MTT assay

[김희중]

MTT assay는 세포의 성장을 알아보는 방법중 하나입니다.
yellow tetrazolium salt MTT는 살아있는 세포에서 물에 녹지 않는 formazan crystal로 환원됩니다. 이 크리스탈은 나중에 DMSO로 녹여서 생성된 크리스탈의 양을 분광학적인 방법 (Spectroscopic method)으로 측정합니다.
살아있는 세포의 수가 많을 수록 이 크리스탈의 생성도 많아지므로 이러한 방법을 통해 세포의 성장을 쉽게 측정할 수 있습니다.

방법은..

1) 세포를 96 well에 적당한 양으로 깔아놓습니다. 세포종류마다 그리고 처리하는 기간마다 다르기때문에 미리 적절한 흡광도(0.2-0.8)가 나오도록 세포주에 맞게 세포량과 처리기간을 결정해야 합니다.
2) MTT용액을 만듭니다. 5 mg/ml PBS, 필터처리를 하고 빛에 민감하기 때문에 포일로 싸서 냉장보관합니다.
3) MTT 용액 20 ul를 넣고 37C CO2 incubator에서 4시간가량 둡니다.
4) Media를 제거하고 여기에 DMSO를 200 ul 넣습니다.
(미디어 제거시 세포들이 같이 딸려나오지 않도록 주의해야 합니다. 최근엔 이러한 것을 피하기 위하여 물에 녹는 formazan이 나오도록 개발된 것도 있고 Detergent를 넣어서 녹이는 방법도 나오고 있습니다)
5) 피펫팅으로 잘 섞어줍니다. 이 과정에서 버블이 많이 생기므로 가능한한 줄이거나 버블이 없어지도록 일정시간 둡니다.(5분정도, 단 다른 실험과 비교시 이 시간을 일정하게 두는 것이 좋습니다)
6) 550 nm에서 (595 nm까지 가능) 흡광도를 측정합니다.
(Blank는 세포가 들어있는 well에 MTT 대신 PBS 20 ul를 넣은 것으로 합니다)

INTRODUCTION

세포의 증식 또는 살아있는 세포를 정확하게 측정할 수 있는 기법은 생명과학 분야, 특히 종양 생물학에서 필수적인 기법중의 하나이다. 새로운 항암제 개발을 위한 표능검색이나 기존에 개발된 항암제의 감수성을 알아보기 위하여 동물실험 등 생체에의 적용 단계 이전에 생체 밖에서의 약물의 종양세포 성장 억제력을 알아보는 과정을 거쳐야 한다.

가장 직접적이고 이상적인 방법은 세포에 trypan blue등을 처리한 후 현미경과 hemocytometer를 이용하여 살아있는 세포를 세는 것이지만 시간과 너무 많은 노력이 요구되므로 검체수가 많을 경우에는 사용할 수가 없기 때문에 세포의 살아있는 정도를 간접적으로 측정하려는 여러 가지 방법들이 개발되어 왔다. 항암제의 in vitro 약효 검색법에는 집락형성 분석법(clonogenic assay)과 모든 암세포에 대한 세포독성을 측정하는 단기적 항암제 감수성 검사법(short-term chemosensitivity test)이 있다. 집락형성 분석법은 clone의 형성정도를 이용하는 방법으로서 약물효능 검색에 많이 사용되었으나 단일 세포부유액의 준비가 어렵고, 세포의 종류에 따라 clone 형성정도가 다르기 때문에 실험자의 기준에 따라 결과가 달라질 수 있으며 결과를 얻기까지 많은 시간이 소요되는 등의 단점 때문에 1차 검색에는 적합하지 않다. 단기 검사법은 항암물질 처리 후 생존 암세포의 수를 대조군과 비교하는 것으로, trypan blue가 살아있는 세포에는 염색되지 않는 점을 이용한 색소 배제법(dye exclusion assay), 살아있는 세포에서 환원된 형태의 51Cr이 산화된 형태로 변화되는 점을 이용하여 세포 용해시 유출되는 51Cr-표지된 단백질(51Cr-labeled protein)을 측정하는 법 등이 과거에는 많이 사용되었으나 시간과 노력이 많이 필요하고 실험조작의 자동화가 곤란하여 대량검색을 하기에는 적합하지 않다. 현재 많이 사용되고 있는 Tetrazolium-based colorimetric (MTT) 검색법은 96-well plate를 사용하고 검사결과를 ELISA reader를 이용하여 많은 시료를 간단히 빠르고 객관성 높게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 sulforhodamin B (SRB) 검색법과 더불어 널리 사용되고 있다. MTT 검색법의 과정 중 생성된 formazan의 용해단계를 생략한 방법으로서 MTT의 변형 물질인 XTT, MTS 등을 이용한 방법이 개발되어 사용되고 있으나 MTT 검색법에 비하여 background가 높고 값이 비싼 단점이 있다. MTT 검사법은 항암제의 감수성에 대한 1차 선별검사의 목적으로 많이 사용되지만, 성장인자에 대한 세포의 감수성 실험 등에도 대단히 유용하게 사용될 수 있다.

MTT 검색법의 원리

MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT formazan의 흡광도는 540nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 그러나 측정할 well의 세포의 농도가 너무 낮거나 높은 범위에 있으면 살아있는 세포의 농도와 흡광도 사이의 직선적인 비례관계가 성립되지 않게 되므로 최적의 세포농도를 결정하는 과정을 거쳐야 한다. 항암약제를 세포배양배지에 투여한 후 배양한 암세포는 약제의 농도에 따라서 항암제를 투여하지 않고 순수한 배지에서 배양한 암세포에 비해 생존세포의 비율이 감소한다. 그 감소되는 비율은 약제의 종류, 약제에 대한 암세포의 감수성과 약제의 농도에 따라 달라지며, 사멸되지 않고 대사적 활성이 있는 세포는 흡광도를 측정함으로써 간접적으로 알 수 있다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교한다. 4일 간의 배양후 살아있는 암세포의 농도를 약제 비처리군(대조군)에 비해 50%로 줄일 수 있는 약제의 농도를 IC50이라고 하며 실제의 실험에서는 오차를 줄이기 위해 각 칸의 8well에 동일 검체를 처리하여 얻은 결과의 평균값을 이용하여 계산한다. MTT의 여러 장점 가운데서 기존에 사용하던 51Cr release assay 등과 비교하여 가장 특이할 만한 점은 96well plate에 사용함으로써 흡광도의 측정을 동시에 시행할 수 있고 결과의 해석을 반자동화함으로써 대량 검체에 대하여 검색할 때 시간과 노력을 대폭 절감할 수 있게 된 점이다.

MATERIAL & METHOD

이번 실험에서 우리들이 직접 실습한 부분은 실험절차상의 극히 일부분에 지나지 않으며, 그 이전의 과정에 대해서는 찾아보기는 하였으나 우리의 실험상 적확한 과정인지는 확신할 수가 없어 보인다.

Method

전단계 : 정적 cell농도 결정하기
실험에서는 적정세포농도를 사용하였을 때만 세포의 농도와 흡광도 사이에 직선적인 상관관계를 보이며 적정농도 이상이나 이하의 세포농도를 사용하게 되면 세포의 농도와 흡광도 사이에 직선적인 상관관계가 왜곡되므로 본 실험에 선행하여 적정 접종세포의 수가 먼저 결정되어야 한다.
1. 첫 번째칸에는 180ul의 배지와 PBS 20ul만을 넣어 blank로 사용한다.
2. 두 번째칸에는 먼저 배지만 90ul넣고, 세포부유액(4×10^5개/ml) 90ul를 넣어 잘 혼합한다.
3. 두 번째칸에서 세포부유액 90ul를 얻어 세 번째칸에 옮기고, 다시 배지 90ul를 넣어 잘 합한다.
4. 같은 방법으로 세포밀도를 1/2씩 희석하면서 접종한다.
5. 접종이 끝나고 나면 세포가 들어있는 두 번째칸부터 PBS 20ul를 넣어준다. (PBS를 넣어주는 이유는 MTT할 때 시료를 처리해 줄 것을 고려하는 것이다.)
6. 세포가 접종된 plate를 37℃, 5% CO2 하에서 4일간 배양한 후 540nm에서 흡광도를 측정한다.

▶ 이로부터 얻어진 값을 세로축을 세포의 흡광도로 하고 가로축을 세포의 농도로 하여 그래프로 도시하면 지수적인 곡선을 얻게 된다. 이 지수곡선에서 흡광도가 0.6-0.7인 부분에서의 흡광도는 세포가 세포의 농도에 정비례하여 감소 또는 증가한다. 그러므로 이 성장곡선으로부터 지수성장기에 있는 세포의 수가 적정 세포밀도가 되며 구하여진 적정세포의 수는 본 시험에 사용하게 된다.

MTT assay

1. cell suspension을 haemacytometer를 사용하여 counting한 다음, 96 well plate의 각 well에 원하는 적정농도의 cell 부유액 180ul를 넣는다.
- Blank ; 배지 180ul와 PBS 20ul.
- Control ; 세포부유액 180ul와 PBS 20ul
2. 측정하고자 하는 시료는 PBS에 녹인 후 농도별로 20ul씩 각 well에 첨가한다.
3. 원하는 시간만큼 incubation한다.
4. 시료를 제거하고, 각 well에 MTT solution을 100ul씩 첨가한다.
5. 4시간동안 incubation시킨 후 MTT 희석액을 조심스럽게 제거한다.
6. 각 well에 100ul의 DMSO를 첨가하여 15-20분간 plate shaker로 흔들어 준다.
7. ELISA reader를 사용하여 wave length 540nm에서 흡광도를 측정한다.
(이 흡광도는 MTT가 세포의 의해 환원된 양을 나타내며 각 well에 존재하는 생존 세포수와 비례한다.)

이런 방식으로 실험을 진행하게 된다.