ESCC(식도 편평세포암) - 높은 유병률/낮은 생존율 -중국 란쩌우대학교

[dhleepaul]

ESCC 진행 잠금 해제: CCL15-CCR1 축이 AKT/ERK1/2/c-Jun/CDK2 경로를 활성화합니다.

Shengliang He 1,2,3 , Yunjiu Gou 4 , Qizhou Bo 4 , Dacheng Jin 4 , Songchen Han 4 , Hui Cai 1,2,3,

1. 중국 란저우대학교 란저우제1임상의학원, 란저우대학교, 730000,
2. 중국 간쑤성 병원 위장관 종양 진단 및 치료 국가위생건강위원회 중점실험실, 730000,
3. 중국 간쑤성 병원 간쑤성 외과 종양학 분자진단 및 정밀의학 중점실험실, 730000,
4. 중국 간쑤성 란저우시 간쑤성 병원, 730000, 란저우시

✉ 연락처: Hui Cai (ldyy_caih @lzu.edu.cn).

접수일 2025-3-18; 승인일 2025-6-15; 게시일 2025-7-4

citation(인용)

He S, Gou Y, Bo Q, Jin D, Han S, Cai H. ESCC 진행 억제: CCL15-CCR1 축이 AKT/ERK1/2/c-Jun/CDK2 경로를 활성화한다. J Cancer 2025; 16(10):3112-3127. doi:10.7150/jca.113925. https://www.jcancer.org/v16p3112.htm

복사 다른 스타일

   엔드노트   메드라인   빕텍스   참조 관리자   리스    다운로드 파일 가져오기 지침

추상적인

전 세계적으로 주요 종양학적 관심사로 여겨지는 식도 편평세포암(ESCC)은 소화계 상피세포에서 기원하는 악성 종양 중 높은 발병률을 보입니다. 종양 세포는 케모카인(CC 모티프) 리간드 15(CCL15)를 분비하여 CC 모티프 케모카인 수용체 1(CCR1) 양성 대식세포를 유인하여 면역 회피를 촉진하고 종양 진행을 촉진할 수 있습니다. 그러나 종양 세포에서 분비되는 CCL15가 동일한 종양 세포에 발현되는 CCR1에도 직접 작용하여 종양 조절 효과를 나타낼 수 있는지는 아직 불분명합니다. 본 연구에서는 ESCC 진단을 받은 환자의 종양 조직에서 CCL15와 CCR1이 모두 유의미하게 과발현됨을 발견했습니다. 또한, ESCC 세포주 EC109, TE-1, KYSE150에서 CCR1과 CCL15의 기저 발현 수치는 정상 식도 상피세포주 HET-1A보다 현저히 높았습니다. 시험관 내 실험에서 재조합 인간 CCL15(rhCCL15)가 EC109와 TE-1의 증식, 이동, 그리고 침윤을 유의미하게 증가시키는 것으로 나타났습니다. 렌티바이러스를 이용한 CCL15 또는 CCR1의 녹다운은 증식과 이동을 현저히 억제했습니다. 특히, CCR1 녹다운은 ESCC 세포에서 rhCCL15의 종양 촉진 효과를 역전시켰습니다. 이후 면역형광 동시 위치 측정 및 동시 면역침전법을 통해 CCR1과 CCL15 사이의 직접적인 상호작용을 확인했습니다. 기전적으로, PCR 어레이 분석을 통해 사이클린 의존성 키나아제 2(CDK2)가 CCL15-CCR1 축의 하위 효과기임을 확인했습니다. 또한, 전사 인자 예측, 단백질-단백질 상호작용(PPI) 데이터베이스 분석, 그리고 ChIP-qPCR 분석을 통해 CDK2 전사가 AKT/ERK1/2 경로를 통한 CCL15-CCR1 매개 c-Jun 인산화를 통해 활성화됨을 확인했습니다. 또한, CCR1을 표적으로 하는 약물 스크리닝을 수행하여 Jervine을 잠재적인 CCR1 분해자로 확인했습니다. 요약하자면, 본 연구는 CCL15-CCR1 축과 ESCC 진행 사이의 관계를 밝히고 이 경로를 표적으로 하는 잠재적인 치료 전략에 대한 통찰력을 제공합니다.

키워드 : CCR1, ESCC, CCL15, CDK2, 세포 증식 및 이동

1. 서론

종양학에서 중요한 임상적 실체로서 식도암은 높은 역학적 유병률과 낮은 생존 결과를 특징으로 하는 상당한 전 세계적 질병 부담을 부과합니다[ 1 ]. 중국에서는 식도암 사례의 약 80%가 ESCC로 분류됩니다[ 2 ]. ESCC는 암 관련 사망 원인 중 7위를 차지하며, 2020년에만 약 60만 건의 사망자가 보고되었습니다. 지난 10년 동안 진단 방법과 치료적 개입이 괄목할 만큼 발전했음에도 불구하고 ESCC의 발생률은 여전히 높고 5년 생존율은 20% 미만으로 계속 떨어져 지속적인 임상적 과제를 안고 있습니다[ 3 ]. 따라서 ESCC의 잠재적인 분자적 메커니즘을 조사하고 효과적인 치료 전략을 식별하는 것은 여전히 시급한 우선순위입니다.

CCL15는 다양한 종양 유형에서 상향 조절되는 113개 아미노산 케모카인입니다[ 4 , 5 ]. CCL15의 표적 삭제는 종양 진행을 상당히 완화하는 것으로 나타났습니다[ 4 , 6 , 7 ]. 이전 연구에서는 종양 유래 CCL15가 면역 세포 모집 및 활성화를 조절하여 간세포암의 진행을 촉진하고, 이를 통해 면역 억제 미세환경을 유지한다는 것이 입증되었습니다[ 4 ]. 대장암에서 CCL15는 호중구를 모집하여 폐 전이를 촉진하고 골수 세포를 유인하여 간 전이를 촉진합니다[ 8 ]. 더욱이 CCL15는 흑색종과 췌장암의 진행을 조절하는 데에도 중요합니다. 기전적으로 CCL15는 여러 케모카인 수용체, 특히 CCR1과 상호 작용하여 대식세포, 호중구 및 림프구를 모집하여 종양 성장을 조절합니다[ 6 , 9-11 ] . G 단백질 결합 수용체 슈퍼패밀리 구성 요소인 CCR1은 주로 PI3K/AKT 및 ERK1/2 신호 전달 계단을 통해 세포 증식과 세포 사멸 경로의 이중 조절을 통해 종양 형성 과정을 매개합니다[ 12-15 ] . 이러한 연구는 종양과 면역 세포 간의 교차 통신을 실행하여 종양 형성을 촉진하는 CCL15-CCR1 축의 중요한 기능을 강조합니다. 그러나 CCL15가 종양 세포 자체에서 발현되는 CCR1 을 직접 활성화하여 종양 진행을 촉진할 수 있는지 여부는 불분명합니다. 또한 ESCC에서 CCL15-CCR1 축의 특정 기여도는 완전히 밝혀지지 않았습니다.

본 연구에서는 환자 유래 ESCC 조직에서 CCL15와 CCR1이 고도로 발현되며, 식도 상피 세포에 비해 ESCC 세포에서 기저 발현이 증가함을 확인했습니다. 이러한 결과를 바탕으로 종양 내재적 CCL15-CCR1 축이 ESCC 진행에 기여한다는 가설을 세웠습니다. rhCCL15 처리 및 CCL15와 CCR1의 억제를 통해, CCL15 -CCR1이 ESCC 진행을 유도한다는 것을 in vitro 및 in vivo 에서 확인했습니다 . 추가 분석 결과, CCL15-CCR1은 Ser63 부위의 c-Jun의 AKT/ERK1/2 의존적 인산화를 통해 CDK2 전사를 활성화하는 것으로 나타났습니다. 또한, ESCC 진행을 완화하는 데 사용될 수 있는 잠재적인 약물을 찾기 위해 CCR1에 대한 소분자 스크리닝을 수행했습니다. 본 연구는 ESCC 발병 기전에 대한 기전적 통찰력을 제공하고 정밀 종양학 접근법을 위한 새로운 치료 표적을 제시합니다.

2. 재료 및 방법2.1 세포 배양

인간 ESCC 세포주 TE-1, EC109, KYSE150은 Wuhan PriCella Biotechnology에서 구입했습니다. TE-1과 EC-109는 10% 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양했습니다. 모든 세포 배양 시약은 Gibco(미국)에서 구입했습니다. 세포는 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C로 배양했습니다 . 배양액은 T25 플라스크에서 배양하고, 약 85%의 컨플루언시에 도달했을 때 계대 배양했습니다.

2.2 세포 증식 분석

증식 분석을 위해, 웰당 5 × 10³개의 세포를 분주하고 재조합 인간 CCL15(rhCCL15)로 48시간 동안 처리했습니다. 처리 후, 각 웰에 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 시약(Beyotime, 중국) 10 μL를 첨가했습니다. 2시간 배양 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율과 증식을 평가했습니다.

2.3 렌티바이러스 패키징 및 유전자 침묵

관심 유전자를 표적으로 하는 shRNA 서열은 Merck 온라인 도구를 사용하여 설계하고 Sangon Biotech(중국)에서 합성했습니다. shRNA 올리고뉴클레오티드는 T4 DNA 리가제(M0202T, NEB, 미국)를 사용하여 pLKO.1 벡터(#10878, Addgene, 미국)에 클로닝했습니다. 결찰 산물을 DH5α 컴피턴트 세포(11803ES80, YEASEN, 중국)에 형질전환하고, 양성 콜로니를 스크리닝하여 정확한 삽입을 확인했습니다.

렌티바이러스 생산을 위해, pLKO.1-shRNA 플라스미드를 psPAX2(#12260, Addgene, 미국) 및 PMD2.G(#12259, Addgene, 미국)와 함께 표준 인산칼슘 또는 지질 기반 형질감염 프로토콜을 사용하여 HEK-293T 세포(CL-000, PriCella, 중국)에 공동 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 및 48시간에 렌티바이러스 상층액을 수집하고, 원심분리 후 여과하여 후속 감염 단계에 사용하였다.

표적 ESCC 세포를 여과된 Lenti-shRNA가 포함된 상층액으로 48시간 동안 감염시켰다. 감염 후, 형질도입된 세포 집단을 농축하기 위해 2 μg/mL의 푸로마이신(ST551, Beyotime, China)이 포함된 완전 배지에서 세포를 선별하였다. 그런 다음, 푸로마이신 내성 세포를 1 μg/mL의 푸로마이신이 포함된 배지에서 안정적인 세포주가 형성될 때까지 증식시켰다[ 16 ]. 사용된 모든 shRNA 서열은 표 S1 에 나열되어 있다 .

2.4 종양 관련 PCR 어레이 분석

포괄적인 유전자 발현 분석은 WC-MRNA0188-H PCR 어레이 플랫폼(Wc Gene Biotech Co., Ltd., Shanghai, China)을 사용하여 수행되었습니다. 모든 과정은 모든 생물학적 반복 실험에서 일관성과 재현성을 보장하기 위해 제조사의 지침에 따라 수행되었습니다.

2.5 임상 검체 수집

간쑤성 인민병원에서 총 33쌍의 ESCC 조직과 그에 상응하는 인접한 비종양성 식도 조직을 확보했습니다. 수술적 절제 후, 모든 조직 표본은 후속 분자 분석을 위해 액체 질소에서 즉시 급속 냉동되었습니다. 표본 채취 및 처리는 사전 동의 규정 및 승인된 기관 윤리 지침에 따라 수행되었습니다.

2.6 트랜스웰 분석

이동 및 침윤 분석을 위해, 세포를 1% FBS가 첨가된 200 μL RPMI-1640 배지에 2 × 105 cells/mL 농도로 현탁 하고 Transwell 인서트의 상부 챔버에 분주했습니다. 하부 챔버에는 화학 유인제 역할을 하는 10% FBS가 첨가된 800 μL RPMI-1640 배지를 채웠습니다. 24시간 배양 후, 상부 막 표면에서 이동하지 않은 세포를 면봉으로 조심스럽게 제거했습니다. 하부 표면에서 이동하거나 침윤된 세포는 메탄올에 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 염색했습니다. 침윤 분석을 위해, 상부 챔버는 Matrigel(Corning, USA)로 미리 코팅했고, 이동 분석은 Matrigel 없이 수행했습니다.

2.7 이종이식 실험

암컷 면역결핍 BALB/c 누드 마우스(4~5주령)를 공인 공급업체(란저우 수의학 연구소, CAAS)에서 구입하여 온도와 습도가 조절되는 SPF 시설에서 적응시켰습니다.

EC109 세포(5×10 7 )를 무처리하거나 rhCCL15로 전처리한 후 트립신으로 분해하고 PBS로 세척한 후 원심분리했습니다. 수집된 세포를 PBS에 재현탁하여 마우스의 겨드랑이 중앙-후방 부위에 피하 주사하여 종양을 형성했습니다.

동물은 다음과 같이 4개의 실험 코호트(n=5)로 무작위로 배정되었습니다: (1) 대조군(처리하지 않은 EC109 세포 주입), (2) rhCCL15 군(rhCCL15로 전처리한 EC109 세포 주입), (3) shRNA-CCR1 군(CCR1이 억제된 EC109 세포 주입), (4) rhCCL15 + shRNA-CCR1 군(rhCCL15로 전처리한 CCR1이 억제된 EC109 세포 주입).

최종 평가 시점에, 마우스는 이소플루란 흡입(YaJi Biological, 상하이, 중국)을 이용하여 안락사시켰다. 종양을 절제하고 무게를 측정한 후, 추가 분석을 위해 -80°C에서 급속 냉동하거나 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정시켰다.

2.8 RT-qPCR 분석

종양 조직 또는 EC109/TE-1 세포에서 TRIzol(Invitrogen, 미국)을 사용하여 총 RNA를 추출했습니다. 정량 후, 1 μg의 RNA를 역전사하여 cDNA(Takara, 일본)로 전환했습니다. 정량적 PCR(qPCR)은 희석된 cDNA, 유전자 특이적 프라이머, SYBR Green Master Mix(Vazyme, 중국)를 사용하여 수행했습니다. 상대적 mRNA 발현량은 2^ -ΔΔCt 방법[ 17 ]을 사용하여 계산했습니다. 사용된 프라이머 서열은 표 S2 에 제시되어 있습니다 .

2.9 웨스턴 블로팅 분석

EC109 및 TE-1 세포에서 프로테아제 및 포스파타아제 억제제가 보충된 RIPA 용해 완충액(Beyotime, 중국)을 사용하여 총 단백질을 추출했습니다. 용해물을 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후, 4°C에서 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리했습니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정했습니다. 동량의 단백질(20 μg)을 10% SDS-PAGE 겔에 분리하여 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. 실온에서 2시간 동안 5% BSA로 블로킹한 후, 멤브레인을 CCR1, p-AKT, 총 AKT, p-ERK1/2, 총 ERK1/2 및 GAPDH에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 세척 후, 멤브레인을 HRP-접합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 단백질 밴드는 화학발광법으로 시각화하였고, 밴드 강도는 GAPDH를 기준으로 정량화하였다. 사용된 항체의 세부 사항은 표 S3 에 제시되어 있다 .

2.10 전사인자 예측

CDK2 유전자의 전사 개시 부위(TSS)로부터 1000 bp 상류 DNA 서열을 Cistrome DB( http://cistrome.org/db/#/ ) 에 제출하여 전사 인자 예측을 수행했습니다. 전사 인자는 예측되는 조절 잠재력을 기준으로 내림차순으로 정렬되었습니다.

2.11 데이터 통계 및 분석

통계 분석은 GraphPad Prism 또는 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 여러 독립 집단을 비교하기 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용했으며, 두 집단 간의 비교에는 양측 비페어드 스튜던트 t-검정(two-tailed unpaired Student's t-test)을 사용했습니다. 데이터는 평균 ± 평균 표준오차(SEM)로 제시했습니다. p-값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주했습니다.

3. 결과3.1 CCR1과 CCL15는 ESCC 세포에서 상당히 상향 조절됩니다.

ESCC 조직을 채취하고 임상 환자의 인접한 비종양 조직과 매칭했습니다. CCR1과 CCL15는 인접한 비종양 조직에 비해 ESCC 조직에서 현저하게 과발현되었습니다(그림 1A ). 또한, RT-qPCR과 WB를 사용하여 식도 상피 세포(HET-1A)와 ESCC 세포(TE-1, EC109, KYSE150)에서 CCR1과 CCL15의 발현 수준을 분석했습니다. CCR1과 CCL15의 기저 발현은 HET-1A 세포에 비해 TE-1, EC109, KYSE150 세포에서 유의하게 증가했습니다(그림 1B - 1D ). 분비 케모카인인 CCL15는 세포 배양 상층액에서 ELISA를 사용하여 정량화했습니다. CCL15 농도는 TE-1, EC109, KYSE150 세포의 상층액에서 HET-1A 세포에 비해 유의하게 높았습니다(그림 1E ). 이러한 결과는 CCR1과 CCL15가 ESCC 진행에 중요한 기여 인자 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

3.2 CCL15는 ESCC 세포의 증식과 이동을 촉진합니다.

ESCC에서 CCL15의 기능적 역할을 탐구하기 위해, EC109와 TE-1 세포에 rhCCL15를 in vitro 처리했습니다 . 트랜스웰 분석 결과, rhCCL15는 ESCC 세포의 이동 및 침윤 능력을 유의미하게 향상시켰습니다(그림 2A ). CCL15가 세포 증식에 미치는 영향은 CCK-8 분석을 통해 평가했습니다. rhCCL15 처리가 EC109와 TE-1 세포 모두의 증식을 유의미하게 촉진하는 것을 관찰했습니다(그림 2B ).

 그림 1 

CCR1과 CCL15는 ESCC에서 높게 발현됩니다. (A) CCR1과 CCL15의 면역조직화학 결과 및 통계. (B) HET-1A, TE-1, EC109 및 KYSE150 세포에서 CCR1과 CCL15의 mRNA 수치 통계. (CD) HET-1A, TE-1, EC109 및 KYSE150 세포에서 CCR1과 CCL15 단백질 수치에 대한 웨스턴 블롯 분석. (E) 세포 배양 배지 상층액에서 CCL15의 ELISA 분석. * vs. 종양/HET-1A, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.

 그림 2 

CCL15는 ESCC의 증식과 이동을 매개한다. (A). 크리스탈 바이올렛 염색은 세포 이동과 침윤의 변화를 보여준다. (B) 세포 생존율은 CCK8을 이용하여 분석하였다. (C) 렌티바이러스에 감염된 EC109 및 TE-1 세포의 모식도. (DE) CCL15의 mRNA 수치 분석을 위한 RT-qPCR. (F) 세포 생존율은 CCK8을 이용하여 분석하였다. (GH) 세포 이동 분석을 위한 세포 스크래치 분석. (IL) EC109 및 TE-1 세포에서 Ki67, PCNA, E-CAD 및 N-CAD 단백질 수치에 대한 면역형광 분석. * 대조군/shNC/shControl과 비교, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.

CCL15의 역할을 더욱 자세히 연구하기 위해 CCL15를 표적으로 하는 세 가지 shRNA 서열을 설계하여 렌티바이러스 벡터(lenti-shCCL15)에 패키징했습니다. ESCC 세포 감염 후(그림 2C - 2E ), 세포 증식 분석 결과 CCL15 발현 억제가 세포 증식을 유의미하게 억제하는 것으로 나타났습니다(그림 2F ). 세포 이동을 평가하기 위해 상처 치유 분석을 수행한 결과, CCL15 발현 억제가 ESCC 세포의 이동 능력을 현저히 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 2G - 2H ).

Ki67과 PCNA는 세포 증식의 확립된 마커이며 종양 세포 성장을 평가하는 데 널리 사용됩니다[ 18 ]. 면역 형광 분석 결과 rhCCL15 처리가 Ki67 및 PCNA 양성 세포의 비율을 증가시킨 반면 CCL15 노크다운은 이들의 발현을 현저히 감소시켰습니다(그림 2 I- 2 J). 상피-중간엽 전이(EMT)에 관여하는 중요한 접착 분자인 E-카드헤린(E-CAD)과 N-카드헤린(N-CAD)도 평가되었습니다. rhCCL15 처리가 E-CAD와 N-CAD의 발현을 현저히 억제한 반면 CCL15 노크다운은 이들의 수준을 회복시켰습니다(그림 2 K- 2 L).

3.3 CCL15는 CCR1에 의한 ESCC 진행을 촉진합니다.

CCL15-CCR1 축에 대한 기존 연구는 주로 종양 유래 CCL15가 CCR1⁺ 면역 세포를 모집하는 데 초점을 맞추었지만, 본 연구에서는 CCR1이 정상 식도 상피 세포인 HET-1A 세포에 비해 ESCC 세포에서 기저 수준에서 유의미하게 발현됨을 확인했습니다. 이러한 관찰을 통해 종양 내재성 CCR1이 CCL15에 의해 활성화되어 종양 진행을 촉진하는 기능적 수용체 역할을 할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 검증하기 위해 CCR1을 표적으로 하는 shRNA 서열을 pLKO.1 벡터에 클로닝하고, psPAX2 및 pMD.2G와 함께 293T 세포에 공동 형질감염시켜 렌티바이러스 입자(lenti-shCCR1)를 생성했습니다. EC109 및 TE-1 세포에 렌티-shCCR1을 감염시킨 후, RT-qPCR 분석을 통해 세 가지 shRNA 구조체 모두 CCR1 mRNA의 효과적인 발현 억제를 확인했습니다(그림 3A - 3B ). 웨스턴 블롯 분석은 CCR1 단백질 발현 억제를 더욱 검증했습니다(그림 3C ). 기능적으로, CCK-8 및 상처 치유 분석 결과 CCR1 억제는 세포 증식과 이동을 유의미하게 억제하는 것으로 나타났습니다(그림 3D - 3E ).

PPI 데이터베이스를 이용하여 CCL15와 CCR1 사이의 직접적인 상호작용을 확인했습니다(그림 3F ). PDB 데이터베이스를 이용한 구조 분석 결과, CCL15가 CCR1의 세포외 도메인에 결합하는 것으로 나타났습니다(그림 3G ). 면역형광 동시국소화 및 동시면역침전 분석을 통해 ESCC 세포에서 CCL15와 CCR1 사이의 물리적 상호작용이 확인되었습니다(그림 3H 및 S2A-S2B). 특히, CCR1 발현 억제는 rhCCL15에 의해 유도된 세포 증식 증가를 역전시켰고(그림 3I ), rhCCL15에 의해 유도된 Ki67 및 PCNA 발현의 상향조절을 약화시켰습니다(그림 3K ). 마찬가지로, 상처 치유 분석 결과, CCR1 발현 억제는 rhCCL15에 의해 유발된 이동성 표현형의 증가를 역전시켰음이 확인되었습니다(그림 3J ). 또한, CCR1 노크다운은 rhCCL15 처리 시에 하향 조절되었던 E-CAD 및 N-CAD 발현을 회복시켰습니다(그림 3 L).

ESCC 진행에서 CCL15-CCR1 축의 생체 내 관련성을 더욱 검증하기 위해, 누드 마우스에서 피하 이종이식 모델을 시행했습니다. 구체적으로, EC109 세포를 네 가지 코호트(대조군, rhCCL15 투여군, rhCCL15 투여 + CCR1 넉다운군, 그리고 CCR1 넉다운군)로 나누었습니다. 마우스의 액와부 중앙 피하 부위에 세포를 주입했습니다(그림 4A ). rhCCL15를 투여한 EC109 세포에서 유래한 종양은 대조군보다 컸지만, CCR1 넉다운은 현저한 종양 성장 억제를 유도했습니다(그림 4B ). 특히, CCR1 넉다운은 rhCCL15의 종양 촉진 효과를 역전시켰습니다(그림 4B ). Ki67과 PCNA 발현을 조사하여 세포 증식을 추가로 평가하고, 종양 조직에서 E-CAD 및 N-CAD 수치를 통해 세포 이동을 평가했습니다. 시험관 내 연구 결과 와 일치하게 , rhCCL15 처리는 Ki67 및 PCNA 양성 세포의 수를 유의미하게 증가시켰고(그림 4C ), E-CAD 및 N-CAD의 발현 수준을 감소시켰습니다(그림 4D ). 이러한 효과는 CCR1의 발현 억제에 의해 역전되었습니다(그림 4C - 4D ). 종합적으로, 이러한 결과는 CCL15가 종양 내재성 CCR1에 작용하여 ESCC 진행을 촉진함을 보여줍니다.

3.4 CDK2는 ESCC에서 CCL15-CCR1 유도 증식 및 이동을 매개합니다.

CCL15-CCR1 축이 ESCC 진행을 촉진하는 기전을 규명하기 위해, CCL15 및 CCR1의 발현 억제 후 EC109 세포에서 종양 관련 유전자 PCR 어레이 분석을 수행했습니다. 특히, CCL15 또는 CCR1의 발현 억제 후 CDK2 발현이 유의미했습니다(그림 5 A- 5 C). 시험관 내(In vitro)에서 rhCCL15 처리는 EC109와 TE-1 모두에서 CDK2 mRNA 수치를 증가시켰지만, CCR1의 발현 억제는 이러한 상향 조절을 효과적으로 역전시켰습니다(그림 5 D). CDK2의 단백질 발현은 관찰된 mRNA 경향과 일치했습니다(그림 5 E- 5 F 및 5J). 마찬가지로, 생체 내(in vivo) 분석에서 rhCCL15 처리는 mRNA 및 단백질 수치 모두에서 CDK2 발현을 증가시켰지만, CCR1의 발현 억제는 이러한 효과를 역전시켰습니다(그림 5 G). 이러한 결과는 CCL15-CCR1 축이 ESCC에서 CDK2의 전사 활성화를 긍정적으로 조절함을 뒷받침합니다. 세포주기의 핵심 조절자인 CDK2는 G1기 후반에 활성화되고 S기 내내 활성 상태를 유지하며 암세포 증식에 중요한 역할을 합니다[ 19 ].이를 바탕으로 CDK2가 CCL15-CCR1 축에 의해 유도되는 ESCC 세포의 증식과 이동을 매개한다는 가설을 세웠습니다.Cdk2의 CDS를 pcDNA3.1 벡터에 클로닝하고 rhCCL15 로 처리하고 CCR1을 억제한 세포에서 Cdk2를 과발현시켰습니다.CCK-8 분석 결과 CDK2 과발현이 CCR1 억제 효과를 약화시켰음이 밝혀졌습니다(그림 5 H- 5 I).

 그림 3 

CCL15는 CCR1을 통해 ESCC의 증식과 이동을 촉진합니다. (A) 렌티바이러스에 감염된 EC109와 TE-1 세포의 모식도. (B) CCR1의 mRNA 수치를 분석하기 위한 RT-qPCR. (C) CCR1의 단백질 수치 변화에 대한 웨스턴 블롯 분석. (D) 세포 생존율은 CCK8을 이용하여 분석했습니다. (E) EC109와 TE-1의 세포 이동 분석. (F) 단백질-단백질 상호작용(PPI) 분석. (G) PBD(7VLA)는 CCR1과 CCL15의 결합 패턴을 보여줍니다. (H) CCR1과 CCL15의 면역형광 공동국소화 분석. 공동국소화 분석에는 Image J 소프트웨어를 사용했습니다. (I) 세포 생존율은 CCK8을 이용하여 분석했습니다. (J) EC109와 TE-1의 세포 이동 분석. (KL) EC109 및 TE-1 세포에서 Ki67, PCNA, E-CAD 및 N-CAD 단백질 수치에 대한 면역 형광 분석. * 대조군/sh대조군 대비, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; # 대조군 rhCCL15 대비, ### p <0.001.

 그림 4 

CCL15는 CCR1을 통해 ESCC 진행을 촉진합니다 . (A) 이종이식 실험 흐름도. 누드 마우스에 처리 또는 미처리 EC109 세포를 피하 주사했습니다. (B) 종양 질에 대한 통계적 분석. (C) 종양 조직에서 Ki67 및 PCNA 수치에 대한 면역형광 분석. (D) 종양 조직에서 E-CAD 및 N-CAD 수치 분석을 위한 면역형광 분석. * vs. shControl, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; # vs. rhCCL15, ## p <0.01, ### p <0.01.

3.5 CCL15-CCR1은 AKT와 ERK1/2를 통해 CDK2 전사를 활성화합니다.

ESCC에서 PI3K/AKT 및 ERK1/2 신호 전달은 세포 증식, 세포 사멸 및 이동을 조절하는 것으로 알려져 있습니다[ 20 ]. G 단백질 결합 수용체인 CCR1은 PI3K-AKT 및 ERK1/2를 포함한 여러 하위 신호 전달 계단을 활성화할 수 있습니다[ 12 , 13 ]. CCL15-CCR1 축이 이러한 경로를 통해 CDK2 전사를 조절하는지 알아보기 위해 일련의 시험관 내 실험을 수행했습니다 . 실험에서 rhCCL15 처리가 ESCC 세포에서 AKT(p-AKT) 및 ERK1/2(p-ERK)의 인산화를 증가시킨다는 것이 입증되었습니다(그림 6A - 6B ). 특히, CCR1 노크다운은 rhCCL15로 유도된 p-AKT 및 p-ERK의 활성화를 없앴습니다(그림 6C - 6D ). 이는 rhCCL15가 CCR1을 통해 AKT 및 ERK1/2 신호 전달을 활성화한다는 것을 나타냅니다. 이를 더욱 확인하기 위해, 테무터키브(ERK1/2 억제제)와 카피바세르팁(AKT 억제제)으로 세포를 처리했습니다. 두 억제제 모두 rhCCL15에 의해 유도되는 CDK2의 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 상향조절을 유의미하게 감소시켰습니다(그림 6 F- 6 G). 또한, CCK-8 분석 결과, 테무터키브와 카피바세르팁은 rhCCL15에 의해 유도되는 ESCC 세포의 증식을 역전시켰습니다(그림 6 E). 면역형광 분석 결과, 이 억제제들이 rhCCL15에 의해 유도된 Ki67 및 PCNA 양성 세포의 증가를 약화시켰음이 확인되었습니다(그림 6 G). 또한, 이 억제제들은 rhCCL15에 의해 하향조절되었던 E-CAD 및 N-CAD 수준을 회복시켰습니다(그림 6 G). 이러한 결과는 CCL15-CCR1 축이 AKT 및 ERK1/2 경로의 활성화를 통해 CDK2 전사 및 ESCC 진행을 촉진함을 보여줍니다.

 그림 5 

CCL15는 CCR1 매개 CDK2 전사 활성화를 통해 ESCC 세포 증식을 촉진합니다 . (AB) CCR1 및 CCL15 녹다운 후 EC109 세포에서 종양 관련 유전자 변화에 대한 PCR 어레이 분석. (C) 하향 조절된 유전자를 보여주는 벤 다이어그램. (D) CDK2 mRNA 수치를 분석하기 위한 RT-qPCR. (EG) EC109, TE-1 세포 및 종양 조직에서 CDK2 수치를 분석하기 위한 면역 형광 분석. (HI) 세포 생존율은 CCK8 분석으로 분석했습니다. (J) CDK2 단백질 수치를 분석하기 위한 웨스턴 블로팅. * vs. shControl, ** p <0.01, *** p <0.001; # vs. rhCCL15, # p <0.05, # # p <0.01; & vs. shCCR1 + rhCCL15, & p <0.01.

 그림 6 

CCL15-CCR1은 ESCC에서 AKT와 ERK1/2를 통해 CDK2 전사를 활성화합니다 . (AD) p-AKT, AKT, ERK1/2, p-ERK1/2 및 GAPDH에서 단백질 수치 변화에 대한 Western blotting 분석. (E) CCK8을 사용하여 검출한 EC109 및 TE-1 세포의 세포 증식. (F) RT-qPCR을 사용하여 EC109 및 TE-1 세포의 CDK2 mRNA 수치 분석. (G) Ki67, PCNA, E-CAD, N-CAD 및 CDK2의 면역 형광 분석. * 대조군/공백 대조군, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; # rhCCL15 대조군, # p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.01.

3.6 AKT와 ERK1/2는 c-Jun을 인산화하여 CDK2 전사 활성화를 매개합니다.

AKT와 ERK1/2가 CDK2 전사를 조절하는 하류 기전을 더욱 자세히 규명하기 위해, Cistrome DB 데이터베이스를 이용하여 CDK2 프로모터 영역을 분석했습니다. 구체적으로, 전사 개시 부위(TSS) 상류에 위치한 1,000 bp 서열을 제출하여 ZNF750, MBD2, STAG1, H2AZ, RELA, MECOM, ESR1, POLR2A, JUN(c-Jun), H2AFZ, RAD21을 포함하여 예측 점수가 0.78 이상인 14개의 전사 인자를 확인했습니다(그림 7 A). PPI 네트워크 분석을 통해 c-Jun이 CDK2를 조절할 뿐만 아니라 AKT 및 ERK1/2와도 상호작용한다는 사실이 추가로 밝혀졌습니다(그림 7 B). 이러한 관찰 결과를 바탕으로, AKT와 ERK1/2가 c-Jun 의 인산화를 통해 CDK2 전사를 조절한다는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 뒷받침하는 것으로, c-Jun 녹다운은 rhCCL15로 처리한 EC109 및 TE-1 세포에서 CDK2 mRNA 발현을 유의미하게 억제했습니다(그림 7C ). 흥미롭게도, rhCCL15 처리는 총 c-Jun mRNA 수치를 변화시키지 않았으며(그림 7D ), 이는 전사 후 기전을 시사합니다. 면역형광 분석 결과, rhCCL15 처리 후 총 c-Jun 단백질 수치는 변하지 않았지만, Ser63 위치에서 c-Jun의 인산화(pc-Jun)는 두 세포주 모두에서 현저하게 증가했습니다(그림 7E - 7F ). 테무터키브와 카피바세르팁 처리는 rhCCL15에 의해 유도된 c-Jun의 인산화를 억제했습니다(그림 7E - 7F ). 또한, rhCCL15 처리는 pc-Jun과 CDK2 프로모터의 결합을 증가시켰는데, 이 효과는 AKT 및 ERK1/2 억제제에 의해 모두 사라졌습니다(그림 7G - 7H ). 이러한 연구 결과를 종합해 보면 ESCC 세포에서 CCL15-CCR1 축이 Ser63의 c-Jun의 AKT 및 ERK1/2 매개 인산화를 통해 CDK2 전사 활성화를 촉진한다는 것을 알 수 있습니다.

3.7 천연 유기 화합물 라이브러리 스크리닝을 통해 Jervine이 CCR1 억제제로 확인되었습니다.

표적 약물 스크리닝은 암 치료에서 중요한 전략입니다. 본 연구에서는 ESCC 세포에서 잠재적인 CCR1 억제제를 확인하기 위해 1,250개의 식물 유래 천연 유기 화합물 라이브러리를 스크리닝했습니다(그림 8A ). EGFP로 표지된 CCR1을 안정적으로 발현하는 EC109 세포에 각 화합물(n=2)을 10 μM 농도로 72시간 동안 처리했습니다. 후보 물질 중 트록세루틴, 과이아콜, 저빈의 세 가지 화합물이 CCR1 수치를 유의미하게 감소시켰습니다( 그림 S1A -S1C). 2차 스크리닝(n=6)에서 저빈은 CCR1 발현을 지속적이고 강력하게 하향 조절했습니다(그림 8B - 8C ). 형광 감소가 CCR1 특이적 분해가 아닌 EGFP 단백질 감소 때문일 가능성을 배제하기 위해, EGFP만 발현하는 EC109 세포에 저빈을 처리했습니다. 형광 강도는 변하지 않았습니다(그림 8D ). 이는 Jervine이 EGFP 형광보다는 CCR1 단백질 수치를 특이적으로 감소시킨다는 것을 나타냅니다.

단백질 분해는 유비퀴틴-프로테아좀 또는 자가포식-리소좀 경로를 통해 발생할 수 있으므로 [ 21 ], 우리는 프로테아좀 억제제 MG132와 자가포식 억제제 3-MA로 세포를 처리하여 근본적인 메커니즘을 조사했습니다.특히, MG132는 3-MA가 아닌 Jervine에 의해 유도된 CCR1 분해를 역전시켰습니다(그림 8E ).이는 Jervine이 자가포식-리소좀 경로가 아닌 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 CCR1 분해를 촉진한다는 것을 시사합니다.또한, 우리는 피하 이종이식 모델을 사용하여 생체 내에서 Jervine의 치료적 잠재력을 평가했습니다 .처리하지 않았거나 10 μM Jervine으로 전처리한 EC109 세포를 누드 마우스에 피하 주사했습니다. Jervine 치료는 종양 성장을 유의미하게 억제하고(그림 8 F), Ki67 및 PCNA 양성 세포 수를 감소시켰으며(그림 8 H- 8 I 및 S3A-S3B), E-CAD 및 N-CAD 발현을 회복시켰습니다(그림 8 J- 8 K). 또한, Jervine은 CDK2 전사를 유의미하게 억제했습니다(그림 8 G 및 S3A-S3B). 이러한 연구 결과는 Jervine이 CCR1을 선택적으로 표적으로 삼고 프로테아좀 경로를 통해 분해를 촉진하며 ESCC 진행을 효과적으로 억제하는 천연 화합물임을 시사합니다.

4. 토론

ESCC 는 후기 진단, 높은 전이 가능성, 화학 요법에 대한 내성으로 인해 가장 공격적인 암 및 치명적인 악성 종양 중 하나로 간주됩니다[ 22-24 ]. ESCC 치료에 있어서 여전히 상당한 과제가 남아 있지만, 격려적으로 최근 몇 년 동안 점점 더 많은 치료 표적이 확인되었습니다[ 25-29 ] . 그 중 CC(예: CCL1, CCL3, CCL5, CCL7 및 CCL15), CXC(예: CXCL1, CXCL3, CXCL5 및 CXCL10), XC(예: XCL1 및 XCL2), CX3C(예: CX3CL1)를 포함하는 케모카인 계열은 종양 발달, 전이 및 화학 요법 내성에 중추적인 역할을 합니다[ 30-33 ] . 이러한 케모카인 중 CCL15는 다양한 종양 조직에서 높게 발현되는 것으로 밝혀졌습니다. Yamamoto et al. 영어: 직장암에서 CCL15가 폐 전이에 기여한다는 것을 밝혔고[ 8 ], Liu et al. 은 CCL15가 면역 관련 신호 전달 경로를 조절함으로써 간세포암에서 면역 회피를 용이하게 한다는 것을 발견했습니다[ 4 ]. 나아가 CCL15는 위암[ 34 ], 흑색종[ 35 ], 백혈병[ 36 ]에서 바이오마커이자 종양 촉진제로 확인되었습니다. 그러나 ESCC에서 CCL15의 기능은 잘 알려져 있지 않습니다. 저희 연구에서는 CCL15 발현이 인접한 비종양 조직에 비해 ESCC 종양 조직에서 유의하게 증가했고 유사하게 ESCC 세포주는 정상 식도 상피 세포보다 더 높은 CCL15 수치를 나타냈습니다. 이러한 결과는 CCL15가 ESCC 진행을 촉진하는 데 관여할 수 있음을 시사합니다. 이를 조사하기 위해 rhCCL15 처리와 CCL15 노크다운을 사용하여 기능 획득 및 기능 상실 실험을 수행했습니다. 본 가설과 일치하게, CCL15는 실제로 ESCC 세포의 증식과 이동을 촉진했습니다. 또한, 누드 마우스를 이용한 피하 이종이식 실험에서 CCL15가 생체 내 종양 성장을 촉진한다는 것이 확인되었습니다 .

 그림 7 

AKT와 ERK1/2는 c-Jun 인산화를 매개하고 CDK2 전사를 개시합니다.(A) 시스트롬 DB는 CDK2 전사를 조절하는 전사 인자를 보여줍니다.(B) 전사 인자와 AKT 및 ERK1/2의 PPI 분석.(C) RT-qPCR을 통한 EC109 및 TE-1 세포의 CDK2 mRNA 수준 분석.(D) EC109 및 TE-1 세포의 c-Jun mRNA 수준 변화.(EF) c-Jun 및 pc-Jun(Ser63)의 면역 형광 분석.(G) UCSC Genome Browser는 pc-Jun(Ser63)이 CDK2 프로모터 영역에 결합하는 것을 나타냅니다.(H) EC109 및 TE-1 세포에서 pc-Jun이 CDK2 프로모터에 결합하는 것에 대한 ChIP-qPCR 분석.* vs. Blank/Control, ** p <0.01, *** p <0.001; # 대 rhCCL15, ## p <0.01, ### p <0.01.

 그림 8 

Jervine은 CCR1 분해를 촉진하고 ESCC를 치료합니다. (A) CCR1 억제제를 위한 천연 유기 약물 라이브러리 스크리닝 과정. (B) Jervine의 분자 구조. (CD) EGFP-CCR1 및 대조군 EGFP 구조물의 형광 강도 분석. (E) CCR1 수치 변화 분석을 위한 면역형광 분석. (F) 종양 질에 대한 통계적 분석. (GK) 종양 조직에서 CDK2, Ki67, PCNA, E-CAD 및 N-CAD 수치에 대한 면역형광 분석. * 대조군 대비, ** p <0.01, *** p <0.001. # 대조군 대비, ## p <0.01.

CCL15는 CCR3 및 CCR1을 포함한 여러 수용체를 활성화할 수 있습니다[ 37 ]. 이 중 CCR1은 CCL15의 종양 촉진 효과를 매개하는 주요 수용체로 간주되며 암 전이, 약물 내성 및 진행과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 특히, 지금까지 대부분의 연구는 CCL15의 부신피질자극호르몬 분비 기능, 즉 종양 미세환경으로 CCR1⁺ 면역 세포를 모집하는 역할에 초점을 맞추었습니다. 예를 들어, 간세포암에서 CCL15는 CCR1⁺ 단핵구를 모집하여 면역 회피 및 전이를 지원합니다[ 38 ]. 마찬가지로 대장암에서 THRC1에 의해 유도된 CCL15의 상향 조절은 CCR1⁺ 대식세포의 모집을 용이하게 하여 종양 진행을 향상시킵니다[ 39 ]. 이와 대조적으로, Yamamoto et al. CCL15에 의해 모집된 CCR1 양성 세포는 주로 종양 관련 호중구(CD11b + , CD33- , HLA-DR- , CD15 + 및 CD16 + )였으며, 소수가 과립구 골수유래 억제 세포인 것으로 밝혀졌습니다[ 8 ]. 이러한 세포는 면역억제성 종양 미세환경 형성에 기여하고 MMP9 및 ARG1을 생성하여 종양 진행을 촉진합니다. 그러나 CCR1의 종양 내재적 역할에 대한 관심은 부족했습니다. 저희 연구에서는 CCR1 단백질 수치가 ESCC 조직뿐만 아니라 ESCC 세포주에서도 인접한 비종양 조직 및 정상 상피 세포와 비교하여 증가한 것을 발견했습니다. 이는 CCR1이 ESCC 진행에 기여할 수 있으며 ESCC 세포에서 CCL15에 의해 활성화될 수 있음을 나타냅니다. 이를 검증하기 위해, CCR1의 렌티바이러스 녹다운을 시행하여 CCR1의 발현 억제가 시험관 내에서 ESCC 세포의 증식과 이동을 유의미하게 억제함을 확인했습니다 . 또한, 누드 마우스 피하 이종이식 분석 결과, CCR1이 생체 내에서 종양 성장을 촉진하는 것으로 나타났습니다 . 중요한 것은, CCR1 녹다운이 CCL15의 종양 촉진 효과를 역전시켜 CCL15가 주로 CCR1 활성화를 통해 ESCC에서 종양 형성에 기여한다는 강력한 증거를 제시했다는 것입니다. 이러한 결과는 CCL15-CCR1 축에 대한 이해를 넓혀, 이전에는 제대로 알려지지 않았던 ESCC 진행에 기여하는 종양 내재적 기전을 밝혀냈습니다.

다음으로, 우리는 CCL15-CCR1 축이 ESCC 증식과 이동을 촉진하는 잠재적인 분자적 메커니즘을 탐구했습니다. PCR 어레이 분석은 CCR1 또는 CCL15 노크다운 후 EC109 세포에서 Cdk2 발현이 하향 조절되었음을 보여주었습니다. CDK2는 세포 주기를 조절하는 데 기여하며, 비정상적인 활성화는 폐암[ 19 ], 유선암[ 40 ], 간암[ 41 ], 식도 편평 상피암[ 42 ]과 같은 다양한 암의 발병 기전에 연루되어 있습니다. Lei 등은 ARRB1을 매개로 하는 자가포식 결핍이 세포 주기를 차단하고 CDK2-CCNE1 복합체를 통해 간세포암 진행을 촉진한다는 것을 보여주었습니다[ 41 ]. Hu 등은 CDK2가 중심소 단백질 CP110을 조절하여 폐암에서 종양 형성을 촉진한다고 보고했습니다. 특히 KRAS 돌연변이 사례에서 그렇습니다[ 19 ]. ESCC에서 CDK2는 Rb/E2F2/RRM2 신호 전달 경로를 통해 악성 진행을 유도하는 것으로 나타났습니다[ 42 ]. 종양 생물학 에서의 중심 역할을 감안할 때 CDK2는 유망한 치료 표적으로 간주되며 표적 분해는 효과적인 치료 전략으로 간주됩니다[ 43-45 ] . 이러한 결과를 바탕으로 CDK2가 ESCC에서 CCL15-CCR1 축의 효과를 매개하는 데 관여할 수 있다고 가설을 세웠습니다. 이를 테스트하기 위해 ESCC 세포에 rhCCL15를 처리하고 CCR1을 억제한 다음 동시에 CDK2를 과발현시켰습니다. 이 결과는 CDK2가 ESCC 세포에서 CCL15-CCR1로 유도된 증식 및 이동 증가를 매개한다는 것을 확인했습니다.

AKT와 ERK1/2의 인산화는 CCR1 신호전달을 매개하는 핵심 하류 분자 사건입니다. CCR1은 AKT-ESR1을 활성화하여 간세포암 세포의 증식과 이동을 촉진하고[ 46 ] ERK1/2와 Rac 신호전달을 활성화하여 전립선암 세포의 침습성을 증가시킵니다[ 14 ]. 저희 연구에서 rhCCL15 치료는 AKT와 ERK1/2 인산화를 증가시켰지만 CCR1 노크다운은 ESCC 세포에서 이 효과를 없앴습니다. 이러한 경로의 기능적 관련성을 평가하기 위해 저희는 ESCC 세포를 Temuterkib(ERK1/2 억제제)와 Capivasertib(AKT 억제제)로 처리했습니다. 두 치료 모두 CDK2 전사를 상당히 감소시켰는데, 이는 AKT와 ERK1/2가 CCL15-CCR1 하류의 CDK2 전사 활성화를 매개한다는 것을 시사합니다. 다음으로, CDK2의 전사 조절자를 조사하고 높은 조절 잠재력을 가진 후보 전사인자로 c-Jun을 식별했습니다.특히, AKT와 ERK1/2는 c-Jun을 인산화하여 전사 활성을 조절할 수 있습니다[ 47 ].이러한 결과는 CCL15-CCR1이 유도하는 CDK2의 전사 활성화가 AKT와 ERK1/2를 통한 c-Jun 인산화에 의해 매개될 수 있음을 시사합니다.c -Jun의 렌티바이러스 녹다운을 사용하여 c-Jun이 AKT/ERK1/2를 매개로 한 CDK2 상향 조절에 필수적임을 확인했습니다.c-Jun의 63번 위치에 있는 트립토판은 주요 인산화 부위이며 c-Jun의 전사 활성화에 중요한 역할을 합니다[ 48 ]. 본 연구에서는 AKT와 ERK1/2의 약리학적 억제가 CCL15에 의해 유도된 c-Jun 인산화를 억제하고, pc-Jun과 CDK2 프로모터의 결합을 현저히 감소시켰습니다. 요약하자면, 이러한 결과는 ESCC에서 CCL15-CCR1에 의한 CDK2의 전사 활성화가 AKT뿐만 아니라 ERK1/2를 통한 c-Jun 인산화에 의해 매개됨을 시사합니다.

BX471, J113863, UCB35625, MLN-3897과 같은 CCR1을 표적으로 하는 억제제는 암 중재 요법에서 유망한 결과를 보이며 광범위하게 연구되어 왔습니다. 그러나 이러한 억제제는 특히 특이성과 관련된 문제를 포함하여 한계점을 가지고 있습니다. 예를 들어, BX471은 CCR1뿐만 아니라 CCR2, CCR5, CXCR4도 표적으로 하는 반면, J113863은 CCR3에 강력한 억제 효과를 나타냅니다. 본 연구에서는 천연 유기 화합물 라이브러리를 이용하여 CCR1 분해 인자를 스크리닝하고, CCR1 분해를 효과적으로 촉진하는 Jervine을 동정했습니다. 세포 내 단백질 분해는 일반적으로 자가포식-리소좀 경로 또는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 발생합니다 . Jervine에 의한 CCR1 분해의 기전을 규명하기 위해 ESCC 세포에 MG132(프로테아좀 억제제)와 3-MA(자가포식 억제제)를 처리했습니다. 종합 분석 결과 MG132가 Jervine 유도 CCR1 분해를 역전시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이 과정이 자가포식-리소좀 경로보다는 유비퀴틴-프로테아좀 경로에 의존함을 나타냅니다.Jervine은 항염증 및 항산화 특성으로 알려진 스테로이드 알칼로이드입니다[ 49 ].최근 연구에서는 장에 대한 보호 효과와 비인두암에 대한 항암 활성이 입증되었습니다[ 49 , 50 ].이 연구에서 우리는 ESCC 진행에 대한 Jervine의 생체 내 효과를 추가로 평가하고 종양 성장을 상당히 지연시키는 것을 확인했습니다.이러한 결과는 Jervine이 ESCC 치료 결과를 개선하기 위한 CCR1 표적 분해 요법의 잠재적 후보가 될 수 있음을 시사합니다.

요약하면, 우리는 ESCC에서 CCL15-CCR1 축의 종양 촉진 역할을 확인했고 하위 AKT/ERK1/2/c-Jun/CDK2 경로를 핵심 조절 메커니즘으로 밝혔습니다. 나아가, 우리는 Jervine을 새로운 CCR1 분해자로 식별하여 ESCC의 치료적 개입을 위한 잠재적인 후보 분자를 제공했습니다. 그러나 우리는 우리 연구에 특정 한계가 있음을 인정합니다. 예를 들어, AKT와 ERK1/2 활성화가 c-Jun 인산화와 상관관계가 있지만, c-Jun을 직접 인산화하지 않을 수 있으며, 이는 추가적인 키나제의 관련성을 시사합니다. Jervine이 CCR1 분해를 유도하는 정확한 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 게다가, EMT 과정은 일반적으로 E-카드헤린 발현의 감소와 N-카드헤린 발현의 증가를 동반합니다[ 51 ]. 이 연구에서 우리는 CCL15-CCR1 축이 세포 이동을 촉진한다는 것을 발견했습니다. 그러나 N-카드헤린 발현은 감소하였는데, 이는 EMT의 전형적인 특징과 일치하지 않습니다. 이러한 측면은 향후 연구에서 다룰 예정입니다.

보충 자료

보충 그림 및 표.

감사의 말자금 조달

본 연구는 중국 국가자연과학기금(번호 82360498), 간쑤성 공동과학연구기금 중점 프로젝트(번호 23JRRA1537), 간쑤성 병원 일반 프로젝트(번호 21GSSYB-36)의 지원을 받았습니다.

데이터 가용성

요청 시 해당 저자에게 자료를 제공해 드립니다.

저자 기여

HSL과 GYJ는 실험 설계에 기여했습니다. HSL, HSC, BQZ는 실험을 수행했습니다. HSL은 데이터를 분석했고, HSL과 JDC는 원고를 작성했습니다. CH는 원고를 수정하고, 연구비와 지도를 제공했습니다.

윤리 선언문

임상 샘플 수집 및 동물 실험은 간쑤성 인민병원 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다(2024-699).

경쟁적 이해관계

저자들은 경쟁적 이해관계가 존재하지 않는다고 선언했습니다.

참고문헌

1. Chen Y, Lu Y, Ren Y, Yuan J, Zhang N, Kimball H. 외 . miR-10b에 의한 기아 유도 DAZAP1 억제는 식도 편평세포암에서 TSC2 조절 발암성 자가포식에 스플라이싱 조절을 통합한다 . Theranostics. 2020; 10 :4983-96

2. Teng H, Xue M, Liang J, Wang X, Wang L, Wei W. 외 . 식도 편평세포암의 림프절 전이 및 예후와 관련된 종양 간 및 종양 내 DNA 메틸화 이질성 . Theranostics. 2020; 10 :3035-48

3. Fong LY, Taccioli C, Palamarchuk A, Tagliazucchi GM, Jing R, Smalley KJ. 외 . miR-31 유전자 결손 쥐에서 식도암 발생 억제 . Proc Natl Acad Sci US A. 2020; 117 :6075-85

4. Liu LZ, Zhang Z, Zheng BH, Shi Y, Duan M, Ma LJ. 외 . CCL15는 간세포암에서 면역 회피 및 질병 진행을 촉진하기 위해 억제성 단핵구를 모집한다 . Hepatology. 2019; 69 :143-59

5. Shao Z, Shen Q, Yao B, Mao C, Chen LN, Zhang H. 외 . 케모카인 수용체 CCR1에 대한 G 단백질 편향 리간드의 동정 및 작용 기전 . Nat Chem Biol. 2022; 18 :264-71

6. Du X, Li F, Zhang C, Li N, Huang H, Shao Z. 외 . 호산구 유래 케모카인(hCCL15/23, mCCL6)은 CCR1과 상호작용하여 호산구성 기도 염증을 촉진한다 . Signal Transduct Target Ther. 2021; 6:91

7. Wang C, Dong D, Zhao N, Liu Y, Bai C, Hua J. 외 . 종양 유래 CCL15는 암 관련 섬유아세포에서 RNA m(6)A 메틸화를 조절하여 간세포암종 성장을 촉진한다 . Cancer Lett. 2024; 611 :217420

8. 야마모토 T, 카와다 K, 이타타니 Y, 이나모토 S, 오카무라 R, 이와모토 M. 외 . SMAD4의 손실은 CCL15-CCR1 축을 통한 CCR1+ 종양 관련 호중구의 축적으로 대장암의 폐 전이를 촉진합니다 . Clin Cancer Res. 2017; 23 :833-44

9. Qin R, Ren W, Ya G, Wang B, He J, Ren S. 외 . 종양과 종양 관련 대식세포 간 교차 신호 전달에서 케모카인의 역할 . Clin Exp Med. 2023; 23 :1359-73

10. Niu B, Tian T, Wang L, Tian Y, Tian T, Guo Y. 외 . TGF-β를 포집하여 SMAD4 결핍 대장암의 전이를 약화시키는 CCL9/CCR1 축 유도 화학주성 나노소포. Acta Pharm Sin B. 2024; 14 :3711-29

11. Barnes PJ. 케모카인 수용체 CCR1: 천식 치료의 새로운 표적 . Trends Pharmacol Sci. 2022; 43 :539-41

12. van Attekum MHA, Terpstra S, Slinger E, von Lindern M, Moerland PD, Jongejan A. 외 . 대식세포는 만성 림프구성 백혈병에서 CCR1 의존성 번역 MCL-1 유도를 통해 생존 신호를 부여합니다 . 종양 유전자. 2017; 36 :3651-60

13. Sang Y, Li Y, Xu L, Chen J, Li D, Du M. CCR1(+) 탈락막 대식세포 기능 장애는 원인 불명의 반복 유산 발생의 잠재적 위험 요인입니다 . Front Immunol. 2022; 13 :1045532

14. Guan B, Li H, Yao J, Guo J, Yu F, Li G. 외 . CCL3-CCR5 축은 Akt 신호전달 경로를 통해 대장 선암의 세포 이동 및 침윤을 촉진한다 . Environ Toxicol. 2023; 38 :172-84

15. Shi C, Jin J, Xu H, Ma J, Li T, Xie Y. 외 . CCR1은 ERK 인산화를 상향 조절하여 DGCR8의 SUMOylation을 증가시켜 척추 신경 결찰로 유발된 신경병증성 통증을 촉진한다 . Gene Ther. 2022; 29 :379-89

16. Luo Y, Tian W, Kang D, Wu L, Tang H, Wang S. 외 . RNA 변형 유전자 WDR4는 유방암에서 종양 진행 및 면역치료 내성을 촉진한다 . J Adv Res. 2025; 72 :333-351

17. Tian W, Tang Y, Luo Y, Xie J, Zheng S, Zou Y. 외 . AURKAIP1은 삼중 음성 유방암에서 DDX5를 안정화시켜 종양 진행을 촉진한다 . Cell Death Dis. 2023; 14 :790

18. Jayaraman S, Pazhani J, PriyaVeeraraghavan V, Raj AT, Somasundaram DB, Patil S. PCNA 및 Ki67: 구강암에 대한 예후 증식 마커 . 경구용 종양. 2022; 130 :105943

19. Hu S, Danilov AV, Godek K, Orr B, Tafe LJ, Rodriguez-Canales J. 외 . CDK2 억제는 중심체 단백질 CP110을 통해 폐암의 후기 재앙을 유발한다 . Cancer Res. 2015; 75 :2029-38

20. Lei K, Liang R, Liang J, Lu N, Huang J, Xu K. 외 . CircPDE5A로 암호화된 PI3K/AKT 경로의 새로운 조절자는 USP14를 매개로 한 PIK3IP1의 탈유비퀴틴화를 촉진하여 식도 편평세포암 진행을 억제한다 . J Exp Clin Cancer Res. 2024; 43 :124

21. Varshavsky A. 유비퀴틴 시스템, 자가포식, 그리고 조절되는 단백질 분해 . Annu Rev Biochem. 2017; 86 :123-8

22. An L, Li M, Jia Q. 식도 편평세포암에 대한 방사선 치료 저항성 기전 및 방사선 민감화 전략 . Mol Cancer. 2023; 22 :140

23. Xiong G, Chen Z, Liu Q, Peng F, Zhang C, Cheng M. 외 . CD276은 CXCL1-CXCR2 유도 신경내분비종양(NET)을 통해 식도 편평세포암종의 면역 회피를 조절한다 . J Immunother Cancer. 2024; 12 :e008662

24. Wei H, Zhao D, Zhi Y, Wu Q, Ma J, Xu J. 외 . RTN4IP1은 아미노산 운반체의 조절을 통해 ESCC에 기여합니다 . 고급 과학 (Weinh). 2025; 12 :e2406220

25. Wang L, Liu H, Liu Y, Guo S, Yan Z, Chen G. 외 . ESCC에서 암줄기세포 유사세포의 잠재적 마커: 현재 지식에 대한 고찰 . Front Oncol. 2023; 13 :1324819

26. Xie F, Qiu J, Sun C, Feng L, Jun Y, Luo C. 외 . 식도 편평세포암 치료를 위한 특정 압타머 변형 나노 시스템 개발 . Adv Sci (Weinh). 2024; 11 :e2309084

27. Shi X, Zhang X, Huang X, Zhang R, Pan S, Huang S. 외 . N(6)-메틸아데노신을 매개로 한 LNCAROD의 상향조절은 PARP1 안정화를 통해 식도 편평세포암에서 방사선 저항성을 부여한다 . Clin Transl Med. 2024; 14 :e70039

28. Li L, Zhu R, Zhou H, Cui CP, Yu X, Liu Y. 외 . All-Trans 레티노산은 식도 편평세포암에서 종양 억제성 OTUD6B-β-TrCP-SNAIL 축을 촉진하고 면역치료를 향상시킨다 . Adv Sci (Weinh). 2023; 10 :e2207458

29. Zhao Z, Deng Y, Han J, Ma L, Zhu Y, Zhang H. 외 . CircMALAT1은 식도 편평세포암에서 Musashi-2/c-Myc 축 조절을 통해 암 줄기세포 유사 특성 및 항암제 내성을 촉진한다 . MedComm (2020). 2024; 5 :e612

30. Han D, Han Y, Guo W, Wei W, Yang S, Xiang J. 외 . 식도 편평세포암의 고차원 단일세포 프로테오믹스 분석을 통해 신보조요법 후 종양 면역 미세환경의 역동적인 변화가 드러남 . J Immunother Cancer. 2023; 11 :e007847

31. Chen J, Zhao D, Zhang L, Zhang J, Xiao Y, Wu Q. 외 . 종양 관련 대식세포(TAM) 분비 CCL22는 디아실글리세롤 키나제 α(DGKα)/NOX4 축 활성 조절을 통해 식도 편평세포암(ESCC) 세포의 시스플라틴 저항성을 유발한다 . Drug Resist Updat. 2024; 73 :101055

32. Sui X, Chen C, Zhou X, Wen X, Shi C, Chen G. 외 . 종양 관련 대식세포 유래 CCL18을 식도 편평세포암의 치료 표적으로 확인하기 위한 벌크 및 단일 세포 유전자 발현 프로파일의 통합 분석 . J Exp Clin Cancer Res. 2023 ; 42:51

33. Gu L, Sang Y, Nan X, Zheng Y, Liu F, Meng L. 외 . circCYP24A1은 PKM2와 결합하여 NF-κB에 의해 유발된 CCL5 분비를 조절함으로써 식도 편평 세포 암종의 진행을 촉진합니다 . 몰 암. 2022; 21 :217

34. Rajkumar T, Vijayalakshmi N, Gopal G, Sabitha K, Shirley S, Raja UM. 외 . 위암 발생 관련 유전자의 동정 및 검증 . Cancer Cell Int. 2010 ; 10:45

35. Barrio-Alonso C, Nieto-Valle A, García-Martínez E, Gutiérrez-Seijo A, Parra-Blanco V, Márquez-Rodas I. 외 . 흑색종-대식세포 누화에 대한 케모카인 프로파일링은 CCL8과 CCL15를 피부 흑색종의 예후 인자로 식별합니다 . J 파톨. 2024년; 262 :495-504

36. 이재성, 김인수. 류코탁틴-1/CCL15는 PKC델타 활성화를 통해 인간 호산구성 백혈병 EoL-1 세포의 세포 이동 및 분화를 유도한다 . Mol Biol Rep. 2010; 37 :2149-56

37. Korbecki J, Kojder K, Simińska D, Bohatyrewicz R, Gutowska I, Chlubek D. 외 . 종양 내 CC 케모카인: 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4 리간드의 항암 및 항암 특성에 대한 고찰 . Int J Mol Sci. 2020; 21 :8412

38. Inamoto S, Itatani Y, Yamamoto T, Minamiguchi S, Hirai H, Iwamoto M. 외 . SMAD4 손실은 CCL15-CCR1 케모카인 축을 통해 골수 유래 억제 세포의 축적을 통해 대장암 진행을 촉진한다 . Clin Cancer Res. 2016; 22 :492-501

39. Liu Y, Chen X, Xu Y, Yang T, Wang H, Wang Z. 외 . CTHRC1은 CCL15의 상향조절을 통해 종양 관련 대식세포를 유인하여 대장암 진행을 촉진한다 . J Mol Med (Berl). 2024; 102 :81-94

40. Freeman-Cook K, Hoffman RL, Miller N, Almaden J, Chionis J, Zhang Q. 외 . CDK2/4/6 억제제를 이용한 종양 세포주기 조절 확장 . Cancer Cell. 2021; 39 :1404-21.e11

41. Lei Y, Xu X, Liu H, Chen L, Zhou H, Jiang J. 외 . HBx는 ARRB1 매개 자가포식을 통해 G(1)/S 주기를 유도하여 간세포암 발생을 유도한다 . Autophagy. 2021; 17 :4423-41

42. Chen Y, Dai X, Chen W, Qiao Y, Bai R, Duan X. 외 . 디오스메틴은 CDK2/Rb/E2F2/RRM2 경로를 통한 ESCC 진행을 억제하고 시스플라틴과 시너지 효과를 나타낸다 . Oncogene. 2023; 42 :2278-93

43. Zeng Y, Ren X, Jin P, Fan Z, Liu M, Zhang Y. 외 . CDK2의 억제제 및 PROTAC: 과제와 기회 전문가 Opin Drug Discov. 2024년; 19 :1125-48

44. Sun L, Wang Y, Li J, Xu S, Xu S, Li J. 브루산티놀은 CDK2/4/6 억제제로서 유방암 세포의 성장을 억제합니다 . Chem Biol Interact. 2024; 395 :110999

45. Kasirzadeh S, Lenjisa JL, Wang S. 항암 치료에서 약물 내성 퇴치를 위한 CDK2 표적 연구 . Future Oncol. 2024; 20 :3325-41

46. Meng J, Wang L, Hou J, Yang X, Lin K, Nan H. 외 . CCL23은 CCR1/AKT/ESR1 피드백 루프를 통해 간암 진행을 억제한다 . Cancer Sci. 2021; 112 :3099-110

47. Tian W, Zhu L, Luo Y, Tang Y, Tan Q, Zou Y. 외 . SAT1에 의해 유도된 자가포식 결핍은 삼중 음성 유방암에서 종양 진행을 강화한다 . Adv Sci (Weinh). 2024; 11 :e2309903

48. Cho YY, Tang F, Yao K, Lu C, Zhu F, Zheng D. 외 . Ser63 및 Ser73의 Cyclin 의존성 키나아제 -3 매개 c-Jun 인산화는 세포 형질 전환을 향상시킵니다 . 암 입술. 2009; 69 :272-81

49. Chen J, Wen B, Wang Y, Wu S, Zhang X, Gu Y. 외 . Jervine은 Hedgehog 신호전달 차단을 통해 자가포식 세포자멸사를 촉진하여 비인두암에 항암 효과를 나타낸다 . Biomed Pharmacother. 2020; 132 :110898

50. Yakan S, Aydin T, Gulmez C, Ozden O, Eren Erdogan K, Daglioglu YK. 외 . 방사선 유발 위장관 독성에 대한 저빈의 보호 역할 . J Enzyme Inhibit Med Chem. 2019; 34 :789-98

51. Huang Y, Hong W, Wei X. 종양 진행 및 전이에 대한 EMT의 분자적 기전 및 치료 전략 . J Hematol Oncol. 2022; 15 :129

저자 연락처

연락처: Hui Cai (ldyy_caih @lzu.edu.cn).

---

인용 스타일

미국 의사회복사

He, S., Gou, Y., Bo, Q., Jin, D., Han, S., Cai, H. (2025). ESCC 진행 억제: CCL15-CCR1 축이 AKT/ERK1/2/c-Jun/CDK2 경로를 활성화시킨다. Journal of Cancer , 16(10), 3112-3127. https://doi.org/10.7150/jca.113925.

ACS복사

He, S.; Gou, Y.; Bo, Q.; Jin, D.; Han, S.; Cai, H. ESCC 진행 잠금 해제: CCL15-CCR1 축이 AKT/ERK1/2/c-Jun/CDK2 경로를 활성화합니다. J. Cancer 2025, 16(10), 3112-3127. DOI: 10.7150/jca.113925.

NLM복사

He S, Gou Y, Bo Q, Jin D, Han S, Cai H. ESCC 진행 억제: CCL15-CCR1 축이 AKT/ERK1/2/c-Jun/CDK2 경로를 활성화한다. J Cancer 2025; 16(10):3112-3127. doi:10.7150/jca.113925. https://www.jcancer.org/v16p3112.htm

CSE복사

He S, Gou Y, Bo Q, Jin D, Han S, Cai H. 2025. ESCC 진행 잠금 해제: CCL15-CCR1 축은 AKT/ERK1/2/c-Jun/CDK2 경로를 활성화합니다. J Cancer . 16(10):3112-3127.

출원: https://www.jcancer.org/v16p3112.htm#Section1

Unlocking ESCC Progression: CCL15-CCR1 Axis Activates AKT/ERK1/2/c-Jun/CDK2 Pathway

본 저작물은 크리에이티브 커먼즈 저작자표시 라이선스(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에 따라 배포되는 오픈 액세스 저작물입니다. 전체 이용 약관은 https://ivyspring.com/terms에서 확인하세요.

---

©2025 Ivyspring International Publisher . 이용 약관