암세포에 미치는 종합효소의 작용
제2회 國際病態生理學會總會 위성 심포지엄 학회기록 1994.11.25
黃 祐 翊 교수 李 成 東 교수
고려대학교 의학부 생화학 교실
고려대학교 보건전문대학 식품영양학과
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머 리 말
암치료는 현대과학 분야에서 가장 곤란한 문제중의 하나이다 많은 사람들이 암과 암의 진행
에 동반하는 기능 不全에 의하여 사망한다 그러한 상황은 해마다 늘어 날것으로 생각된다
의료분야에서 항암제로서 일반적으로 사용되는 화학물질은 강한 부작용을 가지고 있지만 천
연물에서 유래하는 항암제는 부작용을 갖지 않는 약이 되지는 않을가 하고 기대된다
그러한 관점에서 저자들은 과거 10년간 전통적인 동양의 약초에 대하여 항암활성의 검색을
하고 고려인삼을 포함한 몇개의 약초 추출물이 여러종류의 암세포에 대하여 in vitro에서도 in vivo 에서도 강력한 세포 활성을 갖고 있음을 보고하였다
종합효소는 과실과 해초같은 천연물 50여종을 약 3년이상 발효시켜 조제된 건강식품이고 膏丸
testosterone 함량, 식욕및 위궤양에 대한 종합효소의 항암작용을 조사한 것이다
<실험 방법>
a. 종합효소의 추출과 분화(分畵)
종합효소 50g을 100ml 증류수에 의해 실온에서 24시간 추출하고 5.000회전. 30분간 원심분리
하였다 그 上淸을 millipore filter disc (fraction-1 : 粗 추출액)에 의해 여과
하였다 粗추출액을 YM 10限外여과막(emicon社 : 分畵분자량 약 10.000)에 의해 殘사 (fracti-on-2 : 분자량 10.000 이상) 과 濾液 (fraction-3 : 분자량 10.000 이하) 으로 分畵 하였다
또 fraction-3은 YM 5 濾液여과막(分畵分子量 약 5.000)에 의해 殘사 (fraction-4 : 분자량 5.000~ 10.000) 과 濾掖(fraction-5 : 분자량 5.000 이하)으로 분화하였다 fraction-6 (분자량 500~5.000)
과 fraction-7( 분자량 500 이하) 은 fraction 5를 YC05 限外 여과막(分畵 분자량) 으로 分畵하
여 조제하였다
이들 分畵물을 암세포와 정상세포에 대한 세포 傷害 활성, 사이즈 분포 분석 및 형태학적 변화
의 시험에 사용하였다
b. 세포의 배양
P388 및 L1210 세포는 10% 말 혈청과 항생물질(배양액 중에 streptomycin 100 чg/ml, penic-
illin 100units/ml)을 포함하는 Fischer's 배지에 의해 37C° 의 인큐베이터 안에서 浮遊 배양하였
다 그리고 HCT-48, HT-29 및 VERO76세포는 5% FBS를 첨가한 DMEM배지에서 단층 배양하
였다
c.倍加 시간(세포수가 2배로 되는데 필요로하는 시간) 의 측정
P388 및 L1210 은 배양액을 채운 시험관 안에서 초기 세포수 1-2 X 10 4 cells/ml로 배양하였다 HCT-48, HT-29 및 VERO 76세포는 배양액을 채운 petridishes 안에서 초기세포수 5 X 104 cells/ml 로 배양하였다
배가시간을 산정하기 위해 Coulter Counter에 의해 일정한 간격으로 각각의 시험관과 Petridishes 안의 세포수를 세었다 얻어진 세포수를 반대수방연지에 눈금을 재어 배가시간을 산
출하였다
d. 세포傷害 활성의 시험
세포상해 활성을 측정하기 위해 여러 농도의 종합효소 추출액 분화물을 포함하는 배양액 중에서
일정한 초기 세포수로 배양을 시작하고 배양 도중에 각 배양액중의 세포수를 일정한 시간 마다
측정하였다
한편 대조군은 종합효소의 추출액 대신에 같은 용량의 증류수를 첨가한 배양액 중에서 같은 조
건으로 배양하였다 대조군과 종합효소 추출액의 각 분화물을 포함하는 배양액에서 배양한 균의
세포수를 비교하였다
e.종합효소 추출액의 탄수화물의 定量시험
lodine 테스트, benedict's 테스트, barfoed's 테스트와 같은 일반적인 탄수화물의 定量시험에
의해 종합효소 추출액의 각 분화물이 다당류, 이당류, 단당류인지를 조사하였다
f. 암세포의 형태학적 변화에 미치는 종합효소의 영향
종합효소의 추출액을 포함하는 DMEM배지 중에서 12, 24, 48, 72시간 배양했을 때의 HCT-48
(암세포) 및 VERO76(정상세포)의 형태학적 변화를 倒立현미경(X 100배) 으로 관찰하였다
g.세포크기의 분포에 미치는 종합효소의 영향
Coulter Counter의 크기 분포 분석기를 이용해 세포크기를 측정하여 종합효소의 추출액을 포
함하는 DMEM 배지중에서 48시간 배양한 HCT-48 암세포의 사이즈 분포 변화를 조사하였다
<결과와 고찰>
A. 각 세포株의 배가시간
쥐 백혈병 세포의 P388 및 L1210 의 배가시간은 11~12시간 이었다 또 HCT-48, HT-29 및 VE
RO 76의 배가시간은 24, 22, 및 26시간이었다
이들 세포는 최근 NIH(미국 국립 위생 연구소)에서 약물의 세포상해 활성의 검색에 사용되고 있
는 것이다 그리고 이번에 우리가 측정한 배가시간은 Chu의 보고와 일치 하고 있다 따라서 이
들 세포株를 이번 연구에 택하였다
표1 각세포 株의 배가시간
세포株 배가시간(시간)
L1210 11~ 12
P388 11~ 12
HT-29 22
HCT-48 24
VERO 76 26
B. 종합효소의 粗 추출액(fraction-1) 의 쥐 백혈병 세포에 대한 세포 상해작용
P388 및 L1210 두 암세포를 여러농도의 fraction-1을 포함하는 배양액 안에서 48시간에서 72
시간 배양하자 fraction -1의 농도에 비례해서 암세포 증식이 억제되었다
이 결과로 종합효소의 추출액이 쥐 백혈병 세포에 대한 세포상해 활성 물질을 포함하고 있음을
알 수 있다
C .human 암세포 및 정상세포에 대한 종합효소 추출액의 세포상해 작용
1ml 중에 10. 20. 30mg의 fraction-1을 포함하는 배양액에서 human 결장세포암 HT-29를
배양했을 때 증식율을 살펴보면 농도가 2-mg/ml인 상태에서 모든 실험을 통해 세포수는 실
험 개시때의 세포수로 보존된 채였지만 20mg/ml 이상일 경우에는 증식하지 않고 죽어 있었다
HCT-48 에 대한 증식 억제 효과는 HT-29 의 경우와 유사하지만 HCT-48의 경우는 HT-29 보
다도 약 1.4배 고농도의 fraction-1을 필요로 하였다 그리고 fraction-1을 포함하는 배양액
에서 정상세포VERO 76을 배양했을 때의 것과 유사한 증식 곡선응 나타낸다
1ml중에 14. 28. 42mg의 fraction-1을 포함하는 배양액에서 24시간 배양했을 때의 정상세포
인 VERO 76 에 대한 증식 억제율은 각각 36%, 50%, 63% 이었다 같은 조건에서 HCT-48 에
대한 억제 효과는 VERO 76에 대한 것 보다도 약 2.5배 강했다
HT- 29 에 대한 경우도 VERO 76보다 강하게 증식을 억제 하였다 이렇게 종합효소의 粗추출액
은 정상세포 보다도 강하게 암세포의 증식을 억제 하였다 이것은 세포의 타입에 따라 세포활
성이 다르다는 점을 시사한다
종합효소의 고분자 화분(fraction-2) 과 저분자 화분(fraction-3)으로 처리했을 때의 증식율을 보
면 0.04ml 의 fraction-2 (분자량 10.000이상) 로 처리된 群의 증식 억제율은 대조군과 비교해
약 35% 억제되었다 그러나 0.04ml 의 fraction-3 (분자량 10.000 이하) 으로 처리된 群은 증식을
멈추고 증식 억제율은 117%에 달했다
fraction-3 을 분자량 5.000 의 限外 여과막에 의해 분화하여 fraction-4 ((분자량 5.000 이상
10.000 이하) 및 fraction-5(5.000 이하를 조제하였다 fraction-4에서 48시간 처리한 群의 증식
억제율은 105% 이었다
따라서 항암 활성 물질은 fraction-1에서 fraction-3을 거쳐 fraction -5로 이행하는 것을 알 수
있다
D. 탄수화물의 정량시험
fraction-5의 lodine 테스트 , benedict's 테스트, barfoed,s 테스트에 대한 결과는 각각 음성,
양성, 이었다 이결과로 부터 종합효소중의 세포 상해 활성 물질은 단당류 혹은 이당류 라고 생
각된다
E. 사이즈 분포 곡선
세포상해 활성의 매카니즘을 살피기 위해 fraction-1(粗 추출액) 및 fraction-3(분자량 10.000 이
하)으로 처리한 HCT -48세포의 사이즈 분포 변화를 조사 하였다(그림11.12)
fraction-1(粗 추출액) 및 fraction-3(분자량 10.000 이하) 처리한 群의 HCT-48 세포의 사이즈 분
포는 대조군의 것과 비교하여 작은 사이즈 쪽으로 이행해 갔다
따라서 종합효소 추출액에서 처리한 세포의 수를 각 배양 시간 마다 측정했을 때 세포의 크기가
보통의 크기보다 작아졌기 때문에 대조군과 비교하여 보통크기의 세포가 감솬소한 것이라 생각
된다
上述한 결과에서 종합효소의 분화물의 세포상해 활성 매카니즘의 하나는 분화물로 처리하여 보
통 크기의 세포가 감소한 것에 의한다고 생각된다
F.종합효소 추출액에 의한 암세포와 정상세포의 형태학 적 변화
fraction-1을 포함하는 배양액과 포함하지 않은 배양액에서 12. 24. 48시간 배양했을 때의 HCT
-48세포를 관찰해 보면 대조군의 세포수는 배양시간에 비례해서 서서히 증가하고 형태학적 변화
도 보이지 않지만 실험군의 세포수는 감소하고 대조군과 비교하여 세포의 형태도 수축하거나 일
그러졌다
그러나 HCT- 48세포와 같은 조건에서 실함했을 때의 VERO76 세포에서의 결과는 암세포(HCT_
48) 의 것과는 달라 있었다 즉 실험군의 세포수와 형태 어느쪽도 대조군과 비교해 차이는 보이
지 않았다
따라서 종합효소 추출액(fraction-1)의 정상세포 (VERO 76)에 대한 세포 상해 활성은 암세포(HCT-48)에 대해 보다 약하다고 추측된다
<결 론>
上述한 in vitro의 실험결과에서 만다효소 안에는 여러 종류의 암세포를 죽이는 작용을 지니는
화합물이 존재 한다는 것이 밝혀졌다 그 세포 상해 작용은 세포의 종류에 따라 다른 특성, 즉 정
상세포에는 별다른 영향을 끼치지 않는 선택적성을 지니고 있다
이번 실험 결과를 볼 때 이 화합물을 화학 요법제로써 또는 생리학적인 그리고 세포학적인 연구
의 수단으로써 발전 시키기 위해 더욱 많은 연구가 필요하다