Re: 자가포식 유도체 '스퍼미딘' 간경화 방지 기전 탐구!!! 2018년

[문형철]

ORIGINAL RESEARCH article

Front. Immunol., 02 May 2018

Sec. Inflammation

Volume 9 - 2018 | https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.00948

Spermine Alleviates Acute Liver Injury by Inhibiting Liver-Resident Macrophage Pro-Inflammatory Response Through ATG5-Dependent Autophagy

Shun Zhou1,2,3†

• 1Liver Transplantation Center, First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing, China
• 2Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing, China
• 3Jiangsu Key Laboratory of Cancer Biomarkers, Prevention and Treatment, Collaborative Innovation Center for Cancer Personalized Medicine, Nanjing Medical University, Nanjing, China
• 4Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, Nanjing, China

Liver-resident macrophages (Kupffer cells, KCs) and autophagy play critical roles in the pathogenesis of toxin-induced liver injury. Recent evidence indicates that autophagy can regulate macrophage M1/M2 polarization under different inflammatory conditions. Polyamines, including putrescine, spermidine, and spermine (SPM), are polycations with anti-oxidative, anti-aging, and cell autophagy induction properties. This study aimed to determine the mechanisms by which SPM protects against thioacetamide (TAA)-induced acute liver injury in a mouse model. Pretreatment with SPM significantly alleviated liver injury and reduced intrahepatic inflammation in TAA-induced liver injury compared to controls. SPM markedly inhibited M1 polarization, but promoted M2 polarization of KCs obtained from TAA-exposed livers, as evidenced by decreased IL-1β and iNOS gene induction but increased Arg-1 and Mrc-1 gene induction accompanied by decreased STAT1 activation and increased STAT6 activation. Furthermore, pretreatment with SPM enhanced autophagy, as revealed by increased LC3B-II levels, decreased p62 protein expression‎, and increased ATG5 protein expression‎ in TAA-treated KCs. Knockdown of ATG5 in SPM-pretreated KCs by siRNA resulted in a significant increase in pro-inflammatory TNF-α and IL-6 secretion and decreased anti-inflammatory IL-10 secretion after TAA treatment, while no significant changes were observed in cytokine production in the TAA treatment alone. Additionally, the effect of SPM on regulation of KC M1/M2 polarization was abolished by ATG5 knockdown in TAA-exposed KCs. Finally, in vivo ATG5 knockdown in KCs abrogated the protective effect of SPM against TAA-induced acute liver injury. Our results indicate that SPM-mediated autophagy inhibits M1 polarization, while promoting M2 polarization of KCs in TAA-treated livers via upregulation of ATG5 expression‎, leading to attenuated liver injury. This study provides a novel target for the prevention of acute liver injury.

간 상주 대식세포(Kupffer 세포, KC)와 자가포식은

독소 유발 간 손상의 발병에 중요한 역할을 합니다.

최근의 증거에 따르면

자가포식은 다양한 염증 조건에서

대식세포의 M1/M2 분화를 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다.

푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민(SPM)을 포함한 폴리아민은

항산화, 노화 방지, 세포 자가포식 유도 특성을 가진

polication(양전하를 띤 고분자물질)입니다.

이 연구는 SPM이 마우스 모델에서

티오아세타미드(TAA)로 인한

급성 간 손상을 방지하는 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 했습니다.

SPM 사전 투여는

TAA로 유발된 간 손상에서 대조군에 비해 간 손상을 유의미하게 완화시키고

간 내 염증을 감소시켰습니다.

SPM은 TAA에 노출된 간에서 얻은 대식세포(KCs)의 M1 분화를 현저히 억제했지만,

M2 분화를 촉진시켰습니다.

이는 IL-1β 및 iNOS 유전자 발현 감소와 함께

Arg-1 및 Mrc-1 유전자 발현 증가,

STAT1 활성화 감소 및 STAT6 활성화 증가로 확인되었습니다.

또한, SPM으로 사전 처리한 경우,

TAA로 처리한 KC에서 LC3B-II 수준이 증가하고,

p62 단백질 발현이 감소하며,

ATG5 단백질 발현이 증가하여 자가포식이 강화된 것으로 나타났습니다.

SPM 사전 처리된 KCs에서 siRNA를 통해 ATG5를 knockdown한 결과, TAA 처리 후 프로염증성 TNF-α 및 IL-6 분비량이 유의미하게 증가했으며, 항염증성 IL-10 분비량은 감소했습니다. 반면 TAA 단독 처리 시 사이토킨 생산량에는 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다. 또한, SPM이 KC의 M1/M2 분극화 조절에 미치는 효과는 TAA에 노출된 KC에서 ATG5 발현 억제에 의해 소실되었습니다.

마지막으로, in vivo에서 KC의 ATG5 발현 억제는 SPM의 TAA 유발 급성 간 손상 보호 효과를 소실시켰습니다. 우리의 결과는 SPM 매개 자가포식이 ATG5 발현을 상향 조절하여 TAA 처리된 간에서 KC의 M1 분극을 억제하고 M2 분극을 촉진하여 간 손상을 완화한다는 것을 나타냅니다. 이 연구는 급성 간 손상의 예방을 위한 새로운 표적을 제시합니다.

Introduction

The liver plays a crucial role in metabolic elimination of most of the currently used drugs and many other foreign compounds, thereby making it one of the most viable target organs for toxicity (1). Thioacetamide (TAA), a classic hepatotoxin that is also a potent carcinogen and mutagen, induces oxidative stress and sterile inflammation, resulting in acute and chronic liver injury (2, 3). Despite an increased understanding of the pathophysiology of toxin-induced liver injury, the precise mechanism of hepatotoxicity remains unclear.

Liver sterile inflammation caused by the innate immune response of liver-resident macrophages (Kupffer cells, KCs) plays a major role in the pathogenesis of toxin-induced liver injury (4). KCs are resident and non-migratory phagocytes serving as sentinels for liver homeostasis (5). During hepatic sterile inflammation, activated KCs release inflammatory cytokines and chemokines and attract other inflammatory cells to foci of injured tissue leading to the inflammatory signal amplification (6).

Macrophages have different functional states with a pro-inflammatory M1 type and an anti-inflammatory M2 type. The M1 macrophage phenotype is controlled by STAT1 and IRF5, whereas STAT6, IRF4, and PPARγ regulate M2 macrophage polarization (7). Autophagy is a homeostatic degradative process that removes damaged organelles and turns over cytoplasmic constituents through lysosomal compartments in eukaryotic cells (8). Recent studies have demonstrated the regulatory role of autophagy in macrophages. In obesity-induced hepatic steatosis, impaired macrophage autophagy increases liver inflammation and injury from lipopolysaccharide (LPS) by promoting pro-inflammatory M1 macrophage polarization (9). An inverse relationship between autophagy induction and maturation of NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) inflammasomes in macrophages suggests another mechanism by which autophagy may influence macrophage activation (10).

Polyamines, such as putrescine, spermidine, and spermine (SPM), are aliphatic cations that interact with nucleic acids and proteins, functioning as modulators for cell growth, cell differentiation, and synthesis of DNA, RNA, and proteins (11). Polyamines are catabolized by back-conversion through acetylation and oxidation mediated by spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SSAT) and N′-acetylpolyamine oxidase (APAO), respectively, or oxidation of SPM by SPM oxidase (SMO) (12). Dysregulation of polyamine metabolism is frequently associated with cancer and other hyperproliferative diseases (13). Several previous studies have demonstrated that polyamines protect against liver injury induced by drugs such as carbon tetrachloride and ethanol (14, 15). A recent study found that oral administration of polyamines ameliorates liver ischemia/reperfusion injury and promotes liver regeneration in rats. However, the mechanism by which polyamines protect against liver injury remains obscure.

Evidence is accumulating that polyamines are novel autophagy inducers and longevity elixirs (16). SPM increases autophagy by directly binding to p53 and p21 promoters (17). Furthermore, SPM ameliorates ischemia/reperfusion injury in cardiomyocytes via regulation of autophagy (18). Polyamines also function as anti-inflammatory factors through inhibition of pro-inflammatory cytokines and chemokine synthesis (19–21). In macrophages, basal polyamine levels are low and increase upon IL-4 or IL-13 stimulation, indicating that polyamines may regulate macrophage function (22).

Given the findings mentioned above, we explored the role of SPM in regulating liver injury and inflammation/immune activation in a TAA-treated mouse model with a focus on KC autophagy and polarization.

소개

간은

현재 사용되는 대부분의 약물과 많은 다른 외인성 화합물의 대사 제거에 중요한 역할을 하며,

이로 인해 독성의 주요 표적 장기 중 하나로 꼽힙니다

(1). 티오아세타미드 (TAA)는 강력한 발암물질이자

돌연변이 유발물질인 고전적인 간독성 물질로,

산화 스트레스와 무균성 염증을 유발하여 급성 및 만성 간 손상을 초래합니다 (2, 3).

독소 유발 간 손상의 병리생리학에 대한 이해가 증가했음에도 불구하고,

간 독성의 정확한 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다.

간 내재성 대식세포(쿠프퍼 세포, KCs)의 선천성 면역 반응으로 인한 무균성 염증은

독소 유발 간 손상의 병리학에서 주요 역할을 합니다(4).

KCs는

간 항상성을 유지하는 감시자 역할을 하는

거주성 비이동성 식세포입니다(5).

간 무균성 염증 동안 활성화된 KCs는

염증성 사이토킨과 케모카인을 분비하고 손상된 조직 부위로

다른 염증 세포를 유인하여 염증 신호 증폭을 유발합니다(6).

대식세포는

염증 촉진형 M1 유형과 염증 억제형 M2 유형의 서로 다른 기능적 상태를 가집니다.

M1 대식세포의 표현형은 STAT1과 IRF5에 의해 제어되는 반면,

STAT6, IRF4 및 PPARγ는 M2 대식세포의 분화를 조절합니다 (7).

자가포식은

손상된 세포 기관을 제거하고

진핵 세포의 리소좀 구획을 통해

세포질 성분을 전환하는 항상성 분해 과정입니다 (8).

최근의 연구에서는

대식세포에서 자가포식의 조절 역할이 입증되었습니다.

비만으로 인한 간 지방증에서,

대식세포의 자가포식 장애는

전염성 염증 반응을 유발하는 M1형 대식세포의 분화를 촉진하여

지질 다당류(LPS)에 의한 간 염증 및 손상을 증가시킵니다 (9).

대식세포에서 NLRP3 (NLR family pyrin domain containing 3) 인플람소좀의 분화와

자가포식 유도 사이의 역상관 관계는

자가포식이 대식세포의 활성화에 영향을 미치는

또 다른 메커니즘을 시사합니다 (10).

폴리아민(putrescine, spermidine, spermine, SPM)은

핵산과 단백질과 상호작용하는 알리파틱 양이온으로,

세포 성장, 분화, DNA, RNA, 단백질 합성의 조절자로

기능합니다(11).

폴리아민은

스퍼미딘/스퍼민 N1-아세틸트랜스퍼레이즈(SSAT)에 의해

아세틸화 및 산화, 또는 SPM 산화효소(SMO)에 의한

SPM의 산화를 통해 역전환으로 분해됩니다(12).

폴리아민 대사 장애는

암 및 기타 과증식성 질환과 자주 연관됩니다(13).

이전 연구들은

폴리아민이 탄소 테트라클로라이드와 에탄올과 같은 약물로 유발된

간 손상을 보호한다는 것을 보여주었습니다(14, 15).

최근 연구에서는 폴리아민의 경구 투여가 쥐의 간 허혈/재관류 손상을 완화하고

간 재생 촉진 효과를 나타냈습니다.

그러나

폴리아민이 간 손상을 보호하는 메커니즘은

여전히 명확하지 않습니다.

폴리아민이

새로운 자가포식 유도제 및 장수 엘릭서라는 증거가 축적되고 있습니다 (16).

SPM은

p53 및 p21 프로모터에 직접 결합하여

자가포식을 증가시킵니다 (17).

또한 SPM은 자가포식 조절을 통해

심근세포의 허혈/재관류 손상을 개선합니다 (18).

폴리아민은

또한 전염증성 사이토카인과 케모카인 합성을 억제하여

항염증 인자로 기능합니다 (19–21).

대식세포에서 기저 폴리아민 수치는 낮지만

IL-4 또는 IL-13 자극에 따라 증가하며,

이는 폴리아민이 대식세포 기능을 조절할 수 있음을 나타냅니다 (22).

위에서 언급한 연구 결과를 바탕으로,

KC 자가포식 및 분극화에 초점을 두고

TAA 처리 마우스 모델에서

SPM이 간 손상 및 염증/면역 활성화 조절에 미치는 역할을 조사했습니다.

Materials and MethodsAnimals

Eight-week-old male mice (C57BL/6J; the Laboratory Animal Resources Center of Nanjing Medical University, China) were house in constant environmental conditions under a standard rodent diet and water. All animals received humane care and all animal procedures met the relevant legal and ethical requirements according to a protocol (number NMU08-092) approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Nanjing Medical University.

TAA-Induced Acute Liver Injury

After 1-week of acclimatization, the mice were intraperitoneally injected with a dose of 500 mg/kg TAA (Sigma, Saint Louis, MO, USA) dissolved in PBS. Normal control mice received the same volume of PBS via intraperitoneal injection. For SPM (Sigma, Saint Louis, MO, USA) supplementation studies, separate group of mice received intraperitoneal administration of SPM dissolved in PBS (10 mg/kg, twice daily, for 3 days) prior to TAA administration. The mice were divided into four groups: CON group, SPM group, TAA group, and TAA + SPM group (n = 6/group). The mice that received TAA administration alone were randomly sacrificed after 0, 6, 12, 24, and 48 h, six mice were sacrificed at each time point. Other groups were sacrificed at 24 h after TAA treatment. In some experiments, mice were pretreated with chloroquine (CQ, 60 mg/kg, i.p.) for 1 h prior to TAA administration. Serum and liver samples were collected. Tissues were stored continuously in liquid N2. Sections from the dissected livers were also fixed in 10% neutral buffered formalin for histological analysis.