Re: '스퍼미딘' gut skin axis 건선 등 피부질환 치료 탐구!!! 2021 네이처!!

[문형철]

1. nature  
2. communications biology  
3. articles  
4. article

Spermidine-induced recovery of human dermal structure and barrier function by skin microbiome

Download PDF

• Article
• Open access
• Published: 19 February 2021

Spermidine-induced recovery of human dermal structure and barrier function by skin microbiome

• Gihyeon Kim, 
• Misun Kim, 
• Minji Kim, 
• Changho Park, 
• Youngmin Yoon, 
• Doo-Hyeon Lim, 
• Hyeonju Yeo, 
• Seunghyun Kang, 
• Yeong-Geun Lee, 
• Nam-In Beak, 
• Jongsung Lee, 
• Sujeong Kim, 
• Jee Young Kwon, 
• Won Woo Choi, 
• Charles Lee, 
• Kyoung Wan Yoon, 
• Hansoo Park & 
• Dong-Geol Lee 

Communications Biology volume 4, Article number: 231 (2021) Cite this article

•  
•  
•  

Abstract

An unbalanced microbial ecosystem on the human skin is closely related to skin diseases and has been associated with inflammation and immune responses. However, little is known about the role of the skin microbiome on skin aging. Here, we report that the Streptococcus species improved the skin structure and barrier function, thereby contributing to anti-aging. Metagenomic analyses showed the abundance of Streptococcus in younger individuals or those having more elastic skin. Particularly, we isolated Streptococcus pneumoniae, Streptococcus infantis, and Streptococcus thermophilus from face of young individuals. Treatment with secretions of S. pneumoniae and S. infantis induced the expression‎ of genes associated with the formation of skin structure and the skin barrier function in human skin cells. The application of culture supernatant including Streptococcal secretions on human skin showed marked improvements on skin phenotypes such as elasticity, hydration, and desquamation. Gene Ontology analysis revealed overlaps in spermidine biosynthetic and glycogen biosynthetic processes. Streptococcus-secreted spermidine contributed to the recovery of skin structure and barrier function through the upregulation of collagen and lipid synthesis in aged cells. Overall, our data suggest the role of skin microbiome into anti-aging and clinical applications.

초록

인간 피부 표면의 미생물 생태계 불균형은

피부 질환과 밀접하게 연관되어 있으며

염증 및 면역 반응과 관련이 있습니다.

그러나

피부 미생물군이 피부 노화에 미치는 역할에 대해 알려진 바는 많지 않습니다.

본 연구에서는

Streptococcus 종이 피부 구조와 장벽 기능을 개선하여

항노화 효과를 나타냈음을 보고합니다.

메타게놈 분석 결과,

젊은 개인이나 피부 탄력이 높은 개인에서 Streptococcus의 풍부함이 관찰되었습니다.

특히, 젊은 개인의 얼굴에서

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus infantis, 및 Streptococcus thermophilus를

분리했습니다.

S. pneumoniae와 S. infantis의 분비물로 처리한 결과,

인간 피부 세포에서 피부 구조 형성과 피부 장벽 기능과 관련된

유전자 발현이 유도되었습니다.

Streptococcus 분비물을 포함한 배양 상청액을 인간 피부에 적용한 결과,

탄력, 수분 함량, 각질 탈락 등 피부 형질에 현저한 개선이 관찰되었습니다.

유전자 기능 분류 분석은

스페르미딘 생합성 과정과 글리코겐 생합성 과정 간의 중복을 보여주었습니다.

Streptococcus가 분비한 스페르미딘은

노화된 세포에서 콜라겐과 지질 합성을 증가시켜 피부 구조와 장벽 기능 회복에 기여했습니다.

전체적으로, 본 연구 결과는

피부 미생물군이 항노화 및 임상 응용에 미치는 역할을 시사합니다.

Similar content being viewed by others

Senomorphic activity of a combination of niacinamide and hyaluronic acid: correlation with clinical improvement of skin aging

Article Open access15 July 2024

Life stage impact on the human skin ecosystem: lipids and the microbial community

Article Open access13 January 2025

Senotherapeutic peptide treatment reduces biological age and senescence burden in human skin models

Article Open access22 May 2023

Introduction

The human skin has a multi-layered structure composed of various cell types, fibers, lipids, and other components. It is the primary organ to protect the body from the external environment1. The skin surface maintains acidic, desiccated, and aerobic environments, whereas sebaceous follicles maintain an anaerobic and lipid-rich environment. Furthermore, the human skin is populated by various microorganisms including fungi, viruses, archaea, and bacteria, which feed on sebum, lipids, and keratin2. The most abundant microorganisms are bacteria, which produce several metabolites and affect the proliferation and immune responses of the skin3,4,5. Numerous non-pathogenic bacteria living on the skin have been studied through culture isolation methods, and their characteristics have been identified by molecular analysis. Recently, high-throughput deep sequencing of the bacterial 16S ribosomal RNA (rRNA) has enabled researchers to analyze the skin microbiome (skin microbiome means bacteria living on the skin or genomic information of them)3,6 and to investigate the link between skin health and the skin microbiome. Many studies revealed that the marked changes in the skin microbiome can alter skin conditions and cause diseases such as acne, psoriasis, and atopic dermatitis7,8,9.

소개

인간 피부는

다양한 세포 유형, 섬유, 지질 및 기타 구성 요소로 구성된

다층 구조를 가지고 있습니다.

이는 외부 환경으로부터

신체를 보호하는 주요 기관입니다1.

피부 표면은

산성, 건조, 산소 풍부한 환경을 유지하는 반면,

피지선은 무산소 및 지질 풍부한 환경을 유지합니다.

또한 인간 피부는 곰팡이, 바이러스, 고세균, 세균 등

다양한 미생물로 구성되어 있으며,

이들은 피지, 지질, 케라틴을 영양원으로 삼아 생존합니다2.

가장 풍부한 미생물은 세균으로,

다양한 대사물을 생성하며 피부의 증식 및 면역 반응에 영향을 미칩니다3,4,5.

피부에 서식하는 수많은 비병원성 세균은

배양 분리 방법을 통해 연구되어 왔으며,

분자 분석을 통해 그 특성이 규명되었습니다.

최근 세균의 16S 리보솜 RNA (rRNA)에 대한 고효율 심층 시퀀싱 기술은

연구자들이 피부 미생물군집 (피부 미생물군집은 피부 표면에 서식하는 세균이나 그 유전적 정보)3,6을 분석하고

피부 건강과 피부 미생물군집 간의 연관성을 조사하는 것을 가능하게 했습니다.

많은 연구에서 피부 미생물 군집의 현저한 변화가

피부 상태를 변화시키고 여드름, 건선, 아토피 피부염과 같은

질병을 유발할 수 있다는 것이 밝혀졌습니다7,8,9.

Skin aging is caused by a combination of intrinsic factors, such as changes in hormones, cellular metabolism, and immune responses, and external factors, such as exposure to pollutants and ultraviolet rays9,10,11,12. They induce major physiological and physical changes in the skin, such as sagging, wrinkles, dryness, and low elasticity10. Changes in the lipid composition, sebaceous secretion, pH, and hydration of the skin during aging can alter the skin microbiome composition which is colonized at birth13,14,15,16,17,18,19.

The effects of the gut microbiome on skin health were also reported. The absorption of probiotics through the intestinal tract has been shown to improve skin health, known as gut–skin axis20,21. However, these studies have only looked at the indirect role of the microbiome in improving skin conditions; direct evidence on the impact of the skin microbiome on skin health should be eval‎uated.

Here, we sought to investigate the direct link between skin health and skin microbiome in terms of aging. We designed a stepwise study to identify the components of the skin microbiome and their roles in controlling skin conditions. We observed that Streptococcus colonies are enriched in the facial skin of young Korean women (20–29 years old) and demonstrated their roles in the improvement of skin health through metagenomic analysis, in vitro assays using human skin cells, clinical analysis, and genomic analysis with validations (metabolic and cellular analyses). Our findings suggest the potential of the Streptococcus species to rejuvenate aged skin, thereby providing insights on the possible applications of the skin microbiome in clinical practice.

피부 노화는

호르몬 변화, 세포 대사, 면역 반응과 같은 내인성 요인과

오염물질 노출, 자외선 노출과 같은외인성 요인의 복합적인 작용으로

발생합니다9,10,11,12.

이러한 요인들은

피부에서 주름, 탄력 감소, 건조함, 처짐 등

주요 생리적 및 물리적 변화를 유발합니다10.

노화 과정에서 피부의 지질 구성, 피지 분비, pH, 수분 함량 변화는

출생 시부터 정착된 피부 미생물군집의 구성을

변화시킬 수 있습니다13,14,15,16,17,18,19.

장 미생물군집이

피부 건강에 미치는 영향도 보고되었습니다.

장을 통해 프로바이오틱스가 흡수되는 것이

피부 건강을 개선한다는 것이 밝혀졌으며,

이는 장-피부 축(gut–skin axis)으로 알려져 있습니다20,21.

성인 장에는 주로 하부 장에 거주하며 인간 숙주와 공생 관계를 유지하는 다양한 세균 종들이 존재합니다. 본 리뷰에서는 장-피부 축의 주요 조절자 중 하나로서 장 미생물이 피부와 어떻게 소통하는지에 대한 최신 연구 성과를 소개합니다. 우리는 이 잠재적 연결이 피부 분화 및 각질화 과정에 미치는 영향, 다양한 질환에서 피부 면역 반응 조절에 미치는 영향, 그리고 이 소통을 활용하여 다양한 피부 질환 관리에 적용하는 방법을 탐구했습니다.

그러나 이러한 연구들은

미생물군집이 피부 상태 개선에 미치는 간접적인 역할만을 살펴보았으며,

피부 미생물군집이 피부 건강에 미치는 직접적인 영향에 대한 증거는

평가되어야 합니다.

본 연구에서는

노화 측면에서 피부 건강과 피부 미생물군집 간의 직접적인 연관성을 조사하기 위해

단계별 연구를 설계했습니다.

피부 미생물군집의 구성 요소와 피부 상태 조절에 미치는 역할을 식별하기 위해

단계별 연구를 진행했습니다.

우리는 젊은 한국 여성(20–29세)의 얼굴 피부에서

Streptococcus 콜로니가 풍부하게 존재함을 관찰했으며,

메타게놈 분석, 인간 피부 세포를 사용한 체외 실험, 임상 분석, 유전체 분석(대사 및 세포 분석)을 통해

그 역할을 입증했습니다.

우리의 결과는

Streptococcus 종이 노화된 피부를 재생시키는 잠재력을 시사하며,

피부 미생물군이 임상 실무에 적용될 수 있는 가능성에 대한 통찰을 제공합니다.

Results

Metagenomic profiling reveals specific microbes related to facial skin aging

To examine the relationship between age and facial skin microbiome, we enrolled 52 healthy Korean women participants (Supplementary Table 1). They were divided into two groups: old (40–53 years old) and young (20–29 years old). The age limit was set to 54 years old to minimize age-related changes in sebum, moisture, and cell proliferation, which could lead to microbial bias due to marked alterations in skin microbiome14.

We first identified and quantified the overall facial microbial composition in relation to age as described previously16,17 through 16S rRNA sequencing. At the genus level, only Streptococcus were more abundant in the young group compared with the old (Fig. 1a, b), and no significant differences were observed for other genera (Supplementary Fig. 2b). In particular, Streptococcus infantis (S. infantis) was significantly enriched, as well as some unclassified species of Streptococcus but to a lesser extent (Fig. 1c). The five most abundant phyla were present in both the young and old groups (Supplementary Fig. 1). The lack of age-related stratification was confirmed by microbial compositional distance measurements (Supplementary Fig. 2a). Based on the metagenomic analysis, we hypothesized that S. infantis or some other unclassified Streptococcus species could be closely related to facial skin aging.

메타게놈 프로파일링은

얼굴 피부 노화와 관련된 특정 미생물을 밝혀냈습니다

연령과 얼굴 피부 미생물군집의 관계를 조사하기 위해

건강한 한국 여성 참가자 52명을 모집했습니다(보충 표 1).

참가자는 두 그룹으로 나뉘었습니다:

노인 그룹(40–53세)과 젊은 그룹(20–29세).

연령 제한을 54세로 설정한 이유는

피지, 수분, 세포 증식 등 연령 관련 변화가 미생물군집에 편향을 초래할 수 있기 때문입니다14.

우리는 이전 연구16,17에서 설명된 방법과 동일하게

16S rRNA 시퀀싱을 통해

연령에 따른 전체 얼굴 미생물 구성의 식별 및 정량화를 수행했습니다.

속 수준에서

젊은 그룹에서 노년 그룹에 비해 Streptococcus가 더 풍부했으며(그림 1a, b),

다른 속에서는 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다(보완 그림 2b).

특히 Streptococcus infantis (S. infantis)가 유의미하게 풍부했으며,

Streptococcus 속의 일부 분류되지 않은 종도 덜 풍부하게 존재했습니다(그림 1c).

가장 풍부한 5개 문은

젊은 그룹과 노인 그룹 모두에서 존재했습니다(보조 그림 1).

연령별 분할이 없음을

미생물 구성 거리 측정으로 확인했습니다(보조 그림 2a).

메타게놈 분석 결과를 바탕으로,

S. infantis 또는 일부 분류되지 않은 Streptococcus 종이

얼굴 피부 노화와 밀접하게 관련될 수 있다고 가설을 세웠습니다.

Fig. 1: Streptococcus species are the potential to anti-aging of skin.

a Relative abundance (RA) of facial skin microbiome at the genus level including some clinical information. The top 10 most abundant genera are presented. Violin plot and boxplot show the RA of each skin microbiome with the columns sorted by age. b Boxplot illustrating the RA of the Streptococcus genus in old (n = 26) and young (n = 26) participants. c Taxonomic plot of LDA scores from LEfSe, illustrating the sequenced microbiome that differed significantly at least at the genus level between the old and young group (|LDA score| > 3.5); g, genus; s, species. d Boxplot illustrating the elasticity index of the old and young groups. Wilcoxon–Mann–Whitney test and Pearson correlation test were used for statistical analysis. e RA of Streptococcus versus normalized elasticity index of the old and young groups.

a 얼굴 피부 미생물군집의 속 수준 상대적 풍부도(RA) 및 일부 임상 정보. 상위 10개 가장 풍부한 속이 표시되었습니다. 바이올린 플롯과 박스플롯은 연령별로 정렬된 각 피부 미생물군집의 RA를 보여줍니다. 

b 노년(n = 26) 및 젊은(n = 26) 참가자의 Streptococcus 속 상대적 풍부도(RA)를 보여주는 박스플롯. 

c LEfSe의 LDA 점수 분류도. 노인 그룹과 젊은 그룹 간에 속 수준에서 유의미하게 차이가 난 미생물군집을 표시함 (|LDA 점수| > 3.5); g, 속; s, 종. 

d 노인 그룹과 젊은 그룹의 탄성 지수 박스플롯. 통계 분석에는 Wilcoxon–Mann–Whitney 검정과 피어슨 상관 분석이 사용되었습니다. 

e Streptococcus의 RA와 노인 및 젊은 그룹의 표준화 탄성 지수 간의 관계.

Abundance of Streptococcus is associated with facial biophysical properties

To confirm‎ Streptococcus as a potential major microbe that determines skin aging, we eval‎uated the biophysical properties of the skin. Because elasticity is an important indicator of facial skin condition and is associated with aging22, we investigated the abundance of Streptococcus in participants with varying facial elasticity. After measuring elasticity from 0 to 1, we split the elasticity index into low (0–0.3), normal (0.4–0.6), and high (0.7–1). Most of the participants with high elasticity belonged to the young group (Fig. 1d). After plotting the relative abundances of Streptococcus against the elasticity-to-age ratio, we obtained a positive correlation as seen in Fig. 1e. The microbial compositional distances did not differ significantly in participants with low or high elasticity (Supplementary Fig. 3a). However, consistent with the age-metagenomic profiling results, Streptococcus and S. infantis were significantly more abundant in the high-elasticity group than in the low-elasticity group (Supplementary Fig. 3b). A comparison of other variables, such as skin appearance and skin moisture, revealed no dependence with microbial distances (Supplementary Fig. 4a, c, respectively). Specifically, Streptococcus and S. infantis were abundant in participants with clear skin surfaces based on appearance (Supplementary Fig. 4b). However, skin moisture did not seem to have a part (Supplementary Fig. 4d). These results indicate the potential of Streptococcus to improve facial skin elasticity.

Streptococcus의 풍부도는 얼굴 생리적 특성과 연관되어 있습니다

Streptococcus가

피부 노화를 결정하는 주요 미생물 중 하나임을 확인하기 위해

피부 생리적 특성을 평가했습니다.

탄력성은

얼굴 피부 상태의 중요한 지표이며 노화와 연관되어 있습니다22.

따라서

다양한 얼굴 탄력성을 가진 참가자의 Streptococcus 풍부도를 조사했습니다.

탄력성을 0에서 1로 측정 후 탄력성 지수를 저탄력(0–0.3), 정상(0.4–0.6), 고탄력(0.7–1)로 분류했습니다. 고탄력성 참가자의 대부분은 젊은 그룹에 속했습니다(그림 1d). Streptococcus의 상대적 풍부도를 탄력성-연령 비율에 대해 플로팅한 결과, 그림 1e에서 볼 수 있듯이 양의 상관관계가 관찰되었습니다. 탄성도가 낮은 그룹과 높은 그룹 간의 미생물 구성 거리는 유의미한 차이를 보이지 않았습니다(보조 그림 3a). 그러나 연령 메타게놈 프로파일링 결과와 일치하게, Streptococcus와 S. infantis는 탄성도가 높은 그룹에서 탄성도가 낮은 그룹보다 유의미하게 더 풍부했습니다(보조 그림 3b). 피부 외관과 피부 수분과 같은 다른 변수와의 비교 결과, 미생물 거리와의 의존성이 관찰되지 않았습니다(보조 그림 4a, c 각각).

구체적으로,

Streptococcus와 S. infantis는 외관상 피부 표면이 깨끗한 참가자에서 풍부했습니다(보조 그림 4b).

그러나

피부 수분은 영향을 미치지 않는 것으로 보였습니다(보조 그림 4d).

이 결과는

Streptococcus가

얼굴 피부 탄력 개선에 잠재적 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

Streptococcal secretions upregulated genes related to skin structure and barrier

A previous study revealed that a pyrimidine compound from a bacterial strain, EPI-7T, had an anti-aging effect on human dermal fibroblasts (HDFs)23. Therefore, we hypothesized that the abundant Streptococcus facial colonies could secrete compounds related to skin aging. First, we isolated Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Streptococcus infantis (S. infantis 1), the other of Streptococcus infantis (S. infantis 2), and Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) from the facial skin of young female participants. To demonstrate the functional roles of the secretions from Streptococcus, we treated primary HDFs and human epidermal keratinocytes (HEKs) with the supernatant derived from the Streptococcus culture (St solution) from the said four strains24,25. Prior to the analysis, we ensured that all four St solutions were not toxic to the two cell types (Supplementary Fig. 5a), whereas St solutions could encourage the proliferation of skin cells (Supplementary Fig. 5b). We then treated HDFs and HEKs with up to 10% of the St solution in growth medium to determine the optimal concentration for subsequent experiments (Supplementary Fig. 5d), and 10% was chosen as the optimal dose.

Streptococcus 분비물이 피부 구조 및 barrier 관련 유전자 발현을 증가시켰습니다

이전 연구에서 세균 균주 EPI-7T에서 유래한 피리미딘 화합물이 인간 피부 섬유아세포(HDFs)에 항노화 효과를 나타냈습니다(23). 따라서 우리는 풍부한 Streptococcus 얼굴 식민지가 피부 노화와 관련된 화합물을 분비할 수 있다고 가설을 세웠습니다. 먼저, 젊은 여성 참가자의 얼굴 피부에서 Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Streptococcus infantis (S. infantis 1), 다른 Streptococcus infantis 균주 (S. infantis 2), 및 Streptococcus thermophilus (S. thermophilus)를 분리했습니다. Streptococcus의 분비물의 기능적 역할을 입증하기 위해, 우리는 Streptococcus 배양액(St 용액)에서 추출한 상층액을 4가지 균주에서 얻은 Streptococcus 배양액(St 용액)에서 추출한 상층액으로 처리한 원시 HDFs와 인간 표피 각질세포(HEKs)를 처리했습니다24,25. 분석 전, 모든 4가지 St 용액이 두 세포 유형에 독성이 없음을 확인했습니다(보조 그림 5a),

반면

St 용액은

피부 세포의 증식을 촉진했습니다(보조 그림 5b).

이후 HDF와 HEK에 성장 매체에 최대 10%의 St 용액을 처리하여 후속 실험을 위한 최적 농도를 결정했습니다(보조 그림 5d), 10%가 최적 용량으로 선택되었습니다.

To assess the effects of the St solutions on skin aging, we analyzed the expression‎ levels of genes involved in the dermis structure. The solutions from S. pneumoniae and S. infantis significantly increased the expressions of collagen type I alpha 1 chain (COL1A1) and collagen type III alpha 1 chain (COL3A1) (Fig. 2a), which are two major components of the extracellular matrix. The major dermal elastic-fiber genes, elastin (ELN) and fibrillin 1 (FBN1) were also considerably induced by the St solutions in HDFs (Fig. 2b). S. pneumoniae culture medium exhibited the most potent effect on skin structural components. Multi-dimensional model of the skin layer also showed a thicker epidermal layer after St solution treatment in Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C)-induced damaged skin model26 (Fig. 2e, f). Additionally, treatment with the St solutions increased the expression‎ levels of desmocollin 2 (DSC2) and filaggrin (FLG), which are responsible for skin barrier function (Fig. 2c). A similar trend was observed for glucosylceramidase beta (GBA) and ATP-binding cassette subfamily A member 12 (ABCA12), which enable the syntheses of lamellar body and ceramide to form the lipid barrier (Fig. 2d). Next, we eval‎uated the effect of the St solutions on skin lipid synthesis and the consequent maintenance of a healthy barrier in HEKs. The solutions from S. pneumoniae, S. infantis 1, and S. infantis 2 increased lipid accumulation, and this was confirmed by the gene expression‎ profiles for lipid synthesis, which involved DSC2, FLG, GBA, and ABCA12 (Fig. 2g, h). The beneficial outcomes were not obtained following treatment with S. thermophilus and other skin microbiome culture medium (Supplementary Fig. 5c, e).

피부 노화에 대한 St 용액의 영향을 평가하기 위해 진피 구조와 관련된 유전자 발현 수준을 분석했습니다. S. pneumoniae와 S. infantis에서 유래한 용액은 진피의 주요 구성 요소인 콜라겐 유형 I 알파 1 사슬(COL1A1)과 콜라겐 유형 III 알파 1 사슬(COL3A1)의 발현 수준을 유의미하게 증가시켰습니다(그림 2a). 주요 진피 탄성 섬유 유전자인 엘라스틴(ELN)과 피브리린 1(FBN1)도 HDF에서 St 용액에 의해 크게 유도되었습니다(그림 2b). S. pneumoniae 배양액은 피부 구조 성분에 대한 가장 강력한 효과를 나타냈습니다. 피부 층의 다차원 모델에서도 Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C)로 손상된 피부 모델에서 St 용액 처리 후 표피 층이 두꺼워진 것이 관찰되었습니다26 (그림 2e, f). 또한 St 용액 처리 후 피부 장벽 기능에 관여하는 데스모콜린 2(DSC2)와 필라그린(FLG)의 발현 수준이 증가했습니다(그림 2c). 글루코실세라마이드아제 베타(GBA)와 ATP 결합 캐스케이드 서브패밀리 A 멤버 12(ABCA12)에서도 유사한 경향이 관찰되었으며, 이 두 단백질은 층상체와 세라마이드의 합성을 촉진하여 지질 장벽 형성에 기여합니다(그림 2d). 다음으로, HEK 세포에서 St 용액이 피부 지질 합성에 미치는 영향 및 건강한 장벽 유지에 대한 효과를 평가했습니다. S. pneumoniae, S. infantis 1, 및 S. infantis 2에서 추출한 용액은 지질 축적을 증가시켰으며, 이는 DSC2, FLG, GBA, 및 ABCA12와 관련된 지질 합성 유전자 발현 프로파일로 확인되었습니다(그림 2g, h). S. thermophilus 및 기타 피부 미생물군 배양액으로 처리한 경우 유익한 결과는 관찰되지 않았습니다(보충 그림 5c, e).

Fig. 2: Streptococcus growth media improve skin cells with various phenotypes.

a–d Relative mRNA expression‎ levels of a, collagen-associated genes important for elasticity in HDFs. b Elastic-fiber–associated genes in HDFs, c tight-junction–associated genes important for skin barrier function and moisture in HEKs, and d lipid barrier-associated genes in HEKs. HDFs human dermal fibroblast, HEKs human epithelial keratinocytes. Expression‎ values are relative to control cells and represent the mean ± S.E. Three technical replicates were done. COL1A1 collagen type l alpha 1 chain, COL3A1 collagen type lll alpha 1 chain, ELN elastin, FBN1 fibrillin 1, DSC2 desmocollin 2, FLG filaggrin, GBA glucosylceramidase beta, ABCA12 ATP-binding cassette subfamily A member 12. e Micrographs of a skin cell layer in the control and after treatment with Poly I:C, Poly I:C and supernatant of S. pneumoniae, Poly I:C and supernatant of S. infantis 1, and Poly I:C and supernatant of S. infantis 2. 1 μg/mL of Poly I:C was used in each treatment. Arrow line indicates the thickness of the epidermal layer. f Corresponding plot of the thickness of skin cell layer, n = 6. g Nile red staining of HEKs treated with different Streptococcus-cultured media. h Plot of area of lipid accumulations, n = 7. The Student’s two-tailed t-test was used to calculate statistical significance. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. ns non-significant. Scale bar corresponds to 100 μm. Control is a non-treated condition.

그림 2: Streptococcus 배양액이 다양한 표현형을 가진 피부 세포를 개선합니다.

a–d HDF에서 탄력성에 중요한 콜라겐 관련 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준. b HDF의 탄성 섬유 관련 유전자, c HEK에서 피부 장벽 기능과 수분 유지에 중요한 밀접 결합 관련 유전자, d HEK의 지질 장벽 관련 유전자. HDFs: 인간 피부 섬유아세포, HEKs: 인간 상피 각질세포. 발현 값은 대조군 세포 대비 상대적이며 평균 ± 표준 오차(S.E.)를 나타냅니다. 기술적 반복 실험을 3회 수행했습니다. COL1A1 콜라겐 유형 I 알파 1 사슬, COL3A1 콜라겐 유형 III 알파 1 사슬, ELN 엘라스틴, FBN1 피브리린 1, DSC2 데스모콜린 2, FLG 필라그린, GBA 글루코실세라마이드아제 베타, ABCA12 ATP 결합 캐스케이드 서브패밀리 A 멤버 12. e 대조군 및 Poly I:C, Poly I:C와 S. pneumoniae 배양 상청액, Poly I:C와 S. infantis 1 배양 상청액, Poly I:C와 S. infantis 2 배양 상청액으로 처리된 피부 세포층의 미세사진. 각 처리에는 1 μg/mL의 Poly I:C가 사용되었습니다. 화살표 선은 표피층의 두께를 나타냅니다. f 피부 세포층의 두께에 대한 대응 그래프, n = 6. g 다양한 Streptococcus 배양액으로 처리된 HEKs의 Nile red 염색. h 지질 축적 면적의 그래프, n = 7. 통계적 유의성은 Student의 양측 t-검정을 사용하여 계산되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. ns: 유의미하지 않음. 척도 바는 100 μm에 해당합니다. 대조군은 처리되지 않은 조건입니다.

Streptococcal secretions improved the physiology of human skin

To confirm‎ whether Streptococcal secretions are clinically effective on human skin, we applied the St solutions on both cheeks of healthy female participants who do not have any skin disease (Fig. 3a and Supplementary Table 2). Phenotype changes were measured on cheeks applied with the control solution and 30% St solution (10% S. pneumoniae, 10% S. infantis 1, and 10% S. infantis 2) at day 0 (day of application) and 28 days after application. After 28 days, significant improvements in various skin phenotypes were observed in cheeks treated with the St solution. Consistent with the increased expressions in the collagen and elastin genes of our in vitro assay, skin elasticity increased significantly from 0.60 ± 0.07 to 0.67 ± 0.07 (mean ± standard deviation; difference 0.06 ± 0.04 or 12.1%; Fig. 3b left), and the extent of which was significantly higher than those in control (Fig. 3b, right), which changed from 0.601 ± 0.07 to 0.61 ± 0.07 (difference 0.01 ± 0.03; Supplementary Fig. 6a). Skin elasticity was maintained at baseline values during the test period in the control-treated cheek. The effectiveness of the St solution on skin moisturization was confirmed by measuring trans-epidermal water loss (TEWL) and horny layer moisture content. TEWL indicates the moisturizing ability and skin barrier function14,27. In the St solution-treated cheeks, the TEWL score declined from 19.90 ± 4.23 to 17.44 ± 3.88 g/h/m2 (difference −2.45 ± 3.30 or 11.3% reduction) after 28 days (Fig. 3c, left), whereas that in the control did not decrease significantly (difference –0.17 ± 2.82 or 0.21% reduction; Fig. 3c right and Supplementary Fig. 6b). Unsurprisingly, skin hydration in the St solution-treated group was significantly higher after 28 days (66.39 ± 7.73 A.U) compared with the baseline (52.40 ± 0.38 A.U; Fig. 3d left). Even though skin hydration was improved also with control solution, augmenting from 51.83 ± 8.75 A.U to 57.97 ± 7.68 A.U (Supplementary Fig. 6c), the improvement was lower than in the St solution-treated cheeks (Fig. 3d, right).

Streptococcus 분비물이 인간 피부 생리 기능을 개선했습니다

Streptococcus 분비물이

인간 피부에서 임상적으로 효과적인지 확인하기 위해,

피부 질환이 없는 건강한 여성 참가자의 양쪽 뺨에 St 용액을 적용했습니다(그림 3a 및 보충 표 2).

대조군 용액과 30% St 용액(10% S. pneumoniae, 10% S. infantis 1, 10% S. infantis 2)을 적용한 볼의 피부 표현형 변화를 적용일(날짜 0)과 적용 후 28일 후에 측정했습니다. 28일 후, St 용액을 적용한 볼에서 다양한 피부 형질의 유의미한 개선이 관찰되었습니다. 체외 실험에서 콜라겐과 엘라스틴 유전자 발현 증가와 일치하게, 피부 탄력성은 0.60 ± 0.07에서 0.67 ± 0.07(평균 ± 표준편차; 차이 0.06 ± 0.04 또는 12.1%; 그림 3b 왼쪽), 이는 대조군(그림 3b 오른쪽)의 0.601 ± 0.07에서 0.61 ± 0.07로 변화한 값보다 유의미하게 높았으며(차이 0.01 ± 0.03; 보충 그림 6a). 대조군 처리된 뺨에서는 시험 기간 동안 피부 탄력이 기저치 수준에서 유지되었습니다. St 용액의 피부 보습 효과는 경피 수분 손실(TEWL)과 각질층 수분 함량을 측정하여 확인되었습니다. TEWL은 보습 능력과 피부 장벽 기능을 나타냅니다14,27. St 용액 처리된 뺨에서 TEWL 점수는 28일 후 19.90 ± 4.23에서 17.44 ± 3.88 g/h/m2로 감소했습니다(차이 −2.45 ± 3.30 또는 11.3% 감소; 그림 3c, 왼쪽), 반면 대조군에서는 유의미한 감소가 관찰되지 않았습니다(차이 –0.17 ± 2.82 또는 0.21% 감소; 그림 3c 오른쪽 및 보충 그림 6b). 예상대로, St 용액 처리 그룹의 피부 수분 함량은 28일 후 기준치(52.40 ± 0.38 A.U)와 비교해 유의미하게 높았습니다(66.39 ± 7.73 A.U; 그림 3d 왼쪽). 대조 용액으로도 피부 수분 함량이 개선되었으며, 51.83 ± 8.75 A.U에서 57.97 ± 7.68 A.U로 증가했습니다(보조 그림 6c). 그러나 개선 정도는 St 용액 처리된 볼 부위보다 낮았습니다(그림 3d, 오른쪽).

Fig. 3: St solutions clinically improve skin phenotypes.

a Scheme of clinical eval‎uations. b–f Boxplots illustrating facial skin parameters on day 0 and day 28 after the application of the St emulsion (left plots), and in control versus St solution-treated individuals (right plots); n = 22 per group. b Elasticity, c TEWL, d moisture, e desquamation. f Direct observation (top) and comparison (bottom) of desquamation on the cheek surface in participants S01 and S05 on day 0 and day 28 of St solution treatment at ×20 magnification. Three technical observations were done. The white area is corneocyte. Scale bar corresponds to 500 μm. g Increase in relative abundances of unclassified Streptococcus and S. infantis on day 28 after application of St solution treatment. The statistical calculation for paired comparison was done using the Wilcoxon signed-rank test, whereas inter-comparison was done using the Wilcoxon–Mann–Whitney test. A.U arbitrary unit, DSC diffuse scattering correction, DI desquamation index.

그림 3: St 용액은 피부 표현형을 임상적으로 개선합니다.

a 임상 평가 체계. b–f St 에멀전 적용 후 0일차와 28일차의 얼굴 피부 파라미터를 보여주는 상자 그림(왼쪽 그림), 및 대조군 대비 St 용액 처리군(오른쪽 그림); n = 22명/그룹. b 탄력, c TEWL, d 수분, e 각질 탈락. f St 용액 치료 후 0일차와 28일차에 참가자 S01과 S05의 볼 표면에서 각질 탈락의 직접 관찰(상단)과 비교(하단)를 ×20 배율로 촬영한 사진. 기술적 관찰은 3회 수행되었습니다. 흰색 영역은 각질 세포입니다. 척도는 500 μm에 해당합니다. g St 용액 처리 후 28일째에 분류되지 않은 Streptococcus 및 S. infantis의 상대적 풍부도 증가. 쌍간 비교는 Wilcoxon 부호 순위 검정을, 그룹 간 비교는 Wilcoxon–Mann–Whitney 검정을 사용하여 통계적 계산이 수행되었습니다. A.U. 임의 단위, DSC 확산 산란 보정, DI 탈락 지수.

Full size image

These improvements in the moisture and lipid composition of the St solution-treated cheeks also led to lower desquamation, which normally increases in older individuals28,29. In the St solution-treated cheeks, the desquamation index (DI) was markedly lower after 28 days (12.08 ± 1.794) compared with the baseline (14.77 ± 0.82), corresponding to an 18.4% reduction (difference 2.69 ± 1.46) (Fig. 3e, left). This was confirmed by a reduction in the corneocyte area (Fig. 3f). Meanwhile, the DI of the control solution-treated cheeks decreased by only 9.7% (Supplementary Fig. 6d), which was lower than that in St solution-treated area (difference −1.45 ± 1.56; Fig. 3e, right) despite its significance.

After 28 days, brightness increased in the St solution-treated cheeks, from 72.95 ± 3.24 to 74.24 ± 3.08 (difference 1.784; Supplementary Fig. 6e, center), was greater than that in the control, from 73.24 ± 3.43 to 73.88 ± 3.06 (difference 0.909; Supplementary Fig. 6e, left and right). Skin transparency values were similarly better following the St solution treatment, as indicated by a 6.280% decrease (Supplementary Fig. 6f). We also observed increased abundances in the Streptococcus genus (unclassified) and S. infantis on the face after 28 days (Fig. 3g). These results altogether suggest that the St solution efficiently improved the structure- and barrier function-related skin physiological parameters. We conclusively suggest that age-related skin microbiome clinically improved the conditions of the multi-skin layer.

St 용액으로 처리한 뺨의 수분 및 지질 성분이 개선됨에 따라, 일반적으로 노년층에서 증가하는 각질 제거도 감소했습니다28,29. St 용액 처리된 뺨의 탈락 지수(DI)는 28일 후(12.08 ± 1.794) 기저치(14.77 ± 0.82)에 비해 현저히 낮았으며, 이는 18.4% 감소(차이 2.69 ± 1.46)에 해당합니다(그림 3e, 왼쪽). 이는 각질 세포 면적의 감소로 확인되었습니다(그림 3f). 한편, 대조 용액 처리된 뺨의 DI는 9.7% 감소(보조 그림 6d)했으며, 이는 St 용액 처리된 부위보다 낮았으나(차이 −1.45 ± 1.56; 그림 3e, 오른쪽) 통계적으로 유의미하지 않았습니다.

28일 후, St 용액 처리된 뺨의 밝기는 72.95 ± 3.24에서 74.24 ± 3.08로 증가했습니다(차이 1.784; 보충 그림 6e, 중앙)로 증가했으며, 대조군(73.24 ± 3.43에서 73.88 ± 3.06; 차이 0.909; 보충 그림 6e, 좌우)보다 높았습니다. 피부 투명도 값도 St 용액 처리 후 유사하게 개선되었으며, 6.280% 감소(보충 그림 6f)로 나타났습니다. 28일 후 얼굴에서 Streptococcus 속(미분류)과 S. infantis의 풍부도가 증가했습니다(그림 3g). 이러한 결과는 St 용액이 피부 구조 및 장벽 기능과 관련된 생리적 매개변수를 효과적으로 개선했음을 시사합니다. 우리는 연령 관련 피부 미생물군이 다층 피부층의 상태를 임상적으로 개선했음을 결론지입니다.

Genomic characteristics and biological pathways are triggered by Streptococcus

To provide a better insight into the genomic and functional characteristics of Streptococcus, we analyzed their entire genomes. Consistent with the results of molecular and cellular level assays, S. infantis 1 and S. infantis 2 displayed the closest genomic distance, followed by S. pneumoniae, whereas S. thermophilus showed a low genomic similarity (Fig. 4a). We thus split them into two groups: S. pneumoniae, S. infantis 1, and S. infantis 2 in one; S. thermophilus in the other. We annotated the genomic fragments using whole-genome analysis, compared their cluster of orthologous groups (COGs) for selecting common genes (Supplementary Fig. 7a, b), and identified their functional roles (Fig. 4b). S. pneumoniae was enriched for the following gene ontology (GO) terms: maltodextrin transport, purine ribonucleotide interconversion, and glyceraldehyde-3-phosphate metabolic process; S. infantis 1, glyceraldehyde-3-phosphate metabolic process, purine ribonucleotide interconversion, and glycogen biosynthetic process; S. infantis 2, glyceraldehyde-3-phosphate metabolic process, polyol metabolic process, and alditol metabolic process; and S. thermophilus, histidine biosynthetic process, tricarboxylic acid metabolic process, and arginine biosynthetic process. To investigate the biological processes of Streptococcus candidates to human skin, we sought all common biosynthetic processes in S. pneumoniae, S. infantis 1, and S. infantis 2. The overlapping GO terms were the spermidine biosynthetic process and glycogen biosynthetic process.

Streptococcus에 의해 유발되는 유전체 특성 및 생물학적 경로

Streptococcus의 유전체 및 기능적 특성을 더 잘 이해하기 위해 전체 유전체를 분석했습니다. 분자 및 세포 수준 분석 결과와 일치하게, S. infantis 1과 S. infantis 2는 가장 가까운 유전체 거리를 보였으며, 그 다음으로 S. pneumoniae가 뒤를 이었고, S. thermophilus는 낮은 유전체 유사성을 나타냈습니다(그림 4a). 이에 따라 우리는 이를 두 그룹으로 나누었습니다: S. pneumoniae, S. infantis 1, 및 S. infantis 2를 한 그룹; S. thermophilus를 다른 그룹으로. 전체 유전체 분석을 통해 유전체 조각을 주석화하고, 공통 유전자를 선정하기 위해 클러스터 오рто로그 그룹(COGs)을 비교했으며(보충 그림 7a, b), 기능적 역할을 식별했습니다(그림 4b). S. pneumoniae는 다음과 같은 유전자 온톨로지(GO) 용어에서 풍부하게 나타났습니다: 말토덱스트린 운반, 푸린 리보뉴클레오티드 상호전환, 글리세알데히드-3-인산 대사 과정; S. infantis 1는 글리세랄데히드-3-인산 대사 과정, 푸린 리보뉴클레오티드 상호 변환, 글리코겐 생합성 과정; S. infantis 2는 글리세랄데히드-3-인산 대사 과정, 폴리올 대사 과정, 알디톨 대사 과정; S. thermophilus는 히스티딘 생합성 과정, 트리카르복실산 대사 과정, 아르기닌 생합성 과정에 풍부했습니다. 인간 피부와의 관련성을 조사하기 위해 Streptococcus 후보 균주의 생물학적 과정을 분석하기 위해 S. pneumoniae, S. infantis 1, 및 S. infantis 2에서 공통된 생합성 과정을 모두 검색했습니다. 중복된 GO 용어는 스페르미딘 생합성 과정과 글리코겐 생합성 과정이었습니다.

Fig. 4: Spermidine contributes to stronger facial skin structure and lipid barrier formation.

a Average nucleotide identity (ANI, %) among four Streptococcus candidates isolated from the face of young participants. b Gene Ontology (GO) terms for biological pathways of the genes from candidates with similar ANI scores. Enrichment network pathways were generated using Cytoscape software with ClueGO plug-in, and the overview terms are represented. The calculation for selecting the pathways used a two-sided hypergeometric test, and the false discovery rate was corrected using the Benjamini–Hochberg method. c Spermidine concentration in control medium and St solutions. d SA β-gal levels in normal, aged, and spermidine-treated aged cells. e Relative mRNA expression‎ levels of COL1A1 and COL3A1 in normal, aged, and spermidine-treated aged cells. f Relative mRNA expression‎ levels of ABCA12. g Nile red lipid staining of HEKs treated with spermidine. Scale bar corresponds to 50 μm. h SA β-gal levels in normal, UV-aged HDFs, and spermidine-treated aged cells. SA β-gal, senescence-associated β-galactosidase. i Relative mRNA expression‎ levels of COL1A1, ELN, and FBN1 in normal, UV-aged HDFs, and spermidine-treated aged cells. Three technical replicates were done. COL1A1, collagen type l alpha 1 chain; COL3A1, collagen type lll alpha 1 chain; ELN, elastin; FBN1, fibrillin 1; ABCA12, ATP-binding cassette subfamily A member 12. j Motif analysis of the regulatory element in spermidine-treated aged cells. Expression‎ values are relative to young or UV cells and represent the mean ± S.E. Student’s two-tailed t-test was used to calculate statistical significance.

그림 4: 스페르미딘은 얼굴 피부 구조 강화와 지질 장벽 형성에 기여합니다.

a 젊은 참가자의 얼굴에서 분리된 네 가지 Streptococcus 후보균 간의 평균 핵산 동일성(ANI, %)

b 유사한 ANI 점수를 가진 후보균의 유전자 생물학적 경로에 대한 GO 용어. 풍부도 네트워크 경로는 Cytoscape 소프트웨어와 ClueGO 플러그인을 사용하여 생성되었으며, 개요 용어가 표시되었습니다. 경로 선택을 위한 계산에는 양측 하이퍼기하 분포 검정이 사용되었으며, 거짓 발견률은 Benjamini–Hochberg 방법으로 교정되었습니다.

c 대조군 배지 및 St 용액의 스퍼미딘 농도.

d 정상, 노화, 및 스퍼미딘 처리 노화 세포의 SA β-gal 수준.

e 정상, 노화, 및 스퍼미딘 처리 노화 세포의 COL1A1 및 COL3A1 상대적 mRNA 발현 수준.

f ABCA12의 상대적 mRNA 발현 수준.

g 스퍼미딘 처리 HEKs의 Nile red 지질 염색. 척도 바는 50 μm에 해당합니다.

h 정상, UV 노화 HDF 및 스퍼미딘 처리 노화 세포에서의 SA β-갈 수준. SA β-갈, 노화 관련 β-갈락토시다아제.

i 정상, UV 노화 HDF 및 스퍼미딘 처리 노화 세포에서의 COL1A1, ELN 및 FBN1의 상대적 mRNA 발현 수준. 세 번의 기술적 반복이 수행되었습니다. COL1A1, 콜라겐 유형 I 알파 1 사슬; COL3A1, 콜라겐 유형 III 알파 1 사슬; ELN, 엘라스틴; FBN1, 피브리린 1; ABCA12, ATP 결합 캐스케이드 하위 가족 A 구성원 12.

j 스페르미딘 처리된 노화 세포의 조절 요소 모티프 분석. 발현 값은 젊은 세포 또는 자외선 처리 세포를 기준으로 하며 평균 ± 표준 오차(S.E.)를 나타냅니다. 통계적 유의성은 Student의 양측 t-검정을 사용하여 계산되었습니다.

Spermidine recovered reduced gene expressions in aged skin cells

We selected spermidine as a potential molecule contributing to skin improvements according to previous studies30,31,32. Spermidine biosynthetic process was also enriched in S. pneumoniae, S. infantis 1, and S. infantis 2. Prior to cell-based assays, we confirmed the existence of spermidine in the St solutions using mass picking and calibration curve. As expected, the concentration of spermidine was higher in St solutions from S. pneumoniae (635.3 μg/mL), S. infantis 1 (361.3 μg/mL), and S. infantis 2 (1026.9 μg/mL) compared to the media (3.3 μg/mL) (Fig. 4c and Supplementary Fig. 8). To investigate the role of spermidine in skin aging, we used aged cells (see Methods for details) and observed the molecular changes induced by spermidine. We confirmed that treatment with spermidine reduced the senescence-associated β-galactosidase (SA β-gal) in aged HDFs (Fig. 4d and Supplementary Fig. 9)33. Spermidine also increased the COL1A1 and COL3A1 levels compared with non-treated aged cells (Fig. 4e). Interestingly, the mRNA level of COL3A1 was higher than those of young cells. We found that spermidine induced lipid synthesis with increased mRNA levels of ABCA12 (Fig. 4f, g). We also observed similar outputs from the recovery of aging induced by UV which is a major external factor of skin aging34. UV-aged HDFs secreted greater levels of SA β-gal than the control (Fig. 4h). Further, UV-aged skin cells expressed lower levels of COL1A1, ELN, and FBN1 genes compared with control cells. Interestingly, spermidine recovered the reduced expressions of these genes (Fig. 4i). Furthermore, upon the examination of the regulatory sequences in promoters of genes upregulated upon spermidine treatment, one of the sequence motifs corresponded to the TWIST1 motif, suggesting that spermidine may act as a transcriptional activator (Fig. 4j). Additionally, we discovered that S. pneumoniae and S. infantis, the effective skin microbiome in this study, exhibited greater growth in presence of spermidine compared with the non-spermidine conditions, whereas S. thermophilus showed the opposite growth trend (Supplementary Fig. 10).

스퍼미딘은 노화된 피부 세포에서 감소된 유전자 발현을 회복시켰습니다

스퍼미딘을 선정했습니다.

스퍼미딘 생합성 과정은

S. pneumoniae, S. infantis 1, 및 S. infantis 2에서 풍부하게 관찰되었습니다.

세포 기반 실험 전에,

우리는 질량 분석과 교정 곡선을 사용하여 St 용액 내 스퍼미딘의 존재를 확인했습니다.

예상대로, S. pneumoniae (635.3 μg/mL), S. infantis 1 (361.3 μg/mL), 및 S. infantis 2 (1026.9 μg/mL)에서 추출한 St 용액의 스퍼미딘 농도는 매체 (3.3 μg/mL)보다 높았습니다 (그림 4c 및 보충 그림 8). 스페르미딘의 피부 노화 역할 조사 위해 노화 세포(방법 참조)를 사용해 스페르미딘에 의한 분자적 변화를 관찰했습니다.

스페르미딘 처리 시 노화 HDF에서

노화 관련 β-갈락토시다아제(SA β-gal)가 감소함을 확인했습니다(그림 4d 및 보충 그림 9)33.

스페르미딘은

비처리 노화 세포에 비해 COL1A1 및 COL3A1 수준을 증가시켰습니다(그림 4e).

흥미롭게도 COL3A1의 mRNA 수준은 젊은 세포보다 높았습니다.

스페르미딘은

ABCA12의 mRNA 수준 증가와 함께 지질 합성을 유도했습니다(그림 4f, g).

또한

피부 노화의 주요 외부 요인인 자외선(UV)에 의한

노화 회복에서도 유사한 결과를 관찰했습니다34.

UV 노화 HDF는

대조군보다 SA β-gal 분비량이 더 높았습니다(그림 4h).

또한

UV 노화 피부 세포는 대조군에 비해

COL1A1, ELN, 및 FBN1 유전자 발현 수준이 낮았습니다.

흥미롭게도

스페르미딘은 이러한 유전자의 감소된 발현을 회복시켰습니다(그림 4i).

또한 스페르미딘 처리 시

발현이 증가한 유전자들의 프로모터 내 조절 서열을 분석한 결과,

한 개의 서열 모티프가 TWIST1 모티프와 일치했으며,

이는 스페르미딘이 전사 활성화제로 작용할 수 있음을 시사합니다(그림 4j).

또한,

본 연구에서 효과적인 피부 미생물군으로 확인된 S. pneumoniae와 S. infantis는

스페르미딘 존재 시 비스페르미딘 조건에 비해 더 큰 성장세를 보였으며,

반면 S. thermophilus는 반대 성장 경향을 나타냈습니다(보충 그림 10).

Discussion

The facial skin microbiome formed at birth changes gradually with aging, and any imbalance in their composition is closely related to skin diseases, such as atopic dermatitis, psoriasis, and acne7,16,19,35,36. Staphylococcus aureus, Cutibacterium acnes, and Streptococcus pyogenes (group A Streptococcus) are examples of pathogenic bacteria related to acne and other infectious skin diseases37,38,39. Depending on age, the composition of the skin microbiome can be changed13,14,15. However, few papers investigated the role of the skin microbiome in the aging of skin35, so the effect of the specific microbiome on skin phenotype has remained largely unknown. Therefore, we conducted a stepwise analysis to determine the facial skin microbiome related to aging and to investigate their roles in skin aging.

Metagenomic analysis revealed specific differences in the facial skin microbiome of old and young participants. There were no differences of abundance among the top five most abundant phyla namely, Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Cyanobacteria, and Bacteroidetes. Our result contrasted with a previous report on fewer Actinobacteria and more Bacteroidetes in individuals older than 6017. This discrepancy could be explained by the different age range of older participants enrolled in our study. Similarly, there was no significant difference in abundance in the skin microbiome among the top 10 genera. Streptococcus was more abundant in young participants, particularly S. infantis. Indeed, four Streptococcus candidates, i.e., S. pneumoniae, S. infantis 1, S. infantis 2, and S. thermophilus were isolated through culture from young participants. S. pneumoniae is pathogenic in the respiratory tract but not on the skin40. Thus, isolated S. pneumoniae, S. infantis 1, S. infantis 2, and S. thermophilus are possible candidates contributing to facial skin aging.

Next, we investigated the role of the Streptococcus candidates in improving skin phenotypes using in vitro cell assays. The secretions of certain Streptococcus species were associated with more elastic skin structure, stronger skin barrier, and more moisturized skin through increased mRNA expressions34,41,42,43,44,45,46,47. We believe that the increased mRNA expressions of various genes related to skin well-being observed in in vitro screening could explain the mechanism underlying these skin improvements48. Additionally, the recovery of the damaged skin layer and increased lipid synthesis of skin cells supported the effects of Streptococcal secretions to improve skin structure and the skin barrier function49,50,51. Then, we demonstrated those improvements in human skin layers showing consequent outcomes.

The importance of microbial secretions emphasized at the start-line of our study needed a genomic approach to identify possible microbial secretions52,53,54. The genomic distances of S. pneumoniae, S. infantis 1, and S. infantis 2 suggested that the effective Streptococcus candidates shared similar genomic characteristics, which was further confirmed by having common biosynthetic pathways, such as those for spermidine and glycogen. Based on previous studies, we extrapolated that spermidine could be related to skin rejuvenation30,31,32. Spermidine is a key precursor in adipogenesis and lipid synthesis30, as well as associated with cell viability and autophagy55,56. Our analysis showed spermidine can increase the expression‎ of collagen and elastin, as well as the synthesis of lipids in aged skins based on previous researches34,43,44,45,46,49,50,51. The increased accumulation of lipid in aged cells treated with spermidine confirmed the role of Streptococcal secretions in lipid synthesis and in strengthening the skin barrier function57,58. Based on the motif analysis of the upregulated genes, spermidine activates the transcriptional activities of genes related to skin improvement59,60.

The increased abundances of Streptococcus colonies at the genus level, particularly that of S. infantis, were also observed. Spermidine in the St solution positively affected the growths of S. pneumoniae and S. infantis and this observation suggested that improved skin conditions could positively feedback to themselves through increments of the beneficial skin microbes. In short, our stepwise analysis and findings show that a colonized skin microbiome could improve skin conditions by producing beneficial secretions and suggest that the potential skin microbiome as therapeutic and clinical applications.

In this present study, we have some limitations. In addition to our insight into microbial activity with spermidine, unknown interactions between Streptococcus and other bacteria on the human skin could have suppressed the growth of the competitive bacteria for Streptococcus candidates, such as the inhibition of S. aureus by Bacillus subtilis and Staphylococcus epidermidis61,62. We also have the restricted sex limit to parlay our investigation into the broad applications. Hence, we anticipate that further studies focusing on these details establishing links to skin health and skin microbiome.

논의

출생 시 형성된 얼굴 피부 미생물군은 노화에 따라 점차 변화하며, 그 구성의 불균형은 아토피 피부염, 건선, 여드름 등 피부 질환과 밀접하게 관련되어 있습니다7,16,19,35,36. Staphylococcus aureus, Cutibacterium acnes, 및 Streptococcus pyogenes (그룹 A Streptococcus)는 여드름 및 기타 감염성 피부 질환과 관련된 병원성 세균의 예시입니다37,38,39. 연령에 따라 피부 미생물군의 구성은 변화할 수 있습니다13,14,15. 그러나 피부 미생물군집이 피부 노화에 미치는 역할을 조사한 연구는 거의 없었기 때문에, 특정 미생물군집이 피부 표현형에 미치는 영향은 대부분 알려지지 않았습니다. 따라서 우리는 피부 노화와 관련된 얼굴 피부 미생물군집을 확인하고 그 역할을 조사하기 위해 단계별 분석을 수행했습니다.

메타게놈 분석 결과, 노인 및 젊은 참가자의 얼굴 피부 미생물군집에 특이적인 차이가 발견되었습니다. 상위 5개 가장 풍부한 문(phylum)인 Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes의 풍부도에는 차이가 없었습니다. 이 결과는 60세 이상 개인에서 Actinobacteria가 적고 Bacteroidetes가 더 많다는 이전 보고와 대조되었습니다17. 이 차이는 우리 연구에 참여한 노인 참가자의 연령 범위가 달랐기 때문일 수 있습니다. 同様に, 상위 10개 속의 피부 미생물군집 풍부도에도 유의미한 차이는 없었습니다. Streptococcus는 젊은 참가자에서 더 풍부했으며, 특히 S. infantis가 두드러졌습니다. 실제로 젊은 참가자에서 배양을 통해 Streptococcus 후보 4종, 즉 S. pneumoniae, S. infantis 1, S. infantis 2, 및 S. thermophilus가 분리되었습니다. S. pneumoniae는 호흡기에서 병원성이 있지만 피부에서는 그렇지 않습니다40. 따라서 분리된 S. pneumoniae, S. infantis 1, S. infantis 2, 및 S. thermophilus는 얼굴 피부 노화에 기여할 수 있는 후보입니다.

다음으로, 우리는 체외 세포 실험을 통해 Streptococcus 후보의 피부 표현형 개선 역할을 조사했습니다. 특정 Streptococcus 종의 분비물은 mRNA 발현 증가를 통해 더 탄력 있는 피부 구조, 더 강한 피부 장벽, 더 보습된 피부를 나타냈습니다34,41,42,43,44,45,46,47. 우리는 체외 스크리닝에서 관찰된 피부 건강과 관련된 다양한 유전자 mRNA 발현 증가가 이러한 피부 개선의 메커니즘을 설명할 수 있다고 믿습니다48. 또한 손상된 피부층의 회복과 피부 세포의 지질 합성 증가가 Streptococcus 분비물의 피부 구조 및 피부 장벽 기능 개선 효과를 뒷받침했습니다49,50,51. 이후 인간 피부층에서 이러한 개선 효과를 확인했으며, 이는 후속 결과로 이어졌습니다.

본 연구의 초기 단계에서 강조된 미생물 분비물의 중요성은

가능한 미생물 분비물을 식별하기 위해

유전체학적 접근이 필요함을 보여주었습니다52,53,54.

S. pneumoniae, S. infantis 1, 및 S. infantis 2의 유전체 거리는

효과적인 Streptococcus 후보들이 유사한 유전적 특성을 공유함을 시사했으며,

이는 스페르미딘과 글리코겐 합성 경로와 같은 공통된 생합성 경로로 추가 확인되었습니다.

이전 연구를 바탕으로

우리는 스페르미딘이 피부 재생과 관련될 수 있음을 추론했습니다30,31,32.

배경: 자연적으로 발생하는 폴리아민인 스페르미딘은 최근 노화 방지 효과를 보이는 물질로 주목받고 있습니다. 스페르미딘의 보충은 수명을 연장하고 스트레스 저항성을 높이며, 노화 관련 질환의 발생과 운동 능력 저하를 감소시킵니다. 그 작용 메커니즘은 아직 초기 단계에 있습니다. 목적: 현재까지 밝혀진 스페르미딘 및 기타 폴리아민이 노화에 미치는 작용 메커니즘에 대한 최신 종합적 개요를 제시합니다. 방법: 노화와 폴리아민 전반, 특히 스퍼미딘의 분자적 효과에 대한 연구를 통해 스퍼미딘 및 기타 폴리아민이 노화에 긍정적인 영향을 미치는 분자적 메커니즘에 대한 지식을 종합합니다. 결과: 자가포식은 분자 수준에서 스퍼미딘의 주요 작용 메커니즘입니다. 그러나 최근 연구에 따르면 스퍼미딘은 염증 감소, 지질 대사, 세포 성장, 증식 및 사멸의 조절 등 다른 메커니즘을 통해 작용할 수도 있는 것으로 나타났습니다. 스페르미딘이 그 효과를 유발하는 주요 경로는 MAPK 경로로 제안되었습니다. 결론: 폴리아민이 많은 분자와 상호작용할 수 있다는 점을 고려할 때, 여러 메커니즘을 통해 노화에 영향을 미치는 것은 놀랍지 않습니다. 지금까지 발견된 많은 메커니즘은 이미 노화와 연관되어 있으며, 이러한 모든 메커니즘에 작용함으로써 폴리아민은 노화의 강력한 조절자일 수 있습니다.

스페르미딘(및 아스피린)이 인간 건강에 광범위한 영향을 미치는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 규명되지 않았습니다. 현재 지식에 따르면, 이러한 물질은 세포적 건강에 대한 전반적인 영향을 통해 노화 과정의 일반적인 시계를 늦추는 방식으로 작용할 수 있으며, 이는 모든 노화 관련 질환에 대한 다중 효과(pleiotropic effect)를 매개할 수 있습니다. 아스피린의 건강 개선 효과는 처음에는 혈소판 응집 억제(사이클로옥시게나제 억제를 통해) 및 항응고 작용에 기인한다고 여겨졌습니다. 스페르미딘은 유사한 항응고 활성이 보고되지 않았기 때문에, 우리는 아스피린이 EP300 억제를 통해 광범위한 건강 증진 효과를 매개할 수 있다는 가설을 선호합니다. 대체적이지만 배제되지 않는 메커니즘으로, 자연적인 EP300 억제제인 스페르미딘과 그 약리학적 등가물인 아스피린이 심혈관 기능(심근 세포, 내피 세포, 페리사이트, 소혈관 근육 세포 등), 항암 면역 감시(암 세포 및 면역 세포) 또는 신경퇴화(신경 세포 및 글리아 세포)에 관여하는 서로 다른 세포 유형에 작용하여 주요 노화 관련 질환의 발생률을 감소시킬 수 있다는 가설을 제시합니다(그림 1). 향후 연구는 스페르미딘이 작용하는 분자적 경로를 규명하여 노화 관련 질환의 치료 및 예방에 활용 가능한 표적 물질을 식별해야 합니다.

스퍼미딘은

지방 생성 및 지질 합성의 핵심 전구물질30이며,

세포 생존력 및 자가포식55,56과도 관련이 있습니다.

건강 관련 식품에서 발견되는 여러 천연 화합물은 자가포식을 유도하여 아세틸트랜스퍼라제를 억제할 수 있습니다. 여기에서는 아나카르디산, 커큐민, 가르시놀, 스퍼미딘이 이러한 특성을 가지고 있음을 보여드리겠습니다. 이 모든 화합물은 배양된 인간 세포의 아세틸화 수준을 감소시키며, 자식작용 증가의 징후(예: 녹색 형광 단백질-미세관 관련 단백질 1A/1B-경량 사슬 3(GFP-LC3) 점상 구조의 형성 및 시퀀소좀-1, p62/SQSTM1의 감소)를 유발합니다. 포유류 라파마이신 복합체 1 (mTORC1)의 억제를 동반합니다. 우리는 자가포식을 활성화하고 동시에 mTORC1을 억제하는 아세틸트랜스퍼라제를 확인하기 위해 스크리닝을 실시했습니다. 43개의 후보 중 두 개의 아세틸전달효소(EP300과 NAA20)의 발현 억제가 이러한 효과를 나타냈습니다. EP300은 라이신 아세틸전달효소이며, NAA20(N(α)-아세틸전달효소 20, NAT5로도 알려져 있음)은 메티오닌 잔기의 N-말단 아세틸화를 촉매합니다. 후속 연구에서는 약리학적인 EP300 억제제인 C646이 정상 세포와 핵이 제거된 세포(세포질) 모두에서 자가포식을 유도하는 능력을 검증하여, EP300이 세포질(비핵) 효과를 통해 자가포식을 억제하는 능력을 강조했습니다. 특히, 아나카르디산, 커큐민, 가르시놀 및 스퍼미딘은 모두 in vitro에서 재조합 EP300 단백질의 아세틸트랜스퍼라제 활성을 억제했습니다. 종합하면, 이러한 결과는 EP300이 자가포식의 내인성 억제제 역할을 하고, 스퍼미딘을 포함한 강력한 자가포식 유도제가 사실상 EP300 억제제 역할을 한다는 생각을 뒷받침합니다.

anacardic acid, curcumin, garcinol and spermidine

과도한 산화 스트레스가 골 손실 및 골 조직 손상에 기여한다는 다수의 발표된 데이터가 있으며, 이는 골 퇴행성 질환의 병리생리학과도 관련이 있습니다. 특히 골다공증(OP)을 포함한 질환에서 이 관계가 명확히 밝혀져 있습니다. 가르시놀(Garcinol)은 폴리이소프렌일화 벤조페논 유도체로 최근 항산화제로 확립되었습니다. 그러나 가르시놀이 골수 중간엽 줄기세포(BMSCs)와 골 조직을 산화 스트레스에 의한 손상으로부터 보호하는지 여부는 아직 명확하지 않습니다. 본 연구에서는 골다공증 마우스에서 산화 스트레스에 의한 BMSCs의 기능 장애와 골 손실을 완화하는 가르시놀 보충제의 잠재적 효과를 탐구했습니다. 본 연구에서 우리는 가르시놀이 과산화수소(H2O2)에 의해 유발된 과도한 산화 스트레스와 BMSCs의 기능 장애에 대해 강력한 보호 기능을 발휘함을 확인했습니다. 또한 가르시놀은 골다공증 상태에서 산화 자극을 억제함으로써 감소된 골량과 BMSCs의 이상적인 분화 경로를 개선하는 것으로 확인되었습니다. 후속 분석 결과, 핵인자 적혈구 2 관련 인자 2(NRF2)가 가르시놀의 H2O2 조절 산화 스트레스 보호 효과의 핵심 조절인자일 수 있으며, 가르시놀의 보호 기능은 NRF2-항산화 신호전달 경로를 통해 매개된다는 것이 밝혀졌습니다. 종합적으로, 가르시놀은 NRF2-항산화 신호전달을 통해 산화 스트레스 관련 BMSC 손상과 골 손실을 예방했으며, 이는 가르시놀이 산화 스트레스 관련 골 손실 치료에 유망한 치료 가치를 갖는다는 것을 시사합니다. 따라서 가르시놀은 OP 치료에 기여할 수 있습니다.

당사의 분석에 따르면

스퍼미딘은 이전 연구34,43,44,45,46,49,50,51에 따르면

노화 피부의 콜라겐 및 엘라스틴 발현과 지질 합성을 증가시킬 수 있습니다.

스페르미딘으로 처리된 노화 세포에서 지질 축적이 증가한 것은

Streptococcus 분비물이 지질 합성과 피부 장벽 기능 강화에 역할을 한다는 것을 확인했습니다57,58.

상향 조절된 유전자 모티프 분석을 기반으로 스페르미딘은

피부 개선과 관련된 유전자의 전사 활성을 활성화합니다59,60.

Streptococcus 속의 식민지 밀도가 증가했으며, 특히 S. infantis의 밀도가 증가했습니다. 스퍼미딘이 포함된 St 용액은 S. pneumoniae와 S. infantis의 성장에 긍정적인 영향을 미쳤으며, 이 관찰은 개선된 피부 조건이 유익한 피부 미생물의 증가를 통해 스스로에게 긍정적으로 피드백될 수 있음을 시사합니다. 요약하면, 본 연구의 단계적 분석과 결과는 정착된 피부 미생물군이 유익한 분비물을 생성하여 피부 조건을 개선할 수 있음을 보여주며, 피부 미생물군이 치료 및 임상 응용의 잠재적 후보로 제안됩니다.

본 연구에는 몇 가지 한계가 있습니다. 스페르미딘과의 미생물 활동에 대한 이해 외에도, 인간 피부에서 Streptococcus와 다른 세균 간의 알려지지 않은 상호작용이 Streptococcus 후보균의 경쟁 세균 성장 억제를 유발했을 수 있습니다. 예를 들어, Bacillus subtilis와 Staphylococcus epidermidis에 의한 S. aureus 억제 현상61,62가 이에 해당됩니다. 또한 연구의 성별 제한으로 인해 광범위한 응용으로의 확장 가능성이 제한되었습니다. 따라서 피부 건강과 피부 미생물군집 간의 연관성을 확립하기 위해 이러한 세부 사항에 초점을 맞춘 추가 연구가 필요할 것으로 예상됩니다.

Methods

Microbial sample collection and preparation

Microbial community samples from the faces of 26 old and 26 young participants were collected using sterilized tape (Elizabeth pack; Cell Lab, Republic of Korea). The tape was then dipped into a liquid Tryptic Soy Broth (TSB) medium (Benton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), prepared according to the manufacturer’s instructions. After bacterial growth for 48 h at 37 °C, the medium was centrifuged at 6000 rpm for 10 min. The collected pellet was used to extract microbial DNA with a Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions. DNA purity and quantity were estimated using a NanoDrop One Spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

16S rRNA PCR amplification and sequencing

The V3–V4 region of the bacterial 16S rRNA gene was amplified according to the Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation guide (Illumina, San Diego, CA, USA) using the following primers with an added adapter overhang sequence63: forward, 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′; reverse, 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. PCRs were performed in a 25-μL reaction volume containing 2 μL of genomic DNA (10 ng/μL), 0.5 μL of each primer (10 μM), 12.5 μL of 2× KAPA HiFi HotStart Ready Mix (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA), and 9.5 μL of distilled water. PCR conditions were as follows: initial denaturation at 95 °C for 3 min; 25 cycles consisting of denaturation at 95 °C for 30 s, annealing at 55 °C for 30 s, and extension at 72 °C for 30 s; and a final extension at 72 °C for 5 min. The PCR products were purified with AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) according to the manufacturer’s protocol. The attachment of dual-index sequences and Illumina adapters were conducted using 5 μL of the PCR product, 5 μL of Illumina Nextera XT Index Primer 1 (N7xx), 5 μL of Nextera XT Index Primer 2 (S5xx), 25 μL of 2× KAPA HiFi HotStart Ready Mix, and 10 μL of nuclease-free water. Thermocycling was performed as follows: 95 °C for 3 min; 8 cycles of 95 °C for 30 s, 55 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s; and a final extension at 72 °C for 5 min. PCR products were purified with AMPure XP beads, and the quality control for the 16S metagenomic libraries was performed using the Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Libraries were normalized and pooled for sequencing on the MiSeq platform (Illumina) by 2 × 250 bp paired-end sequencing, following standard Illumina sequencing protocols.

Metagenomic analysis

The quality of the raw sequence reads was analyzed using FastQC64. Illumina adapter sequences of the paired-end reads were removed using Cutadapt version 2.265. Then, the trimmed sequences were processed using QIIME2 version 2019.7. Briefly, the reads were assigned to each sample according to a unique index; pairs of reads from the original DNA fragments were merged using an import tool in QIIME266. Quality control and trimming were performed to yield sequences with lengths of 230 and 220 bp for the forward and reverse reads, respectively. To remove low-quality bases at the end of the reads, the DADA2 software package67 wrapped in QIIME2 was applied. To remove chimeras from the FASTQ files, a consensus method implemented in DADA2 was used. Beta diversity was compared by principal coordinate analysis using Bray–Curtis distances and weighted UniFrac metrics. Similarity among the groups was eval‎uated using permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) with 999 permutations. Taxonomic annotation was performed by mapping the training reference set with primers (forward, 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; reverse, 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) and extracting the V3–V4 region using GreenGenes version 13_868. Linear discriminant effect size analysis (LEfSe) was performed to identify differential features at the species level between groups based on linear discriminant analysis (LDA) scores using Galaxy implementation69. Statistical plots and calculations were generated in R studio with the ggplot2 package70.

Isolation and identification of Streptococcus from the face

Sterilized water was used to wash the faces of the participants and was then spread on solid Tryptic Soy Agar (TSA) medium. Single colonies were collected and incubated in liquid TSB medium at 37 °C for 72 h in stationary culture. Each sample was centrifuged at 6000 rpm for 30 min; the pellet was collected, and microbial DNA was extracted with a Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit according to the manufacturer’s instructions. DNA purity and quantity were estimated using a NanoDrop One Spectrophotometer. The bacterial 16S rRNA gene was amplified with the following primers71: forward, 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′; reverse, 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′. PCRs were performed in a 25-μL reactor containing 2 μL of genomic DNA (10 ng/μL), 0.5 μL of each primer (10 μM), 12.5 μL of 2× KAPA HiFi HotStart Ready Mix, and 9.5 μL of distilled water. The following PCR conditions were used: initial denaturation at 95 °C for 3 min; 30 cycles of denaturation at 95 °C for 1 min, annealing at 55 °C for 1 min, and extension at 75 °C for 90 s; and a final extension step at 72 °C for 8 min. The PCR products were sequenced on an ABI-3730XL DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 16S rRNA fragments were identified using the NCBI Microbial Nucleotide BLAST with Mega-BLAST72. The whole-genomic fragments were used to classify the isolated Streptococcus.

Cell culture and St solution treatment

HDFs and HEKs were purchased (PromoCell, Heidelberg, Germany). HDFs and HEKs were cultured in Fibroblast Growth Medium 2 with supplementMix and Keratinocyte Growth Medium 2 with supplementMix, respectively (PromoCell). For St solution treatment, the cells were seeded at 80% confluence into 6-well plates and incubated in an atmosphere of 5% CO2 at 37 °C. After 24 h, the cells were washed once with phosphate-buffered saline (PBS) and 10% of conditioned medium was added to the cells together with supplement-free medium, followed by a 24 h incubation.

Cell viability assay

HDFs and HEKs were seeded in 48-well plates and incubated for 24 h in 1 mL of the complete medium; 10% of the Streptococcus culture supernatant was added to the cells; they were incubated for another 72 h. After washing the cells once with PBS, 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) solution was added to each well, followed by a 4-h incubation. Then, the medium was discarded, and dimethyl sulfoxide was added to dissolve the formazan crystals. Optical density was measured at 570 nm using a microplate reader and was normalized relative to the untreated control.

RNA isolation and real-time PCR

Total RNA was isolated from cells using TRIzol reagent according to the manufacturer’s instructions (TaKaRa, Shiga, Japan). cDNA was synthesized from 1 µg of total RNA using Reverse Transcription Premix (Elpis-biotech, Daejeon, Republic of Korea) under the following reaction conditions: 45 °C for 45 min and 95 °C for 5 min. Gene expression‎ was quantified by real-time PCR, and the data were analyzed using StepOne PlusTM software (Applied Biosystems). Real-time PCR amplification reactions were performed using SYBR Green PCR Master Mix with premixed ROX (Applied Biosystems). The following primer pairs (Bioneer, Daejeon, Korea) were used in the reactions inside an ABI 7300 cycler following the manufacturer’s protocol: β-actin (forward, 5′-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3′; reverse, 5′-GACACCTTCAACACCCCAGC-3′); COL1A1 (forward, 5′- GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3′; reverse, 5′-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3′); COL3A1 (forward, 5′-TGGAGGATGGTTGCACGAAA-3′; reverse, 5′-ACAGCCTTGCGTGTTCGATA-3′); ELN (forward, 5′-CACCTTGCCCTTGTAGAATCCA-3′; reverse, 5′-CCATGACAGGTCAACCAGGTT-3′); FBN1 (forward, 5′- AATGTCAGACGAAGCCAGGG-3′; reverse, 5′-GATTTGGTGACGGGGTTCCT-3′); DSC2 (forward, 5′- AGTGTGAGTTTGTTCATCACAGGTC-3′; reverse, 5′-CCATGGCCTCACAGCCTTTA-3′); GBA (forward 5′-GCTAGGCTCCTGGGATCGAG-3′; reverse, 5′-GTTCAGGGCAAGGTTCCAGTCA-3′); FLG (forward, 5′-AGTGCACTCAGGGGGCTCACA-3′; reverse, 5′-CCGGCTTGGCCGTAATGTGT-3′); and ABCA12 (forward, 5′-ACAGGAATGGCCTTCATCAC-3′; reverse, 5′-AACATGGTGCCCTGAGAAAC-3′). The reaction conditions were as follows: initiation at 50 °C for 2 min and 95 °C for 10 min, followed by cycling at 95 °C for 10 s and 60 °C for 1 min for 40 cycles. β-actin was used as an internal control.

Nile red staining for neutral lipids

HEKs were seeded in 6-well plates. After 24 h, 10% of the Streptococcus culture supernatant was added to the cells, and these were incubated for another 24 h. After washing, a stock solution of Nile red (1 mg/mL) in acetone was prepared and stored at –20 °C away from light. A fresh staining solution was made by adding 1 μL of the stock solution to 1 mL of PBS and then 500-μL aliquots of the mixture were added to each well. After 10 min at room temperature in the dark, the cells were examined using a fluorescence microscope (Axio Observer Z1; Carl Zeiss, Jena, Germany). Neutral lipids were visualized as red fluorescent structures.

Normal human 3D skin model culture and treatment

A normal human 3D skin model at full-thickness (Epiderm-FT; MatTek Co., Ashland, MA, USA), comprising normal human keratinocytes and normal human fibroblasts, was cultured. The tissue was transferred to 6-well plates and cultured overnight in DMEM (MatTek Co., MA, USA), containing 5 μg/mL gentamicin B (MatTek Co., MA, USA), 0.25 μg/mL amphotericin B (MatTek Co., MA, USA), and other growth factors, in a 5% CO2 atmosphere at 37 °C. To induce aging, 3D skin models were treated with poly I:C (1 μg/mL). Afterward, they were treated with St solutions.

Clinical approval

This study was approved by the Institutional Review Boards (IRBs) of the Global Medical Research Center (IRB: 1-2018060502-A-N-01) and Ellead (IRB: 1-219969-A-N-01).

Clinical analysis

All steps of clinical analysis were performed in double-blind manners and all individuals were controlled about their cosmetics and cleansers. A total of 22 female healthy participants aged 20–59 years were enrolled in this study after securing their informed consent. On day 1, their basal skin conditions were measured before applying the test solutions. Each volunteer was provided with the control solution (distilled water) and the treatment solution containing 30% St solution (10% S. pneumoniae, 10% S. infantis 1, and 10% S. infantis 2). Each solution was applied to the respective cheeks daily for 4 weeks; measurements were performed on days 1, 14, and 28. Solution application and measurements were carried out at 20–24 °C and 45–55% relative humidity. The following measurements were performed: area of corneocyte (white regions) using ImageJ73; brightness of the face using a Mark-Vu instrument (PSIPLUS Co., LTD, Suwon, KOREA) and a continuous light source, data analysis were done using the I-max plus software and expressed as L-values74; transparency of the cheek using a Translucency meter (TLS850; Dia-Stron, Andover, UK), and the intensity of the scattered light in the skin layer was measured with a fiber optic face plate; TEWL of the cheek using a TEwameter TM300 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Köln, Germany) for 25 s; average face moisture using a Corneometer CM825 (Courage + Khazaka electronic GmbH) measured thrice, and the difference in dielectric constants between water and measured area was used; average face elasticity using a Cutometer Dual MPA580 (Courage + Khazaka electronic GmbH) measured thrice; the length of the stretched skin layer following application of a negative pressure (450 mbar), and the unit R2 was defined as Ua/Uf, where Ua is the final retraction and Uf the final deformation75; and desquamation of the skin layer was measured by harvesting desquamated skin cells using a D-squame standard sampling disk (D100; Clinical & Derm, Texas, USA) and Visioscan VC98 (Courage + Khazaka electronic GmbH), and the DI was calculated as D⋅I=2A+∑n=15⁡Tn(n−1)/6, where A is the percentage of area covered by corneocytes, Tn is percentage of corneocyte related to thickness, and n is thickness level; 1–576.

Genomic analysis

DNA was sequenced using the Illumina HiSeq 4000 sequencer with a read length of 151-bp paired-ends. Libraries were prepared with the TruSeq Nano DNA Kit (Illumina). The sequence reads were trimmed by trimmomatic-0.38 and assembled using SPAdes v3.13.077. Assembled fragments shorter than 100 nucleotides were filtered. Gene prediction was performed using Prokka v1.1378 for the assembled and filtered genome. COGs were used to search for common genes between the Streptococcus species. A functionally grouped annotation network for the selected genes was constructed using the Cytoscape plug-in ClueGO v2.5.479. ANI was calculated by JSpeciesWS80. Functionally related GO terms for biological processes in Escherichia coli (version: 18 November 2016) were grouped based on a kappa score >0.4 with a network specificity of 4–10. Statistical significance was calculated using a two-sided hypergeometric test, and the false discovery rate was corrected using the Benjamini–Hochberg method.

Quantitative analysis of spermidine in St solutions

TSB medium (control) and the St solutions were collected at 1 × 108 CFU/mL and centrifuged at 6000 rpm for 10 min. Then, the supernatants were filtered (0.22 μm membrane filter, Woongki Science Co., Ltd., Seoul, Korea) and a 10-μL aliquot of each, after dilution to 1/10 (TSB medium) and 1/1000 (St solution), was injected to Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Sunnyvale, CA, USA) with the Thermo Hypersil Gold column (50 × 2.1 mm, 1.9 μm, Thermo Fisher Scientific Inc.). The mobile phase [0.1% heptafluorobutyric acid (HFBA) in H2O, solvent A; 0.1% HFBA in acetonitrile, solvent B] was eluted at a flow rate of 0.4 mL/min with the elution gradient of 10% (0.01 min) → 10% (0.5 min) → 100% (5 min) → 100% (6.5 min). Next, MS/MS analysis was performed by a Triple TOF 5600+ (AB Sciex, Framingham, MA, USA) in the positive-ion mode using electrospray ionization (ESI) source. Spermidine was quantified using multiple reaction monitoring (MRM) with mass transitions from m/z 146 (Q1) to m/z 72 (Q3). The operating parameters were set as follows: MS data type, high resolved MS; MS scan type, MRM mode; Ionization source, Electrospray ionization (ESI); Nebulizing gas, 50 psi; Heating gas, 50 psi; Curtain gas, 25 psi; Desolvation temperature, 500 °C; ionspray voltage floating, 4.5 kV; collision gas, 3.5 m Torr.

Aged-skin cell model and spermidine treatment

Human skin cells (young HDF: neonatal, aged HDF: 60 olds, young HEK: 20 olds, and aged HEK: 40 olds) were purchased from PromoCell (Heidelberg, Germany) and cultured similarly (see Cell culture and St treatment). To stabilize the dose of UVB irradiation, the UVB irradiation machine (CL-1000 ultraviolet crosslinker) was pre-warmed for 30 min. Normal HDF cells were then irradiated with UVB (20 mJ/cm2) for 12 s twice a day. After 2 days, the UV-induced aged skin cells were treated with spermidine. Both aged skin cells and UV-induced aged skin cells were treated with 80 μg/mL of spermidine (Sigma, STL, USA). Motif enrichment analysis in the promoters of the upregulated genes was performed by Pscan using the default option81.

Measurement of growth rate

Each Streptococcus species was activated in 10 mL of TSB medium at 37 °C while shaking at 200 rpm for 24 h. Then, 10 µL of pre-cultured bacterial cells were separately inoculated in 10 mL of TSB broth and 10 mL of TSB supplemented with spermidine (300 μg/mL) to compare the growth of bacterial cultures. Optical density (OD600) was measured by a microplate reader (SPECTRA MAX 190, POWER LAB) every hour for 28 h.

Statistics and reproducibility

Wilcoxon–Mann–Whitney test was used to calculate the significant differences for non-parametric data. Wilcoxon signed-rank test was used for paired comparison. Pearson correlation was used for correlation analysis. The Student’s two-tailed t-test was used in the in vitro cell assay analysis. The power test of the clinical tests was done using 0.7 power. Statistical analyses were performed using R studio or Prism (GraphPad).

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.

Data availability

The sequence data that support the findings of this study are available from the European Nucleotide Archive (accession number: ERP116867). Source data underlying plots shown in figures are provided in Supplementary Data 1.

References

1.  
2.  
3.  
4.  
5.  
6.