TPL2가 PPARδ와 상호작용하여 GC(위암) 조직에 미치는 영향에 관한 연구

[dhleepaul]

- 예비적 고찰(이하의 논문을 이해하기 위한 개념정리)

PPAR (페록시솜 증식체 활성화 수용체)이 뭘까. 유전자의 전사조절부위에 결합하여 유전자발현을 조절하는 전사인자이다. PPAR/RXR 이형이량체는 DNA 서열에서 PPRE라고 불리는 부위에 결합하며 그 서열은 AGGTCA (N)AGGTCA이다. 이와 같은 DNA 서열이 존재할 경우 PPAR은 RXR과 이형이량체 (heterodimer)를 이루어 표적유전자의 발현을 조절한다. PPARα는 간에서 주로 발현되며 포도당신생합성을 조절한다. PPARγ는 주로 지방조직에서 발현되는 전사인자로서 지방조직의 분화에 가장 중요한 요소이다.-ai

피부의 가장 바깥층인 표피의 주요 기능은 미생물, 기계적, 화학적 및 자외선 공격에 대한 방어를 제공하고 탈수로부터 유기체를 보호하는 것입니다. 표피는 기저 미분화층에서 보호 피부 기능이 주로 상주하는 가장 바깥층인 각질층으로 이동하면서 벡터 분화 프로그램을 거치는 여러 층의 각질 세포로 구성됩니다(Downing, 1992; Bickenbach et al., 1995; Roop, 1995). 표피의 성숙, 따라서 공격성과 수분 손실에 대한 유능한 장벽의 형성은 태아 발달의 최신 단계에서 발생하여 출생 전에 완료됩니다(Elias, 1983; Elias와 Menon, 1991; Schurer 및 Elias, 1991). 출생 후 성숙한 피부가 파괴되면 감염과 탈수의 문이 열리게 되며, 이는 심하게 다친 피해자에게 주요 문제가 됩니다. 이러한 경우, 재상피화라고 하는 새로운 상피에 의한 상처 덮개는 손상 후 몇 시간 이내에 시작되며 결국 유능한 보호 표피의 재건에 중요한 완전히 분화된 상피를 재구성합니다. 상처의 재상피화는 초기에 상처와 모낭의 가장자리에서 각질세포의 이동, 증식, 층화 및 분화/성숙을 포함하여 신생 상피를 형성합니다(Woodley, 1996).

피부 성숙과 발달에 영향을 미치는 다양한 요인 중에서 많은 핵 호르몬 수용체가 관련되어 있습니다. 각각의 리간드가 결합한 후 핵 호르몬 수용체는 특정 표적 유전자의 전사를 활성화합니다. 핵 호르몬 수용체 계열의 여러 구성원에 대한 다양한 리간드가 표피 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 갑상선 호르몬과 글루코코르티코이드는 생체 내 및 시험관 내에서 쥐 피부의 투과성 장벽 성숙을 가속화합니다(Aszterbaum et al., 1993; Hanley et al., 1996a, 1997a). 에스트로겐은 피부 장벽 형성을 가속화하는 반면 테스토스테론은 그 과정을 지연시킵니다(Hanley et al., 1996b). 레티노이드는 또한 시험관 내 또는 생체 내에서 분석할 때 기능에 대한 설명이 다르더라도 표피의 분화에 영향을 미칩니다(Imakado et al., 1995; Saitou et al., 1995; Li et al., 2000, 2001). 보다 최근에는 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체(PPAR)* 및 파르네솔 X-활성화 수용체 리간드가 태아 쥐 피부 외식편에 첨가될 때 표피 발달을 가속화하는 것으로 나타났지만 PPARγ 리간드는 효과가 없습니다(Hanley et al., 1997b, 1998). PPARα 또는 γ 리간드가 아닌 PPARβ-선택적 리간드만이 각질세포 분화 마커의 발현을 유도했기 때문에 인간 각질세포에서는 상황이 다른 것으로 보입니다(Westergaard et al., 2001). 또한 최근 결과는 PPAR과 표피의 콜레스테롤 대사 경로 사이에 누화가 존재한다는 것을 시사했습니다(Hanley et al., 2000).

PPAR에 의해 형성된 하위 계열은 지방산과 그 유도체, 고지혈증제 및 항당뇨병제에 결합하고 에너지 항상성에 중요한 역할을 합니다. 세 가지 이소형(PPARα, β/δ 또는 FAAR 또는 NUC1 및 γ; 각각 NR1C1, NR1C2, NR1C3; 핵 수용체 명명법 위원회, 1999) 다양한 종(Xenopus laevis, 설치류, 인간)에서 각각은 특정 발현 패턴을 가지고 있습니다(검토를 위해 Desvergne and Wahli, 1999 참조).

표피 성숙에서 PPAR 리간드의 잠재적 역할과 일치하게, PPAR은 쥐 피부와 인간 각질 형성 세포 모두에서 발현됩니다(Braissant et al., 1996; Braissant 및 Wahli, 1998; Rivier et al., 1998). 피부에서 RNase 보호 분석 및 제자리 혼성화는 PPARα와 PPARβ가 배아 형성 동안 표피에서 모두 발현되는 것으로 나타났습니다. 그러나 PPARα null 마우스에서는 주요 피부 결함이 설명되지 않았으며, 이는 PPARα가 설치류의 피부 성숙에 필수적이지 않음을 시사합니다(Lee et al., 1995). 대조적으로, 우리는 이 연구에서 PPARα와 PPARβ가 성체 동물의 빠른 피부 복구에 중요하다는 것을 보여줍니다.

결과표피의 PPAR 유전자 발현

마우스 피부에서의 PPAR 유전자 발현은 임신 15.5일부터 성인기까지 RNase 보호 분석법으로 분석되었습니다(그림 1 A). 표피와 진피를 포함한 전체 피부 추출물을 준비하고 방사성 표지 PPARα-, β- 및 γ 특이적 프로브를 사용하여 PPAR mRNA 수준을 분석했습니다. 세 가지 PPAR 이소형은 분석된 모든 단계에서 배아 및 출생 후 발달 피부 모두에서 발현되는 것으로 밝혀졌습니다(그림 1 A). 정규화(L27 및 프로브의 특정 활성) 및 결과의 정량화는 PPARα가 배아 15.5일을 제외하고 발달 중 가장 덜 풍부한 이소형임을 밝혔습니다. E15.5에서 PPARα보다 약 1.5 높은 PPARβ의 발현 수준은 출생 후까지 꾸준히 감소합니다. 임신 15.5일째에 PPARγ는 가장 적게 발현되는 PPAR 이소형입니다(PPARα 및 PPARβ보다 각각 1.5배 및 2-3배 낮음). 후기 배아 발달 동안 2배 증가한 후 PPARγ 발현 수준은 출생 후 기간에 감소합니다. 성인 피부에서는 PPARα와 PPARγ가 낮으며 PPARβ는 여전히 가장 많이 발현되는 동형입니다.

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국제 J Biol Sci 2025; 21(13):5874-5890. 도이:10.7150/ijbs.111998 이번 호 인용하다

연구 논문

TPL2는 PPARδ를 사용한 저산소증 유도 포지티브 피드백 루프를 통해 위암 진행 및 화학 저항성을 촉진합니다.

Keng-Li Lan1,2, De-Wei Lai3, Cheng-Ning Yang4, Hung-Chuan Pan3,5,6,15, Hui-Ting Ou7, Szu-I Yu7,8,15, Tsung-Che Hsieh7, Yi-Lun Ye7, Chia-Yang Chan7, Kin-Long Chou7, Sheng-Mao Wu7, Li-Wei Shen7, Chin-Chang Shen9, Lujen Chen10, Shing-Hwa Liu11,12,16, Chien-Shan Chiu13, Jack L Arbiser14, 미이링슈3,6,7 

- 연구자 명단

1. 대만 타이베이 국립 양밍 차이오퉁 대학교 의과대학 전통의학연구소.
2. 대만 타이베이 재향군인 종합병원 중입자 및 방사선 종양학과.
3. 대만 타이중 재향군인종합병원 의학연구과.
4. 대만 타이페이 국립 대만 대학교 의과대학 치과대학 치과.
5. 대만 타이중 재향군인종합병원 신경외과.
6. 박사 중개 의학 프로그램, Rong Hsing 중개 의학 연구 센터, 생명 공학 산업 관리 및 혁신 박사 과정, 생물 의학 연구 및 산업화 센터, 국립 중칭 대학교, 대만 타이중.
7. 대만 타이중, 국립 중칭 대학교 의생명과학 연구소.
8. 대만 타이중의 Tungs' Taichung MetroHarbor 병원 의학 연구과.
9. 원자력 위원회 원자력 연구소, 타오위안, 대만.
10. 대만 타이중 타이중 재향군인종합병원 병리학 및 검사의학과.
11. 대만 타이베이 국립 대만 대학교 의과대학 독성학 연구소.
12. 대만 타이중, 중국의과대학 중국의과대학병원 의학연구과.
13. 대만 타이중 재향군인종합병원 피부과.
14. 미국 조지아주 애틀랜타 애틀랜타 재향군인회 보건 센터, 애틀랜타 재향군인회 보건 센터, 에모리 대학교 의과대학 피부과.
15. 이 저자는 이 작품의 제1저자에게 동등하게 기여했습니다.
16. 저자는 교신저자에게 동등하게 기여했습니다.

✉ 교신 저자: Meei-Ling Sheu, Ph.D., Institute of Biomedical Sciences, College of Life Sciences, National Chung Hsing University, 250, Kuo Kuang Road, Taichung 402, Taiwan. 이메일: mlsheu@nchu.edu.tw. Shing-Hwa Liu, Ph.D., 독소 연구소 더

받은 일: 2025-2-12; 수락 2025-8-28; 게시 2025-9-12

인용:

Lan KL, Lai DW, Yang CN, Pan HC, Ou HT, Yu SI, Hsieh TC, Ye YL, Chan CY, Chou KL, Wu SM, Shen LW, Shen CC, Chen L, Liu SH, Chiu C, Arbiser JL, Sheu ML. TPL2는 PPARδ를 사용한 저산소증 유도 양성 피드백 루프를 통해 위암 진행 및 화학 저항성을 촉진합니다. 국제 J Biol Sci 2025; 21(13):5874-5890. 도이:10.7150/ijbs.111998. https://www.ijbs.com/v21p5874.htm

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추상적인

MAP3K 세린/트레오닌 단백질 키나아제 계열의 구성원인 종양 진행 유전자좌 2(TPL2)는 면역 반응 및 전염증성 단백질 인산화와 관련이 있습니다. 새로운 증거는 종양 형성에서의 역할을 시사합니다. 그러나 위암(GC) 발병에 대한 기여도는 불분명합니다. 환자의 질병 진행 및 얻은 종양 조직을 사용하여 유전자 발현 및 GSEA 분석을 수행했습니다. TPL2와 PPARδ(Peroxisome proliferator-activated receptor delta) 사이의 관계를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색, EMSA, ChIP, 면역침전 분석, 공초점 현미경 이미지 및 분자 도킹을 수행했습니다. 이종이식 마우스 모델을 사용하여 종양 성장에서 PPARδ/TPL2 축의 역할과 차단된 TPL2의 효능을 연구했습니다. TPL2 발현은 인접한 정상 조직에 비해 GC 조직에서 유의하게 상향 조절되었으며, 높은 TPL2 수치는 열악한 환자 결과와 상관관계가 있었습니다. siRNA 또는 약리학적 억제를 통해 TPL2를 침묵시키면 GC 세포 증식이 억제되고 독소루비신(아드리아마이신)에 대한 민감성이 향상되는 반면, TPL2 과발현은 종양 성장과 화학 내성을 촉진했습니다. 기계적으로 TPL2는 PPARδ와 상호 작용하여 저산소증/PPARδ 신호 전달을 활성화하여 전사 활성을 향상시켰습니다. 또한, PPARδ는 전사적으로 TPL2 발현을 상향 조절하여 긍정적인 피드백 루프를 구축했습니다. 기능 연구는 GC 세포 증식 및 약물 내성을 조절하는 TPL2와 PPARδ 사이의 상호 의존적 관계를 확인했습니다. 이 연구는 GC 진행 및 화학 저항성을 유도하는 새로운 TPL2/PPARδ 포지티브 피드백 조절 루프를 식별합니다. 이 축을 표적으로 삼으면 GC뿐만 아니라 병적 저산소증과 관련된 다른 질병에 대한 새로운 치료 전략을 제공할 수 있습니다.

키워드: TPL2, PPARδ, 저산소증, 증식, 화학저항성

소개

위암(GC)은 세계 악성 종양에서 암 사망의 두 번째 주요 원인으로 지적되었으며 이환율과 사망률도 높습니다. 특히 동아시아에서 우세합니다[1]. GC 발병률과 사망률은 지역에 따라 매우 다양하며 식이요법과 H에 크게 의존합니다. 파일로리 감염, 그 시작 및 진행 메커니즘을 깊이 탐구하는 것의 시급성과 중요성을 강조합니다[2]. GC의 병인에 관여하는 수많은 분자가 있으며, 그 중 가장 중요한 분자에는 환경 인자, 감염 및 식이 요인이 포함됩니다[3]. COX-2/PGE2, IL-8/NF-κB, IL-1β/TAB1, TNFα/VEGF, IL-6/STAT1 및 MCP-1 경로를 포함하여 만성 상피 염증이 GC로 전환되는 데 여러 염증 캐스케이드 경로가 관련되어 있습니다[1-3]. 중요한 조절 장애 인자는 이러한 복잡한 신호 전달 캐스케이드에서 종양 세포 형질전환, 세포사멸 억제, 세포 증식 촉진, 전이 강화, 침습적 및 약물 내성 강화, 혈관신생 및 면역 탈출과 같은 위 조직에서 비정상적인 생물학적 행동을 유발할 수 있는 상호 관련성을 포함합니다[4]. 주목할 만한 점은 종양 저산소증이 암세포의 화학 저항성을 향상시키고 환자의 불량한 결과와 상관관계가 있다는 것입니다. 이러한 분자와 신호 캐스케이드가 GC에서 어떻게 유발되고 유지되는지에 대한 질문은 여전히 수수께끼입니다. 이러한 요인이 어떻게 상호 작용하고 신호 전달 경로와 상호 조절을 하는지 조사하는 것이 최우선 과제입니다.

발암성 키나아제 종양 진행 유전자좌 2(TPL2)는 안정성과 특정 활성을 제어하는 데그론 서열(a.a. 435-457)을 포함하는 C-말단 도메인과 일치하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제입니다. [5-7] N-말단 확장은 α-나선(αN2)과 짧고 평행한 β-시트(βN1 및 βN2), 유연한 15-아미노산 P-루프 확장, 표준 키나아제 도메인 접힘에 비해 단축된 C 나선으로 구성됩니다[7-9]. 흥미롭게도 보고서에서는 TPL-2, ABIN-2 화학량론적 복합체와 NFκB1 p105가 TPL-2 단백질 안정성에 필수적이라는 사실이 나타났습니다[10]. 또한, TPL-2 키나아제와 14-3-3의 IκB 키나아제 유도 상호작용은 ERK-1 및 -2 MAP 키나아제의 Toll 유사 수용체 활성화에 필수적입니다[11]. 다른 구성원들은 TPL2가 악성 종양과 관련된 다양한 세포 활동을 가진 주요 핵소체 인단백질인 뉴클레오포스민(NPM/B23)의 물리적 및 기능적 파트너로서 핵에서 작동할 수 있음을 입증했습니다[12]. TPL2는 지방세포에서 염증 변화와 인슐린 신호 전달의 변화를 촉진하는 지방세포와 대식세포 사이의 혼화에 관여하는 대식세포에 참여하는 것으로 알려져 있습니다[13]. 암에서 TPL2는 종양 억제 또는 종양 형성의 동인 역할을 할 수 있음으로써 양가적이고 결정적이지 않은 역할을 하는 것으로 보입니다. TPL2 녹아웃 배경은 TPL2 키나아제가 폐 발암의 억제 인자로 복용하는 것으로 나타났습니다[14]. 또한, TPL2는 JNK-NPM 경로를 통해 폐 세포에서 p53 매개 종양 억제를 촉진하고[14-16], 전립선암 및 유방암에 유익합니다[9, 16, 17]. 게다가, CD40의 TPL2 및 ERK 활성화 및 Ig 클래스 전환을 초래하는 TNFR 형질도입 신호. CD40은 복합체에서 TPL2와 TRAF6을 모두 모집하여 ERK를 활성화하는 신호의 전달에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다[18]. 이전 연구에 이어 TPL2의 억제가 인플라마좀 복합체의 차단을 통해 당뇨병성 혈관병증을 개선한다는 것이 입증되었습니다[19, 20].

고도로 상승된 TPL2는 실제 유형의 인간 암에서 잠재적인 발암 인자인 것으로 밝혀졌습니다. 췌장암에서 결장암에 대한 연구가 이루어졌습니다[19-25]. 그러나 GC의 화학내성에서 TPL2의 발현 프로파일, 기능적 검증 및 조절 메커니즘은 불분명합니다. 여기에서 본 연구에서 우리는 GC 임상 피험자 조직에서 TPL2의 임상 병리학적 발현 및 면역조직화학적 염색을 기술했습니다[26-30]. 우리는 내성 분석을 위한 시험관 내 및 생체 내 모델에서 GC 증식에서의 역할을 밝혔습니다. 더 중요한 것은 TPL2와 저산소증/PPARδ 신호 전달 사이의 연결을 설정하고, TPL2가 GC 발달 및 화학 저항성을 촉진하기 위해 양의 피드백 루프에 의해 이 신호 전달 캐스케이드를 강화할 수 있다고 제안한다는 것입니다.

재료 및 방법

여기에 나열된 많은 방법이 이전에 발표되었지만 명확성을 위해 여기에서 반복됩니다[19, 20, 22-25, 31-34]. 1차 항체 및 2차 항체에 대한 정보는 각각 보충표 1 및 보충표 2에 나열되었다. qRT-PCR에 사용되는 프라이머 서열에 대한 정보는 보충 표 3에 나열되어 있습니다. 루시페라아제 리포터 분석에 대한 정보는 보충 표 4에 나열되어 있습니다.

세포 배양

세포 배양 시스템은 이전에 설명된 대로 위 선암종[19, 20, 22-25, 31-34]에 사용되었습니다. 인간 위암 세포주, AGS(중간 분화), NCI-N87 세포(고분화 및 더 느리게 분열) 및 MKN45 또는 SCM-1 세포(저분화)는 타이베이 재향군인 종합 병원(대만)의 세포 은행에서 공급되었습니다. 세포는 정상산소 조절 하에 5% CO2/95% 공기 혼합물이 있는 가습 인큐베이터에서 37°C에서 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(완전 배지)이 보충된 RPMI 배지에서 성장되었습니다. 저산소증을 위한 저산소증 챔버에서 배양은 37°C에서 1%O2, 5%CO2 및 94%N2로 가습된 저산소증 챔버 워터 재킷 인큐베이터(Astec Co., Kasuya, Fukuoka, Japan)에서 수행되었습니다. 실험 중에 세포를 무혈청 배지(굶주린 배지)로 밤새 배양한 6웰 플레이트에 도금한 다음 억제제 약물로 처리했습니다. 일부 실험에서는 하룻밤 동안 리포펙틴 시약을 사용하여 암세포의 형질감염을 수행하고 저산소증으로 추가로 처리했습니다. 저산소증 유도는 표시된 대로 표적 단백질 발현을 위한 웨스턴 블롯, 루시페라제 분석 또는 MTS 분석에 의해 수행되었습니다.

웨스턴 블롯 분석 및 면역침전(IP)

면역블로팅은 앞서 설명한 대로 수행되었습니다[19, 20, 22-25, 31-34]. 10% 투입에 대해 총 세포 용해물(800μg) 및 전체 세포 용해물 단백질(80μg)에서 면역침전된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 전기영동으로 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달했습니다. 차단 후, 블롯을 항체(보충 표 1)와 함께 밤새 배양했습니다. 그런 다음 멤브레인을 2차 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다(보충 표 2). 검출은 ECL(Amersham)과 Kodak X-Omat 필름을 사용한 화학발광에 의해 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 항체는 보충표-1에 나열되었습니다. 단백질 사전 세척(800μg)을 4ºC에서 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 사전 면역 혈청과 함께 배양했습니다. 상청액을 특이적 항체와 함께 추가로 배양하고, 단백질 A-세파로스로 면역침전을 4°C에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 비드를 2,500 × g에서 원심분리하여 펠릿화하고, IP 완충액으로 3회 세척하고, 상술한 바와 같이 전기영동 및 면역블롯으로 분석하였다.

형질감염

암세포에 1μM siRNA-TPL2, 스크램블-RNA(Santa Cruz Biotechnology)를 형질감염시켰다. 제조업체의 지침에 따라 리포펙틴 시약(Invitrogen)을 사용하여 5μg/ml shRNA-TPL2 또는 shEGFP 또는 TPL2 과발현 플라스미드 1mg/ml pcDNA-TPL2(국립양명대학교 게놈연구센터).

MTS 세포 증식 분석

세포주는 96웰 플레이트에서 웰당 3,000개의 세포 밀도로 파종되었습니다. 96-웰 플레이트에서 배양된 세포를 테트라졸륨 화합물[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부 염; MTS](프로메가, 매디슨, 위스콘신). 증식은 96웰 플레이트 리더(Biotek)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 제조업체의 지침에 따라 MTS 분석으로 결정되었습니다.

[3H] 티미딘 혼입 분석

[3H] 티미딘 혼입 분석을 수행하여 표시된 바와 같이 다양한 유도에 의해 유도된 DNA 합성의 억제를 평가했습니다. 세포(웰당 ~5 × 103)를 96웰 플레이트에 파종한 후 필요한 농도의 약물로 처리했습니다. 화합물과 함께 18시간 배양한 후, [3H] 티미딘을 첨가하고(웰당 0.2μCi) 6시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척했습니다. 5% 트리클로로아세트산으로 침전되고 0.2N NaOH에 가용화됩니다. 상대적 세포 생존력은 처리되지 않은 대조군에 대한 티미딘 혼입 비율로 계산되었습니다. 세포를 수확하고 방사능을 측정하고 섬광 카운터를 사용하여 분당 수(cpm)로 정량화했습니다.

동물 모델

모든 동물 관리 및 실험 절차는 National Chung Hsing University의 동물 실험 위원회(승인 문서 NCHU-100-26)의 승인 및 수행을 받았습니다. 실험의 모든 분석은 맹검 조건에서 이루어졌습니다. 누드 마우스에게 암세포 SCM1 또는 MKN45 형질감염 shEGF 및 shTpl2(5μg/ml) 또는 TPL2 억제제(2mg/kg, 주 2회, i.p.)를 1개월 동안 복강 내 주사하였다. 신체 장기의 종양 성장을 검사하고 조직학적 검사를 위해 다양한 조직을 처리했습니다. 복막 파종 분석은 앞서 설명한 대로 수행되었습니다. shRNA를 암세포로 형질감염시키는 것은 Lipofectin을 사용하여 수행되었습니다. 암세포(1 x 106) 세포를 24시간 동안 형질감염시킨 후 각 마우스는 30일 동안 복강에 복강내 주사를 통해 세포 유형 중 하나를 투여받았습니다. 종양 덩어리의 정량화는 하나의 슬라이드 섹션으로 평가되었고 무작위로 선택된 5개의 고배율 필드를 계산하여 혈관을 추정했습니다.

연질 한천 콜로니 형성 분석

세포(10000개 세포/웰)를 0.7% 한천을 함유한 10% FBS-RPMI 1640에 현탁하였다. 그런 다음 세포를 10% FBS-RPMI 1640 및 1.4% 한천으로 구성된 경질 한천 베이스를 포함하는 6웰 배양 플레이트에 넣었습니다. 플레이트를 4주 동안 배양했습니다. 세포를 37도에서 밤새 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색했습니다. 콜로니를 시각화하고 X20 배율의 광학 현미경으로 계산했습니다. 표시된 결과는 적어도 5개의 독립적인 실험을 대표합니다.

RNA 분리 및 qRT-PCR(정량적 실시간 PCR)

총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 TRizol regent(Sigma-Aldrich, Germany)를 사용하여 CRC 세포에서 추출되었습니다. RNA(2μg)를 PrimeScript RT 시약 키트(TaKaRa, Japan)를 사용하여 역전사하였다(보충 표 3). qRT-PCR은 ABI 7500 PCR 시스템(Applied Biosystems, USA)에서 TB Green® Premix Ex Taq™ 키트(Takara, Japan)를 사용하여 수행되었습니다. 모든 결과는 최소 4개의 독립적인 실험으로 표현되어 발표되었습니다. 각 샘플의 mRNA 수준은 2-ΔCt 방법을 통해 β-액틴으로 정규화되었습니다.

루시페라제 리포터 분석

60% 합류의 세포를 0.2μg의 프로모터 리포터 구조물 과산화좀 증식자 반응 요소(PPRE) 및 0.1mg의 티미디네키나제 프로모터 구동 레닐라-루시페라제 벡터(pRLTK; Promega, Mannheim, Germany). 배양 후, 제조업체가 설명한 대로 Dual Luciferase Kit(Promega)를 사용하여 세포를 용해하고 상대적인 루시페라제 활성을 처리했습니다. 루시페라제 활성은 형질감염 효율을 위해 레닐라 반딧불이 활동으로 정규화되고 발광계(LKB, Rockville, MD)로 기록되었습니다. 신호 전달 경로 분석을 위해, AP-1-luc, ARE-luc, HRE-luc, NF-κB-luc, STAT3-luc, PPRE-luc, SMAD2/3-luc, WNT-luc를 포함하는 8개의 루시페라제 리포터 구조체는 8개의 신호 전달 경로(Cignal Reporter Assay Kits, QIAGEN)를 나타내며(보충 표 4). 이들 플라스미드를 레닐라 루시페라아제 플라스미드 pRL-SV40과 함께 6-웰 플레이트 내의 TPL2 녹다운 세포 및 대조군 세포 유무에 각각 공동 형질감염시킨 후, 상술한 바와 같이 이중 루시페라제 리포터 분석 키트에 의해 상대적 루시페라아제 활성을 측정하였다. 모든 형질감염은 일상적으로 3중으로 수행되었으며 실험은 3회 반복되었습니다.

면역조직화학 분석

10% 포르말린 고정, 파라핀 포매 눈 샘플에서 절단된 절편(4-5μm 두께)을 헤마톡실린-에오신 염색에 사용했습니다. 면역조직화학 분석은 앞서 설명한 대로 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 상용 항체는 보충표 1 및 2에 출처와 함께 나열되었습니다.

면역형광 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경

세포를 준비하고 이전에 설명한 바와 같이 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM, TCS SL, Leica, Wetzlar, Germany)에 의해 면역형광을 결정했습니다. 이미지는 Confocal Assistant MetaMorph 소프트웨어 프로그램을 사용하여 배경을 빼고 병합하고 Adobe Photoshop 소프트웨어로 처리했습니다.

전기영동 이동성 이동 분석

EMSA는 앞에서 설명한 대로 수행되었습니다. 사용된 PPARδ 합의 결합 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 (5'-AGGTCA-3'); -389 내지 -358 인간; 정방향 프라이머(5'-GGGGCGCGCGGAAAAAGGTCTGACTGCCC-3')인 반면, 역방향 프라이머는 (5'-GGGCAGTCACCAGACCTTTTCCGCGCGCCCC-3')이었습니다. DNA-단백질 복합체는 6% 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분리되었고 자가방사선 필름에 노출되어 시각화되었습니다.

염색질 면역침전 분석

분석 프로토콜은 이전에 설명한 바와 같이 수정되었으며, 추정 PPARδ-결합 부위를 포함하는 TPL2 프로모터의 단편(221bp)을 사용했습니다. 정방향 프라이머는 -496≈-477(5'-TAGCAATCGGACCCACAGTC-3')인 반면, 역방향 프라이머는 -295≈-276(5'-GGGCGCGAGTACACTAAGAT-3')이었습니다. PCR은 94°C에서 30초, 64.8°C에서 30초, 72°C에서 45초 동안 30회 수행되었습니다. PCR 산물을 침전시키고 1.5% 아가로스 겔에서 실행했습니다.

단백질-단백질 도킹

두 단백질 사이의 도킹 방향에 대한 전체 강체 검색을 수행하는 ZDOCK에 의한 단백질 도킹 시뮬레이션. 현재 버전인 3.0.2에는 성능 최적화와 새로운 쌍별 통계 에너지 잠재력이 포함되어 있습니다. TPL2: PPARδ 복합체의 단백질-단백질 도킹은 각각 RCSB PDB에서 발견되는 인간 구조를 사용했습니다. 쌍별 모양 상보성, 탈용매화, 정전기 및 통계적 전위를 고려하는 빠른 푸리에 변환 기반 도킹 알고리즘을 사용하여 ZDOCK 서버를 사용하여 일련의 도킹 실행을 수행했습니다. 290 사슬 A THR의 TPL2.pdb 및 256 사슬 B THR의 PPARδ.pdb에서 결합 부위에서 차단할 잔기를 선택합니다. ZDOCK 결과는 TPL2가 방향에서 PPARδ와 연관되어 있음을 안정적으로 나타냈습니다. 구조 디스플레이와 관련하여 달리 명시되지 않는 한 여기에 제시된 구조 그림은 PyMOL에서 준비했습니다. 또한 가장 낮은 에너지와 가중 점수 -1044.6~ -903.7을 도킹하기 위해 ClusPro 웹 서버를 사용했습니다.

TPL2 발현 수준과 환자 생존 사이의 연관성

위암 및 위 선암종 데이터베이스용 공용 웹 서버를 활용하여 정상 및 종양 조직 전반에 걸친 TPL2 발현 패턴과 전체 생존 확률을 조사했습니다. 이러한 플랫폼을 통해 현재 연구된 환자 하위 그룹과 연구되지 않은 환자 하위 그룹 모두에서 새로 확인된 유전자 발현 기반 바이오마커 및 시그니처에 대한 향후 분석 및 검증이 가능합니다. GENT2(http://gent2.appex.kr/gent2/)를 사용한 표적 유전자 분석은 정상 및 종양 조직 전반에 걸쳐 TPL2 발현 패턴을 탐색하기 위해 제시되며, 수반되는 통계 테스트와 함께 72개의 쌍을 이루는 샘플에 걸쳐 조직 전체의 유전자 발현 패턴을 포함합니다. 전체 생존(OS), 첫 번째 진행(FP) 및 진행 후 생존(PPS)에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 생성하는 Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)를 사용하여 생존 분석을 수행했습니다. 결과는 프로브 세트 선택(특정 프로브 세트 또는 유전자당 모든 프로브 세트)을 위한 사용자 옵션과 데이터 세트 GSE62254 제외 기능을 갖춘 Kaplan-Meier 곡선으로 시각화됩니다. (GSE62254는 더 긴 생존 기간과 이동된 발현을 포함하여 현저하게 다른 특성을 나타내므로 모든 데이터 세트를 함께 분석할 때 제외됨을 시사합니다.) 또한, 위 선암종 데이터에는 샘플 유형, 종양 등급 및 특정 암 아형을 기반으로 종양 하위 그룹 유전자 발현 및 생존 분석을 용이하게 하도록 설계된 포털인 UALCAN(https://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)이 사용되었습니다. 체계적이고 통합된 생물정보학 분석을 통해 잠재적인 핵심 유전자와 위암의 불량한 예후와의 연관성을 확인했습니다.

통계 분석

데이터 및 통계 분석은 약리학의 실험 설계 및 분석에 대한 British Journal of Pharmacology의 권장 사항 및 요구 사항을 준수합니다. 연구 통계 분석은 SAS 소프트웨어(SAS Institute, Cary, NC)를 사용하여 수행되었습니다. 값은 평균±SD로 표시되었습니다. 분산 분석에 이어 Fisher의 최소 유의 차이 테스트가 모든 데이터에 대해 수행되었습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 설정되었습니다.

결과TPL2 발현은 GC 환자에서 상향 조절됩니다.

정상 및 종양 조직 전반에 걸쳐 유전자 발현 패턴을 탐색하고 다양한 조직에 걸쳐 조직 전체 발현 프로필을 검색하기 위한 플랫폼인 GENT2의 데이터. 암 실험 전반에 걸친 유전자 발현 프로파일에 대한 박스플롯[GPL96 플랫폼(HG-U133A)]. 우리는 위암이 정상 조직에 비해 TPL2를 높게 발현한다는 것을 발견했습니다(그림 1). 1A). 또한 TCGA 정상 데이터를 일치시키기 위해 유전자 발현 프로파일, T(n=408), N(N=36)에서 백만 당 전사체(TPM)를 보여줍니다(그림 1). 1B). 이어서, GC 실제 단어 조직 샘플에서 TPL2 단백질 발현을 조사하기 위해 면역조직화학적 분석(IHC)을 수행했습니다. 타이중 재향군인 종합병원(VGHTC) 조직은행 암연구소 데이터 수집에 따르면 TPL2 단백질 발현은 정상 조직(n=39)보다 종양 조직(n=40)에서 유의하게 높았습니다(그림 1). 1C). TPL2의 단백질 발현에 관한 온라인 데이터베이스 분석과 일치하는 이러한 결과는 GC 조직에서도 유의하게 증가했습니다. 2 (그림 2A, 전체 환자 생존(OS); 무화과. 2B, 첫 번째 진행(FP); 무화과. 2C, 진행 후 생존(PPS)). 또한 TPL2 발현과 환자의 예후 사이의 관계를 평가했습니다. 샘플 유형에 따른 위암 환자에서 TPL2의 발현(그림 1). 2D), 종양 등급(그림 1). 2E) 및 개별 암 단계(그림 1). 2F). 결과는 TPL2의 높은 발현이 전체 생존 감소와 상관관계가 있고 종양 진행과 관련이 있음을 보여주었습니다. 이러한 데이터는 TPL2가 GC에서 중요한 역할을 할 수 있음을 강력하게 시사했습니다.

TPL2 녹다운 또는 TPL2 억제제는 시험관 내 GC 세포 증식 및 생체 내 종양 형성을 억제합니다.

As demonstrated by western blotting in Fig. 3A, TPL2 발현은 GC 세포주에서 다양했으며, SCM1과 MKN45 모두 높은 단백질 발현을 보인 반면, AGS, N87, SNU5, SNU16, KATOIII, TMK-1은 상대적으로 낮은 TPL2 발현을 보였다. GC에서 TPL2의 생물학적 기능을 탐색하기 위해 SCM1 및 MKN45 세포에서 리포펙틴 형질감염을 사용하여 siRNA와 shRNA를 모두 사용하는 일시적인 형질감염 모델을 확립하여 TPL2의 발현을 성공적으로 하향 조절했습니다(그림 1). 3B; 보충 그림 1). 그런 다음 SCM1 및 MKN45 세포의 거동을 MTS 및 티미딘 혼입 분석법으로 조사했습니다. TPL2의 하향 조절은 5일 동안 대조군에 비해 SCM1 및 MKN45 세포의 세포 생존력을 유의하게 억제했습니다(그림 1). 3또한, N87, SUN5 및 KATO3와 같이 TPL2 발현 수준이 낮은 세포에서도 유사한 패턴이 관찰되었습니다(보충 그림 2). 이와 동시에, 대조군에 비해 SCM1 또는 MKN45 그룹의 siTPL2, shTPL2 또는 TPL2 억제제에서 티미딘 혼입 계수율의 비율이 감소했습니다(그림 1). 3D). 동시에, 특정 TPL2 약리학적 억제제가 유사한 패턴을 보였다(보충 그림 3). 우리의 결과는 TPL2 녹다운과 약리학적 억제 모두 대조군에 비해 세포 생존력을 감소시켰으며, 이는 TPL2가 이러한 세포의 증식과 생존을 모두 지원하는 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 세포 증식을 위한 TPL2의 필수적인 역할은 피하 이종이식 종양 모델에서 추가로 확인되었습니다. 그림과 같이. 3E, shTPL2-SCM1 그룹의 종양형성은 TPL2의 침묵(a-b) 또는 TPL2 억제제(c-d)에 대한 노출 하에서 4주 후에 더 낮은 종양 무게와 더 작은 종양 부피가 관찰되었기 때문에 현저하게 감소했습니다. 도 3F에서, 도 3E의 종양 중량 및 부피를 정량화하고 각각의 대조군과 비교하였다. 또한, shTPL2(a-b) 또는 TPL2 억제제에 대한 노출은 SCM1 세포의 콜로니 형성 분석에서 입증된 바와 같이 독소루비신 처리에 감작을 나타냈습니다(그림 1). 3G). 도 3H에서, 도 3G의 콜로니 형성 분석의 정량화는 독소루비신 처리(100 nM) 유무에 관계없이 SCM1 및 MKN45 세포에서 TPL2 녹다운에 대해 수행되었습니다(n = 6). 통계적 유의성은 *p < 0.05로 표시됩니다. 또한, 인장 고리 세포 암종에 유래하고 독소루비신 및 5-FU와 같은 화학요법제에 특히 민감한 MKN45 세포가 보충 그림 18에 포함되었습니다. 이러한 발견은 TPL2 침묵 또는 TPL2 억제제가 GC 세포의 증식 및 화학 요법 독소루비신 치료 내성을 약화시키는 것으로 나타났습니다.

그림 1 

TPL2는 GC에서 과발현되었으며 불량한 예후와 유의한 관련이 있습니다. 공용 웹 서버 GENT2는 정상 및 종양 조직 전반에 걸쳐 발현 패턴을 탐색하기 위해 제공됩니다. 1ᅡ. TPL2 mRNA 수준은 정상 및 종양 조직 전반에 걸쳐 유전자 발현 패턴을 탐색하고 다양한 조직에 걸쳐 조직 전체 발현 프로필을 검색하기 위한 플랫폼인 GENT2의 정상 조직보다 위 선암종 조직에서 더 높았습니다. 암 실험 전반에 걸친 유전자 발현 프로파일에 대한 박스플롯[GPL96 플랫폼(HG-U133A)]. 1B. TCGA 정상 데이터와 일치 유전자 발현 프로필, T(n=408), N(N=36)에서 백만당 전사체(TPM)를 보여주었습니다. TPL2는 위암 암종 샘플의 정상 조직과 비교하여 종양 조직에서 상향 조절되었습니다. 1C. 인간 정상 위 점막(왼쪽), 중분화 장형 선암종(가운데), 저분화 장형 선암종(오른쪽)에서 TPL2 발현의 대표적인 면역염색. 스케일 바: 25μm.

TPL2 과발현은 GC 세포 증식 및 화학 요법 내성을 촉진합니다.

위에서 제안한 제안을 검토하기 위해, 여러 옵션에 의해 확립된 2개의 과발현 TPL2 GC 세포주(AGS/ovTPL2-#1 및 AGS/ovTPL2-#2, N87/ovTPL2-#1, N87/ovTPL2-#2)가 실험 방법의 연속 섹션 및 범위에 따라 생성에 사용됩니다(그림 1). 4A). 동시에 MTS 분석 및 [³H]-티미딘 혼입 분석을 TPL2 억제제 유무에 관계없이 수행했습니다. 그 결과 세포사멸이 크게 감소하고 세포 증식이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 1). 4B-4C), TPL2 과발현이 AGS 및 N87 세포의 증식을 촉진하고 이 효과가 TPL2 활성에 의존한다는 것을 시사합니다. 또한, MEK 경로를 조절하는 TPL2의 역할도 조사되었으며 보충 그림 4에 제시되어 있으며, 여기서 TPL2는 이 신호 캐스케이드의 활성화에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 일관되게, 티미딘 혼입 분석 및 생체 내 피하 종양 이종이식 분석은 또한 TPL2 과발현이 GC 세포 증식을 촉진하고 종양 성장에 중요한 역할을 한다는 것을 확인했습니다(그림 1). 4C, 4D). 종양 무게(왼쪽)와 종양 부하(오른쪽)의 정량화는 그림에 나와 있습니다. 4E. TPL2 과발현이 독소루비신(아드리아마이신) 내성에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해 AGS/ovTPL2 세포를 독소루비신으로 처리한 후 콜로니 형성 분석을 수행했습니다. 결과는 TPL2의 과발현이 독소루비신에 대한 AGS, N87 세포의 내성을 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 1). 4F). 그림에 제시된 정량화 분석. 4G. 웨스턴 블로팅 분석을 사용하여 TPL2 과발현이 독소루비신 유도 절단 카스파제-3 세포사멸에 영향을 미치는지 여부를 조사했습니다. 대조군과 비교하여 AGS/ovTPL2 또는 N871/ovTPL2 세포는 독소루비신 치료 시 세포사멸률이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1). 4H), 독소루비신 유도 세포사멸이 TPL2의 과발현에 의해 약화되었음을 암시합니다.

그림 2 

높은 MAP3K8 mRNA 발현은 GC 환자의 전체 생존 확률을 감소시켰습니다. 이들은 위암(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=gastric)에 대한 공개 웹 서버 KM Plotter와 위 선암종(https://ualcan.path.uab.edu/)에 대한 앨라배마 대학교 버밍엄 암 데이터 분석 포털(UALCAN)의 데이터를 탐색하고 제시합니다. 2ᅡ. 높은 TPL2 발현은 위암에서 전체 생존(OS) 확률 감소와 관련이 있었습니다. 얻은 데이터는 TPL2 평가를 위해 Kaplan-Meier plotter.com 를 사용한 포괄적인 검색을 통해 데이터 세트(219934_s_at, n = 592)에서 가져왔습니다. 2B. TPL2 발현 증가는 위암에서 첫 번째 진행(FP) 확률 감소와 관련이 있었습니다. 얻은 데이터는 TPL2 검증을 위해 Kaplan-Meier plotter.com 를 사용한 웹 기반 생존 분석을 통해 데이터 세트(205027_s_at, n = 358)에서 가져왔습니다. 2C. TPL2 발현의 증가는 위암에서 진행 후 생존(PPS) 확률 감소와 관련이 있었습니다. 얻은 데이터는 TPL2 분석을 위해 Kaplan-Meier plotter.com 를 사용하여 데이터베이스를 통해 데이터 세트(204573_s_at, n = 498)에서 가져왔습니다. TPL2 발현으로 분류된 GC 환자의 두 그룹에 대한 Kaplan-Meyer 플롯. 통계 분석은 표시된 대로 로그 순위 테스트로 수행되었습니다. 빨간색, 높은 발현 그룹; 검은색, 낮은 발현 그룹. 2차원. 샘플 유형에 따른 위암 환자에서 TPL2의 발현. 정상(n=34), 기본(n=415). * p < 정상군에 비해 0.05입니다. 2E. 종양 등급에 따른 위암 환자에서 TPL2의 발현. 정상(n=34), 1등급(n=12), 2등급(n=148), 3등급(n=246). * p < 정상군과 비교하여 0.05입니다. 2층. 개별 암 병기에 따른 위암 환자의 TPL2 발현. 정상(n=34), 1등급(n=18), 2등급(n=123), 3등급(n=169), 4등급(n=41). * p < 정상군에 비해 0.05입니다.

TPL2는 PPARδ와 상호 작용하여 저산소증 신호 전달 경로에 영향을 미칩니다.

암 내성은 진실성 메커니즘과 관련된 복잡성 현상이며, 저산소증은 세포 발현 프로그램에 영향을 미치고 화학 저항성을 향상시키는 고형 종양의 주요 특징 중 하나입니다. TPL2가 종양 성장 및 약물 내성을 촉진하는 메커니즘을 탐색하기 위해 저산소증 조건에서 이중 루시페라제 리포터 분석을 수행했습니다. 8개의 신호 전달 경로 중 HRE 및 PPRE 경로만이 SCM1 및 MKN45에서 TPL2 녹다운 후 유의미한 영향을 받았고 상대적 루시페라제 활성이 감소하여 PPRE 경로에 TPL2가 관여할 가능성이 있음을 시사하며, 저산소증은 HRE 및 PPRE 경로를 표적으로 삼고 이후 루시페라아제 활성을 확대합니다(그림 1). 5A-5B)를 참조하십시오. 또한, TPL2의 과발현은 저산소증 유발 HRE 및 PPRE 경로 활성화를 현저하게 증가시켰습니다(그림 1). 5C-5D). 우리는 또한 위암 선암종의 입력 유전자의 발현 패턴을 성장 및 화학 저항성 유전자에서 스크리닝하고 식별합니다(그림 1). 5다음으로, qRT-PCR을 이용하여 BCL2, c-MYC(MYC), 사이클린 D1(CCND1) 및 화학저항성 후보 ABCB1, ABCC1 및 CD44에 의한 증식 유전자의 다운스트림 표적 발현을 분석하였다. 대조군과 비교하여 TPL2가 AGS 세포를 과발현했을 때 관련 요인의 유의한 상향 조절이 개별적으로 발견되었습니다. TPL2 과발현 N87 세포에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다(그림 1). 5F). 약리학적 억제 및 유전자 조작, TPL2 과발현 또는 shTPL2 녹다운 모두 위에서 설명한 바와 같이 일관된 결과를 생성했습니다(보충 그림 5). 그 동안 TCGA-STAD 데이터 세트(GSE2865)를 사용하여 유전자 세트 농축 분석(GSEA)을 수행하고 TPL2와 저산소증 및 퍼옥시좀 신호 전달의 양의 상관관계를 검증했습니다(그림 1). 5F).

그림 3 

TPL2 하향 조절은 GC 세포 증식, 종양 형성 및 독소루비신 내성을 억제했습니다. 3ᅡ. 상기 다른 인간 GC 세포주에서 TPL2 발현 수준은 웨스턴 블로팅에 의해 결정되었습니다. 3B. SCM1 및 MKN45 세포에서 TPL2 녹다운의 웨스턴 블롯 분석. 세포에 스크램블 siRNA(scr; 5 μg/mL) 또는 TPL2 특이적 siRNA(siTPL2#1 및 siTPL2#2; 각각 5 μg/mL)와 비표적 shRNA 대조군(shNC; 5 μg/mL) 또는 TPL2 특이적 shRNA(shTPL2#1 및 shTPL2#2; 각각 5 μg/mL)를 형질감염시켰습니다. 24시간 후, 세포를 수확하고 TPL2 발현 분석을 위해 단백질 용해물을 준비했습니다. GAPDH는 내부 로딩 제어로 사용되었습니다. TPL2 단백질은 특정 1차 항체를 사용하여 검출되었습니다. 결과는 위암 세포에서 TPL2의 효과적인 녹다운을 입증하여 관찰된 단백질 신호의 특이성을 뒷받침합니다. 3C. SCM1 및 MKN45 세포에서 TPL2 녹다운의 MTS 분석(n = 6). *p < 0.05. 3D. 티미딘 혼입은 TPL2 후 세포 증식을 관찰하는 데 사용되었습니다. SCM1 또는 MKN45 세포에서 녹다운. 계수 세포의 수를 기록했습니다(n = 6). *p < 0.05. 3E. 누드 마우스에서 제거된 종양의 대표적인 이미지. 모든 마우스는 처음에 복강에 주입된 동일한 수의 암세포(1 × 10⁶)를 접종했습니다. 종양은 MKN45 또는 SCM1 세포의 복강내 주사 후 7일 동안 확립되도록 허용되었습니다. 7일째부터 마우스를 30일 동안 TPL2 억제제(5mg/kg, 주 2회)로 복강내(i.p.) 치료했습니다. 별도의 실험에서 마우스에게 MKN45/shTPL2 세포(n = 5) 또는 대조군 MKN45 세포(n = 5)를 이식하고 4주 동안 모니터링했습니다. 그런 다음 이미징 및 추가 분석을 위해 종양을 수확했습니다. "I" 및 "II"는 다음과 같이 서브그룹을 나타낸다: a. 그룹 I: shEGF 또는 그룹 II: shTPL2로 형질감염된 위암 SCM1 세포에 대한 접종; 비. 그룹 I: shEGF 또는 그룹 II: shTPL2로 형질감염된 위암 MKN45 세포 접종; 씨. 그룹 I: 대조군 또는 그룹 II: TPL2 억제제(inh)로 처리된 위암 SCM1 세포 접종; 디. 그룹 I: 대조군 또는 그룹 II: TPL2 억제제(inh)로 처리된 위암 MKN45 세포 접종. 도 3E의 서브그룹 a, b, c 및 d를 정량화하고 도 3F. 3F에 제시했습니다. 도 3E의 종양 중량 및 종양 부피의 정량화를 각각의 대조군과 비교하여 분석하였다. 표시된 결과는 그룹당 최소 5마리의 마우스 수를 대표합니다. 모든 실험은 최소 3회 반복되었습니다. *p < 0.05. 3G. 화학 요법 독소루비신 치료 유무에 관계없이 SCM1 세포에서 TPL2 녹다운 또는 억제제의 콜로니 형성 분석(100 nM). "I" 및 "II"는 다음과 같이 서브그룹을 나타낸다: a. 그룹 I: shEGF 또는 그룹 II: shTPL2로 형질감염된 위암 SCM1 세포에 대한 접종; 비. 그룹 I: 대조군 또는 그룹 II: TPL2 억제제(inh)로 처리된 위암 SCM1 세포 접종; 씨. 그룹 I: shEGF 또는 그룹 II: shTPL2로 형질감염된 위암 SCM1 세포를 접종한 후 독소루비신 처리(100nM)를 접종합니다. 디. 그룹 I: 대조군 또는 그룹 II: TPL2 억제제(inh)로 처리된 위암 SCM1 세포를 접종한 후 독소루비신 치료(100nM)를 접종합니다. 도 3G의 서브그룹 a, b, c 및 d를 정량화하고 도 3H. 3H에 제시하였다. 도 3G의 콜로니 형성 분석에서 독소루비신 처리(100 nM) 유무에 관계없이 SCM1 및 MKN45 세포에서 TPL2 녹다운을 위해 정량화하였다(n = 6). 통계적 유의성은 *p < 0.05로 표시됩니다.

TPL2에 의한 PPARδ 신호 전달의 조절에 대한 더 많은 통찰력을 얻기 위해 TPL2가 침묵하거나 과발현되었을 때 PPARδ 발현을 검출했습니다. 그 결과, PPARδ 단백질 수준은 저산소증 조건에서 TPL2 발현 변화와 함께 유의하게 변화했습니다(그림 1). 6A-a)를 포함하지만 PPARα 또는 PPARγ 단백질은 아닙니다(데이터는 표시되지 않음). TPL2의 과로는 PPARδ 생산을 증가시키고 TPL2의 억제는 PPARδ 양을 감소시킵니다(그림 1). 6A-bc)를 사용합니다. 정량 분석은 보충 그림 6에 나와 있습니다. 동시에, 이러한 효과는 PPARδ 루시페라아제 리포터 분석 및 웨스턴 블롯 분석에서 TPL2 억제제를 사용하여 입증된 바와 같이 TPL2의 키나아제 활성에 의존하는 것으로 밝혀졌습니다(보충 그림 7 및 8). 또한, 두 단백질이 상호작용을 하는지 여부를 공동 면역침전 실험을 통해 조사하였다. 외인성 FLAG 태그 TPL2는 HA 태그 PPARδ로 풀다운되었고, 마찬가지로 PPARδ는 FLAG 태그 TPL2 면역침전 복합체에서 검출되었습니다(그림 1). 6B-6C). 놀랍게도 TPL2는 내인성 면역침전된 PPARδ 복합체에서도 관찰되었습니다(그림 1). 6D). 더 중요한 것은 ChIP 분석이 TPL2 하향 조절이 PPARδ 결합 부위로 이전 보고서에 의해 입증된 사이클린 D1 프로모터 영역에 대한 PPARδ의 결합을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다(그림 1). 6E). 위에서 언급한 보고에 따르면, 공초점 분석은 두 단백질이 SCM1 세포에서 공동 국소화를 갖는 것을 추가로 입증했습니다(도 1). 6F). 염색 특이적 및 녹다운 효율은 보충 그림 9에 표시된 바와 같이 면역형광 염색에 의해 확인되었습니다. 이러한 데이터는 TPL2와 PPARδ가 서로 상호 작용한다는 것을 시사하며, 이들의 연관성에 대한 증거는 공초점 공국소화뿐만 아니라 보완적인 접근법의 조합에서 파생됩니다. 특히, 공동 면역침전 분석(그림 6BD; 보충 그림 19) 기능 분석(보충 그림 7 및 8)은 두 단백질 사이의 구체적이고 기능적으로 관련된 상호 작용에 대한 생화학적 및 기계론적 지원을 제공합니다. 종합하면, 이러한 발견은 TPL2가 PPARδ 신호 전달의 조절에 관여하고 PPARδ와의 상호 작용에 의해 PPARδ 활성에 영향을 미친다는 것을 암시합니다.

그림 4 

TPL2 상향 조절이 GC 세포 증식, 종양 형성 및 독소루비신 내성에 미치는 영향. 4ᅡ. AGS 및 N87 세포에서 TPL2 과발현의 웨스턴 블롯 결과. 항-TPL2(왼쪽) 및 항-TPL2(오른쪽) 항체를 사용하였다. 4B. TPL2 과발현 및 TPL2 억제제가 있거나 없는 AGS 및 N87 세포의 성장률을 MTS 분석으로 모니터링했습니다(n = 6). *p < 0.05. 4C. 티미딘 혼입 분석은 TPL2 과발현, TPL2 억제제 및 대조군 세포가 있는 AGS 및 N87 세포에서 세포 증식을 검출하는 데 사용되었습니다. 정량화 세포의 수를 기록했습니다(n = 6). *p < 0.05. 4D. 3주 후 TPL2 과발현(ovTPL2; n = 6) 또는 대조군 벡터(pcDNA3; n = 8)로 AGS 또는 N87 세포를 이식한 누드 마우스에서 절제된 종양의 대표 이미지. 모든 마우스는 초기에 복강내 주사를 통해 동일한 수의 암세포(1 × 10⁶)를 접종했습니다. 종양의 무게와 부피를 분석하고 대조군과 비교하였다. "I" 및 "II"는 다음 하위 그룹을 나타냅니다: 그룹 I: pcDNA3(대조군), 그룹 II: ovTPL2(TPL2 과발현). 4E. 종양 무게(왼쪽) 및 종양 부하(오른쪽)의 정량화(n = 6). *p < 0.05. 4층. 독소루비신 처리(50nM) 하에서 TPL2 과발현(ovTPL2; 5μg/ml)이 있거나 없는 AGS 및 N87 위암 세포를 사용하여 콜로니 형성 분석을 수행했습니다. 세포를 대조군 벡터 pcDNA3 또는 TPL2 과발현 플라스미드로 형질감염시킨 다음 독소루비신으로 처리했습니다. 그룹 I: pcDNA3(대조군), 그룹 II: ovTPL2(TPL2 과발현). 4G입니다. 독소루비신 처리(50nM) 유무에 관계없이 TPL2 과발현 AGS, N87 세포 및 대조군 세포의 정량화(n = 6). *p < 0.05. 4시간. 독소루비신 처리(50nM) 유무에 관계없이 세포사멸성 AGS, N87 세포의 웨스턴 블롯 분석. TPL2 발현 세포는 항세포사멸 효과가 있었습니다. GAPDH는 내부 통제로 사용합니다. 4나. Cleavage caspase3 형태 발현 프로파일의 정량화(n = 6). *p < 0.05.

그림 5 

TPL2는 HIF1α/PPARδ 경로의 조절에 관여했습니다. 5ᅡ. 이중 루시페라제 리포터 분석은 표시된 바와 같이 8개의 전형적인 신호 전달 경로 리포터 시스템을 사용하여 SCM1/shTPL2 세포에서 수행되었습니다(n = 6). *p < 0.05. 5B. 이중 루시페라제 리포터 분석은 표시된 바와 같이 8개의 전형적인 신호 전달 경로 리포터 시스템을 갖는 MKN45/shTPL2 세포에서 제시되었습니다(n = 6). *p < 0.05. 5C. 저산소증 치료 후 AGS/ovTPL2 세포에서 HIF1α/PPARδ 경로에 대한 이중 루시페라제 리포터 분석(n = 6). *p < 0.05. 5D. 저산소증 노출 후 N87/ovTPL2 세포에서 HIF1α/PPARδ 축에 대한 이중 루시페라제 리포터 분석(n = 6). *p < 0.05. 5E. 위암 선암종에서 입력 유전자(MAP3K8, HIF1A, PPARD, BCL2, MYC, CCND1, ABCB1, ABCC1, CD44)의 발현 패턴. 5층. RT-qPCR에 의한 AGS/ovTPL2 세포에서 BCL2, c-MYC, Cyclin D1, ABCB1, ABCC1 및 CD44의 상대적 mRNA 발현(n = 6). *p < 0.05. 5G. RT-qPCR에 의한 N87/ovTPL2 세포에서 BCL2, c-MYC, 사이클린 D1, ABCB1, ABCC1 및 CD44의 상대적 mRNA 발현(n = 6). *p < 0.05. 5시간. 저산소증 경로의 유전자 세트와 TPL2 발현을 비교하는 GSEA 분석. 데이터는 TCGA 데이터베이스에서 얻었습니다. 나는. 과산화좀 경로의 유전자 세트와 TPL2 발현을 비교하는 GSEA 분석(GSE2865). 데이터는 TCGA 데이터베이스에서 얻었습니다.

그림 6 

TPL2는 HIF1α/PPARδ 축의 표적화에 참여했습니다. 저산소증 치료 후 하룻밤 동안 위암 세포 형질감염 shEGFP, shMAP3K8(shTPL2), pcDNA3 및 pDONR223-MAP3K8(ovTPL2) 또는 TPL2 억제제. 6ᅡ. 표시된 대로 정상산소 또는 저산소 조건에서 PPARα, PPARβ 및 PPARδ 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석. 6나. Co-IP 분석은 HA-PPARδ 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 SCM1/TPL2 세포에서 수행되었습니다. 6C. 외인성 TPL2는 항-HA 항체로 면역침전되었습니다. 6D. 면역침전 분석에 의한 단백질-단백질 상호작용. 내인성 PPARδ는 Co-IP 분석을 통해 SCM1/TPL2-2 세포에서 항-FLAG 항체로 끌어내렸습니다. 6E. 염색질 면역침전(ChIP)을 사용하여 단백질-유전자 상호작용을 평가했습니다. 내인성 TPL2는 SCM1 세포에서 항-PPARδ 항체와 공동면역침전되었습니다. TPL2 녹다운 및 대조군 세포가 있는 SCM1 세포에서 분리된 염색질을 사용하여 수행된 ChIP 분석 결과. 항-PPARδ 항체에 의해 면역침전된 DNA를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 정상 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다. 6층. SCM1/TPL2 세포에서 TPL2(빨간색)와 PPARδ(녹색)의 공동 국소화가 나타났습니다. 스케일 바: 30μm. 표시된 모든 결과는 최소 5개의 독립적인 실험을 대표합니다.

PPARδ는 GC 세포에서 TPL2 발현을 유의하게 조절합니다.

흥미롭게도, PPARδ(5'-AGGTCA-3')의 두 추정 합의 결합 부위가 전사 시작 부위의 -1930 및 -375bp 상류에 위치한 TPL2 프로모터 영역에서 발견되었습니다. PPARδ가 TPL2 발현을 조절하는지 여부를 평가하기 위해 shPPARδ, ovPPARδ 플라스미드 및 강력한 약리학적 PPARδ 작용제인 L-165,041 및 선택적 PPARδ 길항제인 GSK 0660을 형질감염하여 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)에 의한 DNA 결합 활성과 염색질 면역침전(ChIP) 분석에 의한 DNA-단백질 상호작용을 각각 평가합니다. PPARδ 결합 부위에 대한 EMSA의 결과, 특히 shPPARδ 및 GSK0660 노출 하에서 SCM1 세포에서 TPL2 프로모터 부위 활성을 유의하게 약화시켰습니다. 일치하는 상호 결과는 PPARδ 과발현 또는 L-165,041이 TPL2 DNA 결합 활성에 대한 영향을 촉진했다는 것을 볼 수 있었습니다(그림 1). 7A). 보다 직접적인 증거를 제공하기 위해 SCM1 세포에서 제조된 염색질을 사용하여 ChIP 분석을 수행했습니다. 결과는 ovPPARδ 또는 내인성 PPARδ가 추정되는 TPL2 결합 부위에 결합하는 것으로 나타났습니다(그림 1). 7B). PPARd가 TPL2 전사를 직접 조절하는지 확인하기 위해 리포터 분석도 수행됩니다. PPRE 요소의 돌연변이는 AGS 및 SCM1 세포 모두에서 PPARδ 유도 프로모터 활성화를 유의하게 약화시켰습니다(보충 그림 10). 또한, 웨스턴 블롯 결과는 TPL2 발현 수준이 PPARδ 녹다운 또는 과발현에 의해 변화하는 것으로 나타났습니다. 한편, 강력한 PPARδ 작용제인 L-165,041은 SCM1 및 MKN45 세포에서 TPL2 발현을 현저하게 증가시켰습니다. GSK 0660, 선택적 PPARδ 길항제는 TPL2 발현을 감소시켰습니다. 이러한 데이터는 TPL2가 전사 수준에서 PPARδ에 의해 조절된다는 것을 시사했습니다. (그림. 7C) 보충 그림 11에 표시된 정량 분석. 또한, PPARδ 항체로 면역염색을 통해 조직 절편의 임상 피험자에서 PPARδ와 TPL2 발현 사이의 양성 연관성이 관찰되었습니다(그림 1). 7D). 또한, 웹 기반 상관관계에 의해, 318에서 PPARδ의 낮은 발현 수준 사이에 현저하게 양의 상관관계가 있었다. 선택한 매개변수를 사용하고 Kaplan-Meier 플로터(KMplot.com), 확률 GSE208044 데이터 세트 또는 TCGA에 의해 실행되는 위암 환자 558명에서 PPARδ의 높은 발현 수준(그림 1). 7E). 동시에 유전자형-조직 발현 프로젝트와 암 게놈 아틀라스의 데이터를 먼저 통합하여 172개의 건강한 조직과 413개의 종양 조직의 전사체를 종합적으로 분석했습니다(그림 1. 7F). 중요하게도, TPL2 항체 및 PPARδ 항체로 면역염색에 의해 조직 마이크로어레이 30건에서 PPARδ와 TPL2 발현 사이의 양성 연관성이 관찰되었습니다(그림 1). 7G). 구조 생물학 분석에 의한 TPL2(Thr 290) 및 PPARδ(Thr 256) 활성 부위의 단백질-단백질 상호작용 및 국소 상호작용 위치의 표면 표현이 도에 나타났습니다. 7H-7I. DSC는 단백질-단백질 결합 사건의 민감한 검출기이자 이러한 상호 작용의 에너지를 조사하는 정량적 방법 역할을 합니다. 우리의 실험에서 우리는 열 전이 피크에서 오른쪽으로 이동하는 것을 관찰했는데, 이는 TPL2/PPARD 단백질 안정성이 증가하여 결합 또는 복합체 형성을 제공함을 나타냅니다(보충 그림 12). 물리적 상호 작용을 확인하기 위해 시험관 내 GST 풀다운 분석을 수행했습니다. 보충 그림 20에서 볼 수 있듯이 GST-TPL2[30-397]는 PPARδ를 성공적으로 끌어내렸지만 GST 단독은 그렇지 않았습니다. 또한 PPARδ가 없는 대조 반응에서는 신호가 검출되지 않아 상호 작용의 특이성을 뒷받침했습니다. 이 결과는 DSC 실험에 사용된 절단된 TPL2 단백질이 PPARδ에 결합하는 능력을 유지한다는 것을 검증합니다. 종합적으로, 이러한 데이터는 PPARδ가 TPL2 발현을 유의하게 조절할 수 있음을 강력하게 나타냅니다.

PPARδ 녹다운은 TPL2 유도 세포 증식 및 화학 저항성을 감소시키며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

GC 세포 증식 및 화학 저항성에서 TPL2와 PPARδ 사이의 기능적 관계를 결정하기 위해 TPL2 과발현 AGS 및 N87 세포에서 PPARδ를 침묵시켰습니다. MTS 분석은 PPARδ 침묵이 정상적인 배양 조건 또는 독소루비신 처리 조건에서 TPL2 과발현 유도 세포 생존력을 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 1). 8AB; 8E-F). 동시에 PPARδ 과발현 SCM1 및 MKN45 세포에서 TPL2를 침묵시켰습니다. 결과는 TPL2 침묵이 저산소증 배양 조건에서 PPARδ 과발현 유도 세포 생존력을 감소시켰다는 것을 나타냈습니다. (그림. 8C-8D) 또한, PPARδ 과발현 세포에서 TPL2 녹다운은 또한 PPARδ 매개 세포 성장 및 독소루비신 내성을 지연시켰다. 이러한 효과는 TPL2 억제제를 사용하여 입증된 바와 같이 TPL2 키나아제 활성을 필요로 합니다(보충 그림 13). 이러한 관찰은 TPL2와 PPARδ가 세포 증식과 화학 요법에 대한 반응을 상호 의존적으로 조절한다는 것을 시사합니다. 따라서 이전 연구 결과와 함께 우리는 그림 2에 묘사된 바와 같이 GC 세포 증식 및 화학 저항성의 조절에 관여하는 TPL2/PPARδ 상호 포지티브 피드백 루프를 제안합니다. 8G.

토론

COT 또는 MAP3K8이라고도 알려진 TPL2는 이전에 TNFαR, IL1R, TLR, CD40, IL17R 및 염증 반응의 캐스케이드 조절에 관여하는 일부 GPCR의 다운스트림에서 활성화되는 것으로 보고되었습니다[7]. 새로운 증거에 따르면 TPL2는 전립선암, 췌장암 및 방광암을 포함한 다양한 종양의 핵심 요소입니다[35-39]. 본 연구에서 우리는 TPL2가 GC 암 조직에서 유의하게 상향 조절되고 TPL2의 높은 발현이 낮은 전체 생존율 및 이 암의 임상병리학적 특성과 상관관계가 있음을 입증했습니다. 또한, 우리는 TPL2 하향 조절이 GC 세포 증식 및 종양 성장을 방해한다는 것을 처음으로 입증했습니다. 반대로, TPL2 발현의 증가는 GC 세포주 증식과 생체 내 종양 성장을 유의하게 향상시켰습니다. 또한 TPL2 발현은 GC 세포의 독소루비신 내성과 양의 상관이 있었으며, 이는 TPL2가 항세포사멸 인자가 될 수 있음을 시사합니다. TPL2의 임상적, 생물학적 중요성을 감안할 때, 이 연구는 TPL2가 GC 예후를 위한 잠재적인 바이오마커가 될 수 있으며 향후 GC 치료제에 잠재적으로 적용될 수 있음을 보여주었습니다.

그림 7 

TPL2는 PPARδ에 의해 유의하게 조절되었습니다. 과발현 또는 shRNA PPARδ 플라스미드를 SCM1 세포에 형질감염시켰다. 한편, L-165,041, 강력한 PPARδ 작용제 및 GSK 0660, 선택적 PPARδ 길항제도 효과를 평가하기 위해 노출됩니다. 7ᅡ. PPARδ의 2개의 추정 합의 결합 부위가 TPL2 프로모터 영역(-1940 내지 -1920 bp, -385 내지 -365 bp)에서 나타났다. 그런 다음 DNA 결합 활성을 EMSA 분석으로 검사했습니다. 표시된 결과는 적어도 5개의 독립적인 실험을 대표합니다. 7B. 과발현 또는 shRNA PPARδ를 형질감염시켰을 때 SCM1 세포에서 TPL2 프로모터 리포터의 CHIP 분석. 표시된 결과는 적어도 5개의 독립적인 실험을 대표합니다. 7C. TPL2 발현에 대한 웨스턴 블롯 검출. ovPPARδ 또는 shPPARδ 플라스미드로 형질감염된 MKN45 및 SCM1 세포에서 TPL2의 상대적 단백질 수준과 L-165,041 및 GSK 0660에 의한 약리학적 유도. 표시된 결과는 적어도 5개의 독립적인 실험을 대표합니다. 7D. PPARδ는 타이중 재향군인종합병원(TCVGH) 조직은행(n=45)의 위암 조직에서 상향조절됩니다. (a) 인간 정상 위 점막에서 PPARδ 발현의 대표적인 면역 염색. (b) 저분화 장 선암종, (c) 점막의 미만성 선암종. 스케일 바 = 100 μm. 7E. 높은 PPARδ 발현은 위암의 전체 생존 확률 감소와 관련이 있었습니다. 얻은 데이터는 PPARδ 평가를 위해 Kaplan-Meier plotter.com 를 사용한 포괄적인 검색을 통해 데이터 세트(208044_s_at, n = 875)에서 가져온 것입니다. 위암(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=gastric)에 대한 공개 웹 서버 KM Plotter의 데이터를 탐색하고 제공합니다. 7층. 공개적으로 이용 가능한 유전자형-조직 발현(GTEx, n = 172) 및 암 게놈 아틀라스(TCGA, n = 413) 유전자 발현 데이터에서 파생된 정상 조직 및 종양 샘플의 PPARδ 발현 수준은 각각 상자 및 수염 그림으로 표시됩니다. 사분위수 분포로 계층화된 OS. *p < 0.05. 7G. Pearson 상관 계수 분석을 사용하여 GC 표본(n = 30)에서 TPL2와 PPARδ 발현 사이의 상관 관계를 평가합니다. 그래프의 점 중 일부는 둘 이상의 표본을 나타냅니다. 7H. 단백질-단백질 상호작용의 표면 표현. TPL2(빨간색) 및 PPARδ(노란색)는 표면 표현으로 표시됩니다. 7나. TPL2(Thr 290) 및 PPARδ(Thr 256) 활성 부위의 국소 상호 작용 위치.

그림 8 

세포 증식 및 독소루비신 내성 조절에서 TPL2와 PPARδ 사이의 기능적 관계. 8ᅡ. 세포 생존력은 PPARδ 녹다운 유무에 관계없이 AGS/TPL2에서 MTS 분석으로 측정되었습니다. 대조군과 비교하여 #P<0.05. *대조군과 비교하여 P < 0.05. 8B. 세포 생존력은 PPARδ 녹다운 유무에 관계없이 N87/TPL2 세포에서 MTS 분석으로 측정되었습니다. 대조군과 비교하여 #P<0.05. *대조군과 비교하여 P < 0.05. 8C. 저산소증 배양 조건에서, 표시된 대로 pcDNA3-PPARδ, shTPL2, 빈 벡터 또는 pcDNA3 플라스미드를 결합된 방식으로 형질감염된 SCM1 세포에서 MTS 분석. 대조군과 비교하여 #P<0.05. *대조군과 비교하여 P < 0.05. 8D. 저산소증 배양 조건에서, 표시된 대로 pcDNA3-PPARδ, shTPL2, 빈 벡터 또는 pcDNA3 플라스미드를 조합된 방식으로 형질감염된 MKN45 세포에서 MTS 분석. 대조군과 비교하여 #P<0.05. *대조군과 비교하여 P < 0.05. 8E. 세포 생존력은 표시된 대로 SCM1 세포를 사용하여 구배 독소루비신 처리 하에서 MTS에 의해 검사되었습니다. 대조군과 비교하여 #P<0.05. *대조군과 비교하여 P < 0.05. 8층. 세포 생존력은 표시된 대로 MKN45세포를 사용하여 구배 독소루비신 처리 하에서 MTS로 측정되었습니다. 대조군과 비교하여 #P<0.05. *대조군과 비교하여 P < 0.05. 8G입니다. TPL2와 PPARδ 사이의 포지티브 피드백 루프의 개략도.

기계적으로 Paarth B Dodhiawala et al. TPL2를 MAPK와 NF-κB 캐스케이드를 모두 추진하는 필수 키나아제로서 IRAK의 새로운 표적 유전자로, TPL2 억제제는 생체 내 PDAC 성장을 억제하기 위해 화학 요법과 시너지 효과를 발휘했습니다[40]. Maria Vougioukalakiet al. TPL2-MEK-ERK가 암 치료에 중요한 영향을 미칠 수 있는 접착 관련 분자에 의해 분기된다고 보고했습니다[41]. TPL2는 또한 C/EBPB, NFκB, AP-1/달팽이 축, VEGF를 조절하여 세포 대사 재프로그래밍에 기여하고 위 종양 성장 및 복막 파종을 크게 촉진합니다[23]. 최근 연구에 따르면 TPL2는 LMP1에 의한 발암성 JNK 신호 전달과 EBV 형질전환 세포의 세포 생존을 매개하는 것으로 나타났으며, TPL2는 이식 후 림프증식성 질환과 같은 EBV 유발 악성 종양에 대한 신약 또는 기존 억제제의 용도 변경에 대한 매력적인 표적으로 간주되어야 합니다[42]. 또한, TPL2 녹아웃 마우스 절제술은 간 염증 및 지방증을 억제하여 간세포 암종 발병을 억제했으며, 이는 Tpl2의 전염증 효과가 간세포암종 예방 및 간세포암종 발달 억제를 위한 분자 표적이 될 수 있음을 시사했습니다[43]. 또한, TPL2 의존성 산화 버스트는 TLR3 및 TLR 9 신호 전달 동안 세포외 신호 조절 키나아제의 인산화를 유도합니다. 선천적 숙주 방어 메커니즘에서 TPL2의 중요성을 추가로 확인하고 면역 체계가 병원체 특이적 유전자 발현 패턴을 맞춤화하는 것을 밝힐 수 있습니다[44]. 본 연구에서 우리는 TPL2가 저산소증 상태를 심화시켜 암세포 증식 및 화학 저항성 중에 관여할 수 있다는 새로운 신호 전달 경로를 발견했습니다. 이중 루시페라제 리포터 분석 스크리닝에 따르면 TPL2 발현이 PPARδ 및 HRE 신호 전달과 높은 관련이 있음을 발견했습니다. TPL2의 하향 조절은 이 신호 전달의 활동을 현저하게 약화시켜 경로에 TPL2의 관여를 암시합니다. 한편, TPL2가 PPARδ에 의해 조절된다는 증거도 제공했습니다. 프로모터 서열 분석을 통해 TPL2 프로모터에서 PPARδ의 추정 결합 부위 하나를 관찰했습니다. ChIP 분석은 PPARδ가 추정 프로모터 영역에 결합하는 것을 확인했습니다. qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 데이터는 PPARδ가 전사적으로 TPL2 발현을 증가시킬 수 있다는 추측을 뒷받침했습니다. 따라서 우리는 PPARδ 신호 전달을 강화하고 GC 발달 및 진행으로 이어지기 위해 새로운 TPL2/PPARδ 상호 포지티브 피드백 루프를 최초로 제안했습니다(보충 그림 14).

독소루비신은 위암에 대한 중요한 제제 중 하나이며, 항암 약력학의 메커니즘은 (i) DNA로의 삽입 및 토포이소머라제-II 매개 DNA 복구의 파괴 및 (ii) 자유 라디칼의 생성 및 세포막, DNA 및 단백질에 대한 손상을 통해 이루어집니다(Thorn et al., 2011). 후천성 독소루비신 약물 내성은 PTEN/Akt 신호 전달 경로 또는 관련 다중 신호 전달 경로를 조절하여 화학요법 효과를 심각하게 방해하여 항상 예후가 좋지 않습니다(Xu et al., 2017; Xu et al., 2018). 중요한 것은 독소루비신이 정상산소 상태에서 HIF1a 발현을 유도했으며 저산소증에 의해 악화되었다는 것입니다(보충 그림 15). 이러한 결과는 독소루비신에 반응하여 정상산소 HIF-1a를 상향 조절하는 종양 세포의 이전 보고서와 일치했습니다(Cao et al., 2013; Osada-Oka et al., 2022). 또한, 상술한 효과는 PPARδ 및 TPL2 키나아제 생성과 일치하였다. 동물 검증 효과에서 우리는 녹다운 TPL2가 독소루비신 약물 효과를 향상시킨다는 것을 입증했습니다. TPL2의 과발현은 독소루비신 요법 효과에 저항했습니다(보충 그림 16). 이러한 결과는 TPL2/PPARδ 표적 전략이 화학 저항성 효능 및 종양 진행을 차단할 수 있다는 가설을 강조합니다.

TPL2 유전자는 실제로 전장 M1-TPL2(p58)와 더 짧은 M30-TPL2(p52)의 두 가지 이소형을 암호화하며, 둘 다 각각 메티오닌 1(M1) 및 메티오닌 30(M30)에서 대체 번역 개시를 통해 동일한 mRNA에서 번역됩니다. 전형적으로, 두 이소형 모두 존재하고 사용된 항체가 이를 인식할 수 있는 경우, 웨스턴 블로팅에 의해 두 개의 별개의 밴드를 관찰할 수 있습니다. 이전 연구에서 우리는 이소형 안정성에서 그림 3A 및 3B: A에서 단일 밴드의 존재를 설명할 수 있는 주요 이유를 확인했습니다. M1 이소형(p58)은 종종 불안정하고 특히 특정 세포 조건에서 급속한 프로테아좀 분해되기 쉽습니다. 이전 실험에서 우리는 프로테아좀 억제제 MG132로 샘플을 처리하고 두 번째 밴드의 재출현을 관찰하여 M1 이소형이 처리되지 않은 조건에서 분해된다는 개념을 뒷받침했습니다. 우리의 실험(그림 3A 및 3B)에서 이것은 사용된 실험 조건에서 위암 세포에서 M30 이소형의 우세한 발현 및/또는 더 높은 안정성 때문일 수 있습니다. 더 긴 이소형이 더 낮은 수준에서 발현되거나 더 빠르게 분해되어 분석의 검출 한계 미만일 수도 있습니다.

종양의 맥락에서 TPL2(Tumor Progression Locus 2)와 NF-κB1 p105 사이의 상호 작용은 염증, 세포 생존 및 종양 진행을 조절하는 데 복잡하고 잠재적으로 이중 역할을 합니다[45-48]. TPL2는 MEK/ERK 신호 전달 경로를 활성화하여 염증 유발 및 생존 유전자의 발현을 촉진하는 MAP3K입니다. 정상적인 조건에서 NF-κB1 p105는 화학량론적 고친화성 복합체에서 TPL2에 결합하여 키나아제 활성을 억제하고 제어되지 않는 신호 전달을 방지합니다. 종양에서 p105의 인산화 및 분해 또는 TPL2의 과발현을 통한 이러한 상호 작용의 조절 장애는 ERK 신호전달의 구성적 활성화로 이어질 수 있으며, 종양 세포 증식, 세포사멸에 대한 저항성 및 종양 유발 염증 미세 환경에 기여할 수 있습니다. 더욱이, p105 처리를 통한 비정상적인 NF-κB 신호 전달은 만성 염증을 더욱 유발하고 발암 과정을 지원할 수 있습니다. 보충 그림 17에서 우리는 저산소증 상태에서 NF-κB1 p105가 특정 세린 잔기(특히 인간 p105의 Ser337)에서 인산화된다는 것을 발견했으며 TPL2의 억제가 이 효과를 차단했습니다. 또한, MEK 억제제는 세포 증식(보충 그림 4 및 보충 그림 5) 및 관련 신호 전달 캐스케이드(보충 그림 7)를 약화시킬 수 있었습니다. 따라서 TPL2-p105 축은 염증과 암을 연결하는 중요한 조절 노드를 나타내며, 그 파괴는 잠재적으로 종양 발생 및 진행을 촉진합니다.

상당한 양의 문헌에서 PPARδ의 다발성 효과가 종양 형성, 진행 및 침윤에 광범위하게 관여한다는 것이 입증되었습니다[49-51]. Yi Liu 등은 PPARδ 경로가 BMP7/TAK1 신호전달의 상향 조절을 통해 장 상피 세포(IEC)에서 β-카테닌 활성화를 강화하고 CRC에서 PDGFRβ, AKT1, EIF4G1 및 CDK1을 포함한 여러 다른 중요한 전종양 형성 단백질을 상향 조절하여 종양 진행 및 침범을 촉진한다는 것을 입증했습니다[49]. 또한, PPARδ 활성화는 KRASmu 췌장 상피 세포가 CCL2를 분비하도록 유도하며, CCL2는 CCL2/CCR2 축을 통해 면역억제 대식세포와 골수 유래 억제 세포를 췌장으로 모집하여 면역억제 종양 미세 환경을 조율하고 이후 PanIN을 PDAC로 진행합니다[50]. 또한 Xiangsheng Zuo와 그의 동료는 PPARδ가 면역 적격 마우스에서 B16-F10 흑색종 세포의 폐 전이에서 EMT, 혈관신생, 이동, 침범을 촉진한다고 지적했습니다[51]. 이에 비추어 볼 때, 우리의 결과는 초기 단계의 유전자 조절을 제외하고; 또한, TPL2는 TPL2(Thr290/Ser400) 부위 및 PPARδ(Thr256) 부위 하에서 단백질 상호 작용을 통해 하류 표적에 대한 PPARδ의 결합을 강화할 수 있습니다. 그러나 TPL2가 PPARδ와 상호 작용하는 방식에 대한 정확한 메커니즘은 아직 알려지지 않았습니다. 흥미롭게도, PPARδ 표적 유전자 및 PPARδ 매개 세포 증식 억제의 매개체인 CDKN1C(p57kip2라고도 함)는 PPARδ(-/-) 마우스에서 관찰된 종양 내피 증식 및 종양 혈관신생의 조절 완화에 대한 가능한 기계론적 설명을 제공합니다. 이는 기능적 종양 미세혈관의 형성을 허용하기 위해 종양 내피 세포 증식을 제한하는 데 있어 PPARδ의 예상치 못한 필수적인 역할을 가리킵니다[52]. PPARδ는 고갈된 조직 배양 배지에서 성장하고 저포도당 및 저산소증과 같은 기타 소포체 스트레스 조건에서 생존할 수 있는 능력을 부여했으며, 이는 PPARδ가 가혹한 대사 조건에서 유방암 세포의 생존을 촉진한다는 것을 시사합니다[53]. Bokai Zhu et al. PPARδ는 소포체 스트레스의 억제를 통해 종양유전자 유도 세포 노화를 촉진한다고 보고되었습니다[54]. Yalan Wuet al. HIF1α 안정성과 혈관 복구 및 혈관 완전성 회복에 참여하는 다운스트림 표적 유전자를 상호 향상시키는 저산소증 유도 PPARδ를 제시했습니다. PPARδ-HIF1α의 상호 작용 및 조절은 후지 허혈의 관류 회복에 중요합니다[55]. 이러한 메커니즘은 종양 성장과 관련된 저산소증에 중요한 역할을 하며 악화됩니다.

결론

이 연구는 TPL2가 위암(GC)과 다른 암 유형에서 과발현된다는 것을 보여줍니다. 상향 조절은 GC 환자의 낮은 전체 생존율과 밀접한 관련이 있습니다. TPL2는 저산소증/PPARδ 축 신호 전달을 증폭시켜 세포 증식을 촉진하고 독소루비신 내성을 향상시킵니다. 도 8G는 인간 위암 세포에서 저산소증 유도 PPARδ/TPL2 발현을 포함하는 신호 전달 경로를 보여줍니다. 우리의 연구 결과는 GC 개발에서 PPARδ 신호 전달의 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, TPL2는 암을 넘어 병적 저산소증과 관련된 질병의 치료를 포함하는 잠재적인 치료 표적 역할을 할 수 있습니다.

약어

TPL2: 종양 진행 유전자좌 2

GC: 위암

PPARδ: 퍼옥시좀 증식제 활성화 수용체 델타

IHC: 면역조직화학적

EMSA: 전기영동 이동성 이동 분석

ChIP: 염색질 면역침전

IP: 면역침전

MTS: 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내염

qRT-PCR: 정량적 실시간 PCR

TPM: 백만 당 성적 증명서

PPRE: 퍼옥시좀 증식제 반응 요소

OS: 전체 환자 생존

FP: 첫 번째 진행

PPS: 진행 후 생존

CCND1: 사이클린 D1

GSEA: 유전자 세트 농축 분석

보충 자료

보충 방법, 그림 및 표.

승인

저자는 타이중 재향군인종합병원(TCVGH), 특히 핵심 시설인 의학연구부, 동물 관리 센터에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 또한 shRNA에 대해 대만 타이페이에 있는 National RNAi Core Facility Platform에, pcDNA에 대해 National Yang-Ming University의 게놈 연구 센터에 감사를 표합니다. 비영리 플라스미드 저장소인 Addgene은 고품질 플라스미드를 저장하고 배포하는 유용한 플라스미드 기반 연구 자료를 공유합니다. 데이터 가용성 연구 결과를 뒷받침하는 데이터는 합당한 요청 시 해당 저자로부터 제공됩니다. 일부 데이터는 환자의 개인 정보 보호 또는 윤리적 제한으로 인해 제공되지 않을 수 있습니다. 이 연구는 대만 교육부(MOE-112-S-0023-A)의 고등 교육 새싹 프로젝트 프레임워크에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

자금

이 작업은 대만 국가과학기술위원회(NSTC)(111-2320-B-005-007-MY3; 109-2320-B-005-012-MY3; 106-2320-B-005-001-MY3), 타이중 재향군인종합병원(TCVGH-1117301C; TCVGH-YM1110103) 이 연구는 대만 교육부(MOE-112-S-0023-A)의 고등 교육 새싹 프로젝트 프레임워크에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

윤리 승인 및 참여 동의

이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 대만 타이중 재향군인종합병원(TVGH)의 기관 윤리 위원회(승인 번호 CE19188B)의 승인을 받았습니다. 모든 참가자는 원래 연구와 연구 바이오뱅크에 대해 서면 동의서를 제공했습니다. 투명성 및 과학적 엄격성 선언: 이 선언은 이 논문이 설계 및 분석, 동물 실험에 대한 IJBS 지침에 명시된 전임상 연구의 투명한 보고 및 과학적 엄격함에 대한 원칙을 준수하고 자금 지원 기관, 출판사 및 지원 연구에 참여하는 기타 조직에서 권장하는 원칙을 준수함을 인정합니다. 모든 동물 실험 절차는 TVGH의 동물 복지 위원회에서 심사를 받았으며 연구는 대만 타이중 재향군인 종합병원의 해당 기관 위원회(승인 번호 La-1021063 La-1091722, 1091723, La-1091723)의 승인을 받았습니다. 동물 연구는 ARRIVE 지침(du Sert et al., 2020) 및 British Journal of Pharmacology(Lilley et al., 2020)의 권장 사항에 따라 보고됩니다.

저자 기여 명세서

KLL, DWL, CNY, HCP, SMW, LWS, CCS, SHL은 모든 마우스 및 세포 실험을 수행하고 데이터를 생성 및 분석했습니다. KLL은 임상 피험자 샘플링을 수행했습니다. DWL, CNY 및 SHL은 임상 정보 분석을 수행했습니다. HTO, ZTH, KLC, CSC 디스플레이는 실코 예측 및 정렬에 있습니다. LWS, CCS는 분자 도킹을 수행했습니다. SMW 분석 가장 낮은 에너지 및 가중 점수. SHL과 MLS는 연구를 구상하고, 데이터를 해석하고, 원고의 초안 작성 및 비판적 수정을 제공했습니다. MLS는 실험을 설계하고, 데이터를 분석하고, 원고를 작성했습니다. 모든 저자는 연구 데이터에 접근할 수 있었고 최종 원고를 검토하고 승인했습니다. KLL과 HCP는 이 작업에 동등하게 기여했습니다.

데이터 가용성 선언문

이 연구 결과를 뒷받침하는 데이터는 합당한 요청 시 해당 저자로부터 제공됩니다.

출판 동의

원고는 출판을 위해 모든 저자의 승인을 받았습니다.

투명성과 과학적 엄격함 선언

이 선언은 이 논문이 설계 및 분석, 면역블로팅 및 면역화학 및 동물 실험에 대한 영국 약리학 저널(British Journal of Pharmacology) 지침에 명시된 바와 같이 전임상 연구의 투명한 보고 및 과학적 엄격성에 대한 원칙을 준수하고 자금 지원 기관, 출판사 및 지원 연구에 참여하는 기타 조직에서 권장합니다.

경쟁하는 이해관계

저자는 경쟁 이해관계가 존재하지 않는다고 선언했습니다.

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저자 연락처

 교신 저자: Meei-Ling Sheu, Ph.D., Institute of Biomedical Sciences, College of Life Sciences, National Chung Hsing University, 250, Kuo Kuang Road, Taichung 402, Taiwan. 이메일: mlsheu@nchu.edu.tw. Shing-Hwa Liu 박사, 국립 대만 대학교 의과대학 독성학 연구소, 타이베이, 대만. 이메일: shinghwaliu@ntu.edu.tw.

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인용 스타일

APA 복사

Lan, KL, Lai, DW, Yang, CN, Pan, HC, Ou, HT, Yu, SI, Hsieh, TC, Ye, YL, Chan, CY, Chou, KL, Wu, SM, Shen, LW, Shen, CC, Chen, L., Liu, SH, Chiu, C., Arbiser, JL, Sheu, ML (2025). TPL2는 PPARδ를 사용한 저산소증 유도 양성 피드백 루프를 통해 위암 진행 및 화학 저항성을 촉진합니다. 국제 생물 과학 저널, 21(13), 5874-5890. https://doi.org/10.7150/ijbs.111998.

ACS 복사

란, KL; 라이, DW; 양, CN; 팬, HC; 오우, HT; 유, SI; 시에, TC; 예, Y.L.; 찬, CY; 초우, KL; 우, SM; 셴, LW; 셴, CC; 첸, L.; 리우, SH; 치우, C.; 아르비저, J.L.; Sheu, ML TPL2는 PPARδ를 사용한 저산소증 유도 포지티브 피드백 루프를 통해 위암 진행 및 화학 저항성을 촉진합니다. 국제 J. Biol. Sci. 2025, 21 (13), 5874-5890. DOI: 10.7150/ijbs.111998.

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Lan KL, Lai DW, Yang CN, Pan HC, Ou HT, Yu SI, Hsieh TC, Ye YL, Chan CY, Chou KL, Wu SM, Shen LW, Shen CC, Chen L, Liu SH, Chiu C, Arbiser JL, Sheu ML. TPL2는 PPARδ를 사용한 저산소증 유도 양성 피드백 루프를 통해 위암 진행 및 화학 저항성을 촉진합니다. 국제 J Biol Sci 2025; 21(13):5874-5890. 도이:10.7150/ijbs.111998. https://www.ijbs.com/v21p5874.htm

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Lan KL, Lai DW, Yang CN, Pan HC, Ou HT, Yu SI, Hsieh TC, Ye YL, Chan CY, Chou KL, Wu SM, Shen LW, Shen CC, Chen L, Liu SH, Chiu C, Arbiser JL, Sheu ML. 2025. TPL2는 PPARδ를 사용한 저산소증 유도 양성 피드백 루프를 통해 위암 진행 및 화학 저항성을 촉진합니다. 국제 J Biol Sci. 21(13):5874-5890.

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