Re:화학전공하시는분들...또는 화학실험많이해보신 학부 or 대학원생분들 ㅠㅠ

[포항★프메향]

첨부 되었던 실험 내용에 관한 댓글은 지금에야 확인했네요.

저는 화학쪽에서 생화학 쪽으로 걸쳐있는 부분을 연구했긴 하지만, 화학쪽을 주로 해서 자세히는 모르지만, 

Dansyl method에 대해서 설명을 대충해보면, 

단백질이나, 폴리펩타이드 즉 아미노산의 연속체에서 N-말단과 C-말단이 있는데, 

(참고, 펩타이드란 아미노기와 산기가 반응해서 생긴 아미드 결합을 펩타이드 결합이라고 합니다.)

당연 N-말단이라면 아미노기 (NH2-)가 있는 부분이고, C-말단이라면 산기(-COOH)가 있는 부분입니다.

N-말단이 있는 쪽의 산기로부터 폴리펩타이드 합성이 시작되는 것은 아시겠죠?

그 N-말단의 부분의 아미노산이 무엇인지 결정하는 방법중의 하나가 dansyl method 입니다.

아래는 그림을 인터넷에서 검색해서 올렸습니다.

1. 폴리펩타이드 N말단에 위치한 α-아미노기에 특이적으로 단실클로라이드가 결합을 해서 술폰아미드 결합을 형성하게 되고, 단실술폰아미드 부분이 형광을 띄게 되어 형광 표지가 되게 됩니다. 

2. 그렇게 결합된 것을 약자로 α-DNS(단실술폰아미드)-단백질 또는 폴리펩타이드를 가수분해하면, 폴리펩티드가 다 가수분해 되어, 각각의 아미노산이 됩니다. 하지만, 말단에 있던 아미노산은 α-DNS-아미노산 형태가 되겠죠? 

참고로, 여기서 펩타이드 즉 아미드 결합은 가수분해되는데, 왜 술폰아미드는 가수분해가 안될까요? 아미드 결합도 상당히 안정적인 결합이지만, 술폰아미드는 매우 안정적인 결합이라, 아미드의 가수분해 조건에서 술폰아미드는 가수분해 되지 않습니다.

3. 결국 말단에 단실술폰아미드가 표지된 아미노산을 확인할 수 있다. 그런데 어떻게 확인할 수 있을까?

4. 확인하는 방법은 20개의 아미노산에 모두 단실 표지가 되어있는 혼합물을 위 그림과 같이 2-D TLC(그림에 나온 내용)로 20개의 단실표지된 아미노산의 위치를 표 바탕실험(blank)으로으로 해서 확인한다.

5. 본 실험에서 얻은 실험 혼합물을 2-D TLC를 실시한 결과를 4번의 바탕실험과 비교해서 확인하여, N-말단 아미노산이 뭔지 결정하게 된다.

실험내용을  살펴보면

1. 단실술폰아미드 형성반응

펩타이드 시료 1mg를 원심분리기에 넣는 깔대기형 튜브에 넣고, 0.2M NaHCO3 수용액 0.5mL를 넣어서 녹이고, 아세톤에 녹인 단실클로라이드 0.2mL를 넣는다. hydrocarbon foil은 안써봐서 뭔지를 잘 모르겠네요. 어쨌거나 덮어서, 37도에서 1시간이나, 실온에서 2시간 동안 반응을 진행시킨다. 반응이 완료되면, 따뜻한 물이든 비커에 반응튜브를 담구고, 진공이나, 질소가스를 흘려보내는 방법으로 용매를 제거한다. 

2. 펩타이드 가수분해 반응

아세톤과 6M HCl 혼합용액 0.5mL에 반응잔여물을 녹여서, 가수분해 vial(플라스틱 두껑이 있는 작은 유리병)에 옮긴다. 질소가스를 흘려보내는 방법으로 vial의 아세톤을 증발시키고, 가수분해 바이알을 밀봉한 다음, 100도 오븐에서 10-12시간동안 가열한다.

vial에서 시계접시로 옮긴후 가열램프를 이용해서 건조시킨다. 

3. TLC

50% 에탄올/피리딘 용액을 최소한으로 사용해서 반응잔여물을 녹여서 microsyringe를 이용해서 고정상이 polyamide인 TLC판의 코너에서 1cm 떨어진 위치에 로드한다. 그 점의 지름이 3-4mm가 넘지 않도록 한다. 그 점을 따뜻한 공기로 말린다. 반대쪽 면에(TLC가 양면인듯...저는 양면은 한번도 본적도 없고 사용해 본적도 없는데..) 똑같은 위치에 표준 단실 아미노산 혼합물(위에서 말한 20가지 단실아미노산)을 마찬가지 방법으로 로드하고, 건조한다.  시료와 표준물질이 같은 위치에 점이 찍혀야 한다.(코너에서 1cm 위치)

그 TLC 판을 용액1, 1.5% 포름산 수용액에서 상단끝에서 2-3cm 떨어진 위치까지 용매가 올라가도록 전개시킨다. 대략 1시간 걸린다. 꺼내서 TLC 판을 따뜻한 공기로 양면 모두를 건조시키고, UV(자외선)을 비춰본다. 이때 안전 고글을 써라. 희미한 녹색형광의 점과 끌리는 파란 형광을 볼 수 있을 것이다. 용액2, 톨루엔-아세트산 용액으로 용액1로 전개시켰을 때에서 오른쪽으로 돌려서 전개시켜라. 꺼내서 용매를 제거하고, 공기로 건조시킨후, UV(자외선)에 비쳐봐라. 파란색과 녹색의 점들이 분리되어 보일 것이다. 또 이 TLC판을 용매2를 전개시킨 방향으로 용매3, 에틸아세테이트-메탄올-아세트산 조건에서 전개를 한번더 시켰나 봅니다. 그 내용이 위의 그림과 같습니다.

위에는 안나와있지만, 그렇게 해서 N-말단의 아미노산이 무엇인지 표준실험과 비교해서 앞뒤 TLC 판을 비교해서 알 수 있습니다.

저는 이 실험을 전혀 안해봐서, 표준물질이 그림에서 각각 스팟의 각각 어떤 아미노산인지 나와있지만, 그것을 어떻게 알았는지는 모르겠습니다만, 아마도 이러한 표준물질의 프로토콜이 정확하게 정해져 있어서, 각 단실 아미노산의 표준 프로토콜에 따른 위치가 아마도 이미 데이터베이스가 되어있지 않을까 생각됩니다. 그렇기 때문에 저렇게 각각 이름을 붙여 놨지 않을까 생각되는 군요.

잠이 안와서 쓰다가 보니 길어졌네요. 뭘 한건지....ㅎㅎㅎ

어쨌거나 발표잘하세요.

[내이름은토레스]

정성스럽게 답변해주신거 너무감사합니다 발표끝나고난후 제일먼저 이리로달려와 사례부터하겠습니다!! ㅠㅠㅠ...
한가지 더묻고싶은게있습니다....
여기서 에탄올 피리딘용액의 역할과...

생화학을 전공하셨다고하시길래,,,
산가수분해와 염기 가수분해 두종류의 경우 몇개의 아미노산은 소실되며 산분해의 경우 아스파라긴은 아스파르트산, 글루타민은 글루탐산으로 바뀌는것으로 알고있습니다.
그럼 이런 피해를 회유하는(?)방법은 무엇이고,,, 저기 아미노산의 변화는 왜일어나는지 알수 있을까요 ㅠㅠ

[포항★프메향]

아스파라긴과 글루타민은 아미노산 분자 자체내에 amide(O=C-NH2) 결합을 가지고 있습니다. 펩타이드 결합이 바로 아미드 결합이지요. 그러기 때문에 펩타이드를 가수분해 하는 과정에서 아스파라긴과 글루타민의 아미드 기도 카르복시산 기로 가수분해되어 버리지요.
물론 아스파라긴이나 글루타민은 O=C-NH2이고 펩타이드는 O=C-NH-옆아미노산 의 형태로 아미드의 N에 하나가 치환된 형태니 반응성이 약간 다릅니다. 즉 "pH조절, 온도조절"이 필수가 되겠죠. 저는 유기, 무기화학이 이 주전공이고 생화학쪽은 살짝 발만 담그고 있는 정도라 이런 실험이나 내용의 체감은 그다지 없네요. 화학적인 관점에서 설명합니다.

[포항★프메향]

아스파라긴과 글루타민의 아미드는 가수분해 하지 않고, 펩타이드 아미드만 가수분해 하는 조건이라면 상당히 선택적인 조건이기에 반응조건이 mild해야겠죠. 또 너무 mild하면 펩타이드 가수분해가 일어나지 않을 거고, 그러니 pH조절이 중요해지고, 또 반응온도가 올라가면 반응성이 증가하니 반응온도도 중요해지는 것입니다.

그리고 그냥 답변을 달고 싶어져서 단 것 뿐입니다. 사례 같은 것은 생각하실 필요가 없습니다. 상대적으로 이런 분야를 좀 더 알고 있으니 도움을 드린 것 뿐입니다. 그럼...발표 잘하세요.

[포항★프메향]

아...에탄올은 TLC에 로드하기 위한 용매이고, 피리딘은 카르복시기의 COOH와 아민기의 NH2가 pH에 따라 COO-와 NH3+등으로 다양하게 존재하게 되는데, 그 때마다 아미노산의 극성이 다양해집니다. 즉 TLC에서 스팟으로 전개되는 것이 아니라 쭉 끌리면서 올라갑니다. 피리딘은 COO-와 NH2의 형태로 고정시키게 되고 그렇게 수소이온을 뺏아온 피리딘은 피리디늄 양이온으로 아미노산의 카르복시 음이온과 쌍을 이루게 됩니다. 보통 이온의 형태로 된 아미노산은 유기용매에 용해도가 아주 낮은데, 양이온이 피리디늄 같은 유기물질이라면 에탄올에 대한 용해도가 증가하겠죠?
아마도 피리딘을 사용하지 않으면 에탄올에는 그렇게 잘녹지 않을 듯

[포항★프메향]

생각 되는 군요. (피리딘H)+ (아미노산COO)- 결국 가장큰 이유는 잘녹이기 위해서.....일듯 합니다.
에탄올/피리딘 용액의 양을 최소화해야 하는 이유는 TLC 분석에서 점을 찍을 때 크기가 작을 수록 더 깨끗한 분리를 보이겠죠. 달리기의 출발점이 좁을수록 달리기 실력의 변별력이 크겠죠.
그리고 전개용매에 포름산이 포함된 것은 전개시에 이런 효과들을 상쇄시키기 위함이 아닐까 보여지는 군요.

[포항★프메향]

이런 디테일한 부분은 해당 실험을 직접해봤을 때 느낄 수 있는 부분이라 정확한 해답일지는 모르겠습니다.

[내이름은토레스]

진짜너무감사해요.....ㅠㅠ

[내이름은토레스]

개인적으로 도움을 구할대가없어, 크게도와주신분인데 이정도사례는 해야죠! ㅠㅠㅎ 여튼감사합니다 앞으로 건승하시고...행복하세요! ㅎ