췌장암 모델에서 Lu 기반 나노신틸레이터에 의한 방사선 요법 향상에 대한 물리적 및 생물학적 기여 결합

[dhleepaul]

췌장암 모델에서 Lu 기반 나노신틸레이터에 의한 방사선 요법 향상에 대한 물리적 및 생물학적 기여 결합

사라 스텔스-마송1,2, 제니 리트비넨코3, 크리스텔 베드레갈-포르투갈1, 클레망틴 오브룬1,2, 마테오 라보1, 말리카 카드리1, 티보 자케1,2, 크리스틴 모리스콧4, 브누아 갈레5, 브누아 쇼벨롱6,7, 장 뤽 콜1, 장 뤽 라바나트8, 에바 미호코바3,9, 바츨라프 추바3, 엘렌 엘로움2,*, 안느 로르 불랭1,*, 

Combined physical and biological contributions to radiotherapy enhancement by Lu-based nanoscintillators in pancreatic cancer mo

* 참고문헌: [보고서]암 오가노이드 모델을 이용한 췌장암 전이의 후성유전학적 조절 기전 연구

[보고서]암 오가노이드 모델을 이용한 췌장암 전이의 후성유전학적 조절 기전 연구

1. 그르노블 알프스 대학교, INSERM U1209, CNRS UMR5309, 첨단 생명과학 연구소, 암 표적 및 실험 치료제 팀, 38000 그르노블, 프랑스.
2. 그르노블 알프스 대학교, INSERM UA7, 생물의학을 위한 싱크로트론 방사선, 38000 그르노블, 프랑스.
3. 프라하에 있는 체코 공과대학교 원자력 과학 및 물리 공학 학부, 프라하 1, 115 19, 체코.
4. 그르노블 알프스 대학교, EMBL, 통합 구조 생물학 그르노블(ISBG), UAR3518 CNRS CEA, 38000 그르노블, 프랑스.
5. 그르노블 알프스 대학교, 구조 생물학 연구소, CNRS CEA, 38000 그르노블, 프랑스.
6. 그르노블 알프스 대학교, 분자 약리학부, CNRS UMR 5063, 38000 그르노블, 프랑스.
7. Service de Biochimie SB2TE, Institut de Biologie et Pathologie, CHU Grenoble Alpes, 38041 Grenoble Cedex, France.
8. 그르노블 알프스 대학교, CEA, CNRS, 그르노블 INP, SyMMES UMR 5819, 38000 그르노블, 프랑스.
9. 체코 과학 아카데미 물리학 연구소, Cukrovarnická 10, 프라하, 162 00, 체코.
* 이 저자들도 동등하게 기여했습니다.

✉ 교신저자: 이메일: anne-laure.bulin@inserm.fr.

수신일: 2025-4-4; 수락 2025-6-3; 게시 날짜: 2025-6-23

인용:

Stelse-Masson S, Lytvynenko X, Bedregal-Portugal K, Aubrun C, Lavaud M, Kadri M, Jacquet T, Moriscot C, Gallet B, Chovelon B, Coll JL, Ravanat JL, Mihóková E, Čuba V, Elleaume H, Bulin AL. 췌장암 모델에서 Lu 기반 나노신틸레이터에 의한 방사선 요법 향상에 대한 물리적 및 생물학적 기여를 결합했습니다. 나노더아노스틱스 2025; 9(3):199-215. 도이:10.7150/NTNO.115120. https://www.ntno.org/v09p0199.htm

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추상적인

근거: 췌장암은 예후가 좋지 않아 더 나은 치료가 필요합니다. 한 가지 유망한 접근 방식은 전리 방사선을 가시광선으로 하향 변환하여 X선 조사 시 다양한 방사선 치료 효과를 유발하는 나노신틸레이터를 사용하여 방사선 요법을 개선하는 것을 목표로 합니다. 그러한 효과 중 하나는 나노신틸레이터 코어에 존재하는 고Z 요소에 의해 구동되는 방사선량 증강입니다. 이러한 원소는 X선을 효율적으로 흡수하여 주변 조직의 방사선량을 증폭시키는 2차 전자를 방출합니다.

방법: 이 논문에서 우리는 루테튬 기반 나노신틸레이터인 Lu3Al5O12:P r@SiO2가 두 가지 인간 췌장암 세포 모델, 즉 PANC-1 및 MIA PaCa-2에서 방사선량 증강 효과를 발휘하는 능력을 연구합니다.

결과: Lu3Al5O12:P r@SiO2 나노입자는 2D 및 3D 모델에서 최대 1mg/mL까지 무시할 수 있는 독성을 보였습니다. 단색 싱크로트론 방사선을 사용하여 무독성 나노입자 농도가 에너지 의존적 방식으로 3D 스페로이드의 방사선량을 증가시킨다는 것을 입증했습니다. 이러한 결과는 몬테카를로 시뮬레이션에 의해 추가로 뒷받침되었습니다. 이러한 물리적 기여 외에도 γ-H2AX 초점 정량화는 방사선 감작에 대한 생물학적 구성 요소를 밝혔습니다: Lu3Al5O12:P r@SiO2 나노입자는 초기 DNA 손상을 증폭시켰을 뿐만 아니라 복구도 손상시켰습니다.

결론: 이러한 발견은 DNA 복구의 물리적 선량 증강과 생물학적 조절을 결합하여 방사선 요법 강화에 대한 Lu3Al5O12:P r@SiO2 나노입자의 이중 기여를 강조합니다.

키워드: 나노신틸레이터, 방사선 요법, 방사선량 증강, 방사선 감작, 췌장암

소개

췌관 선암종은 여전히 세계에서 가장 치명적인 암 중 하나이며 평균 5년 생존율은 7%에 불과합니다. 현재 미국에서 암 사망의 세 번째 주요 원인이며[1] 2030년까지 두 번째로 증가할 것으로 예상되며[2], 질병을 관리하기 위한 새로운 전략의 필요성이 강조됩니다. 현재 수술이 유일한 근치적 치료 옵션이지만 수술을 받을 수 있는 환자는 20% 미만이며 불완전 절제는 여전히 주요 문제로 남아 있습니다[3]. 재발률을 줄이고 생존 결과를 개선하기 위해 화학 요법 및 방사선 요법과 같은 보조 요법이 연구되었으며 다양한 정도의 성공을 거두었습니다. 보조 화학 요법은 지속적으로 생존 결과를 개선하고 현재 표준 치료에 포함되어 있지만 방사선 요법의 이점은 여전히 명확하지 않습니다. 국소 제어를 개선하는 능력이 입증되었지만 환자의 생존 결과를 개선하지는 못했습니다[4,5]. 선량 증량 방사선 요법 접근법으로 유망한 결과가 나타나고 있지만[5,6], 이러한 전략은 인접한 건강한 조직에 대한 독성을 증가시킬 위험이 있습니다. 따라서 종양 조직에 대한 특이성이 증가한 췌장암에 대한 방사선 치료 접근법을 개발하는 데 분명한 관심이 있습니다. 광역학 요법(PDT)은 췌장암 치료에 대해 유망한 전임상 및 임상 결과를 보여준 빛 기반 암 치료법입니다[7,8]. 병용 요법으로 더 적합할 수 있지만 치료 결과를 극대화하기 위한 보조 또는 국소 치료로서 가능성을 보여줍니다[8]. PDT는 가시광선에 의한 감광성 분자의 활성화에 의존하여 괴사 또는 세포사멸을 통해 종양 세포 사멸을 초래하는 세포독성 활성 산소종(ROS)을 생성합니다. 이 치료법은 건강한 조직에 대한 독성 최소화, 저항 메커니즘 부족, 전신 면역 발달과 관련된 염증 반응 유도 능력 등 여러 가지 장점이 있지만[9,10], 주로 조직에서 빛의 얕은 침투 깊이에 의해 적용이 제한됩니다[9,11,12].

PDT를 더 깊은 종양으로 확장하기 위한 몇 가지 전략이 모색되고 있으며, 그 중 하나는 X선 유도 PDT(X-PDT)라는 과정에서 X선을 활성화 소스로 사용하는 데 의존합니다. 이 과정은 이온화 방사선을 가시 범위에서 낮은 에너지 광자로 하향 변환하는 나노입자 또는 나노신틸레이터를 섬광시켜 매개할 수 있습니다[13,14]. 섬광성 나노입자는 감광제에 접합하거나 근처에 위치할 때 X선에 의해 여기된 국소 광원으로 작용하여 X-PDT를 유도하여 가시광선에 의한 활성화의 침투 깊이 문제를 극복할 수 있습니다[14,15]. 본 연구에서는 Lu3Al5O12:P r3+를 섬광 물질로 선택했습니다. 결정 형태일 때 광범위하게 연구된 이 물질은 많은 포르피린 기반 감광제의 흡수와 잘 겹치는 약 400nm[16-19]에 도달하는 강력한 방사성 발광 방출로 잘 알려져 있습니다. 이전 연구에서는 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 성공적인 합성을 보여주었고 이러한 나노입자가 감광제 프로토포르피린 IX(PpIX)를 활성화하여 X선 조사 하에서 일중항 산소를 생성할 수 있음을 입증했습니다[20], 따라서 X-PDT 제제로서의 가능성을 보여줍니다.

감광제와의 접합을 통해 X-PDT를 유도할 가능성 외에도 섬광 나노입자는 몇 가지 다른 중요한 항종양 효과, 특히 고원자 번호(high-Z) 원소에 의해 유도된 방사선량 증강(RDE) 효과를 유도할 수 있습니다. 직교전압 X선(<250keV)을 조사하면 고Z 물질은 주변 조직보다 X선 광자를 더 효율적으로 흡수하여 이온화 이벤트를 생성하여 국부 에너지 증착을 증가시키는 광전자, 오거 및 콤프턴 전자를 생성합니다[21,22]. 이 개념은 1980년대 초 Callisen, Norman 및 공동 연구자들에 의해 방사선량을 높이기 위해 분자 요오드화 조영제를 사용했음에 의해 처음 기술되었습니다[23,24]. 나중에 Hainfeld et al. 종양 조직 내 축적을 개선하기 위해 고Z 요소로 구성된 나노입자의 사용을 도입하여 나노입자 강화 방사선 요법 분야를 열었습니다[25,26]. 후속 연구에서는 높은 Z 요소의 충분한 종양 내 흡수 후 X선 조사가 기존 방사선 요법 단독에 비해 전달되는 방사선량을 크게 증가시키고 더 큰 DNA 손상을 유도하는 것으로 나타났습니다[27]. 최근 여러 연구에서 이 RDE 효과를 통해 전임상 모델에서 종양 사멸을 향상시키는 고Z 나노신틸레이터의 능력이 입증되었습니다[28-31]. 우리는 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자도 강력한 용량 증강 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대합니다. 생물학적 모델에서 이 화합물의 복잡한 X-PDT 효과를 조사하기 전에 먼저 RDE 효과의 기여도와 그 효능을 주도하는 매개변수를 보다 철저하게 이해하는 것이 중요합니다. 이 논문에서 우리는 단층 또는 3D 스페로이드 모델로 성장한 두 개의 췌장암 세포주인 PANC-1 및 MIA PaCa-2에서 RDE 효과를 유도하는 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노신틸레이터의 능력에 대한 연구를 제시합니다.

방법Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노신틸레이터의 합성

Lu3Al5O12:P r3+ (1%) 나노분말은 광유도 침전법을 사용하여 제조되었습니다[32]. 질산, 수산화암모늄(25-29%, p.a., PENTA) 및 무수 에탄올(≥ 99.8%, p.a., PENTA)을 포함한 모든 화학 시약은 추가 정제 없이 사용되었으며 상업용 공급원에서 구입했습니다. 합성 전에 PrO2-x(≥ 99.999%, Koch-Light Laboratories)를 진한 질산에 용해시켜 Pr3+ 원액을 제조했습니다. 질산루테튬 오수화물(99.999%, Sigma-Aldrich) 3x10-3mol/L, 질산알루미늄 비수화물 5x10-3mol/L(99.997%, Sigma-Aldrich), 포름산암모늄 0.1mol/L(≥ 99.995%, Sigma-Aldrich) 및 3x10-5mol/L를 함유한 반응액을 탈이온수에서 제조하였다. 용액을 4×25W 저압 수은 램프로 3.5시간 동안 조사했습니다. 조사 후 얻어진 젤라틴 생성물을 0.45μm HAWP 멤브레인 필터(Millipore Ltd.)를 이용하여 미세여과에 의해 용액에서 여과하고 공기 중에서 건조시켰다. Lu3Al5O12:P r3+ 나노분말은 0415 VAK 진공로(Clasic)에서 1100°C에서 2시간 동안 분쇄된 전구체를 소성하여 얻었다. Lu3Al5O12:Pr 3+ 나노분말 200mg을 초음파 수조에서 40mL의 무수 에탄올에 분산시킨 다음 자기 교반기에 놓았습니다. 23μL의 테트라에톡시실란(TEOS; ≥99%, Sigma-Aldrich)을 현탁액에 첨가했습니다. 그 후, 7mL의 수산화암모늄 용액을 혼합물에 적가하여 12시간 동안 격렬하게 교반하였다. 얻어진 실리카 코팅 나노입자를 물로 3회 세척하고 공기 중에서 건조시켰다.

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노 신틸레이터의 특성화

X선 회절(XRD) 측정은 각각 40kV 및 15mA의 고전압 및 전류 설정으로 Cu X선관(Kα 1,2 = 0.15418nm)이 장착된 Rigaku MiniFlex 600 회절계를 사용하여 수행되었습니다. 수집된 데이터를 평가하고 ICDD PDF-2 데이터베이스 버전 2013을 사용하여 표준과 비교했습니다. 나노신틸레이터의 결정체 크기는 FWHM(절반 최대의 전체 너비)과 계산을 위해 Scherrer 상수 K = 0.94를 사용하여 Halder-Wagner 방법[33]을 적용하여 평가되었습니다.

분말 샘플의 투과전자현미경(TEM) 이미지는 EDX 검출기가 장착된 투과전자현미경 JEOL JEM-3010 9JEOL(Ltd., Tokyo, Japan)으로 수집되었습니다(Oxford Instruments, Abingdon, UK); 고전압 가속은 최대 300kV까지 가능했습니다.

동적 광산란(DLS)은 입자 크기 분포를 결정하는 데 사용되었습니다. DLS 측정은 Zetasizer - Ultra Red(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 실온(RT)에서 수행되었습니다. 측정은 정사각형 구멍이 있는 10mm 유리 셀에서 수행되었습니다. 현탁액 샘플은 초음파 수조에서 증류수 배지에 분말을 1시간 동안 분산시켜 제조했습니다. 샘플의 부피는 약 1.5mL였습니다.

실온 방사선 발광 스펙트럼은 SARRP 조사기(220kV, 13mA, IRMaGe 플랫폼, GIN Grenoble)에 의해 전달되는 다색 X선 조사에서 측정되었습니다. 방사성 발광 신호는 광섬유를 사용하여 수집되어 Kymera 328i 분광기(Andor, Oxford Instruments)에 입력되었습니다. 빛은 300nm에서 발광된 150 l/mm 격자를 사용하여 회절되었고 방사성 발광 스펙트럼은 Newton EM-CCD 카메라(Andor)를 사용하여 획득되었으며 EM-CCD(Newton, Andor, Oxford Instruments)를 사용하여 측정되었습니다.

세포 배양 및 시약

세포주 PANC-1 및 MIA PaCa-2는 The American Type Culture Collection에서 얻었습니다. PANC-1 및 MIA PaCa-2는 남성 환자의 원발성 췌관 선암종에서 유래한 인간 췌장암 세포주입니다. 그들은 10% 태아 소 혈청(Dominique Dutscher)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM, Gibco)에서 유지되었습니다. 배양은 일반적으로 매주 계대되었고 표준 배양 조건(37°C, 5% CO2)에서 30 미만의 계대 수로 유지되었습니다.

3D 배양

종양 스페로이드는 이전에 설명한 바와 같이 24웰 플레이트(Falcon)의 Matrigel(Corning)에서 성장했습니다[34]. 간단히 말해서, 200μL의 마트리겔을 얼음 위에 보관된 24웰 플레이트의 각 웰에 증착했습니다. 그런 다음 Matrigel을 37°C에서 20분 동안 응고시켰습니다. 마트리겔 증착 후, PANC-1 또는 MIA PaCa-2 세포를 1mL 배양 배지의 부피에 7500 세포/웰의 밀도로 파종했습니다. 스페로이드는 나노입자를 첨가하기 전에 배양 조건(37°C, 5% CO2)에서 5일 동안 성장하도록 허용되었습니다. 성장 배지는 필요에 따라 일반적으로 3-5일마다 새로 고쳐졌습니다.

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 원액의 제조

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자의 현탁액은 다음 프로토콜을 사용하여 각 실험 전에 준비되었습니다. Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 분말을 2mg/mL의 농도로 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고 Bioruptor 수조 초음파 처리기(Diagenode)에서 15분 동안 초음파 처리했습니다. 그런 다음 이 원액으로부터 희석액을 준비했습니다. DLS 크기 및 제타 전위 측정은 재료 굴절률 = 1.83, 분산제 굴절률 = 1.34, 점도 = 1.1 cP. 독립적으로 준비된 최소 3개의 샘플에 대해 측정을 수행했습니다.

독성2D로 수행된 실험

PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포를 50μL 배양 배지의 부피에서 7500개 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 파종하고 37°C에서 24시간 동안 성장하도록 방치했습니다. 그런 다음 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 원액을 배지에서 희석하여 원하는 나노입자 농도의 2배에 도달했습니다. 희석된 각 나노입자 현탁액 50μL를 적절한 웰에 첨가하여 각 웰의 총 부피를 100μL로 만들었습니다. 24시간 배양 후, 나노입자 현탁액을 제거하고 세포를 1x PBS로 헹구었습니다. 배양의 생존력은 CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)를 사용하여 평가되었습니다. 희석된 CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent 100 μL(100 μL 배양 배지에 20 μL 시약)를 각 웰에 첨가했습니다. 배양 2시간 후, CLARIOstar Plus 96웰 플레이트 리더(BMG Labtech)를 사용하여 플레이트의 흡광도를 490nm에서 판독했습니다. 조건당 3개의 웰에서 데이터를 얻었고, 실험은 세포주당 3회 수행되었습니다.

3D 모델에서 수행된 실험

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자의 현탁액을 완전 배지에서 원액을 희석하여 원하는 농도로 제조하였다. 배지를 각 웰에서 제거하고 0.5mL의 적절한 나노입자 현탁액으로 교체했습니다. 배양물을 24시간 동안 인큐베이터로 되돌린 후 나노입자 현탁액을 제거하고 각 웰을 1x PBS로 헹구었습니다. 배양의 생존 가능성을 평가하기 위해 살아있는/죽은 염색 프로토콜을 적용했습니다. 조건당 최소 50개의 스페로이드에서 데이터를 얻었고 실험은 세포주당 두 번 수행되었습니다.

치료 효과2D에서 치료 효과를 평가하기 위한 클론제닉 분석

PANC-1 또는 MIA PaCa-2 세포를 50,000 세포/플라스크의 밀도로 T25 세포 배양 플라스크(Falcon)에 파종했습니다. 4일의 성장 후, 배지를 각 플라스크에서 제거하고 배양 배지에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2(0.5 mg/mL) 현탁액 2mL로 대체했습니다. 37°C에서 24시간 배양한 후, 나노입자 현탁액을 제거하고 세포를 1x PBS로 한 번 헹구고 각 플라스크에 5mL의 신선한 배지를 첨가했습니다. 플라스크는 2 또는 4 Gy(CIX2 조사기, CEA)에서 조사되었습니다. 조사 후, 트립신(트립신-EDTA 0.5%, Gibco)을 사용하여 각 플라스크의 세포를 채취하고 계수하였다. 표 1에서 발견된 밀도에 따라 6웰 플레이트(Falcon)에 파종하기 위해 희석액을 준비했습니다. 콜로니는 37°C에서 2주 동안 성장하도록 방치했으며 필요에 따라 배양 배지를 새로 고쳤습니다. 콜로니가 충분히 성장한 후(일반적으로 2주) 세포를 1x PBS로 세척하고 0.5% 크리스탈 바이올렛(Amresco) 및 6.0% 글루타르알데히드(Sigma Aldrich) 용액으로 염색했습니다. 각 웰의 콜로니 수는 ImageJ를 사용하여 계산하고 각 조건에 대한 생존율을 계산했습니다. 데이터는 조건당 6개의 웰(두 가지 다른 파종 밀도 포함)에서 얻었고 실험은 세포주당 최소 2회 수행되었습니다. 데이터는 Prism을 사용하여 선형 2차 모델에 적합되었습니다. 각 세포주에 대해 선형 2차 모드를 사용하여 대조군 생존 곡선(나노입자 없음)을 피팅하여 이러한 조사 조건에서 세포주의 특징인 알파 및 베타 매개변수를 제공했습니다(그림 3). 나노입자의 존재 하에서 얻은 생존 곡선은 대조군 데이터와 함께 얻은 알파 및 베타 매개변수와 선량에 DEF 인자를 곱한 값을 사용하여 적합시켰습니다. 생존 데이터의 적합성은 [31]에 더 자세히 설명된 대로 DEF 요인을 제공했습니다. 유의성은 양방향 ANOVA와 Tukey 사후 검정을 사용하여 계산되었으며, 여기서 (*)는 p < 0.05를 나타내고, (**)은 p < 0.01을 나타내고, (***)은 p < 0.001을 나타내고, (****)는 p < 0.0001을 나타냅니다.

표 1 

클론 생성 분석 파종 밀도

PANC-1MIA 파카-2

0 Gy	200, 300	200, 300
2 Gy	230, 345	300, 500
4 Gy	260, 390	2500, 5000

3D에서 치료 효능을 연구하기 위한 생존율 분석

5일의 성장 후, 배지를 웰에서 제거하고 배양 배지에 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자(0.5 mg/mL)의 현탁액으로 대체했습니다. 37°C에서 24시간 배양한 후, 나노입자 현탁액을 제거하고 웰을 1x PBS로 한 번 헹구고 각 웰에 1mL의 신선한 배지를 첨가했습니다. 배양은 단색 빔(유럽 싱크로트론 방사선 시설, ESRF, 그르노블, 프랑스)의 ID17 생의학 빔라인)을 사용하여 2, 4 또는 8Gy(62.3 또는 64.3keV)에서 조사되었습니다. 조사 후, 배양물을 6일 동안 인큐베이터로 되돌린 다음 살균/사멸 염색 프로토콜을 적용하여 배양의 생존력을 평가했습니다. 조건당 최소 100개의 스페로이드에서 데이터를 얻었고 실험을 한 번 수행했습니다. 유의성은 양방향 ANOVA와 Tukey 사후 검정을 사용하여 계산되었으며, 여기서 (*)는 p < 0.05를 나타내고, (**)은 p < 0.01을 나타내고, (***)은 p < 0.001을 나타내고, (****)는 p < 0.0001을 나타냅니다.

3D 배양의 생존 가능성을 연구하기 위한 라이브/데드 프로토콜

완전히 괴사된 세포의 대조군(총 사멸 대조군)은 다음 프로토콜에 따라 준비되었습니다: 스페로이드를 실온에서 2분 동안 10% 포르말린(Sigma Aldrich)으로 고정한 다음 1x PBS로 한 번 헹구고 실온에서 30분 동안 0.5% Triton-X 100(Bio-Rad) 용액으로 투과화했습니다. 그런 다음 스페로이드를 0.1 M 글리신(Euromedex)으로 두 번 헹구고 1x PBS에서 유지했습니다. 생존력을 평가하기 위해, 배양 배지(또는 총 사멸 그룹의 경우 PBS)를 각 웰에서 제거하고 PBS에서 2μM 칼세인 AM(Invitrogen) 및 3μM 요오드화 프로피듐(PI)(Sigma Aldrich)을 함유하는 염색 용액 0.5mL로 교체했습니다. 37°C에서 1시간 배양한 후, 5x 대물렌즈(Plan Neofluar, NA = 0.15)를 통해 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM510 ConfoCor II Combination system, Zeiss)을 사용하여 배양물을 이미지화했습니다. 형광 신호는 λexc = 488 nm / λem = 500-540 nm(칼세인) 및 λexc = 543 nm / λem = 600-670 nm(PI)에서 기록되었습니다. 우물당 두 개의 이미지를 촬영했습니다. 이미지 분석은 앞서 설명한 대로 CALYPSO 방법론에 따라 수행되었습니다[34].

흡수 - ICP-MS2D 성장 세포 분석

PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포를 2mL 배양 배지에서 50,000 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 파종했습니다. 4일의 성장 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 배양 배지에서 1mL Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 (0.5 mg/mL) 현탁액으로 대체했습니다. 37°C에서 24시간 동안 배양한 후, 나노입자 현탁액을 제거하고 각 웰을 1x PBS로 헹구었습니다. 그런 다음 세포를 트립신화하고 PBS로 세척한 다음 분석을 위해 100μL PBS에 재현탁했습니다. 각 샘플에 대해 PierceTM BCA 단백질 정량 분석(ThermoFisher)을 수행했습니다. 각 샘플에 포함된 루테튬(175Lu 동위원소)의 양은 사중극자 ICP-MS(Perkin Elmer NexION 2000, Waltham, MA, USA)에 의해 측정되었습니다. 샘플을 실온에서 24시간 동안 질산의 대기압 하에서 광물화한 후 연속 3일 동안 오븐(50°C)에서 8시간씩 3단계를 거쳤습니다. 광물화는 분석 전에 질산의 1% 농도에 도달하도록 희석되었습니다. 표준 용액은 질산 1% v/v에서 제조되었습니다. 103Rh를 내부 표준으로 사용했습니다. 실험은 독립적으로 수집된 세 가지 샘플에 대해 수행되었습니다. 유의성은 p가 0.05< 나타내는 (*)로 짝이 없는 t-검정을 사용하여 계산되었습니다.

3D 성장 세포 분석

5일의 성장 후, 배지를 웰에서 제거하고 배양 배지에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2(0.5 mg/mL)의 현탁액으로 대체했습니다. 37°C에서 24시간 동안 배양한 후, 나노입자 현탁액을 제거하고 각 웰을 1x PBS로 헹구었습니다. 1mL의 세포 회수 용액(Corning)을 각 웰에 첨가하여 Matrigel을 용해시켰습니다. 각 웰의 내용물을 15mL 튜브(Falcon)로 옮기고 얼음 위에 2시간 동안 보관했습니다. 튜브 바닥에 스페로이드가 축적되는 것이 보이면 튜브를 원심분리하고(5분, 1200rpm) 차가운 PBS로 두 번 세척했습니다. 샘플을 수백 마이크로리터에 재현탁하고 ICP-MS 분석까지 -20°C에서 보관했습니다. 각 샘플에 대해 PierceTM BCA 단백질 정량 분석(ThermoFisher)을 수행했습니다. 루테튬의 정량화는 이전 섹션에서 설명한 대로 ICP-MS에 의해 결정되었습니다. 조건당 6개의 웰에서 데이터를 수집했으며 실험은 독립적으로 수집된 두 개의 샘플에 대해 수행되었습니다.

투과 전자 현미경

PANC-1 세포를 Lab-TekTM 챔버 슬라이드(Thermo Scientific)에서 2일 동안 성장시킨 후 배지를 제거하고 배양 배지에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자(0.5 mg/mL)의 현탁액으로 교체했습니다. 배양 24시간 후, 세포를 DMEM으로 세척하고 DMEM에 2% 파라포름알데히드(PFA)(R1026) 및 0.2% 글루타르알데히드(GA, R1020)를 함유한 용액에 부드럽게 흔들면서 30분 동안 고정했습니다. 앞서 설명한 바와 같이 연속적인 고정, 헹굼 및 염색 단계 후[35], 세포를 등급별 에탄올 시리즈로 탈수하고 Epon 수지에 포매했습니다(Embed 812, Electron Microscopy Sciences, 14120). 70nm의 초박형 절편을 울트라마이크로톰(Leica, UC7)에서 절단하고 formvar-carbon-코팅 구리 100 메쉬 그리드(Formvar)에 수집하고 Tecnai G2 Spirit BioTwin으로 690배에서 9300배까지 배율로 이미지화했습니다.

면역형광 염색

12mm 유리 커버슬립(Knittel)을 멸균하고 24웰 플레이트의 웰에 넣었다. PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포를 1mL 배양 배지의 부피에서 30,000 세포/웰의 밀도로 웰에 파종하였다. 48시간 성장 후, 배지를 제거하고 배양 배지에 0.5mL의 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2(0.5 mg/mL) 현탁액으로 대체하였다. 37°C에서 24시간 배양한 후, 나노입자 현탁액을 제거하고 세포를 1x PBS로 한 번 헹구고, 각 웰에 1mL의 신선한 배지를 첨가하였다. 배양물을 2 Gy(SARRP 조사기, GIN)에서 조사하고 인큐베이터로 되돌렸습니다. 1시간 또는 24시간 후, 웰을 트리스 완충 식염수(TBS)로 2회 헹구고 2% PFA(10% 포르말린에서 제조, TBS로 희석)로 4°C에서 10분 동안 고정시켰다. 웰을 TBS로 3회 헹구고 다음날까지 4°C에서 보관하였다. 그런 다음 세포를 TBS에서 0.2% Triton-X 100(Bio-Rad)으로 실온에서 10분 동안 투과화하고, TBS로 한 번 헹구고, TBS에서 5% 소 혈청 알부민(BSA)(Interchim)에서 1시간 동안 차단하였다. 추가 TBS 헹굼 후, 커버슬립을 1차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음 커버슬립을 TBS로 다시 3회 세척하고 실온에서 어두운 곳에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 배양했습니다. TBS를 3회 더 세척한 후, 커버슬립을 실온에서 5분 동안 2μM Hoechst로 염색하고 TBS로 한 번 더 헹구고 형광 마운팅 매체(애질런트)를 사용하여 유리 슬라이드에 장착했습니다. 실온에서 30분 동안 중합하고 4°C에서 보관한 후, 슬라이드를 Stellaris 8 컨포칼 현미경(라이카 마이크로시스템즈)을 사용하여 63X(물침지, NA=1.2)에서 이미지화했습니다. 핵은 λexc = 405 nm(다이오드)에서 여기될 때 이미지화되었고 415 내지 509 nm 사이에서 발광을 수집했습니다. γ-H2AX 병소는 λexc = 499 nm에서 백색 레이저에 의해 전달되는 여기에 의해 이미지화되었습니다. 방출은 509 내지 639 nm 사이에서 수집되었습니다. 약 6 μm의 Z-스택을 0.358 μm의 단계로 획득했습니다. 1차 항체: 항-인-히스톤 H2AX Ser139 클론 20E3 (세포 신호 전달, TBS의 1% BSA에서 1:200). 2차 항체: 염소 항토끼 Alexa Fluor 488 (Invitrogen, TBS의 1% BSA에서 1:500). 초점은 ImageJ 매크로(Bram van den Broek, 네덜란드 암 연구소)를 사용하여 정량화되었습니다. 여기에 표시된 이미지는 배경 신호를 제거하기 위해 다음과 같은 방식으로 ImageJ를 사용하여 처리되었습니다: 핵과 초점 채널을 분리하고 초점 채널에서 배경 빼기를 수행했습니다. 그런 다음 핵 채널을 임계값으로 설정하고 초점 채널에 마스크로 적용하여 핵에 국한되지 않은 신호를 제거했습니다. 조건당 최소 80개의 핵에서 데이터를 수집하고 실험을 한 번 수행했습니다. 유의성은 양방향 ANOVA와 Tukey 사후 검정을 사용하여 계산되었으며, 여기서 (*)는 p < 0.05를 나타내고, (**)는 p < 0.01을 나타내고, (***)은 p < 0.001을 나타내고, (****)는 p < 0.0001을 나타냅니다.

조사 조건다색 조사원 - CEA

X선은 전압 = 195kV, 전류 = 10mA 및 초점 소스 거리 = 40cm의 매개변수로 3mm 알루미늄 필터를 통해 CIX2 조사기(XStrahl)에 의해 전달되었습니다. 균일한 방사선량을 보장하기 위해 세포 배양 플레이트를 조사 필드의 중앙에 배치했습니다. 선량률은 PTW 이온화 챔버(TN30010-1)와 PTW UNIDOS E 전위계를 사용하여 측정되었습니다. 이 실험의 물 속의 일반적인 선량률은 1.8 ± 0.5 Gy/min이었습니다.

다색 조사원 - GIN

X선은 전압 = 220kVp, 전류 = 13mA, 초점 소스 거리 = 35cm의 매개변수와 함께 0.15mm 구리 필터를 통해 SARRP 조사기(XStrahl, SAXO - Grenoble IRMaGe 시설)에 의해 전달되었습니다. 샘플은 조사 필드의 균일한 영역 내에 배치되었습니다. 이러한 실험을 위한 배양 배지의 일반적인 선량률은 3.1 ± 1.0 Gy/min이었습니다.

단색 조사원 - ESRF

방사선 요법은 ESRF에서 의료용 빔라인(ID17)의 단색 X선 빔에 의해 전달되었습니다(빔 시간 번호: md1260). ESRF 장치는 7/8 모드에서 작동되었습니다. w125 위글러는 50mm로 설정되었고 빔 필터는 0.8mm 탄소와 3mm 알루미늄이었습니다.

세포 배양은 루테튬 K-가장자리(63.31keV, 에너지 대역폭 ~ 70eV)보다 1keV 아래 또는 1keV 위의 24웰 플레이트에 조사되었습니다. 세포가 들어 있는 플레이트를 입사 X선 빔에 대해 26° 기울이고 X선 빔(폭 45mm, 높이 1mm)을 통해 2.5mm/s의 속도로 수직으로 스캔하여 총 높이 65mm를 조사했습니다. 처방된 선량을 전달하는 데 필요한 스캔 횟수는 PTW 전위계(PTW UNIDOS E, Freiburg, Germany)로 판독한 이온화 챔버(UNIDOS PTW 31 002, Freiburg, Germany)를 사용하여 측정한 링 전류(mA)와 X선 선량률을 기준으로 계산되었습니다. 실험을 위한 물의 일반적인 선량률은 3.9 ± 0.1 mGy/s/mA였습니다.

몬테카를로 시뮬레이션

Geant4(버전 4.10.1, 패치 01)는 들어오는 X선과 Lu3Al5O12:P r3+ 사이의 1차 상호 작용 중에 생성된 2차 입자(광자 및 전자)의 스펙트럼을 시뮬레이션하는 데 사용되었습니다. Livermore 저에너지 패키지는 이전에 설명한 대로 물리 목록으로 사용되었습니다[30,36]. 간단히 말해서, Lu3Al5O12:P r3+(1nm2 면적 및 1mm 길이)의 막대를 만들어 진공 상태에 놓았습니다. Lu3Al5O12:P r3+ 막대는 1x106 단색 광자(63.31keV 및 64.31keV의 에너지, 즉 Lu K-가장자리 위와 아래의 1keV)의 들어오는 플럭스에 사실상 노출되었습니다. 이 광자는 1nm2 표면의 중심에서 막대에 부딪히고 있었습니다. 이 조사 중에 생성된 모든 2차 입자(전자 및 광자)는 Lu3Al5O12:P r3+ 막대 주위에 대칭으로 배치된 가상 검출기에 의해 수집 및 정량화되었습니다.

결과Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노 신틸레이터는 광유도 침전 방법을 사용하여 성공적으로 합성되었습니다

나노입자는 광유도 침전법을 사용하여 합성된 후 SiO2 층으로 코팅되었습니다. 이 코팅은 여러 가지 역할을 합니다. 표면 패시베이션을 위한 수단을 제공하고 입자 응집을 제한하는 데 도움이 됩니다. 또한, 실리카 쉘은 표면 반응을 통한 미래의 접합 및 기능화를 위한 다목적 플랫폼을 제공합니다. 소성 후 준비된 Lu3Al5O12:P r3+ 및 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자에 대해 수행된 X선 회절도는 그림 1.A에 나와 있습니다. 회절 패턴은 ICDD PDF-2 데이터베이스(카드 번호 01-073-1368)의 Lu3Al5O12:P r3+의 표준 매개변수와 일치하며 입방 결정 구조 및 Ia

d 공간 그룹에 해당합니다. 좁은 피크에서 알 수 있듯이 고체상은 잘 결정화되어 있으며 Lu3Al5O12:P r3+ 및 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 결정자 크기는 각각 (44 ± 6) nm 및 (46 ± 6) nm로 결정되었습니다. 17-37° 2θ 범위에서 관찰된 약간의 배경 강도 증가(그림 1. B)는 실리카 층의 비정질 특성을 확인합니다.

실온 방사성 발광 스펙트럼(그림 1. B)는 4f - 4f 전이(480-650nm)와 관련된 Pr3+ 중심의 전형적인 방출 대역과 5d - 4f 전이로 인해 315nm 및 370nm에서 정점에 도달하는 넓은 방출 대역을 보여줍니다.

그림 1 

Lu3Al5O12:P r3+ 및 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노 신틸레이터는 잘 결정화되어 강한 방사성 발광 신호를 나타냅니다. A) Lu3Al5O12:P r3+(상단) 및 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2(하단) 샘플의 X선 회절 분광법으로 얻은 회절도를 ICDD PDF-2 데이터베이스의 표준 라인과 비교한 회절도(점선, 카드 번호 01-073-1368). B) Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노분말의 실온 방사성 발광 스펙트럼은 Pr3+의 전형적인 방출, 즉 5d-4f 전이에 해당하는 넓은 방출과 4f-4f 전이에 해당하는 좁은 피크를 보여줍니다. C) 변형되지 않은 Lu3Al5O12:P r3+(왼쪽) 및 실리카 코팅된 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2(오른쪽)의 TEM 이미지. 스케일 = 100nm. 삽입물에는 SiO2 코팅의 세부 사항이 표시됩니다(노란색 화살표로 표시됨). 스케일 = 20nm. D) 동적 광산란(DLS)으로 측정한 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁 후 동결건조된 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자의 입자 크기 분포. 독립적으로 준비된 최소 3개의 샘플에 대해 측정을 수행했습니다.

SiO2 변형 전후에 나노입자에 대해 수행된 TEM 이미징은 나노입자가 둥근 모양과 약간의 입자 상호 성장을 나타내는 것을 보여줍니다. 또한, 나노입자는 결상을 얻는 데 필요한 고온 어닐링 단계로 인해 응집되는 것으로 보입니다. 실리카 캡슐화 공정은 측정된 두께가 약 2.5nm인 나노입자 표면에 비교적 매끄러운 SiO2 층을 형성하며, 이는 XRD 측정에서 얻은 결과와 잘 일치합니다. 증류수에 분산시킬 때 DLS 방법으로 얻은 입자 크기 분포는 Lu3Al5O12:P r3+ 및 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2개 샘플에 대해 각각 (99 ± 6) nm 및 (106 ± 6) nm의 평균 입자 크기를 초래합니다. 재현탁 프로토콜 후 PBS에서 수행된 DLS 측정은 617 ± 46 nm의 더 높은 입자 크기와 0.41 ± 0.05의 다분산 지수(PDI)를 산출했으며, 이는 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자가 재현탁 시 응집되는 경향이 있음을 나타냅니다. 제타사이저는 또한 PBS에서 입자 현탁액의 제타 전위를 측정하는 데 사용되었으며, 이는 -27.4 ± 0.7 mV로 결정되었습니다. 실험 전반에 걸쳐 일관된 크기 분포를 유지하기 위해, 동일한 배치의 동결건조 나노 분말을 사용하여 각 실험 전에 신선한 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 현탁액을 준비한 다음 사용하기 전에 초음파 처리했습니다. DLS 측정은 배양 배지(DMEM 10% FBS)에서도 수행되었으며, 입자 크기는 489nm ± 136nm이고 PDI는 0.57 ± 0.05로 PBS에서 관찰된 것과 동일한 크기에 도달했습니다.

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자는 췌장암 세포의 2D 배양에서 제한된 독성 및 흡수를 나타냅니다.

우리의 첫 번째 목표는 췌장암 세포의 2D 배양에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자의 흡수 및 독성을 특성화하는 것이었습니다. 우리는 먼저 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 나노 입자가 PANC-1 세포로 내재화되는 것을 시각화했습니다.

그림 2 

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자는 췌장암 세포의 2D 및 3D 배양에서 제한된 흡수와 낮은 독성을 나타냅니다. A) 24시간 동안 0.5 mg/mL Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 현탁액과 이전에 배양된 대조군 PANC-1 세포(i, iv) 및 PANC-1 세포의 대표적인 TEM 이미지. 스케일 = 2 μm (i-iii), 0.5 μm (iv, vi) 또는 0.2 μm (v). B) 0.5 mg/mL Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 현탁액으로 24시간 배양한 후 2D 및 3D PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포 배양에서 단백질 μg당 검출된 루테튬의 양(ng). 데이터는 Pierce BCA 단백질 분석을 사용하여 측정된 단백질 함량으로 정규화되었으며 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 결과는 적어도 2개의 독립적인 반복에서 통합되었고 (*)은 p < 0.05를 나타내는 짝이 없는 t-테스트를 사용하여 유의성을 계산했습니다. C) MTS 분석(평균 ± SEM) 및 D) 24시간 배양 후 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 농도의 함수로 표시된 살아있는/죽은 분석(평균 ± SEM)에 의해 결정된 스페로이드 생존력, 나노 대조군 없음으로 정규화됨. 결과는 조건당 3개의 웰(2D 실험) 또는 50개의 스페로이드(3D 실험)에서 얻었고 최소 2개의 독립적인 실험에서 풀링되었습니다.

그림 2의 이미지 i 및 iv. 두 가지 다른 배율로 이미지화된 쇼 대조군 PANC-1 세포(나노입자 없음). 상단 이미지는 PANC-1 세포 전체를 보여줍니다: 세포막의 경계는 물론 핵 및 기타 세포간 구조도 볼 수 있습니다. 더 높은 배율로 촬영한 아래 이미지는 세포의 미토콘드리아를 더 자세히 보여줍니다. 이미지 ii, iii, v 및 vi는 0.5 mg/mL의 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 현탁액과 함께 24시간 배양한 후 PANC-1 세포를 보여줍니다. 더 낮은 배율로 촬영한 상단 이미지에서 나노입자가 응집체 형태로 내재화된 것으로 보입니다. 이러한 응집체는 마이크로미터 정도까지 다양한 크기로 나타나며, 이는 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자가 재현탁 시 높은 입자 크기와 다분산성을 나타낸다는 것을 확인합니다. 더 높은 배율로 촬영한 이미지 v 및 vi는 이러한 크고 작은 집합체 중 일부를 더 자세히 보여줍니다. 전반적으로, PANC-1 세포로의 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 흡수는 매우 불균일한 것으로 관찰되었으며, 일부 세포는 매우 큰 응집체를 내재화하고, 다른 세포는 더 작은 응집체를 내재화하며, 일부는 나노입자를 전혀 흡수하지 않았습니다.

TEM 이미징은 나노입자의 세포내 국소화에 대한 정성적 정보를 제공하지만 세포가 흡수하는 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 양을 정량화할 수는 없습니다. 반면에 ICP-MS는 실제로 세포에 축적된 루테튬의 양을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 2D에서의 내재화 외에도 췌장암 세포의 3D 스페로이드 모델에서 얼마나 많은 루테튬이 축적되는지에 대해서도 관심이 있습니다. 그림 2에 표시된 ICP-MS 결과에 따르면. B, 2D PANC-1 배양은 MIA PaCa-2 배양에 비해 단백질 μg당 약간 더 높은 수준의 루테튬을 보였으며, 이는 MIA PaCa-2 세포에 비해 PANC-1에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 더 높은 내재화를 나타냅니다. 그러나 3D 배양에서 단백질 μg당 루테튬의 양은 두 세포주에서 동일한 것으로 결정되었습니다. 또한 2D 배양보다 3D 배양에서 단백질 μg당 10배 이상의 루테튬 양이 검출되었습니다. 이것은 스페로이드에 흡수된 나노입자의 대부분이 실제로 세포에 의해 내재화되지 않고 스페로이드 내에서 세포외로 갇혀 있음을 나타낼 수 있습니다.

MTS 분석에 의해 결정된 세포 생존율 데이터(그림 2. C)는 Lu3 Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자가 24시간 배양 후 배양 배지 중 최대 1 mg/mL의 농도까지 PANC-1 또는 MIA PaCa-2 세포에 대해 현저한 독성을 나타내지 않음을 나타낸다. 유사하게, 나노입자는 3D PANC-1 및 MIA PaCa-2 배양액과 함께 최대 1mg/mL의 농도까지 배양할 때 생/사체 분석에 의해 결정된 독성을 유도하지 않았습니다(그림 2. D).

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노신틸레이터는 X선 조사 하에서 PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포의 증식을 감소시킵니다.

우리는 치료 후 세포의 증식 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 클론 형성 분석을 사용하여 2D 세포 배양에서 X선 조사 하에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자의 효능을 평가했습니다. X선 조사는 방법 섹션에 자세히 설명된 대로 다색 소스를 사용하여 전달되었습니다. 클론 형성 분석의 결과는 0.5 mg/mL Lu3Al5O12:P r3+@SiO2와 함께 24시간 배양하면 방사선 단독에 비해 2Gy 및 4 Gy의 X선 조사 하에서 PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포의 생존율을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다. 조사 후 낮은 세포 생존율에서 알 수 있듯이 MIA PaCa-2는 PANC-1에 비해 방사선에 더 민감하며(그림 S1), 이는 이전 보고서와 일치합니다[37]. 데이터를 선형 2차 모델에 적합시킴으로써 세포 사멸에 대한 두 가지 다른 기여를 나타내는 곡선의 α 및 β 값을 얻었습니다. 선형 항 α는 "단일 적중" 사건의 기여도를 나타내는 반면, 2차 항 β는 치명적이지 않은 사건의 조합으로 인한 "다중 적중" 세포 사멸의 기여도를 반영합니다[38]. 이러한 결과를 사용하여 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노신틸레이터에 의해 제공되는 방사선량 증강 계수(DEF)를 계산할 수 있었으며, 이는 이러한 배양 조건에서 PANC-1 및 MIA PaCa-2 배양 모두에 대해 1.4로 결정되었습니다.

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노 신틸레이터는 방사선 치료 중 DNA 손상 생성을 증가시키고 DNA 복구 메커니즘을 손상시킵니다.

클론 형성의 감소가 DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 증가와 상관관계가 있는지 이해하기 위해 면역형광 염색을 사용하여 γ X선 조사 후 1시간 후 PANC-1 세포에 존재하는 γ-H2AX 병소의 양을 정량화했습니다. 또한 조사 후 24시간 동안 세포핵에 남아 있는 병소의 양을 정량화했는데(그림 S3), 24시간 후에 남아 있는 병소의 수가 증식에 실패한 세포의 비율에 해당하는 것으로 나타났기 때문입니다[39]. 그림 4에서. A, 이미지 i, ii 및 iii는 나노입자가 없는 상태에서 각각 0, 2 또는 2.8 Gy의 X선을 받은 PANC-1 세포의 핵을 나타낸다. 2.8 Gy는 2 Gy의 X선 (=2 Gy*DEF = 2 Gy*1.4) 하에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2에 의해 유도된 RDE 효과에 의해 전달되는 유효 선량에 해당하는 X선 선량이기 때문에 선택되었다. 이미지 iv 및 v는 0.5 mg/mL의 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자와 함께 24시간 배양 후 0 또는 2 Gy의 X선을 받은 PANC-1 세포의 핵을 보여줍니다. 각 조건에 대한 핵당 초점 수의 각각의 빈도 분포는 그림 4.B에서 볼 수 있습니다. 우리는 먼저 γ-H2AX의 신호가 2Gy의 X선만 받은 세포보다 나노입자와 함께 배양한 후 2Gy의 X선을 받은 세포에서 더 높은 것으로 보이며 강도가 2.8Gy의 X선을 받은 샘플과 더 유사하다는 것을 관찰합니다. 초점을 정량화할 때 우리는 핵당 평균 초점 수가 2Gy 단독 조건(40 초점/핵, 그림 4)보다 2Gy + 나노 조건(52 초점/핵)에서 유의하게 더 높다는 것을 발견했습니다. E), Lu3Al5O12:P r3+@SiO2가 X선 조사 하에서 유도된 DNA DSB의 양을 증가시킬 수 있음을 확인한다. 주파수 분포를 살펴보면 2 Gy + 나노 조건의 초점 분포가 2.8 Gy 조건의 분포와 더 유사하다는 것을 관찰할 수 있으며, Lu3Al5O12:P r3+@SiO2를 추가하면 2 Gy의 조사 하에서 60개 이상의 초점이 있는 핵 수가 증가합니다.

그림 3 

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 (LuAG:Pr) 나노입자는 X선 조사 하에서 췌장암 세포의 증식을 감소시킵니다. 각각 230 및 500 세포의 밀도로 처리된 A) PANC-1 세포 및 D) MIA PaCa-2 세포로 파종된 플레이트의 대표 이미지. 0(대조군, 상단 패널) 또는 0.5mg/mL(하단 패널) Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노신틸레이터로 24시간 배양 후 세포를 2Gy로 조사했습니다. 방사선량의 함수로 표시된 생존율(평균 ± SEM)은 B) PANC-1 세포 및 E) MIA PaCa-2 세포에 대해 표시됩니다. 생존율은 각 치료군에 대해 0Gy 조건으로 정규화되었습니다. 결과는 최소 2개의 독립적인 실험에서 조건당 6개의 웰에서 수집되었습니다. C) PANC-1 및 F) MIA PaCa-2 세포의 α 및 β 값을 결정하기 위해 Prism을 사용하여 데이터를 선형 2차 모델에 적합시켰고, 양방향 분산 분석(ANOVA)과 Tukey 사후 검정을 사용하여 유의성을 계산했습니다. (*)는 p < 0.05를 나타내고, (**)는 p < 0.01을 나타내고, (***)는 p < 0.001을 나타내고, (****)는 p < 0.0001을 나타냅니다.

그림 4 

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 (LuAG:Pr) 나노입자는 X선 조사 직후 및 X선 조사 후 24시간 동안 PANC-1 세포에서 DNA 이중 가닥 절단 수를 유의하게 향상시킵니다. A) 및 C)는 각각 조사 후 1시간 또는 24시간 후에 수집된 PANC-1 세포의 대표적인 현미경 이미지를 보여줍니다. 이미지 i-iii에서, γ-H2AX 병소에 대한 면역형광 염색은 0, 2 또는 2.8Gy의 X-레이를 받은 후 PANC-1 세포에 대해 수행되었습니다. 이미지 iv-v에서 세포를 먼저 0.5 mg/mL Lu3Al5O12:P r3+@SiO2와 함께 24시간 동안 배양한 다음 0 또는 2 Gy의 X-레이를 받았습니다. 스케일 바 = 25 μm. 핵당 병소의 수를 정량화하고, 각 조건에 대한 빈도 분포는 각각 조사 후 1시간 및 24시간에 수집된 세포에 대해 패널 B) 및 D)에 나타났습니다. 2Gy의 X선으로 조사된 세포의 핵당 평균 병소 수(평균 ± SEM)는 각각 조사 후 1시간 또는 24시간에 수집된 샘플에 대해 그래프 E) 및 F)에 나와 있습니다. 두 시점 모두에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2로 배양된 세포의 병소 수는 조사만 받은 세포보다 유의하게 높았습니다. G)는 2Gy, 2.8Gy 및 2Gy + Lu3Al5O 12:P r3+@SiO2 조건에 대해 조사 후 1시간에 존재하는 병소 수로 정규화된 조사 후 24시간에 남아 있는 병소의 비율을 나타냅니다. 초점 정량화 데이터는 조건당 최소 80개의 핵에서 가져왔습니다. 통계적 유의성은 양방향 ANOVA에 이어 Tukey 사후 검정을 사용하여 평가되었습니다. (*)는 p < 0.05를 나타내고, (**)는 p < 0.01을 나타내고, (***)는 p < 0.001을 나타내고, (****)는 p < 0.0001을 나타냅니다.

조사 후 24시간 후에 수집된 샘플에서도 유사한 추세가 관찰됩니다(그림 4. C 및 4.D). 이 시점에서는 2Gy 단독 조건에서는 제한된 신호만 남아 있으며, 2Gy + 나노 조건에서 가장 강한 신호를 관측합니다. 핵당 병소 수를 정량화할 때 핵당 평균 병소 수가 2Gy 단독 조건(14 초점/핵, 그림 4. F)는 Lu3 Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자가 X선 조사에 의해 유도된 치명적인 DNA 병변의 수를 증가시킬 수 있음을 나타냅니다. 흥미롭게도 2Gy + 나노입자 조건에 남아 있는 병소 수는 2.8Gy 조건에서 남아 있는 병소 수보다 훨씬 더 많은 것으로 보입니다(31 병소/핵 대 16 병소/핵). 이것은 빈도 분포에서 특히 분명합니다. 2.8Gy 조건에서 대부분의 핵은 40개 미만의 초점을 포함하는 반면, 2Gy + 나노입자 조건에서는 훨씬 더 많은 수의 핵이 40개 이상의 초점을 포함합니다. 이는 X선 조사 하에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 효과가 2.8 Gy의 예상 "등가" 선량에 의해 유도된 효과보다 더 뚜렷하기 때문에 물리적 선량 증강보다 더 복잡할 수 있음을 나타냅니다. 보다 구체적으로, Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자의 존재는 X선 조사에 의해 유도된 DNA 손상을 복구하는 세포의 능력을 방해할 수 있습니다. 그림 4. G는 다양한 조사 조건에 대해 조사 후 1시간 후에 검출된 병소와 비교하여 조사 후 24시간 동안 남아 있는 병소의 비율을 보여줍니다. 나노입자가 없는 상태에서 조사된 세포의 경우, 세포에 2Gy 또는 2.8Gy의 X선을 조사했는지 여부에 관계없이 24시간 후에 남아 있는 병소의 비율은 약 33%인 것으로 나타났습니다. Lu3Al5O12:P r3+@SiO2로 배양한 후 2Gy로 조사된 세포의 경우, 이 비율은 병소의 거의 60%가 남아 있는 상태에서 상당히 높은 것으로 밝혀졌으며, 이는 나노입자가 유효 방사선량을 증가시킬 뿐만 아니라 DNA 손상 복구를 손상시킬 수 있는 추가 메커니즘을 통해 X선의 효과를 향상시킬 수 있음을 시사합니다. 그러나, Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자의 존재 하에서 조사 후 관찰되는 느린 복구 동역학은 또한 DSB보다 덜 효율적으로 복구되는 것으로 알려진 여러 국소 손상 부위의 형성 증가에 의해 설명될 수 있습니다. 이러한 군집 병변의 형성은 중원소와의 X선 상호 작용에 의해 생성된 광전자 때문일 수 있습니다. 나노입자의 존재 하에서 관찰되는 방사선량 증강 효과를 설명할 수 있습니다[40]. 실험은 MIA PaCa-2 세포에서 반복되었으며(그림 S4), 여기서 DNA 손상 복구 동역학에서 유사한 변형을 관찰했습니다.

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자는 3D 췌장암 세포 배양에서 X선 에너지 의존적 방식으로 방사선량 증강을 유도합니다.

우리는 췌장암 스페로이드 크기 및 생존력에 대한 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자에 의해 유도된 방사선량 증강의 효과를 연구했습니다. 2D 배양과 달리 3D 배양은 유럽 싱크로트론 방사선 시설(ESRF, 그르노블, 프랑스)에서 전달된 단색 싱크로트론 방사선을 사용하여 조사되었습니다.

우리는 그림 5와 같이 각각 루테튬 K-가장자리 아래 1keV와 위 1keV에 해당하는 62.31 및 64.31keV에서 배양물을 조사했습니다. A 및 5.B. 그림 5. A는 루테튬(주황색)과 연조직(파란색)의 질량-에너지 흡수 계수를 X선 에너지의 함수로 나타내며 그림 5를 보여줍니다. B는 루테튬의 K-가장자리를 확대하여 표시합니다. K-가장자리 아래와 위에 조사하면 광전 효과를 조사할 수 있으므로 방사선량 증강 효과의 물리적 기원을 조사할 수 있습니다. 루테튬 K-가장자리 아래에 조사된 배양물은 Lu3, Al, 5, O,12:P r, 3+@SiO2 나노입자와 배양한 후 방사선량 증강 효과의 징후를 보이지 않았습니다(그림 S5. B), K-가장자리 위에 조사된 사람들은 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2와 배양할 때 X선 조사에 대한 향상된 반응을 보였다. 흥미롭게도 방사선 손상이 스페로이드 크기와 생존력에 미치는 영향은 두 세포주 간에 다른 것으로 나타났습니다. PANC-1 스페로이드는 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2를 조사했을 때 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2를 조사하지 않은 조사에 비해 낮은 평균 생존율을 나타냈습니다(그림 5. D); 그러나 평균 스페로이드 크기는 변하지 않았습니다(그림 5. 반면에 MIA PaCa-2 스페로이드는 방사선량 증강에 대한 반응으로 생존력의 변화를 나타내지 않았습니다(그림 5. G)을 보였지만 처리에 대한 반응으로 크기가 크게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 5. H).

몬테카를로 시뮬레이션은 X선 에너지가 방사선량 증강 효과의 강도에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2는 64.31keV 싱크로트론 방사선 하에서 스페로이드에서 선량 증강 효과를 생성할 수 있는 것처럼 보였지만 62.31keV의 더 낮은 X선 에너지에서는 동일한 효과가 관찰되지 않았습니다(그림 S5). 우리는 이것이 루테튬의 K-가장자리(63.31keV에 위치)의 아래와 위의 X선 흡수 차이 때문이며, 이는 광전자의 더 높은 생산으로 이어져 더 강한 방사선량 증강 효과로 이어질 수 있다고 가정합니다. 이 두 에너지에서 효과의 강도를 조사하기 위해 Geant4 툴킷을 사용하여 몬테카를로 시뮬레이션을 수행하여 각각 62.31keV 또는 64.31keV의 단색 X선과 상호 작용한 후 Lu3Al5O12:P r3+에서 생성된 2차 입자를 계산했습니다.

그림 5 

Lu3Al5O12:P r3+@SiO2(LuAG:Pr) 나노입자는 각각 PANC-1 및 MIA PaCa-2 스페로이드의 생존력 또는 스페로이드 영역에 영향을 미쳐 췌장 종양의 3D 모델에서 X선 방사선 요법을 강화합니다. A) 루테튬(주황색)과 연조직(파란색)의 X선 에너지의 함수로서의 질량 에너지 흡수 계수. 점선은 63.31keV에서 Lu K-edge를 나타냅니다. [41]에서 얻은 데이터. B) Lu의 K-edge(63.31keV)와 사용된 조사 에너지(62.31keV, 64.31keV, 점선으로 표시됨). C), F) 나노입자 없이(왼쪽) 또는 0.5mg/mL Lu3Al5O12:P r3+@SiO2(오른쪽)로 24시간 배양한 후 4Gy 조사(64.31keV) 후 PANC-1(C) 또는 MIA PaCa-2(F) 스페로이드의 대표적인 살아있는/죽은 이미지. 스케일 바 = 200 μm. Lu K-edge(64.31keV) 위로 조사 6일 후 생/사 분석에 의해 결정된 방사선량의 함수로서 평균 PANC-1 스페로이드 생존율(D) 및 면적(E)(평균 ± SEM). Lu K-edge(64.31keV) 위에서 조사 6일 후 생/사 분석에 의해 결정된 방사선량의 함수로서 평균 MIA PaCa-2 스페로이드 생존율(G) 및 면적(H)(평균 ± SEM). 스페로이드 생존력(D, G) 또는 크기(E, H)를 0Gy 조건으로 정규화하고 세 가지 매개변수가 있는 [억제제] 대 반응 모델에 따라 Prism에서 비선형 회귀를 적합시켰습니다. 통계적 유의성은 양방향 ANOVA에 이어 Tukey 사후 검정을 사용하여 평가되었습니다. (*)는 p < 0.05를 나타내고, (**)는 p < 0.01을 나타내고, (***)는 p < 0.001을 나타내고, (****)는 p < 0.0001을 나타냅니다.

시뮬레이션은 몇 가지 주요 발견을 확인했습니다: 첫째, 들어오는 X선 광자의 비율이 더 높다는 것은 X선 에너지가 K-가장자리 아래에 있을 때보다 K-가장자리 위에 있을 때 Lu3Al5O12:P r3+와 상호 작용합니다. K-가장자리 아래에서는 들어오는 광자의 81.92%만이 Lu3Al5O12:P r3+와 상호 작용합니다. K-edge 이상에서는 이 수치가 97.22%로 상승합니다. 상호 작용하는 광자의 비율을 증가시키는 것 외에도 X선 에너지가 높을수록 광자와 물질의 상호 작용 중에 발생하는 과정의 분포도 변경됩니다. 상호 작용하는 광자의 92.78%만이 K-에지 아래에서 광전 효과를 유도하는 반면, 상호 작용하는 광자의 최대 98.37%는 K-에지 위의 광전 효과를 유도합니다. 마지막으로, X- 선 에너지가 높을수록 2 차 전자와 광자의 생성이 높아집니다. 이것은 Lu3Al5O12:P r3+와의 상호 작용 시 64.21keV X선과 62.21keV X선에 의해 생성된 추가 전자 및 광자의 수를 나타내는 그림 6의 패널 E와 H에서 특히 명확하게 볼 수 있습니다.

그림 6 

Lu3Al5O12:P r3+(LuAG:Pr) 나노입자와의 X선 상호 작용 시뮬레이션. 광전 또는 Compton 효과를 통해 발생하는 상호 작용의 백분율은 A) 62.31keV X선 및 B) 64.31keV X선에 대해 표시됩니다. X선 광자와 Lu3Al5O12:P r3+ 사이의 상호 작용 후 생성된 전자 및 광자의 스펙트럼 C), F) 62.31keV X선 및 D), G) 64.31keV X선. E) 및 H)는 62.31keV X선과 비교하여 64.31keV X선과의 상호 작용 후 생성된 추가 전자(E) 및 광자(H)의 스펙트럼을 나타냅니다.

토론

다른 요인들 중에서도 방사선량 증강 효과의 강도는 종양 조직 내 나노신틸레이터의 국소 축적에 크게 좌우됩니다[31]. 이러한 맥락에서 이 효과를 극대화하려면 나노신틸레이터 제형이 암세포와 스페로이드 바로 근처에 축적되어야 합니다. 합성 시 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자는 100nm에 가까운 입자 크기를 산출하는 반면[20], 시험관 내 실험 전에 분말화된 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2를 PBS에 재현탁하면 그림 1과 같이 높은 다분산성으로 훨씬 더 높은 입자 크기를 생성하는 경우가 많았습니다. D, 이러한 입자가 큰 응집체를 형성하는 경향을 나타냅니다. 이러한 응집체는 나노입자의 흡수를 제한했을 가능성이 높으며, 실제로 TEM 이미징은 PANC-1이 흡수하는 입자가 주로 미크론 순서의 큰 응집체 형태임을 밝혔습니다. 더 작고 잘 분산된 입자의 내재화도 관찰되었지만 이러한 경향은 세포 전체에서 균일하게 관찰되지 않았습니다. ICP-MS 결과는 2D 및 3D 배양 모두에 대해 PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포에 의한 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 유사한 흡수를 보여줍니다. 그러나 두 세포주 모두에서 단백질 농도로 정규화된 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 양은 2D 배양보다 3D 배양에서 훨씬 높습니다. 따라서 3D 배양에서 정량화된 Lu는 실제로 세포에 의해 내재화되지 않았지만 스페로이드 내에서 세포외로 갇혀 있었다는 가설이 있습니다. 제한된 내재화에도 불구하고, Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자는 실질적인 방사선량 증강 효과를 유도하여 세포 증식을 감소시키고 DNA 손상을 증가시킬 수 있었으며, 이는 방사선량 증강 효과를 담당하는 종이 Lu3Al5O12의 효율적인 세포 내재화 없이 세포내 표적에 도달할 수 있음을 시사합니다. Pr3+@SiO2. 이는 중원소와의 X선 상호 작용에서 생성된 광전자가 수십 미크론 정도의 거리를 이동할 수 있기 때문에 광전 효과의 중요한 기여를 나타냅니다[14]. 광전 효과의 중요한 기여는 단색 싱크로트론 방사선에서 수행된 실험에서 관찰된 에너지 의존성에 의해서도 뒷받침됩니다. 몬테카를로 시뮬레이션 결과는 루테튬의 K-가장자리 위에서 X선의 에너지를 증가시키면 광전 효과의 기여도가 증가하여 나노입자가 세포 내에서 내재화되지 않음에도 불구하고 더 멀리 떨어진 세포 내 표적에 도달할 수 있는 더 높은 에너지 전자를 생성하는 것으로 나타났습니다.

방사선량 증강 효과는 중원소에 의한 X선 흡수 증가로 인해 발생하는 순전히 물리적 현상으로, 이로 인해 주변 조직에 전달되는 유효선량이 높아집니다. 이 효과는 원래 금 나노입자를 사용하여 입증되었지만 최근에는 중원소로 구성된 나노신틸레이터를 사용하여 입증되었습니다[30,31]. 나노신틸레이터 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2를 조사하는 동안 우리는 X선 에너지가 방사선량 증강 강도에 미치는 영향을 입증함으로써 이러한 물리적 효과의 존재를 확인했으며, 이는 몬테카를로 시뮬레이션에 의해 더욱 뒷받침되었습니다. 그러나 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 유도 방사선량 증강 후 DNA 복구의 변화는 생물학적 구성 요소도 관련되어 있음을 나타냅니다. X선 조사가 없는 상태에서 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2와 함께 배양하면 γ-H2AX 병소가 유도되지 않아 나노입자 자체의 유전독성이 없음을 나타냅니다. 그러나 X선 조사 후 24시간 동안 남아 있는 병소의 양을 증가시킬 수 있으며, 이는 DNA 손상 복구를 방해할 수 있음을 나타냅니다[45]. DNA 복구의 물리적 선량 증강과 생물학적 조절의 조합은 X선 조사 하에서 보다 효과적인 전반적인 치료 반응으로 이어질 수 있습니다.

이 근본적인 연구는 물리적, 생물학적 효과의 상호 작용을 통해 방사선 치료 효능을 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 그러나 임상 번역을 진행하기 전에 두 가지 주요 측면을 신중하게 고려해야 합니다.

첫째, 나노입자의 상대적으로 큰 크기와 응집 경향은 망상 내피 시스템에 의한 빠른 제거로 인해 전신 전달을 방해할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 콜로이드 안정성을 향상시키기 위한 전략이 현재 추구되고 있습니다. 또한, 용량 증강제에 대한 임상적으로 관련된 투여 경로인 종양내 주사는 이미 HfO2 나노입자를 사용한 임상 시험에서 연구되고 있으며 방사선 요법 전에 더 큰 나노입자의 국소 축적을 달성하기 위한 실행 가능한 전략을 제공할 수 있습니다[42-44]. 이 접근 방식이 보편적으로 적용되지는 않지만 추가 개발을 위한 실현 가능하고 유망한 경로를 제시합니다.

둘째, 본 연구에서 관찰된 방사선량 증강 효과는 임상 외빔 방사선 치료에 일반적으로 사용되는 고에너지(MeV) 광자와 다른 정교전압/저에너지 X선을 사용하여 얻었습니다. 이는 직접적인 임상 번역에 잠재적인 한계를 제시하지만, 낮은 X선 에너지에서 이러한 효과를 이해하는 것은 유사한 메커니즘이 임상적으로 관련된 조사 설정에서도 기여할 수 있는지 여부를 평가하는 데 필요한 첫 번째 단계로 사용됩니다. 또한, 물리적 방사선량 증강의 효능은 X선 에너지에 크게 의존한다는 것이 확립되었지만, 본 연구에서 관찰된 생물학적 방사선 감작 효과의 에너지 의존성은 아직 알려지지 않았습니다. 이 관계는 추가 조사가 필요합니다. 특히, 저에너지 X선과 고에너지 X선에 노출된 후 DNA DSB 복구의 동역학을 비교하는 것은 향후 연구에서 다루어야 할 중요한 질문이 될 것입니다. 보다 일반적으로, 메가전압 조사 하에서 이러한 나노입자의 거동을 평가하고 그 효과가 고에너지 임상 조건으로 확장되거나 최적화될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 추가 연구가 필요합니다. 임상적으로 사용되는 메가전압 조사에서 접근법이 효과가 없는 것으로 판명되면 대체 임상 경로에는 근접 치료의 사용이 포함될 수 있습니다. 이 기술은 낮은 에너지 광자를 방출하는 내부에 배치된 방사성 소스를 사용하여 잠재적으로 이 연구에서 조사된 나노신틸레이터의 특성과 더 큰 호환성을 제공합니다.

결론

우리의 연구 결과는 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노신틸레이터가 감광제로 기능화되지 않은 경우에도 방사선량 증강 효과를 통해 방사선 치료 효능을 증가시킬 수 있음을 확인했습니다. 예상대로 우리는 X선 조사원의 영향으로 입증된 바와 같이 물리적 메커니즘의 기여를 관찰했습니다. 그러나 이러한 예상 효과 외에도 특히 DNA 복구 조절에서 생물학적 반응도 관찰했습니다. 이는 나노신틸레이터가 물리적으로 방사선량을 향상시킬 뿐만 아니라 DNA 손상 복구를 담당하는 세포 경로를 방해하여 전반적인 치료 효능을 높일 수 있음을 시사합니다.

우리는 PANC-1 및 MIA PaCa-2 세포로의 제한된 내재화에도 불구하고 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2 나노입자의 물리적 용량 증강 효과를 관찰했습니다. 몬테카를로 시뮬레이션 및 싱크로트론 방사선 실험과 결합된 이 발견은 광전 효과의 중요한 기여를 강조하고 나노입자 내재화가 유익하기는 하지만 방사선량 증강을 달성하는 데 엄격하게 필요하지는 않을 수 있음을 시사합니다.

관찰된 생물학적 효과, 특히 Lu3Al5O12:P r3+@SiO2의 존재 하에서 조사 후 γ-H2AX 병소의 장기간 존재는 DNA 복구 동역학에 미치는 영향을 나타냅니다. 나노입자 단독은 유전독성을 유도하지 않지만 X선 조사 후 정상적인 복구 동역학을 조절하는 것으로 보이며, 이는 방사선 치료 효능의 시너지 효과를 향상시킬 수 있습니다. 물리적 및 생물학적 메커니즘의 기여는 상당한 물리적 선량 증가가 예상되지 않는 조건에서도 X선 조사 하에서 고Z 나노입자를 연구할 때 때때로 관찰되는 예상치 못한 높은 치료 효과를 설명할 수 있습니다.

추가 연구는 이 DNA 복구 조절과 관련된 특정 경로, 특히 복구 단백질 모집 및 활성을 변경하는 나노신틸레이터의 잠재적 역할을 이해하는 데 초점을 맞출 것입니다. 나노신틸레이터가 DNA 복구 과정과 상호 작용하는 방식을 더 잘 이해하면 새로운 나노신틸레이터를 설계하고 용량 증강의 물리적 및 생물학적 메커니즘을 모두 활용하는 치료 전략을 최적화하는 데 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다.

보충 자료

보충 수치.

승인

이 작업은 Inserm Cancer(HE, ALB, JLR, CALYPSO 프로젝트), 프랑스 "La Ligue Contre le Cancer" 재단(Comité de l'Isère, HE, ALB, JLR) 및 Cancéropôle Lyon Auvergne-Rhône-Alpes(CLARA)의 지원을 받았습니다. 재정 지원은 또한 체코 과학 재단(보조금 번호 GA23-05615S)과 ESIF와 MEYS SENDISO가 자금을 지원하는 OP JAC 프로젝트(CZ.02.01.01/00/22 008/0004596)로부터 받았습니다.

A-L. B. 유럽 연구 위원회(ERC STG, RADIANCE, 101116304)의 지원을 인정합니다. 그러나 표현된 견해와 의견은 저자의 견해와 의견일 뿐이며 반드시 유럽 연합 또는 유럽 연구 위원회 집행 기관의 견해와 의견을 반영하는 것은 아닙니다. 유럽 연합이나 부여 당국은 이에 대해 책임을 질 수 없습니다.

우리는 빔 타임을 제공한 유럽 싱크로트론 방사선 시설(ESRF, 그르노블, 프랑스)에 감사를 표하며 ESRF의 ID17 빔라인 그룹에 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 그르노블 IRMaGe 시설은 "Agence Nationale pour la Recherche"가 운영하는 프랑스 프로그램 "Investissement d'Avenir"에서 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 'Infrastructure d'avenir en Biologie Santé' 보조금 - ANR-11-INBS-0006. SAXO 장비는 INSERM이 관리하는 자금에 따라 2021-2030 암 통제 전략의 틀 내에서 Aviesan의 ITMO Cancer에 의해 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 로타리클럽 "Jetons le cancer 2022"; 프랑스 라이프 이미징, 보조금 "ANR-11-INBS-0006"; 그르노블 알프스 대학교(UGA); GEFLUC(2022) 및 Labex PRIMES ANR-11-LABX-0063, CALYPSO 프로젝트, INSERM 암 PCSI 20CP082-00. 이 작업은 그르노블 Instruct-ERIC 센터(ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL)은 FRISBI(ANR-10-INBS-0005-02) 및 GRAL의 지원을 받아 그르노블 알프스 대학원(Écoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS(ANR-17-EURE-0003) 내에서 자금을 지원합니다. IBS 전자 현미경 시설은 Guy Schoehn이 이끌고 있으며 Auvergne Rhône-Alpes 지역, Fonds Feder, Fondation pour la Recherche Médicale 및 GIS-IBiSA의 지원을 받습니다.

저자는 또한 ICP-MS 분석을 해준 Dominique André(Institut de Biologie et Pathologie, CHU Grenoble Alpes), CEA에서 조사하는 동안 도움을 준 Sylvain Caillat(CEA 그르노블), SAXO 장비에 대한 조사 중에 도움을 준 Sarvenaz Keshmiri에게 감사를 표합니다.

경쟁하는 이해관계

저자는 경쟁 이해관계가 존재하지 않는다고 선언했습니다.

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 교신저자: 이메일: anne-laure.bulin@inserm.fr.

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Stelse-Masson, S., Lytvynenko, X., Bedregal-Portugal, K., Aubrun, C., Lavaud, M., Kadri, M., Jacquet, T., Moriscot, C., Gallet, B., Chovelon, B., Coll, J.L., Ravanat, J.L., Mihóková, E., Čuba, V., Elleaume, H., Bulin, AL (2025). 췌장암 모델에서 Lu 기반 나노신틸레이터에 의한 방사선 요법 향상에 대한 물리적 및 생물학적 기여를 결합했습니다. 나노아노스틱스, 9(3), 199-215. https://doi.org/10.7150/ntno.115120.

ACS 복사

스텔스-매슨, S.; 리트비넨코, X.; 베드레갈-포르투갈, K.; 오브룬, C.; 라보, M.; 카드리, M.; 자케, T.; 모리스콧, C.; 갈레, B.; 쇼벨론, B.; 콜, JL; 라바나트, JL; 미호코바, E.; 추바, V.; 엘로움, H.; Bulin, AL 췌장암 모델에서 Lu 기반 나노신틸레이터에 의한 방사선 요법 향상에 대한 물리적 및 생물학적 기여를 결합했습니다. 나나노아노스틱스 2025, 9 (3), 199-215. DOI: 10.7150/ntno.115120.

NLM 복사

Stelse-Masson S, Lytvynenko X, Bedregal-Portugal K, Aubrun C, Lavaud M, Kadri M, Jacquet T, Moriscot C, Gallet B, Chovelon B, Coll JL, Ravanat JL, Mihóková E, Čuba V, Elleaume H, Bulin AL. 췌장암 모델에서 Lu 기반 나노신틸레이터에 의한 방사선 요법 향상에 대한 물리적 및 생물학적 기여를 결합했습니다. 나노더아노스틱스 2025; 9(3):199-215. 도이:10.7150/NTNO.115120. https://www.ntno.org/v09p0199.htm

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Stelse-Masson S, Lytvynenko X, Bedregal-Portugal K, Aubrun C, Lavaud M, Kadri M, Jacquet T, Moriscot C, Gallet B, Chovelon B, Coll JL, Ravanat JL, Mihóková E, Čuba V, Elleaume H, Bulin AL. 2025. 췌장암 모델에서 Lu 기반 나노신틸레이터에 의한 방사선 요법 향상에 대한 결합된 물리적 및 생물학적 기여. 나노더아노스틱스. 9(3):199-215.

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