- 조현미 파트장님, 이점순, 박용수, 조은희, 이은송, 이충건 선생님
- 선생님들께서 실습 기간동안 수업 때 배웠던 내용보다 더 많은 정보를 알려주시고 자세하게 설명해주셨습니다. 그 덕분에 정말 좋은 경험들을 쌓을 수 있었습니다. 파트 내 분위기도 너무 좋으니 긴장할 필요 전혀 없습니다!
[Day 1]
첫날 조현미 파트장님께서 자기소개를 시키시니 준비해 가시길 바랍니다.
파트장님께서 분자 유전 파트에서 사용되는 장비들에 대해 설명해주셨습니다. 설명해주신 장비로는 원심분리기, vortex mixer, heating block, water bath, cobas 5800(분자진단 전자동화 장비 - HBV, HCV, HIV-1), PCR, Real time PCR, 3500 Series Genetic Analyzers(시료의 특정 유전자 염기서열을 자동으로 분석), Genexus Integrated sequencer(NGS 장비) 등이 있었습니다. 이 외에도 분자유전 검사실 안에 따로 존재하는 염색체 수확실, 염색체 판독실, 핵산증폭화검사실을 보여주셨습니다. 염색체 수확실은 습도가 적절하지 않을 경우 염색 후 banding이 잘 나오지 않기 때문에 50-60%의 습도를 맞춰주는 것이 중요하다고 하셨습니다. 핵산증폭화검사실의 경우, 분자진단에서는 오염이 발생할 확률이 높기 때문에 위양성을 방지하기 위해 공간을 분리한다고 하셨습니다.
파트장님께서는 실습생으로써 하나라도 더 배워가려면 선생님들 옆에 서서 지켜보고 질문하는 것이 더 많은 공부가 된다고 하셨습니다. 물론, 교과서와 수기도 주시고 읽어보라고 하십니다. 그치만 다리가 아프더라도 실습에 적극적으로 질문하고 참여하는 모습을 보여주시면 좋을 것 같습니다.(파트장님 책상 상단의 달력에 날짜별로 선생님들 이름이 적혀있을 겁니다. 이름은 해당 요일에 특정 검사를 담당하시는 선생님들이시기 때문에, 개별적으로 질문하시거나 실험 과정이 보고싶으시다면 달력에 적힌 선생님께 말씀드리면 됩니다! 저희가 작성한 요일별 일정도 선생님에 따라 진행 날짜가 달라질 수 있습니다.)
+ 점심시간: 12시~1시반(분자유전 선생님들께서도 쉬는시간이 필요하시기 때문에 1시 넘어서 들어가는 게 좋을 것 같습니다.)
[추가 주의사항]
검사실 출입 시, 반드시 손을 씻고 다니셔야 합니다. 오염에 매우 취약한 검사들이 많기 때문입니다. 선생님 말씀에 따라 행동해주시고, 실제로 검사에 참여하실 때 장갑 착용 또한 필수입니다.
실습 중간중간에 검체 기다리는 시간이 있을텐데, 그 시간에 교과서와 수기에 적힌 protocol을 공부하는 게 좋습니다. 대기 시간이 1시간 반이 넘어가지 않는 이상, 한 선생님께서 진행하시는 실험 과정은 끝까지 따라가셔야 합니다. 예를 들어, 대기 시간이 30분인데 그 시간에 다른 실험을 진행하시는 선생님께 가시면 안됩니다. 질문도 다른 선생님보다는 해당 시간에 저희를 담당하시는 선생님께 여쭤보세요!
[1일차 질문]
Q. PCR: denaturation(이중가닥을 단일가닥으로)->annealing(양 끝에 primer 결합)->extension(taq polymerase로 DNA 합성)->반복...
Q. DNA 합성에 필요한 요소: target DNA, primer, taq polymerase, dNTP, Mg2+(reaction buffer)
Q. RNA와 DNA가 갖는 염기 종류 중, 서로 다른 종류의 염기는? 우라실, 티민
Q. DNA가 긴 것과 짧은 것 중, 전기영동 시 더 빠른 속도로 이동하는 것은? 짧은 것(pore을 빨리 통과할 수 있기 때문)
+) Real time PCR을 많이 사용하니 Real time PCR의 원리와 과정을 알고가면 좋을 것 같습니다.
HLA A, B, DR, DQ DNA typing(이은송 선생님)
실습생들이 직접 해볼 수 있는 기회를 주십니다. 각 환자마다 DNA 추출 후 PCR을 진행하고 전기영동으로 잘 추출되었는지 확인합니다.
• 검사 원리
- polymerase chain reaction reverse hybridization으로 검사한다. Genomic DNA를 추출하여 PCR을 시행한 후 유전자 다형성을 갖는 부분을 probe로 제작하여 DNA와 hybridization하고 enzyme conjugate와 substrate로 발색된 band를 software로 판독한다.
• 임상적 의의
- 장기이식, 특정 질병연관성 연구, 친자 확인 등
• 검사 방법
- DNA extraction → PCR → 전기영동 → Probe hybridization
[Day 2]
전날에 청소에 대한 내용을 안내받은 상태라서, 8시~8시 10분 사이에 검사실에 들어갔습니다. 들어가자마자 손 씻고 청소했습니다. 방법은 입구에서 바로 보이는 파란색 뚜껑의 직육면체 통에 정해진 눈금만큼 물 받고 바이오스팟 1개 넣고 녹을 때까지 기다립니다. 이후에 실습생 탁자 아래의 휴지 6장 정도 꺼내서 담궈서 적십니다. 실습생은 1장씩 써서 본부의 모든 장비들, 탁자, 염색체 수획실 등등 선생님들이 사용하시는 모든 장비에 먼지가 쌓이지 않도록 닦아야 합니다. 핵산증폭후검사실 장비는 파트장님께서 닦아주셨으나, 마지막날에는 저희가 닦았습니다.
이후에는 이충건 선생님께서 1일차에 확인하지 못한 HLA band를 확인하고 software로 판독하는 과정을 보여주셨습니다. HLA typing 유형에 따라 입력 양식이 다름을 알려주셨습니다.
*serological test: 항원-항체 반응으로 인한 항원 특이도, “A2”(1자리 수 입력 가능), 결과 보고할 때 사용하는 양식
*DNA test
: sequencing으로 염기서열 분석, “(HLA)A*02”(2자리 수로만 표기), A*31과 A*33이 많음
추가적인 유전정보는 “A*31;01;01,,,,”과 같은 양식으로 표기(뒷부분은 intron으로 발현하지 않음)
추가로, 이충건 선생님께서 분자유전파트에서 하는 검사들에 대해 전체적으로 설명해주셨습니다. Clostridium difficile towin PCR, NTM ID test, JAK2 gene mutation, FLT3-ITD gene mutation, Respiratory virus PCR, M. pneumoniae PCR, Leukemia multiplex PCR, 그 외에도 HSV, CMV, EBV PCR 등이 있습니다.
오후에는 조은희 선생님과 함께 Mycobacterium tuberculosis PCR 검사를 봤습니다. 중간중간 질문하셔도 됩니다! 열정적인 모습을 보여주시면 좋을 것 같습니다.
TB-PCR은 MTB와 NTM 및 Internal control을 동시에 검출하여 신속하게 결핵균 및 비결핵 마이코 박테리아를 진단하는데 유용한 검사법입니다. 검사 과정은 다음과 같습니다.
객담, 기관지 세척액, urin 등의 검체에 NaOH를 넣어 vortexing하는 과정(전처리 과정 1)을 통해 검체의 점액성을 제거한 후 (CSF의 경우 검체가 깨끗하기 때문에 전처리하지 않음) 원심분리를 하였습니다. 이후 상층액은 Bio spot에 버려준 뒤 PBS를 넣고 vortexing 하는 과정을 통해 세척 (전처리 과정 2) 을 해주고 magnetic bead를 이용하여 핵산을 추출한 뒤 Taqman assay를 통해 Realtime PCR을 진행하였습니다.
*이때, CT(cycle Threshold Value) 값이 작을수록 결핵균 많음
[2일차 질문]
Q. M. pneumoniae의 특징: 가장 작은 미생물, 세포벽이 없어서 항생제 치료에 불리하다.
Q. NTM이 뭔지: 비결핵항산균
Q. 정성검사와 정량검사의 차이는? 정성검사는 정확한 양을 알기보다는 양성/음성 정도만 판단, 정량검사는 정확한 검체의 양을 파악
Q. BCR/ABL, PML/RARA 각각 몇 번이 전좌되는지
Q. PLU란? pleural fluid(흉막)
Q. 객담과 침의 차이점: 객담 - WBC多 / 침 – WBC少 (상피세포가 없고 WBC가 많을수록 좋음)
Q. intron과 exon 중 실제로 발현되는 부분은? exon
Q. 전사(transcrption)와 번역(translation)은 각각 어느 단계에 있는가? 전사는 DNA를 mRNA로, 번역은 mRNA가 단백질로 만들어지는 과정이다.
Q. 시약 제조는 병리사 업무인가? O
Q. 삼출액과 누출액
[Day3]
오전에 이점순 선생님께서 실습생들 부르셔서 BCR/ABL gene rearrangement 실험 과정에 대해 설명해주셨습니다.
#BCR/ABL gene rearrangement
- leukemia multiplex PCR 활용(여러 종류의 primer를 동시에 사용하는 nested PCR로, translocation/chromosomal rearrangement 판별)
- 전체적으로 PCR(1st, 일종의 screening test)한 이후에 특정 부분만 nested PCR(2nd)
- split out: 1차 PCR에서 나온 결과를 토대로 2차 PCR을 하여 translocation 여부를 알아냄
*당시 PCR 결과에서 6B와 8F에서 양성 결과가 나왔습니다. 이렇게 범위를 추려서 2차 PCR을 합니다.
조현미 파트장님께서 세포 유전에 대한 전반적인 설명과 염색체 수획을 위한 전체 과정을 설명해주셨습니다. 아래 과정은 참고만 하시면 됩니다!
#염색체 기본 설명
- 진단 분자생물학 p365, p380 내용을 기반으로 설명해주십니다.(염색체 구조 유형, 수획 방법 등)
- 결과 보고: 20개 정도만 파악해도 가능, 3주 이내 보고(염색체 판별이 어렵기 때문에 오래 걸림)
- sample: 골수(활발하게 분열), 혈액만 사용
- 배양 방식: 골수는 72h/48h/24h으로 나누어 다양하게 배양시킴, 혈액은 3일이면 충분함
- 크게 4단계로 분류
1. 방추사 억제 작업(염색체 일렬로 배열): colcemid 사용, PB에 PHA 사용(세포 분열 자극)
2. hypotonic solution 처리: KCl과 증류수를 섞은 용액을 조금씩 넣음(cell lysis 방지)->37도 incubation->천천히 부풀어오름, 이 시기부터는 조심히 다뤄야 함
3. fixation(수획): 세포가 부풀어진 상태 유지, methanol과 acetic acid 비율을 3:1로 설정-> 슬라이드 생성
*methanol: 고정력이 높으나 인체에 매우 유해함
4. Giemsa staining(G banding): 염기 중 A-T는 어둡게, G-C는 밝게 나타남 ->karyotyping
- 염색체 유형: metacentric/submetacentric/acrocentric (+telocentric: 사람에게는 없는 유형의 염색체)
박용수 선생님께서는 저희가 실습 갔던 주 내내 염색체 판별 검사를 담당하고 계셨습니다. 오후에 염색체 특징과 맞추는 것도 세세하게 설명해주시니 가볍게 참여하시면 좋을 것 같습니다.
#염색체 기본 설명
- centromere, p arm, q arm 등등 기본 구조에 대한 지식이 필요합니다. 배양 및 수획에 대한 모든 과정은 교과서에 잘 나와있으니 시간 나는대로 읽어보시기 바랍니다.
- 배송 시: heparin tube(WBC에 최소한의 영향)
- 검체 종류: PB(이미 분화 완료, 선천성 질환 판별), BM(혈액암 진단) *저희는 혈액 샘플로 했습니다
- PB 3일 배양->RPMI(세포 배양 전용 배지)+FBS(세포 성장을 위한 양분 제공) mix->배지 10ml 주입->plask->sample 1ml씩 분주->PHA 100ml 분주->배양 (오염되면 검게 배양, 이산화탄소 유입을 위해 뚜껑은 살짝 열어둠)
#염색체 band 특징
- 전반적인 설명은 진단 분자생물학 교과서에 자세히 나와있으니 참고바랍니다. 아래 내용은 선생님께서 짚어주신 부분만 요약해두었습니다. 이 특징들을 토대로 염색체 번호 맞추는 실습을 진행했습니다.
- 1번: 가장 큰 metacentric ch., 장완(q arm) 동원체 부근 3개의 균등한 band 염색
- 2번: submetacentric ch. 중 가장 큼, 단완(p arm)에 4개의 균등한 band 염색, 장완 말단에 밝은 염색대
- 3번: metacentric ch., 특히 진한 3개의 band 존재
- 4번: submetacentric ch., 단완 종극절 부위에 비교적 크고 밝은 부분이 존재함, 장완 근위부 진한 band 존재(4군데, 가장 크고 뚜렷함)
- 5번: submetacentric ch., 단완에 진한 1줄, 장완에 같은 세기의 band 3개 + 진한 염색대
- 6번: submetacentric ch., 단완에 밝은 염색대, 장완은 전체적으로 진한 염색대
- 7번: submetacentric ch., 단완 종극절 부위 연함 + 끝부분은 크고 진함, 장완에 진한 염색대 2개
- 8번: submetacentric ch., 중심절 분위는 안진함, 장완 1/3 원위부에 진한 염색대
- 9번: submetacentric ch., 단완에 진한 염색대 2개 + 근위부 밝고 큰 염색대, 장완에 진한 band 2개
- 10번: submetacentric ch., 장완에 균등하고 진한 염색대 3개
- 11번: submetacentric ch., 단완이 큼, 장완에 진한 염색대 2개가 붙어있어 1개처럼 보임 + 말단에 진한 band
- 12번: submetacentric ch., 장완 근위부 밝은 염색대 + 가운데 진한 염색대군
- 13번: acrocentric ch., 장완 중간 1/3지점 다소 크고 진한 염색대 2개
- 14번: acrocentric ch., 장완 근위부 1/3지점 매우 진한 염색대 2개(위/아래 1개씩 존재)
- 15번: acrocentric ch., 장완 근위부 작고 큰 염색대 2개(중앙에 1개)
- 16번: acrocentric ch., 동원체 주위에 크고 진한 염색대, 위아래 2개씩 연한/진한 염색대 존재
- 17번: submetacentric ch., 장완 원위부 1/2 진한 염색대 2개(11번과 유사함)
- 18번: submetacentric ch., 가장 진하게 연색되는 염색체 중 하나, 총 3개의 진한 염색대, 장완에 균등하고 진한 염색대
- 19번: metacentric ch., 단완/장완 모두 밝게 염색, 중심절 주변에 넓고 진한 염색대 + 2개씩 연한 band(개인별 차이 존재)
- 20번: metacentric ch., 단완에 진한 염색대, 장완에 덜 진하고 균등한 염색대 2개
- 21번: acrocentric ch., 중앙 아래 진한 염색대
- 22번: acrocentric ch., 중심절 부위 진하게 염색, 장완 중간부위에 진하고 미세한 염색대
- X 염색체: 긴 단완 + 중앙에 넓고 진한 염색대, 장완 근위부 1/3에 크고 진한 염색대 + 원위부 작고 덜진한 염색대 3개
- Y 염색체: 사람마다 다름
[3일차 질문]
- 염색체를 확인할 수 있는 적절한 시기는? 중기(metaphase)
- 세포분열기: 전기 - 중기 - 후기 - 말기
[Day4](오전까지)
이점순 선생님께서 diarrhea multiplex PCR 과정을 보여주셨습니다. stool에서 핵산을 추출할 때는 proteinase k, stool lysis buffer를 이용해 stool이 PCR에 적합한 검체가 되도록 처리해줍니다. 그 후 heating block를 이용해 배양을 해주고 원심분리 후 상층액을 사용합니다. ExiPrep-16dx(BioNeer)로 magnetic bead 원리를 이용해 핵산을 추출하고 PCR을 해줍니다. 이때, internal control은 PCR이 제대로 일어났는지 확인할 수 있도록 해줍니다.
diarrhea를 일으키는 세균이나 바이러스는 매우 다양하기 때문에 여러 target에 대한 primer를 사용하는 multiplex PCR을 합니다. (검사 지침서를 참고하시면 C. difficile, E. coli 등 diarrhea multiplex PCR에서 target으로 하는 세균이나 바이러스가 나와있습니다.) 그중 E. coli O157은 STEC와 같이 나왔을 때만 확진 판정을 한다고 하셨습니다.