달 매개물로 활용할 수 있는 길이 열리게 되었다. Viruses의 genome은 retrovirus인 경우는 RNA들로, 또 다른 viruses들은 DNA들로 구성되어 있고, 이들에 대한 생활환(life cycle)이나 생물학적 특성들이 집중적으로 연구되어 왔다15~17). 1980년대 초에 DNA viruses와 RNA viruses를 이용한 여러 유전자 전달매개물에 대한 연구가 동시에 진행되었으나, 처음 대부분의 동물세포 안으로 유전자 정보를 전달할 수 있는 virus 중개물을 이용한 연구들은 retroviruses에 집중되었다. 이는 아마도 retrovirus는 자신의 RNA genome을 proviral DNA에 역전사가 가능하고, 이런 proviral DNA는 동물세포의 genomic DNA와 결합할 수 있는 능력이 있기 때문이 아닌가 생각된다. 비록 recombinant gene과 cellular genomic DNA와의 결합이 세포분열 시 유전자 정보를 전달해 주지만, 이는 아울러 변이 유전자의 삽입 및 암유발 유전자의 활성화 등을 통하여 세포 변형의 위험성도 높일 수 있으며, 더군다나 전달된 유전자가 표현되기 위해서는 retroviral genome이 결합 하여야 하고, 이런 결합은 세포분열시 나타나는 여러 세포 요소들의 도움이 꼭 필요하므로 분열 가능한 세포 안에서만 가능하다는 단점이 있다. 그럼에도 불구하고 retroviruses에 대한 집중적인 연구는 중개물의 고안(vector design), 특히 아주 위험한 replication-competent recombinant strains의 생성을 억제할 수 있는 helper viruses 생산 분야에 획기적인 공헌을 하게되었고, 많는 유전자 치료에서 disabled murine retroviruses을 이용하고있는 실정이다15~17,20).
최근 들어 DNA viruses가 강력한 유전자 전달 매개물로 관심을 끌고 있다15~17,21). 이들 DNA viruses들은 각각의 장점 및 단점을 지니고 있다. 예를 들면 vaccinia viruses는 25kb 이상의 큰 유전자 정보를 전달할 수 있는 반면, 감염된 숙주 안에서 homologous recombination에 의해서만 recombinant viruses의 생성이 가능하다. 그러나 이는 비효율적이며 recombinant viruses를 선택하는데 유전자 기법이 필요하다는 단점이 있다22). Adeno-assisted viruses는 사람의 염색체 19(19q13.3qter)에 장소 특이성으로 결합하는 성질이 있다23). 그러나 recombinant AAV virions는 이런 장소 특이성 결합력을 상실한다. 더군다나 AAV genome의 크기가 매우 작아(4680bp) recombinant inserts의 크기에 있어서 제한을 받으며, 이는 parvovirus이므로 복제시 adenovirus 유전자들을 활성화시켜야만 가능하다. 그리고 AAV 중개물은 recombinant AAV virions들이 adenovirus에 감염된 packing 세포주에서 번식하는데 꼭 필요한 genome이 상실된 상태이므로 다른 특성을 보여주기도 한다. 이런 이유들로 인하여 아직까지 viral stock이 생산되지 않고 있는 실정이다.
Adenovirus를 효과가 오래 지속되는 유전자 치료(long-term gene therapy)에 사용할 수 있는지에 대해서는 아직 확실하지 않지만, 사용 가능한 DNA virus system 중에는 이는 가장 많이 연구되고 사용하기 간편하며 또 일반적으로 널리 이용되고 있는 DNA virus이다. 이런 adenovirus의 장점들을 살펴 보면, 비교적 큰 DNA inserts(helper virus의 사용 없이 7kb까지 가능)를 표현할 수 있으며, 고농도의 viral stock 생산이 쉽고, 여러 종류의 동물 세포에 대한 감염력이 높다. 그리고 다른 promoters를 지닌 수많은 다른 중개물로의 이용이 가능하다. 처음 주입된 virus에 의하여 면역체계가 활성화되기 때문에 유전자 정보의 지속적인 발현을 위한 반복 주입도 불가능한 실정이며, 주로 episomal mode로 존재하기 때문에 삽입된 유전자의 발현 기간이 제한을 받는다는 단점이 있다. 그러나 곧 유전자 공학을 이용하여 이런 장점들을 유지하면서 단점들을 보완한 새로운 차세대 DNA virus 중개물이 등장할 전망이다.
아울러 p53 종양억제 유전자 또한 그 동안 가장 많이 연구되어 오고, 종양 치료에 가장 큰 가능성을 지닌 유전자 중 하나이다. 지금까지 알려진 p53의 기능은 생활환의 조절을 통한 세포성장 조절, DNA 복제조절, 전사 조절, 그리고 세포자멸을 유도하는 것으로 알려져 있다11~14,24). 그래서 이번 실험에서는 정상적인 p53을 표현해낼 수 있는 recombinant adenovirus를 먼저 제작, 확인하는 과정을 거쳤다. Adenovirus- p53은 human CMV promoter와 human wild-type p53 cDNA, 그리고 SV40 early polyadenylation signal을 지닌 expression cassette을 지니고 있으며, 이런 expression cassette은 adenovirus의 E1 region을 대치하여 adenovirus의 복제력이 소실되도록 만든 것이다. 이런 recombinant adenovirus는 293 세포안에서만 생산이 가능한데, 이는 293 세포가 소실된 adenovirus의 E1 단백질을 공급하여 주기 때문이다. 그러므로 293 세포 안에서의 Adenovirus-p53 번식에는 helper virus가 필요하지않다.
Adenovirus-p53의 효과는 각기 다른 p53 성질을 지니고 있는 네 개의 비소세포폐암 세포를 대상으로 실험을 실시하였다. NCI H358 세포주는 p53 유전자의 소실이 있는 세포이고, NCI H460 세포주는 정상적인 p53 유전자를 지니고 있는 세포이다. 그리고 PC9 세포주와 NCI H441 세포주는 p53 점변이가 있는 세포들이다. Gene transfer efficiency tests는 human CMV IE promoter가 전사된 LacZ 유전자를 전달할 수 있는 Adenovirus-LacZ를 이용하여 실시하였으며, 그 결과 20MOI로 이입된 경우 약 98%에서 100%가 X-gal 염색에 의하여 β-galactosidase activity가 나타남을 알 수 있었다. 이 실험에서 adenovirus는 암세포에 유전자를 전달하는 데 매우 효과적인 매개체임을 알 수 있었다.
그리고 Western blot assay를 통하여 Adenovirus-p53은 비소세포폐암 세포주에 고농도의 p53 단백질을 생산해낼 수 있음이 확인되었다. 이렇듯 p53 단백질이 많이 발현되는 것은 아주 효율적으로 유전자가 전달되고, 강력한 CMV promoter에 의하여 p53 cDNA가 유도되며, adenoviral E1 enhancer에 의하여 p53 cDNA의 전사가 잘 이루어지기 때문인 것으로 생각되었다. 따라서 Adenovirus-p53이 이입될 경우 정상적인 p53 단백질이 빠르게 형성됨을 알았으며, 이런 성질을 이용하여 각기 다른 p53 성질을 갖고 있는 비소세포폐암 세포를 대상으로 p53 단백질의 생물학적 특성을 연구할 수 있었다.
이번 실험에서 Adenovirus-p53은 실험관 안에서 비소세포폐암 세포의 성장을 강력히 억제할 수 있음을 알았다. Zhang 등은 비소세포폐암을 대상으로 한 실험에서 Ad5CMV-p53을 이용하여 감염시켰을 경우, 1MOI 이하인 경우는 성장억제 효과가 거의 없었고 100MOI 이상인 경우에는 Ad5/RSV/GL2를 이용한 대조군과 비슷하게 성장이 억제된다는 사실을 보고한 바 있다25). 이번 성장속도 비교실험에서도 10~20MOI가 적절한 Adenovirus-p53의 주입 농도임을 알았으며, 이 범위 안에서 성장속도 억제정도는 p53 단백질 농도와 비례한다는 사실을 알게 되었다. 그리고 NCI H358 세포주나 NCI H460 세포주에 10 또는 20MOI로 이입시켰을 경우에는 전형적인 세포자멸성 DNA fragmentation을 발견 할 수 없었으나, 50MOI로 이입시켰을 경우에는 발견할 수 있었다. 이 결과를 토대로 Adenovirus-p53이 비소세포폐암의 성장을 억제시키는 기전 중에 세포자멸도 포함되어 있음을 알 수 있었다.
그리고 Soft agar clonogenic assay의 결과를 통하여 실험관 내에서 비소세포폐암의 종양형성 능력도 Adenovirus-p53에 의하여 억제된다는 사실을 확인하였다. 특히 Adenovirus-Luc에 의한 것보다 Adenovirus-p53에 의한 성장 억제 효과가 월등함을 볼 때 p53 단백질이 치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었고, 일시적으로 고농도의 p53 단백질에 노출되어도 충분한 항암효과를 기대할 수 있음을 알았다. 그리고 성장억제 정도는 세포자체의 p53 유전자 상태에 따라서도 좌우됨을 확인하였다. 즉 p53 유전자의 변이가 있거나(NCI H441 & PC 9), p53 유전자의 표현이 전혀 되지 않는(NCI H 358) 비소세포폐암 세포는 정상적인 p53을 지니고 있는 세포에(NCI H 460) 비하여 Adenovirus-p53에 의한 성장이 더 억제되었다. 더욱이 과량의 정상적인 p53에 노출될 경우에 p53 유전자가 결여된 NCI H358 세포주에서는 세포자멸이 발생하였지만 NCI H460 세포주에서는 세포자멸이 일어나지 않았다. 이는 여러 기전으로 설명 할 수 있는데, 세포가 파괴되는 것은 여러 다른 세포로부터 형성된 p53의 양, p53 단백질의 안정성, 세포 안에서의 p53 분포, 그리고 p53 단백질의 다른 세포 요소 또는 down stream signal transduction pathway와의 결합력에 비례하여 발생될 수 있기 때문이다.
세포수는 세포증식과 세포사의 균형에 의하여 유지된다. 세포증식이란 수많은 점검과 균형에 의하여 정밀하게 조절되는 기전이다. 최근에는 세포 성장인자, 암 유전자, 또는 암 억제 유전자 등이 세포주기 조절 등 세포증식의 조절기전에 미치는 영향 등에 관한 많은 정보들이 보고되고 있는 실정이다. 그러나 세포사의 조절기전도 세포증식 조절기전 못지 않게 복잡하며 세포사의 중요성이 세포증식에 뒤지지 않는다는 사실이 인정된 것은 아주 최근의 일이다. 다세포 생물의 분화된 세포는 스스로 죽을 수 있는 능력을 가지는데 이는 내부에 존재하는 자살계획에 의한다. 이 자살계획이 활성화되면 자멸이라 불리는 특징적인 형태의 세포사가 일어나는데 자멸은 내부 또는 외부로부터의 다양한 자극에 의하여 촉발될 수 있다. 최근에 이르기까지 자멸의 중요성이 부각되지 않는 이유 중의 하나는 형태학적으로 쉽게 눈에 띄지 않는다는 점이다. 세포자멸이 쉽게 눈에 띄지 않는 것은 첫째 생체 내의 자멸은 한정된 특정 세포에서 한시적으로 일어나므로 생체 전체로 볼 때 흔하지 않은 현상이며, 둘째 자멸체의 크기가 작아서 광학현미경으로 잘 관찰되지 않는 경우가 있고, 셋째 주위의 세포가 자멸세포를 신속하게 탐식하며, 넷째 주위 조직에 염증반응을 일으키지 않고, 다섯째 괴사와의 감별이 때로는 쉽지 않기 때문이다. 아직까지 세포자멸을 평가하는 데 있어서 표준이 될 만한 생화학적 표지자가 알려지지는 않았으나 여러 가지의 형태학적인 변화와 DNA fragmentation을 측정하는 방법이 개발되어 이용되고 있다. 물론 현재까지 가장 널리 인정되는 자멸 표지자는 전자현미경으로 관찰한 chromatin의 농축과 핵의 fragmentation이지만 위상차 또는 주사 전자현미경으로 세포막의 bleb을 관찰하거나 위상차 또는 광학현미경으로 chromatin의 농축과 핵의 fragmentation 또는 자멸체를 관찰할 수 있으며, 때에 따라서는 DNA에 결합하는 색소를 처리한 다음 형광현미경으로 DNA의 양 또는 핵의 fragmentation정도를 평가함으로써 자멸을 증명할 수 있다. 또한 자멸체는 guanidine hydrochloride, urea 및 detergent에 용해되지 않는 특성을 가지는데 이를 이용하여 자멸을 평가하기도 한다. DNA의 fragmentation은 비록 모든 자멸에서 나타나는 현상은 아니지만 자멸을 평가하는데 가장 보편적으로 쓰이고 있다. 이 방법은 DNA fragmentation의 정도를 측정함으로써 자멸을 양적으로도 평가할 수 있다는 장점이 있다. 700, 300 및 50 kb의 큰 DNA fragmentation은 pulse field gel electrophoresis로 알아 보며 이어서 나타나는 oligonucleosomal DNA fragment는 agarose gel 전기영동에서 약 180 염기 배수 크기의 밴드로 보이는데 이를 DNA ladder라 부르고 DNA fragmentation을 알아보기 위하여 흔히 쓰이는 방법이다. 유세포분석(flow cytometry)으로 자멸과 연관된 세포의 성상 변화를 알아볼 수 있는데 chromatin의 물리화학적 상태, 세포 내 DNA 양 또는 nicking/breaking, 세포주기 분석, light scatter 특성을 이용한 세포의 크기 분석 등이 흔히 쓰이는 방법이며 세포막의 투과도를 측정함으로써 세포의 생존을 직접적으로 측정할 수도 있다. 세포자멸의 기전 및 조절에 대한 지식이 급속하게 축적되고 있음에도 불구하고 세포 내의 생화학적인 변화에 대해 알려진 바는 미미한 실정이다. 자멸을 유발하기 위하여 세포 내에서 macromolecule 합성을 필요로 하는지의 여부에 따라 세포자멸을 유도경로(induction pathway), 유리경로(release pathway) 및 전달경로(transduction pathway)로 나누고 있다. 새로운 유전자가 발현되고 단백질이 합성되어야 세포자멸이 일어나는 것을 유도경로라 하는 한편, 단백질이나 mRNA 합성을 억제할 때 자멸이 유발되는 현상을 유리경로라 부른다. 후자의 경우에는 자멸을 유발시키는 경로는 항상 발현되어 있는데 이는 수명이 매우 짧은 억제인자에 의하여 정지되어 있다가 macromolecule 합성 억제제에 의하여 자멸 억제인자가 소멸되면 자멸이 유발되는 것을 말한다. 마지막의 전달경로는 macromolecule 합성의 억제 여부와 무관한 세포자멸을 일컫는데 세포독성 T세포 매개 자멸이 그 예이다. p53 또한 자멸유도에서 중요한 역할을 담당한다. p53 단백은 세포주기 G1기의 점검점(check point)을 통제하여 S기에 진입하기에 앞서 DNA의 상태를 감시한다. p53은 DNA 결합단백으로 전사활성인자이다. DNA가 손상된 세포에서 p53에 의하여 p21 (WAF1, Cip1, 또는 sdi1)의 전사가 증가하는데 p21이 G1기에는 cyclin E-cdk2와 결합하며 S기에는 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)와 결합함으로써 세포주기의 진행을 차단한다. p53 결실 마우스에서 방사선 조사 또는 etoposide에 의한 자멸은 억제되지만 다른 자극에 의한 자멸은 영향을 받지 않는 것으로 보아 p53 의존성 자멸은 DNA가 손상된 세포를 제거하는 역할 수행임을 알 수 있다. 즉 p53은 DNA가 손상된 세포의 자멸을 유발하는 유전자로서 정상적인 유전자를 유지시키는 데 중요한 역할을 하므로 guardian of the genome이라 불린다. 어떤 종류의 종양형성 바이러스는 p53 단백질과 결합하여 이를 비활성화시키는 단백질을 생산한다. 따라서 DNA가 손상된 세포가 제거되지 않고 복제되기 때문에 이차적인 변이가 일어나 암이 유발된다.
이번 실험을 통하여 비소세포폐암에 대하여 Adenovirus- p53은 충분한 치료 효과를 기대할 수 있는 치료제가 될 수 있고 더욱 더 연구할 만한 가치가 있음을 알았으나, 앞으로 해결해야 할 문제점들도 많이 남아있다. 우선은 종양세포에만 선택적으로 전달될 수 있는 새로운 방법이 개발되어야 하며, 동물 또는 인체에서 virus 치료 후 발생되는 항체에 의한 neutralizing effect를 최소화할 수 있는 방법이 모색되어야 한다. 더불어 Adenovirus-p53의 유전자 구조도 더욱 치료 효과를 높일 수 있는, 그러면서 더 오랫동안 치료 효과를 지속시킬 수 있도록 개선되어야 한다. 이를 위해서는 조직 특이성이 있으면서 p53을 더욱 오랫동안 표현할 수 있는 새로운 expression cassette의 개발 및 adenovirus 자체의 세포 독성을 줄일 수 있는 방법의 개발, 그리고 다른 치료 효과가 있는 유전자를 추가할 수 있는 방법의 개발 등이 이루어져야 한다고 생각된다.
한편으로는 인체에서 발생되는 종양들은 변이가 일어난 p53을 갖고 있는 경우가 많으므로, adenovirus 중개물을 이용하여 종양억제 유전자인 p53 유전자를 재구성시키는 것도 종양의 유전자 치료에 흥미를 불러일으킬 수 있는 방법이다. adenovirus는 충분히 낮은 pH endosome-mediated endocytosis에 의하여 인간의 상피세포 안으로 들어갈 수 있기 때문에 상피세포에서 발생된 종양은 Adenovirus-p53에 의하여 치료될 가능성이 있다26). 이미 Liu 등은 cis-platinum이 있는 경우에 adenovirus를 이용하여 p53을 증가시킬 경우 두경부 종양 및 비소세포폐암 세포주가 괴사된다는 보고를 한 바 있다27). 이번 실험에서도 보듯이 정상적인 p53을 지닌 세포는 Adenovirus-p53에 의한 세포자멸에 저항력을 보이지만, p53 유전자가 없거나 변이된 경우에는 쉽게 세포자멸이 일어나는 것을 알 수 있었다. 따라서 Adenovirus-p53을 종양에 대한 유전자 치료에 활용하기 위해서는 좀더 세분화된 실험 및 접근 방법을 강구하여야 할 것이다.
결 론
이번 실험을 통하여 adenovirus는 어렵지 않게 고농도의 stock 생산이 가능하고, 유전자 전달 능력이 매우 뛰어난 매개물임을 알 수 있었다. 한편 adenovirus를 이용하여 recombinant Adenovirus p53을 생산하였으며, 이는 실험판 안에서, 정상적인 p53 유전자가 소실되거나, 변이를 일으킨 비소세포폐암 세포주의 성장 및 이미 형성된 종양의 성장도 강력히 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 더불어 그 성장 억제 기전 중에 세포자멸이 중요한 역할을 한다는 사실도 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 토대로 이를 임상에 적용하기 위한 동물 실험의 대상이 될 수 있다고 생각되어지며, 한편으로는 이의 단점을 보완할 수 있는 새로운 매개물 개발도 동시에 진행되어야 한다는 결론을 얻을 수 있었다.
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