프론티어(국제학술지), 식약처 산업통상부지원 연구논문

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프론티어(국제학술지), 식약처 산업통상부지원 연구논문

safe**** 116.212.***.218 

Frontiers in Pharmacology
(국제 학술지) 프론티어스 약리학

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2023.1220796/full#B21
ORIGINAL RESEARCH article
Front. Pharmacol., 15 August 2023


피라맥스의 코로나치료제 적용시 포괄적인 부정맥영향 평가
Assessment of the proarrhythmic effects of repurposed antimalarials for COVID-19 treatment using a comprehensive in vitro proarrhythmia assay (CiPA)

This study is the first to report the potential cardiotoxicity in electrophysiological terms of pyronaridine and artesunate, which have been repurposed for COVID-19 treatment under the new CiPA initiative (involving multiple ion channel screening, hiPSC-CMs, and a new in silico human-based prediction model that has finished the training phase using CiPA 12 training set drugs).

간추리면, 이 연구는 피라맥스의 코로나치료제 재창출시 발생될 부정적 심장병에 대한 위험이 적다
In summary, this study suggests that pyronaridine, artesunate, and their combination, repurposed for COVID-19 treatment, pose a low risk of adverse cardiac events and cardiotoxicity. Furthermore, the utilization of the CiPA initiative in drug safety assessment platforms can help identify potential cardiotoxicity and serve as an alternative to current in vitro and in vivo systems.


Our study aimed to perform in vitro and in silico investigations of the effects of pyronaridine, artesunate, and a combination of both drugs on cardiac electrophysiological properties and to predict arrhythmic potentials using the principles and methods of the CiPA initiative.

이 연구는 피라맥스가 심장에 부정적이거나 독성이 발생될 위험성이 극히 낮음을 보여준다
This study suggests that pyronaridine, artesunate, and their combination, repurposed for COVID-19 treatment, pose a low risk of adverse cardiac events and cardiotoxicity.

Furthermore, the utilization of the CiPA initiative in drug safety assessment platforms can help identify potential cardiotoxicity and serve as an alternative to current in vitro and in vivo systems.

지원: 한국 식품약품 안전처 장관과 산업통상부 장관에 의해 지원 되었다
Funding
This work was supported by a grant (22213MFDS391) from the Ministry of Food and Drug Safety and the Ministry of Trade, Industry and Energy, Republic of Korea (20009748).

*********************** 아래 번역 내용 ***************************

 포괄적인 시험관 내 부정맥 분석(CiPA)을 사용한 COVID-19 치료를 위한 용도 변경된 항말라리아제의 부정맥 효과 평가
www.frontiersin.org윤승현 (Seung-Hyun Yoon)1,2 www.frontiersin.org이현리 (Hyun-Lee Lee)1초 www.frontiersin.org다은정 (Da Un Jeong)3초 www.frontiersin.orgKi Moo Lim4초 www.frontiersin.org박성준2초* www.frontiersin.org김기석 (Ki-Suk Kim)1초*
1초R&D Center for Advanced Pharmaceuticals and Eval‎uation, 한국독성학연구원, 대전광역시, 대한민국
2초수의과대학 충남대학교 수의과학연구소
3초Intelligent Human Twin Research Center, 한국전자통신연구원, 대전광역시
4초구미 국립공과대학 IT융합공학과
SARS-CoV-2 바이러스의 발생으로 인해 팬데믹 기간 동안 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)를 치료하기 위해 약물 용도 변경 및 긴급 사용 승인이 제안되었습니다. 약물의 효율성이 논의되었지만 클로로퀸 및 하이드록시클로로퀸과 같은 특정 화합물이 QT 간격 연장 및 잠재적인 심장 독성 효과를 유발하는 것으로 확인되었습니다. 약물 유발 심장 독성 및 QT 연장은 잠재적으로 치명적인 부정맥 증상인 TdP(torsades de pointes)와 같은 생명을 위협하는 부정맥을 유발할 수 있습니다. 여기에서 우리는 CiPA(Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay) 이니셔티브를 사용하여 시험관 내 및 실리코 조사를 통해 COVID-19 치료를 위해 용도 변경된 피로나리딘 또는 아르테수네이트 매개 심장 부정맥 단독 및 병용 위험을 평가했습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM) 및 심장 이온 채널(Nav1.5, Cav1.2 및 hERG)을 일시적으로 발현하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용하여 심장 활동 전위(AP) 및 이온 채널에 대한 각 약물 또는 조합의 잠재적 효과를 조사했습니다. 또한 TdP 위험을 분류하기 위해 최적화된 O'Hara-Rudy 인간 심실 근세포 모델(ORd 모델)을 사용하여 인실리코 컴퓨터 시뮬레이션을 수행했습니다. 아르테수네이트와 아르테수네이트의 활성 대사산물인 디히드로아르테미시닌(DHA)은 비틀림 척도 점수(TMS)에 따라 TdP를 유발할 위험이 낮은 것으로 분류됩니다. 또한, 아르테수네이트는 최대 혈청 농도의 최대 100배(C.max). DHA는 APD에서 약간 연장되었습니다.90초 (10.16%) C의 100배에서.max. C를 고려할 때.max, 피로나리딘 및 두 약물의 조합(피로나리딘 및 아르테수네이트)은 TdP를 유도할 중간 위험이 있는 것으로 분류됩니다. 그러나, 결합되지 않은 농도(약리학적 활성을 유도하는 담체 단백질 또는 다른 조직에 결합하지 않은 유리 분획)를 고려할 때, 두 약물 모두 TdP를 유도할 위험이 낮은 것으로 분류된다. 요약하면, 피로나리딘, 아르테수네이트 및 두 약물의 조합은 치료 및 초요법(최대 4배) 유리 C에서 낮은 부정맥 유발 위험을 초래하는 것으로 확인되었습니다.max. 또한 CiPA 이니셔티브는 규제 사용에 적합할 수 있으며 약물 유발 심장 독성을 평가하기 위한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

1 소개
약물 유발 QT/QTc 간격 연장 및 심장 독성은 TdP(torsade de point) 및 심장 돌연사와 같은 부정맥 사건과 관련이 있습니다(Yap and Camm, 2003). 이러한 위험 요소를 평가하기 위해 ICH(International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)는 약물에 대한 심장 독성 평가를 예측하기 위한 프레임워크를 제공하는 S7B 및 E14 지침을 발표했습니다(Cavero and Crumb, 2005). 불행히도 ICH S7B/E14의 낮은 특이성은 심장 부정맥을 유발할 가능성이 없는 약물의 바람직하지 않은 조절로 이어집니다(Jeong et al., 2022). 이것은 일반적으로 활동 전위(AP) 형성을 관장하는 많은 이온 채널 중 하나에만 초점을 맞춘 결과로 이해됩니다(Colatsky et al., 2016; Jeong et al., 2022). 이를 해결하기 위해 미국 식품의약국(FDA)에서 CiPA(Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay) 프로젝트를 제안했으며, FDA와 제약회사가 주도하는 다양한 연구자들이 참여하여 국제 연구 프로젝트로 성장했습니다. CiPA 프로젝트는 2016개의 상호 관련된 구성 요소로 구성되며, 그 중 첫 번째는 인간 심실 AP 형성에 참여하는 이온 전류를 사용하는 시험관 내 실험을 통해 약물의 효과를 평가합니다(Cavero et al., 2016). 두 번째 구성 요소는 in silico 모델인 O'Hara-Rudy 인간 심실 근세포 모델(ORd 모델)을 사용하여 약물 유발 심장 독성을 예측하고 시험관 내 이온 전류 데이터 세트에서 얻은 결과를 입력으로 사용합니다(Cavero et al., 2021; Yoo et al., 2019). 인 실리코 모델을 사용하면 각 약물을 부정맥 위험이 없음/낮음, 중간 또는 높은 것으로 분류할 수 있습니다. 세 번째 구성 요소는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC-CM)의 전기생리학적 효과를 조사하며, 이는 시험관 내 다중 심장 이온 채널 스크리닝 데이터 및 인실리코 예측 모델과 비교하여 예상치 못한 심장 부작용을 확인하는 데에도 사용할 수 있습니다(Strauss et al., 2019). 네 번째 구성 요소는 2019상 임상 시험에서 인간 표면 심전도를 통해 대사 특성으로 인해 발생할 수 있는 약물의 생체 내 인간 전기생리학적 영향을 확인하고 이를 전임상 데이터와 비교합니다(Park et al., 2016; Strauss et al., 2016). CiPA 이니셔티브는 약물 유발 hERG 차단 및 QT 연장에 초점을 맞추기보다는 잠재적인 부정맥 위험이 있는 약물을 체계적으로 평가하기 위한 새로운 인간 기반 패러다임을 제안합니다(Cavero et al., 2017; Fermini 외, 14; Authier et al., 7). 이 새로운 패러다임은 약물 유발 심장 독성을 평가하는 데 사용되는 기존 방법의 한계를 극복할 수 있습니다. 또한 새로운 ICH E14/S7B Q&A는 실험 요인에 대한 위험 평가 모범 사례 고려 사항을 위한 후속 연구로 CiPA 분석을 통합합니다(ICH E2022/S<>B 구현 실무 그룹, <>).

2019년부터 세계는 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)로 인한 팬데믹에 직면해 있습니다(Touret et al., 2020; Yanagida et al., 2021); 클로로퀸(CQ), 하이드록시클로로퀸(HCQ) 및 렘데시비르와 같은 약물의 용도 변경을 포함하여 COVID-19를 치료하기 위해 많은 비임상 및 임상 시험이 수행되었습니다(Yanagida et al., 2021). 약물 용도 변경은 새로운 치료 방법을 식별하는 데 유용한 도구입니다(Serafin et al., 2020). 이전 연구에서는 퀴놀린 관련 항말라리아 약물인 CQ 및 HCQ가 심장 AP 형성과 관련된 이온 채널을 차단하고 QT 연장과 관련된 치명적인 부정맥을 유발할 수 있다고 보고했습니다(Kinoshita et al., 2010; Borba 외, 2020; Chorin 외, 2020; Mercuro 외, 2020; 왕 외, 2020; Tleyjeh 외, 2021; Sala et al., 2022). CiPA 이니셔티브의 규정 준수 데이터에 따르면 말라리아와 관련된 치료 농도에서 CQ 및 HCQ를 사용하거나 COVID-19에 대한 용도 변경은 QT 연장 및 TdP의 위험과 관련이 있습니다(Delaunois et al., 2021). 이러한 약물은 주로 칼륨 채널을 억제했으며, 재분극을 연장할 가능성이 있는 것으로 예측된 in silico 예측 모델(Thomet et al., 2021; Varshneya 외, 2021; 휘태커 외, 2021; TeBay et al., 2022). 또한 CQ, HCQ 또는 아지스로마이신(AZM) 병용 투여는 재분극 장애가 있는 상태에서 높은 부정맥 위험을 유발할 수 있습니다(Sutanto and Heijman, 2020; Montnach et al., 2021). 결과적으로 15 년 2020 월 19 일 FDA는 HCQ 및 CQ가 COVID-2020 치료에 효과적이지 않고 심각한 심장 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 긴급 사용 승인 (EUA)을 취소했습니다 (식품의 약국, 19a). 피로나리딘-아르테수네이트도 코로나2012 치료제로 고려되고 있는 항말라리아제로, 현재 임상시험이 진행 중이다. 피로나리딘-아르테수네이트는 말라리아 치료에 사용되는 아르테미시닌 기반 병용 요법입니다(Rueangweerayut et al., 2). SARS-CoV-3에 대한 피로나리딘, 아르테수네이트 및 HCQ의 효과를 비교한 시험관 내 연구에 따르면 피로나리딘과 아르테수네이트가 인간 폐 상피(Calu-2020) 세포에서 더 효과적이었습니다(Bae et al., 2021; Krishna et al., 19). 그러나 COVID-<> 치료를 위한 용도 변경과 관련된 약물 유발 심장 독성 및 QT 연장에 대한 정보는 제한적입니다. 따라서 심각한 부작용을 피하기 위해 이 약물의 잠재적인 심장 독성을 결정하는 것이 중요합니다.

우리의 연구는 피로나리딘, 아르테수네이트 및 두 약물의 조합이 심장 전기생리학적 특성에 미치는 영향에 대한 시험관 내 및 인실리코 조사를 수행하고 CiPA 이니셔티브의 원리와 방법을 사용하여 부정맥 가능성을 예측하는 것을 목표로 했습니다. 또한, 우리의 연구는 심장 독성 및 QT 연장 메커니즘에 대한 이해를 향상시켜 CiPA 접근 방식을 기반으로 하는 표준화된 비임상 분석에 대한 더 큰 통찰력을 제공하는 것을 목표로 했습니다.

2 메소드
2.1 화학 물질
피로나리딘 및 아르테수네이트는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 입수하였다. 혼합물은 피로나리딘과 아르테수네이트를 3:1의 비율로 구성합니다. 디히드로아르테미시닌(DHA)은 Selleck Chemicals(Houston, TX, USA)로부터 입수하였다. 약물은 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용하여 원액으로 제형화하고 -20°C에서 보관했습니다. 실험 당일에, 원액을 0.1% DMSO 및 목적 약물 농도를 함유하는 외부 용액에 새로 희석하였다. 외부/내부 용액을 준비하는 데 필요한 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich에서 얻었습니다. 약물은 약물 투여 후 최대 혈청 농도를 고려하여 <>가지 다른 농도에서 테스트되었습니다(C.max) 및 혈장 또는 조직 단백질에 결합하지 않거나 적혈구에 흡수되지 않는 약물의 농도(unbound concentration)(표 1)(The European Medicines Agency, 2012). 유럽 의약품청(European Medicines Agency, 2012)에 따르면 인간에서 피로나리딘의 치료 Cmax는 726ng/mL(800nM)이고 결합되지 않은 농도는 12ng/mL(13.2nM)입니다. 피로나리딘은 인간, 개, 쥐 및 토끼를 포함한 다양한 유기체에서 92%에서 96%에 이르는 높은 혈장 단백질 결합을 나타내었으며, 적혈구와 우선적으로 연관되어 있는 것으로 나타났다. 인간에서 아르테수네이트의 치료 Cmax는 0.3μg/mL(780nM)입니다. 인간에서 아르테수네이트의 활성 대사산물인 DHA의 Cmax는 1.2μg/mL(4,200nM)입니다.

[표 1]
www.frontiersin.org
표 1. 전기생리학적 기록에 사용된 약물의 테스트 농도(nM 단위).

2.2 세포 준비
다중 심장 이온 전류(피크 Nav1.5, 후기 Nav1.5, Cav1.2 및 hERG)에 대한 약물의 효과를 조사하기 위해, hERG-CHO 세포주는 B'SYS GmbH(스위스 비터스빌)에서 구입하였고, Nav1.5-CHO 및 Cav1.2-CHO 세포주는 Charles River Laboratories(미국 오하이오주 클리블랜드)에서 구입하였다.

hERG-CHO 세포는 12% 소 태아 혈청(FBS)(Gibco), 12% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco) 및 10μg/mL 하이그로마이신 B(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 가습된 1% CO에서 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium and Nutrient Mixture F-50(DMEM/F5)(Gibco, Gaithersburg, MD, USA)에서 유지되었습니다2초 37°C의 대기. Nav1.5-CHO 세포는 가습된 12% CO에서 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.25mg/mL Geneticin™ 선택적 항생제(Gibco)가 보충된 Ham's F-5 배지(Gibco)에서 유지되었습니다2초 37°C의 대기. Cav1.2-CHO 세포는 12% 테트라사이클린 스크리닝 FBS(Takara Bio Inc., Otsu, Japan), 10% 페니실린/스트렙토마이신, 1.0mg/mL 하이그로마이신 B, 25.0mg/mL Geneticin 선택적 항생제, 25.0mg/mL Zeocin™(Invivogen, San Diego, CA, USA) 및 40.0mg/mL Blasticidin(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)이 가습된 01% CO에서 보충된 Ham's F-5 배지에서 유지되었습니다2초 37°C의 대기. Cav1.2 발현을 유도하기 위해 1μg/mL 테트라사이클린(Sigma-Aldrich)을 테스트 24시간 전에 선별된 무항생제 배지에 첨가했습니다. 또한 Ca를 방지하기 위해2+독성-유도 3 μM 베라파밀 염산염 (Sigma-Aldrich)이 포함되었다.

2.3 이온 전류 기록
기존의 전체 셀 전압 클램프 기록은 FDA에서 권장하는 대로 hERG, 피크 Nav1.5, 후기 Nav1.5 및 Cav1.2 전류의 네 가지 다른 전류에 대해 수행되었습니다(식품의약국, 2020b). 팁 저항이 3&#8211;5MΩ인 기록 피펫은 내부 용액으로 채워졌습니다. 피크 Nav1.5에 대한 외부 용액은 130 NaCl, 10 HEPES, 4 CsCl, 1 MgCl로 구성되었습니다2초*6시간2초O, 2 CaCl2초*H2초O, 및 10개의 덱스트로스(NaOH를 갖는 pH 7.4). 피크 Nav1.5에 대한 내부 용액은 다음을 포함했습니다 (mM 단위) : 130 CsCl, 7 NaCl, 1 MgCl2초*6시간2초O, 5 HEPES, 5 EGTA, 5 Mg-ATP 및 0.4 Tris-GTP (CsOH를 갖는 pH 7.2). 피크 Nav1.5와 동일한 전압 프로토콜 및 솔루션이 후기 Nav1.5 전류를 기록하는 데 사용되었습니다. 후기 Nav1.5 전류를 유도하기 위해, 150 nM ATX-II. (Alomone labs, Jerusalem, Israel)를 첨가하였다. Cav1.2의 외부 용액은 137 NaCl, 10 HEPES, 4 KCl, 1 MgCl로 구성되었습니다(mM 단위).2초*6시간2초O, 1.8 CaCl2초*H2초O, 및 10개의 덱스트로스(NaOH를 갖는 pH 7.4). Cav1.2의 내부 용액은 120 아스파르트산, 120 CsOH, 10 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 5 Mg-ATP 및 0.4 Tris-GTP (CsOH와 함께 pH 7.2)를 함유했다. hERG에 대한 외부 용액은 다음을 포함하였다 (mM 단위): 130 NaCl, 10 HEPES, 5 KCl, 1 MgCl2초*6시간2초O, 1 CaCl2초*H2초O, 및 12.5 덱스트로스(NaOH를 갖는 pH 7.4). hERG에 대한 내부 용액은 120 K-글루코네이트, 20 KCl, 10 HEPES, 5 EGTA 및 1.5 Mg-ATP(KOH의 경우 pH 7.3)로 구성되었습니다. 37개의 전류 모두 생리학적 온도(1°C ± <>°C)에서 기록되었습니다.

2.4 hiPSC-CM에 자발적인 AP 기록
단일 셀 AP 기록의 경우 hiPSC-CM(Cardiosight-S; NEXEL, Co., Ltd., Seoul, Korea)를 배양하였다. 세포를 AP 기록을 위해 Matrigel (Corning, NY, USA) 코팅 유리 커버슬립을 사용하여 5웰 배양 플레이트로 옮겼습니다. 이들은 가습된 <>% CO의 배양 인큐베이터에서 유지되었다2초 37°C에서 대기, 해동 후 7일 이내에 사용. 배지는 2-3 일마다 교체되었습니다. AP 기록을 위한 외부 솔루션에는 145 NaCl, 5.4 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl이 포함되었습니다(mM 단위).2초*6시간2초O, 1.8 CaCl2초*H2초O, 및 5 덱스트로스 (NaOH를 갖는 pH 7.4). AP 기록을 위한 내부 용액은 20 KCl, 120 K-아스파르트산, 5 NaCl, 2 CaCl로 구성되었습니다(mM 단위).2초*H2초O, 5 EGTA 및 5 Mg-ATP (KOH와 함께 pH 7.25). AP (Vmax), 최대 이완기 전위 (MDP), AP 진폭 (APA), 50 %에서의 AP 지속 시간 (APD50초) 및 90%(APD90초) 재분극은 안정적일 때 측정되었습니다. hiPSC-CM의 자발적인 수축은 I = 0 모드에서 기록되었으며, 안정적인 박동을 나타내는 세포만 분석에 사용되었습니다. AP는 생리학적 온도(37°C ± 1°C)에서 기록되었습니다.

2.5 힐 피팅 및 샘플 생성
Hill 피팅은 Chang et al. (2017) R 프로그래밍 언어 (https://github.com/FDA/CiPA/tree/Model-Validation-2018/Hill_Fitting). 전체 셀 전압 클램프 실험에서 얻은 시험관 내 데이터 세트는 Haario et al. (2006)에 의해 제안 된 마르코프 체인 몬테카를로 (MCMC) 모델로 피팅되고 샘플링되었습니다. 레인과 탐미넨 (2008); Soetaert and Petzoldt (2010)는 각 이온 채널에 대한 투여 대 반응에 대한 Hill 곡선을 얻었습니다. 결과는 인 실리코 모델에 대한 입력으로 사용된 약물당 절반 최대 억제 농도(IC2) 및 Hill 계수 데이터를 가진 000,50개의 샘플이었습니다.

2.6 인실리코 모델
약물 효과에 최적화된 ORd 모델은 인간 심실 근세포에 대한 세포 전기생리학적 인실리코 모델로 사용되었으며(Dutta et al., 2017), 심근 세포에서 약물에 의해 억제되는 모든 이온 채널에 대한 전위의 합인 AP를 생성했습니다(O'Hara et al., 2011). 억제된 이온 채널은 일반적인 이온 전류 방정식에서 억제 인자를 곱하여 표현하였다; 억제 계수는 다음과 같이 구성됩니다. 힐 계수 (h
), IC50초및 약물 농도(D
) (방정식 1) (Li et al., 2019).

I n h i b i tion f&#4449;ctor=[1초+(D나는C50)h]&#8722;1
2.7 Torsade 메트릭 점수(TMS)
qNet은 세포막에서 약물에 의해 가장 큰 영향을 받는 6개의 이온 채널을 통과하는 순 전하의 총량입니다(6개의 이온 채널은 다음과 같습니다. I날(NaL); 내부 나트륨 전류, I쾅; L형 칼슘 전류, IKr 크론; 빠르게 활성화되는 지연된 정류기 칼륨 전류, IKs; 천천히 활성화되는 지연 정류기 칼륨 전류, I케이1; 내부 정류기 칼륨 전류, I받는 사람; 일시적인 외부 칼륨 전류) 1 사이클 길이 동안 (CL
)이며, 수학식 2와 같이 계산된다(Li et al., 2019; Yoo et al., 2021). C의 1, 2, 3, 4 배수에서 qNet 값의 평균.max 또는 각 약물에 대한 결합되지 않은 농도인 TMS 값은 Li et al. (2019)의 이전 연구에서 TdP 위험을 예측하는 데 높은 정확도를 보였습니다. 이에 따라 본 연구에서는 CiPA 12 훈련 세트 약물에 대한 TMS 값을 계산하고 로지스틱 회귀 곡선을 도출하여 TdP 위험 분류를 위한 임계값 1 및 임계값 2를 얻었습니다. 임계값 1은 낮은 위험과 중간/높은 위험을 구분하는 TMS 값이며, 임계값 2는 높은 위험과 중간/낮은 위험을 구분합니다. 분류기는 rms 패키지 버전 4.5-0의 lrm 함수를 사용하는 순서형 로지스틱 회귀를 기반으로 했습니다(Chang et al., 2017). 순서형 로지스틱 회귀 분석에 대한 로지스틱 답변을 제공하기 위해 높음, 중간 및 낮음 위험 수준을 각각 2, 1 및 0의 숫자 값으로 범주별로 인코딩했습니다.

qNet=∫0초CL(나는N&#4449;L+나는C&#4449;L+나는Kr+나는Ks+나는K1초+나는 토 토)dt
2.8 통계 분석
데이터 분석은 pCLAMP(Axon Instruments, Foster City, CA, USA), Origin 2022(OriginLab Corp, Northampton, MA, USA), Excel(Microsoft, Redmond, WA, USA) 및 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 통계적 유의성은 Student's t-test를 사용하여 결정되었습니다. 값은 평균의 표준 오차(SEM)± 평균으로 표시되었으며 p-값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 통계적으로 유의미한 차이는 *p < 0.05, **p < 0.01 또는 ***p < 0.001에서 쌍체 t-검정을 사용하여 평가되었습니다.

3 결과
3.1 심장 이온 채널에 대한 약물의 다중 효과
심장 AP 형성과 관련된 이온 채널에 대한 약물의 효과를 조사하기 위해 전체 세포 전압 클램프 기술이 사용되었습니다. 우리의 이전 연구에서, C의 다양한 배수에서 CiPA 12 훈련 세트 약물을 사용하여 심장 이온 전류 스크리닝을 수행했습니다.max (1, 2, 3 및 4). 그런 다음 이러한 데이터 세트를 최적화된 ORd 모델에 활용하여 약물 유발 TdP 위험을 높은 정확도로 예측했습니다. TdP 예측의 정확성을 높이기 위해, 동일한 범위(C의 1, 2, 3 및 4 배수) 내에서 심장 이온 전류 스크리닝을 수행하는 것이 적절하다고 판단되었다..max 또는 결합되지 않은 농도)를 TMS로 사용할 수 있습니다. 따라서 본 연구에서는 이러한 C의 지정된 배수에서 심장 이온 전류 스크리닝을 수행했습니다.max 또는 TdP 위험을 보다 정확하게 예측할 수 있도록 결합되지 않은 농도.

피로나리딘은 4가지 상이한 농도(C.max C의 2, 3, 4 배수.max) (그림 1). 피크 Nav1.5 전류는 -15mV 단계에서 피크 내부 전류로 측정되었고, 후기 Nav1.5 전류는 -15mV 단계 끝에서 내부 전류로 측정되었습니다(그림 1A, B). 피로나리딘은 1, 5,800, 1,600 및 2,400nM에서 피크 Nav3.200를 각각 12.17, 18.05, 20.51 및 32.29% 감소시켰습니다. 또한, 피로나리딘 농도는 후기 Nav1.5 의존적으로 감소하였다. Cav1.2 전류는 0mV 단계에서 피크 내부 전류로 기록되었으며 1,600, 2,400 및 3,200nM에서 각각 40.49, 46.73 및 59.73% 유의하게 감소했습니다(그림 1C). hERG 전류는 램프 다운 단계 동안 피크 외부 전류로 측정되었습니다. 피로나리딘은 38, 56,78, 00,90 및 60,91nM에서 심장 hERG 전류를 각각 60.800, 1.600, 2.400 및 3.200% 감소시켰습니다(그림 1D). 피로나리딘은 피크 Nav1.5, 후기 Nav1.5 및 Cav1.2 전류를 유의하게 감소시켰습니다. 그러나 세 가지 전류에 대한 민감도는 hERG 전류의 민감도보다 낮았습니다. 또한, 피로나리딘은 결합되지 않은 농도와 결합되지 않은 농도의 2, 3 및 4배수에서 테스트되었습니다(그림 2). 피로나리딘은 피크 Nav1.5 및 후기 Nav1.5 전류에 유의한 영향을 미치지 않았다(그림 2A, B). Cav1.2 전류는 52.8nM에서 22.91% 감소했고(그림 2C), hERG 전류는 39.6nM 및 52.8nM에서 각각 30.24% 및 33.63% 감소했습니다(그림 2D).

~~~~~~~~~~  감사합니다. ~~~~~~~~~~~~~