 위에 나열한 Mg의 기능중 A, B, C, D는 농도가 높을수록 실험에 유익하고 E, F는 농도가 낮을수록 실험에 유익하므로 최적 농도를 유지할 수 있도록 노력해야 한다.

c) 반응이 잘 일어나지 않으면 0.5 mM부터 2.5 mM(때로는 8 mM까지)사이에서 농도를 변화시켜 가면서 최적조건을 찾도록 한다.

2. Taq DNA polymerase

Taq는 온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동 적정온도는 70°C∼74°C이며 95°C에서 40분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다. 이 효소가 발견되기 전에는 Klenow 효소를 이용하여 매 cycle마다 효소를 첨가해 주면서 반응을 시켜야만 했다. DNA 합성의 오차율은 1.1×10-4 bp로 DNA polymerase I의 오차율(1.0×10-5)보다 높는데 이는 Taq DNA polymerase가 잘못 들어간 nucleotide를 삭제하고 다시 합성하는 proofreading 기능(3'→5' exonuclease activity)이 없기 때문이다. 따라서 PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되더라도 반드시 확인과정을 거쳐야 한다. 한번의 반응에 사용하는 효소의 양은 보통 0.5-5 unit 정도인데 양이 너무 많으면 비특이 적인 DNA가 형성될 가능성이 많고, 너무 적으면 증폭 산물이 부족하게 되므로 최적 조건을 찾도록 노력해야 한다.

3.Template DNA

선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA(cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을때 반응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다. Chromosomal DNA인 경우 1 μg 이내, plasmid DNA의 경우 100 pg∼100 ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.

4. Primer (제작시 고려해야 될 사항)

Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다.

G+C 비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기전에 신중히 고려해야 할 것이다. Primer 합성은 염기서열을 적어 바이오니아(구 한국생공) 등의 회사에 의뢰하면 주문에 따라서 정제도 해준다. 정제는 Sep-pak, OPC나 PAGE 정제를 이용하는데, 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다.

Primer의 양은 0.1~0.5 μM로 시행한다.

♣제한효소를 이용한 DNA절단

-제한효소 1 unit는 1 μg의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 상품화된 효소는 효소마다 다르지만 대개 10 units/μl 내외의 농도로 공급된다. 제한효소 처리 반응은 절단하려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성된다. 각각의 성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고려하여야 할 것이다.

1) 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 많은 효소를 넣어주기 때문에 그다지 걱정할 필요는 없다.

2) Linear DNA의 끝부분을 자를 때는, 효소에 따라서 인식서열에 몇개의 염기가 더 붙어 있어야만 잘리는 것들이 있음을 주의한다. 이는 plasmid vector의 multiple cloning site를 두가지 효소로 자르는 경우에도 고려해야한다. 또한 PCR primer에 제한효소 인식부위를 넣어 design할 경우에도 반드시 고려해야 한다.

3) DNA의 순수도는 제한효소 처리 효율에 중요하다. DNA 용액 내에 단백질이 남아있는 경우는 보다 많은 양의 효소가 필요하다. Phenol과 같은 유기용매가 남은 경우는 제한효소에 잘리지 않는 DNA가 남는 경우가 많다.

4) 각각의 제한효소는 최적온도, 반응완충용액(reaction buffer)의 조성 및 불활성화 온도 등 각각에 알맞은 반응 조건이 있으며, 제조회사의 안내서에 이 내용이 잘 기록되어 있으므로 잘 읽어보고 사용해야 한다. 어느 회사의 제품이건 효소를 구입할 때 그 효소에 적합한 반응완충용액이 같이 지급되므로 별 어려움 없이 그대로 사용할 수 있으며 대개 10배 농축된 형태(10x)로 만들어져 있으므로 반응액을 조합할 때 10배 희석하는 형태로 반응액을 조성한다.

5) 반응 조건이 최적이 아닌 경우에는 더 많은 양의 효소를 사용해야 한다. 이는 두가지 이상의 효소로 자르는 경우 (효소들의 최적 조건이 다를 때)에 중요하다. 때에 따라서는 이런 경우에 star activity라 불리는 현상(비특이적으로 아무 곳이나 다 잘리는 현상)이 나타날 수도 있으므로 주의해야 한다.

6) 효소가 인식부위를 자르는 데에 있어서 같은 인식부위라도 주위 염기서열에 따라 그 활성도가 다를 수 있다. 그러므로, DNA 양으로 계산한 효소 양보다 조금 더 많이 넣어주는 것이 좋다. 필요할 때는 제한효소 처리 중에 조금씩 덜어 전기영동으로 monitor할 수도 있다.

☐제한효소

DNA도 특정부위를 자르고 붙일 수 있다. DNA를 자른다는 것은 nucleotide들이 연결되어 있는 phosphodiester 결합을 끊어내는 것을 의미하는데, 이런 역할을 하는 효소를 nuclease라고 하며 바깥쪽을 자르는가 안쪽을 자르는가에 따라서 각각 exonuclease, endonuclease라고 부른다. Endonuclease의 대표적인 것이 바로 제한효소(restriction enzyme, restriction endonuclease)이며, DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다. 제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오는 바이러스와 같은 외부 DNA를 제거하기 위한 방어기전으로 가지고 있는 것이며, 자신의 DNA는 절단부위의 염기(adenine, cytosine)를 메칠화시켜서 자신의 제한효소가 자신의 DNA를 자를 수 없게 보호하고 있다.

제한효소는 3가지로 나눌 수 있으며, 실험실에서 사용되는 것은 대부분 type II이다.

A) Type I restriction enzyme

DNA의 특정부위를 인식하긴 하지만 인식된 부위가 아닌 다른 부위를 절단한다. 즉, 인식부위는 특이성을 가지지만 그로부터 약 1,000 base pair가 떨어진 부위를 절단하기 때문에 원하는 부위를 선택하여 자르기가 어렵다. 따라서 이 효소들은 박테리아의 기능에는 중요하지만 실험목적으로는 잘 사용되지 않는다.

B) Type II restriction enzyme

인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생물학 연구에 아주 유용하게 이용되고 있다. 실험에 쓰이는 제한효소는 특별한 말이 없는 한 type II를 말한다. 대부분의 type II 제한효소는 4개, 5개, 또는 6개의 염기서열을 인식하는데, 이에 따라 DNA 상에 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다. 즉 6개의 염기서열을 인식한다면 이론상 46 = 4096 base pair 마다 한번씩 출현하게 된다. 제한효소의 명명은 발견된 세균의 이름 및 serotype에 따라서 붙이게 된다. 즉 Hinf II는 Haemophilus influenza type f에서 분리된 것이다. 제한효소가 인식할 수 있는 부위는 palindrome, 즉 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양을 하고 있는 것이 특징이다. 잘린 후의 DNA 모양은 5'-overhang cohesive end, 3'-overhang cohesive end(sticky end) 또는 blunt end가 만들어질 수 있으므로 목적에 따라서 잘 선택해서 사용해야 한다.

♣Ligation of DNA

Recombinant DNA

1970년대 쯤 등장한 "유전공학(genetic engineering)"이라는 분야가 있다. 요즘도 쓰지만 이 말은 "유전자 재조합 기술(recombinant DNA technology)"를 의미한다. DNA를 자르고 붙여서 새로운 DNA를 만든다. 가위와 풀을 이용해서 종이를 잘라 붙이는 것과 같다. 여기에서 가위에 해당하는 것이 restriction enzyme이고, 풀에 해당하는 것이 DNA ligase이다.

DNA ligase가 하는 일은 그림과 같이 phosphodiester bond를 연결시켜 주는 것이다.

5. 참고문헌

http://blog.naver.com/kuraa.do?Redirect=Log&logNo=80009706622

http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/restriction_enzyme.php

http://kin.naver.com/browse/db_detail.php?d1id=11&dir_id=110205&docid=1399050

http://cafe.naver.com/moleimmunology.cafe?iframe_url=/ArticleRead.nhn%3Farticleid=

[sunshinetj]

그림 이쁘다 ^^
When an additional bases shift and the downstream triplet codons change, resulting in a completely different polypetide.ㅋㅋ 논문끝!

[산똘뱅이]

이거는 사전 들고 오라꼬 울딸애한테 이애기 해서 사전펴서 찿아서 꿰맞추어 봐야 뜻을 알겠는데요 ~~
abcd 꼬부랑글 ~~암만 봐도 모리겐네 ~~

[sunshinetj]

진짭니꺼?
저 위에 인는거 빼끼 쓴긴데,,,ㅋㅋ

[산똘뱅이]

그러니까 더 모르지요 ~~~그거 알면 ~~저위에것 다아는거 아입니까~? 떨어지고 붙는 법칙 ~~흐흣~~

[sunshinetj]

그 이상하게 떨어지고 붙고 떨어지고 붙고 하민서 온통 상처만드는 거 전문인 사람들 만튼데,,
거참 고것도 형질전환된 게놈 임니꺼?

[산똘뱅이]

게놈인지 지놈인지 그놈인지 좌우간 그런놈이 있긴 있어요 ~~그놈이 놈은 놈인데 별놈인거 가타요 ~~

[sunshinetj]

하이참,,, 개놈이 아니고 게놈 말임니더,,^^
그래서 세상이 울고 운는 재미인는 세상 임니더,,^^

[산똘뱅이]

나는 왜 인간들이 개짖을 하는늠덜이 더러 인능공 했더니 가장 깊은 인간의 본성속에 개놈이 들어 있어서 그런가 바요 ~~~그런데 진짜 개몬하고 놀아보면 진짜 개놈은 사람에게 배신 안때려요 ~~~죽어서 고기까지 주인에게 바치 쟈나요 ~~으~~~보신탕 무꼬 시포 ~~

[sunshinetj]

목사님 고단백질ㅋㅋ 뽀신탕 카몬 미국사람들 우리나라 사람 사람 취급도 안함니데이 뭐 배부른 사람들 이해상관업지만예
근데,,,
genome은 하나님 없으믄 못 산다 칼 수 인는데,,,
개놈은 개 없으믄 못 산다 카는 인간인 기라예,,,
지도 동물 사랑하고 특히도 개 이뻐하지마는
개부모쯤 되가지고 끌어 안고 품고 개 아프믄 지목숨보다 더 중요해 가지고 울고,, 살찐개 병원데리고 가고, ,,가관인데 그기까지는 자유겠지마는
옆에 서 인는 사람 자동적으로 그 개보다 못한 인생이 되뿌는 기라예,,
그러이 게놈과 개놈은 철처하게 분간하밍서 살아야함니더.