유통 샐러드중의 병언성 미생물 오염 실태조사

[김동석]

유통 샐러드중의 병원성 미생물 오염 실태조사 | ▶ 오염연구

Abstract : On the purpose of epidemiological survey relate to food poisoning, a total of 114 samples of different salads collected from fast food Restaurants in Gyeonggi-do were for the presence of pathogenic microorganisms. Microbial assessment of salads revealed that TPC(1.1×10 ~ 8.4×10⁵ CFU/g) and coliforms(0 ~  5.4×10⁴ CFU/g) exceeded the standards by Solberg et al.(TPC:10⁵ CFU/g, coliforms:10² CFU/g).

Two pathogenic bacteria were isolated from salad samples, and identified by biochemical methods, including API identification systems.

Isolates from PALCAM agar and MYP agar media were in 98.6, 99.8% agreements with Listeria monocytogenes, Bacillus cereus at the species level, respectively. All 7 strains of Bacillus cereus isolates produced enterotoxin as revealed with CRET-RPLA.

Ⅰ. 서   론

  현대사회가 급격한 경제성장과 사회구조가 변함에 따라 외국문화의 유입과 인구의 팽창 및 핵가족화 그리고 여성의 사회진출 확대 및 생활수준의 향상 등으로 생활양식 및 식생활에서 많은 변화¹⁾가 있었다. 따라서 국민들이 외식에 의존하는 빈도가 점차 증가하게 되었고 오늘날 외식업소가 국민들의 중요한 식생활을 담당하게 되었다²⁾.

  외식산업은 대표적인 서비스산업으로 1980년부터 꾸준히 증가하고 있는데³⁾ 이중 가장 급신장세를 보인 것이 패스트푸드점(fast food restaurant)이다⁴⁾.

  오늘날의 식중독 사고는 거의 가정에서 소규모로 발생했던 과거와는 달리 최근 외식의 기회가 증가함에 따라 집단식중독 발생이 점차로 증가하고 있으며, 그 규모도 대형화되고 있는 추세이다⁵⁾.

  우리나라에서의 총 식중독 환자발생건수는 2001년은 93건에 6,406명이, 2002년에는 78건에 2,980명의 환자가 발생하였다. 2003년은 총 135건이 발생하여 총환자수는 7,909명이었고 학교급식소, 집단급식소, 음식점이 113건에 7,571명을 차지하여 집단화, 대형화 하고 있다⁶⁾. 따라서 식품의 안전성과 품질이 사회적 문제로 크게 대두되고 있으며 이에 대한 대비책이 시급한 국가적 과제로 부상하고 있다.

  최근 식품산업의 급격한 발전으로 인하여 소비자들의 건강에 대한 인식이 증가함에 따라 영양가가 높으면서 맛이 있는 식품을 선호하게 되었다. 그 중에서도 야채류는 인간의 무병장수를 위한 건강식품의 소재로서 날로 관심이 높아지고 있다. 일반적으로 최소가공야채류는 간단하게 솎음, 껍질 벗김, 얇게 잘라냄, 세척 등의 방법을 사용하여 만들어지며 완제품은 포장을 하여 냉장저장을 한다. 이러한 RTU (ready-to-use)야채류는 최소가공을 한 후에도 자체 내에 미생물을 갖고 있으며 식품의 안전성에 심각한 문제를 야기 시키는 식중독균도 포함되어 있다⁷⁾.

  대부분의 야채류는 물을 함유하고 있으므로 미생물이 증식하기에 적당하기 때문에 실제로 많은 병원성세균이 샐러드 야채에서 분리 된다⁸⁾. Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila, Yersinia entero- colitica, Clostridium botulinum 등은 냉장보관 시 생존과 성장이 가능⁹⁾하므로 냉장보관 또한 장시간 보관 시 식품 위생적 측면에서 바람직하지 않는 상황이 초래될 수 있다. 이에 식품의 품질과 안전성에 관한 새로운 대책기술의 필요성이 요구되고 있다. 그러한 기술의 하나로 예측미생물학(Predictive food microbiology)의 중요성이 대두되게 되었다. 최근 들어 미국과 유럽을 중심으로 대단히 활발한 연구가 이루어지고 있다. 지금까지의 상당한 시간과 인력 그리고 경비가 소요되는 미생물 접종시험 및 보존시험을 대체하여 식품의 원재료로부터 소비에 이르기까지의 전과정중에 병원성 미생물의 생장에 대하여 수학적 모델을 이용한 예측과 제어가 가능하기 때문에 대상 식품중의 병원 미생물의 정량적 위험도평가(Quantitative risk assessment)를 위한 저비용의 유효 수단으로 인정되고 있다¹⁰⁾.

  또한 식품의 안전성을 확보하기위해 지금까지의 일반적 위생관리 기준만으로 부족하였다. 따라서 이를 보완하기위한 국제적 기준으로서 HACCP(Hazard analysis critical control point) 시스템¹¹⁾이 도입되어 합리적이고 과학적인 위생관리체계^12,13)로 인식되기에 이르렀다.

  그러나 HACCP은 현장마다 그 상황에 맞게 충분한 위해분석이 이루어진 후 원안을 만들어야 하므로 모범사례가 제각각이고 HACCP에 관한 기초 자료나 정보수집이 안되어 어려운 경우가 많다¹⁴⁾. 국내외적으로는 1990년대 들어 HACCP을 적용, 실시하는 생산업체는 전반적으로 증가하였으나 국내적용에 관한보고는 미흡한 실정이다.

  이에 본 연구는 패스트푸드점에서 판매되는 샐러드에 대해서 미생물학적 품질을 평가하기 위하여 일반세균, 대장균군 및 병원성세균을 분리하여 잠정적 위해를 조사함으로써 위생적인 관리체계 확립을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 조사대상

  본 연구는 경기북부지역의 패스트푸드점에서 판매되고 있는 샐러드를 구입하여 얼음을 채운 아이스박스로 운반하고 6시간 이내에 균 분리 실험에 사용하였다.

2. 검사방법

1) 시료 전처리

  샐러드 25 g 을 무균적으로 취하여 멸균생리식염수 225 ㎖ 를 가하여 stoma- cher(Bagmixer 400, Interscience, USA)로 균질화한 후 시험용액으로 하였다.

2) 미생물 검사

(1) 총균수(Total plate count)

  시험용액을 10 단계 희석법에 따라 희석하여 각 희석액을 멸균 Petri dish 2매에 각각 1 ㎖ 를 분주한 후 Plate Count agar (Difco, USA)를 무균적으로 분주하여 시험용액과 배지를 잘 혼합한 다음 냉각 응고시키고 배지를 중첩시켜 확산집락의 발생을 억제시킨 후 냉각 응고시킨 Petri dish는 35℃ 에서 48시간 배양한 후 1개 평판 당 30～300개의 집락(colony)을 생성한 평판을 택하여 g 당 집락수를 계산하였다.

(2) 대장균군수(Coliforms)

  시험용액을  10단계 희석법에 따라 희석하여 각 희석액을 Petri dish 2매에 각각 1 ㎖ 를 분주한 후 Desoxycholate Lactose agar(Difco, USA)를 무균적으로 분주하여 시험용액과 배지를 잘 혼합한 다음 냉각 응고시키고 배지를 중첩시켜 확산집락의 발생을 억제시킨 후 냉각 응고시킨 Petri dish는 35℃ 에서 22시간 배양한 후, 생성된 집락중 적색의 전형적인 집락이 1개 평판 당 30～300개의 집락(colony)을 형성 한 평판을 택하여 g 당 집락수를 계산하였다.

(3) 대장균(Escherichia coli)

  시험용액 1 ㎖ 를 EC broth(Difco, USA)에 접종하고 44.5℃ 에서 24시간 배양하여 가스발생을 인정한 발효관에서 1 백금이를 EMB agar(Difco, USA)에 도말하고 35℃ 에서 24시간 배양하여 전형적인 집락을 확인하고 그람염색과 API 20E test kit(bio Merieux, France)를 이용하여 생화학 시험을 하여 대장균 양성을 판정하였다

(4) 병원성세균의 분리

  Listeria monocytogenes는 샐러드 25 g 을 무균적으로 취하여 Listeria Enrichment broth(Difco, USA) 225 ㎖ 를 가하고 stomacher로 균질화한 후 30℃ 에서 24시간 배양하여 PALCAM agar(Oxoid, Eng- land)에 획선 도말하여 35℃ 에서 24시간 배양한 후 전형적인 집락을 선택하였다.

  Bacillus cereus는 샐러드 25 g 을 무균적으로 취하여 멸균인산완충희석액 225 ㎖ 를 가하여 stomacher로 균질화한 후 MYP agar(Oxoid, England)에서 획선 도말하여 35℃ 에서 24시간 배양한 후 전형적인 집락을 선택하였다.

  Salmonella, Shigella,  Vibrio para- haemolyticus, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni도 식품공전¹⁵⁾과 감염성실험실진단지침¹⁶⁾에 따라 실험하였다.

(5) 병원성세균의 동정

  L. monocytogenes는 PALCAM agar에서 흑색의 환을 가진 전형적인 집락을 선택 0.6% yeast extract가 첨가된 Tryptic Soy agar(TSA-YE)와 Blood agar에 streaking하고 35℃ 에서 24시간 배양한 후 β-hemolysis를 나타내는 균주에 대하여 Gram stain, Catalase, Oxidase test를 실시하였으며, CAMP test와 API Listeria test kit(bio Merieux, France)를 이용 생화학 시험을 하여  동정하였다.

  B. cereus는 MYP agar에서  혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락을 선별하여 Tryptic Soy agar(TSA)와 Blood agar에 strea- king하여 β-hemolysis를 나타내는 균주에 대하여 Gram stain, Catalase test를 실시하였으며, API 50CHB와 API 20E test kit(bio Merieux, France)를 이용 생화학 시험을 하여 동정하였다.

3) 중합 효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction : PCR)을 이용한 균주 확인시험

(1) 균주의 준비

  대장균은 가스가 생성된  EC broth에서 1 백금이를 취하여 MacConkey agar에 획선 도말하고 35℃ 에서 24시간 배양하여 적색의 전형적인 집락을 선택하여 TSA 배지에 35℃ 에서 24시간 계대 배양하였다. L. monocytogenes로 동정된 균주는 TSA-YE 배지로 B. cereus로 동정된 균주는 TSA 배지로 35℃ 에서 24시간 계대 배양하였다.

(2) DNA의 분리

  TSA-YE와 TSA 배지의 균주 1 백금이를 TE buffer(10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA ; pH 7.6) 1 ㎖ 에 부유시킨 다음 95℃ 에서 10분간 열처리하여 균질화 시킨 후 10,000 rpm 에서 10분간 원심분리 하여 상층액을 사용하였다.

(3) PCR 증폭반응

  균주의 확인 시험을 위하여 L. mono- cytogenes는 Iap gene에서 증폭된 DNA가 454bp 인 LM primer (Kogenbiotec, Korea), B. cereus는 Bce T gene에서 증폭된 DNA가 303bp 인 BC primer (Kogenbiotec, Korea)를 사용 PCR을 실시하였으며, PCR mixture는 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM MgCl₂, 40 mM KCl, 0.001% gelatin, 250 μM dNTP, primer 30 pM, 1 U Taq polymerase를 함유하도록 조제하여 사용하였다. 반응액에 5 ㎕ 의 target DNA를 가한 후 94℃ 2분, (94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초) 35 cycle 반복하였으며 72℃ 에서 5분간 정치하였다.

(4) 전기영동

  증폭된 DNA는 loading buffer와 혼합하여 2% agarose gel에 TBE 완충액(100 mM Tris-HCl, 83 mM boric acid, 1 mM EDTA; pH 8.3)을 사용하여 110 volt로 50분간 전기영동 시키고, ethidium bromide로 염색하여 자외선 투조기 상에서 Polaroid film으로 사진을 찍어 관찰하였다. 

4) 독소확인시험

  B. cereus의 enterotoxin 생성능은 CRET-RPLA (Denkaseiken, Tokyo, Japan)을 사용하여 제조회사의 사용설명서에 따라 enterotoxin을 확인하였다. Enterotoxin을 측정하기 위하여 B. cereus는 Brain Heart Infusion broth (Difco, USA)배지에서 32℃ 에서 6시간 진탕배양(rotary shaker 110 rev/ min, Universal, Korea)하여 상등액을 취한 후 enterotoxin 생성능 시험에 사용하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 미생물검사

1) 총균수

  미생물 분석결과 원재료의 총균수는 1.1×10¹ ~ 8.4×10⁵ CFU/g 으로 샐러드의 종류에 따라 큰 차이를 나타내었다. Solberg¹⁷⁾ 등이 제시한 배식단계 음식의 기준치인 총균수 10⁵ CFU/g 이하를 만족시켰으나 최상의 원료구입과 냉장보관, 위생적인 기구사용 등으로 미생물의 증식방지에 노력해야 하겠다.

2) 대장균군수

  샐러드의 대장균군수는 0 ~ 5.4×10⁴ CFU/g 으로 패스트푸드점별, 종류에 따라 큰 차이를 나타내었으며, 샐러드 71건(62.3%)에서 대장균군이 검출되었다.

  Solberg¹⁷⁾ 등이 제시한 배식단계 음식의 기준치인 대장균군수 10² CFU/g 과 비교하면 조사대상 114개 중 32개(28%)제품이 기준치를 초과하였으며 최고 5.4 × 10⁴ CFU/g 의 대장균군수가 검출되었다.

  대장균군중 Escherichia coli, Klebsiella pneumonia는 분변 유래균이며, Entero- bacter aerogenes, Enterobacter cloacae는 분변 및 자연계에 모두 존재하는 균이다¹⁸⁾. 따라서 샐러드는 가열조리과정 없이 섭취하는 식품임으로 대장균군이 검출된 것은 식품의 안전성에 위협이 된다고 사료된다.

3) 대장균(Coliforms)

  대장균은 분변 유래균이며 독소, 부착인자 생성 및 임상증상 등에 따라 병원성대장균은 EPEC(Enteropathogenic E. coli),  ETEC(Enterotoxigenic E. coli), EHEC(En- terohaemorrhagic E. coli), EIEC(Entero- invasive E. coli), EAggEC(Enteroaggre- gative E. coli)등으로 분류 된다^19,20). 본 실험에서는 샐러드 검체 114건 중 19건(16.7%)에서 대장균이 검출되었으며 PCR (GENECHASER^TM E. Coli Test, RapiGEN, Korea)법으로 병원성대장균을 검사한 결과 EAEC, ETEC, EHEC, EPEC, EIEC는 검출되지 아니 하였다.

4) 병원성 세균의 분리 및 동정

  대부분의 야채는 물을 함유하고 있으므로 미생물이 증식하기에 적당하여 많은 병원성 세균이 샐러드 야채에서 분리되었다⁸⁾. 따라서 본 연구에서는 식중독에 대한 안전성을 확보하기 위해 식중독 원인균의 분포를 조사하였다.

  L. monocytogenes는 열에 비교적 저항력이 강하고 냉장고의 온도에서 성정할 수 있어 안전하다고 생각되는 냉장 저장 식품을 통해 식중독을 발생시키면서 건강한 사람에게는 치사율이 30%, 노약자와 면역력이 약해진 사람에게는 70% 로 써 상당히 독성이 강한 균주로서 알려져 있다²¹⁾. 샐러드 1건에서 검출 된 L. mono- cytogenes는 Table 1.과 같이 그람 양성, Motility 양성, Catalase 양성, Oxidase 음성, Esculin 가수분해, Hemolysis 양성, Rhamnose 양성, CAMP test 양성으로 API  Listeria test kit을 이용해 동정한 결과 98.6% 의 상동성을 보였다. 미국이나 영국에서는 L. monocytogenes가 검출되어서는 안 된다고 규정하여 관리하고 있다²²⁾. 본 조사에서 샐러드를 통한 listeriosis가 발생할 가능성이 있음이 밝혀졌다. 따라서 식품원료가 이 균에 오염되지 않도록 최대한 방지하는 것이 최적의 예방법이라고 사료된다.

  B. cereus는 오심, 구토, 복부경련, 설사를 일으키는 식중독의 원인균으로¹⁶⁾ 본 조사에서는 114개 제품 중 7개 제품(6.14%)의 샐러드에서 검출되었다.

  B. cereus는 Table 2.와 같이 그람양성 포자형성균으로 Catalase 양성, Lecithinase 양성, Motility 양성, Hemolysis 양성균으로 Glucose, Fructose, Starch, Lactose를 분해하고 Lysine, Ornithine, Xylitol 등 음성을

Table 1. Characteristics of Listeria mono- cytogenes isolation from salads using PALCAM agar

Characteristics	Results
Gram stain	+1)
Shape	rod
Motility at 25 ℃	+
Catalase	+
Oxidase	-2)
Hemolysis	+
CAMP test	+
Esculin hydrolysis	+
α-Mannosidase	+
D-Arabitol	+
D-Xylose	-
Rhamnose	+
α-Methyl-D-glucoside	+
Ribose	-
Glucose-1-phosphate	-
D-Tagatose	-

¹⁾ : Positive  ²⁾ : Negative

Table 2. Characteristics of Bacillus cereus isolation from salads using MYP agar

Characteristics	Results
	Isolation 1	Isolation 2
Gram stain	+1)	+
Shape	rod	rod
Motility	+	+
Catalase	+	+
Egg-yolk lecithinase	+	+
Hemolysis	+	+
Glycerol	+	+
Erythritol	-2)	-
D-Arabinose	-	-
L-Arabinose	-	-
Ribose	+	+
D-Xylose	-	-
L-Xylose	-	-
Adonitol	-	-
β-Methyl-D-xyloside	-	-
Galactose	-	-
D-Glucose	+	+
D-Fructose	+	+
D-Mannose	-	+

Table 2. Continued

L-Sorbose	-	-
Rhamnose	-	-
Dulcitol	-	-
Inositol	-	-
Mannitol	-	-
Sorbitol	-	-
α-Methyl-D-mannoside	-	-
α-Methyl-D-glucoside	-	-
N-Acetyl glucosamine	+	+
Amygdalin	-	+
Arbutin	+	+
Esculin	+	+
Salicin	+	+
Cellobiose	+	+
Maltose	+	+
Lactose	+	+
Melibiose	-	-
Saccharose	-	+
Trehalose	+	+
Inulin	-	-
Melezitose	-	-
Raffinose	-	-
Starch	+	+
Glycogen	+	+
Xylitol	-	-
Gentiobiose	+	-
D-Turanose	-	-
D-Lyxose	-	-
D-Tagatose	-	-
D-Fucose	-	-
L-Fucose	-	-
D-Arabitol	-	-
L-Arabitol	-	-
Gluconate	+	-
2-Keto gluconate	-	-
5-Keto gluconate	-	-
Ortho-nitro-phenyl- galactoside	-	-
Arginine	+	+
Lysine	-	-
Ornithine	-	-
Simmon's citrate	-	-
Hydrogen sulfate	-	-
Urea	-	-
Tryptophane	-	-
Indole	-	-
Voges-Proskauer	-	-
Kohn's gelatine	+	+
NO2 production	-	-

¹⁾ : Positive, ²⁾ : Negative

나타내었다. 그러나  B. cereus  7 균주의 생화학적 성상은 D-Mannose, Amyg- dalin, Saccharose, Gentiobiose, Gluconate를 분해하는 균종과 분해하지 않는 균종으로 나타났으며, API 50CHB에 99.8% 의 상동성을 보였다. B. cereus균은 전 세계적으로 널리 분포되어 있는 식중독균이며, cook-chill 야채식품에서 지배적인 호기성균으로 보고되고 있다²³⁾. 10℃ 와 20℃ 에서 저장한 cook-chill 제품에서는 증식하였으나 4℃ 에서 저장한 제품은 B. cereus가 검출되지 않았다는 보고²⁴⁾ 가있다. 따라서 원료 야채류에 대한 오염방지로 충분한 세척 및 항균 처리와 3℃이하로 냉장 저장하여 식중독을 예방하여야겠다.

2. PCR을 이용한 L. monocytogenes 와 B. cereus의 확인시험

  PCR은 최근 들어 환경중의 미생물을 동정하는데 효과적인 도구로 사용되어지고 있다²⁵⁾. 또한 각종 병원체를 신속히 검출하고 동정하는데 이용되고 있다. 본 조사에서는 생화학적 시험방법을 통해 검출된 L. monocytogenes와 B. cereus에 대하여 PCR을 이용하여 확인하였다.

  L. monocytogenes는 Fig. 1.과 같이 Iap gene을 증폭하는 LM primer를 사용 454bp band를 확인하였고, B. cereus는 Fig. 2.와 같이 Bce T gene을 증폭하는 BC primer를 사용 303bp band를 확인하였다.

3. Enterotoxin 확인

  샐러드에서 분리된 B. cereus 7균주는 모두 enterotoxin을 생성하였다. 저온성 B.   cereus의 91% 가 cytotoxin을 생성하고   CRET-RPLA와 ELISA immunoassay에서 51% 와 85 %가 독소를 생성한다고 보고한

Fig. 1. Agaros gel electrophoresis(2.0 %

agarose) of PCR amplication products of

isolated L. monocytogenes from salads.

Lane 1 : size marker

Lane 2 : L. monocytogenes positive control

Lane 3 : L. monocytogeness from salads

Lane 4 : L. monocytogenes negative control

Fig. 2. Agaros gel electrophoresis(2.0 %

agarose) of PCR amplication products

of isolated B. cereus from salads.

Lane 1 : size marker

Lane 2 : B.cereus positive control

Lane 3 ～ 4 : B.cereus from salads

Lane 5 : B.cereus negative control

바 있으며²⁶⁾, B. cereus 식중독은 요리도중 생존한 포자가 발아 가능한 온도에 도달, 유지될 경우에 발아, 증식하여 enterotoxin을 생성할 때 발생 한다¹⁶⁾ 고 한다.

 본 조사에서는 B. cereus 7균주가 모두   enterotoxin을 생성하여 B. cereus 식중독의 원인균이 될 수 있음을 확인하였다.

 Ⅳ. 결 론

  패스트푸드점에서 판매되고 있는 샐러드에 대해 총균수, 대장균군수, 대장균 및 10종의 병원성세균의 존재여부를 확인하였다.

  1. 총균수는 1.1×10 ~ 8.4×10⁵ CFU/g, 대장균군수 0 ~ 5.4×10⁴ CFU/g 으로 Solberg 등이 제시한 기준치인 총균수 10⁵ CFU/g 이하, 대장균군수 10² CFU/g 이하와 비교하면 총균수는 기준치를 만족시켰고, 대장균군수는 기준치를 초과하였다.

  2. 10종의 병원성세균을 검사한 결과 listeriosis 유발 가능성이 있는 L. mono- cytogenes가 1건(0.9%), 중요한 식중독 원인균인 B. cereus 7건(6.1%)이 검출되었으며, API를 이용한 생화학 시험과 PCR 검사법으로 확인되었다.

B. cereus 7균주는 CRET-RPLA Kit에서 모두 enterotoxin을 생성하였다.

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출처: 경기도보건환경연구원