식물추출물을 이용한 살충제 항균재 개발...

14 KIEST NewsLetter 2005 신년호 수 행 과 제 소 개 은행잎, 무화과잎, 목초액, 그리고 죽초액 등 다양한 식 물추출물을 이용하여 병충해유발균(Ralstonia solanacerum, Burkholderia glumal, Xanthomonas campestris pv. Oryzae, Pseudomonas lacrymans)4종에 대한 항균성, 식품첨가제로 써의 쇠고기 내 총균수에 대한 항균성, 비듬균(T. beigelli) 에 대한 항진균성, Dermatophagoidees pteronyssi-nus, Tetranychus urticae, Spodoptera litura, Plutella xylostella, Myzus persicae에 대한 살충효과를 검증하였다. 4종의 병 충해유발균에 대한 Paper Disc의 Clean Zone Size는 은행 잎추출물(80℃중탕추출물;1.2cm, 메탄올추출물;0.9cm, 에 틸아테이트추출물;1.5cm), 무화과잎추출물(80℃중탕추출 물;1.1cm, 메탄올추출물;1.2cm, 에틸아테이트추출 물;0.9cm), 목초액;1.9cm, 죽초액;1.7cm로 목초액이 가장 큰 항균력을 나타냈으며, 은행잎 중탕추출물(GLW80), 에 틸아세테이트추출물(GLEAT), 목초액, Sorbic Acid를 이 용하여 쇠고기내 총 세균수에 대한 항균실험으로 Colony Counting 결과 무처리군에 비하여 목초액;82.80%, GLEAT;73.44%, 0.1%sorbic acid;66.33%, GLW80;64.36% 로 나타났다. 비듬균(T. beigelli)에 대해서는 Colony Counting 결과 대조군인 Amphotericin B(0.025㎍/㎖);76 개, 은행잎중탕추출물(0.017㎍/㎖);28개로써 항 진균성이 강하게 나타났다. 집 먼지 진드기의 살비율은 대조군으로 사용한 Putaltrin 이 48시간 경과후 65%인 반면에 은행잎중탕추출물(0.017 ㎍/㎖)은 82.8%로 17.8% 높은 살비율을 나타냈으나, 은행 잎메탄올추출물과 에틸아세테이트추출물은 대조군인 Putaltrin보다 낮은 살비율로 그 효과를 인정하기 어려웠 다. 그리고 은행잎중탕추출물과 메탄올추출물(100배 희석) 에 대하여 점박이응애의 살비율은 처리후 24시간에는 중 탕추출물은 74.3%, 메탄올추출물은 71%이었으나 72시간 후에는 각각 88.7%, 89.3%로 높은 살비율을 나타냈다. 복 숭아혹진딧물은 24시간 후에는 모든 처리구에서 살비율이 낮았으나 72시간 후에는 중탕추출물에서는 50%정도의 살 비효과가 나타났지만 단제로서 충분한 효과를 기대하기는 어려웠다. 그러나 제형과 혼합제로서의 개발 가능성이 있 었다. 1. 서 론 농약의 사용은 농작물의 생산증대와 질적 향상을 위하 여 필수 불가결하다. 그러나 농약의 연용과 남용은 인류가 주식으로 하는 쌀과 채소류를 가해하는 해충의 내성증가 는 물론 유해 천적을 살해하고 잔류함으로서 농산물의 독 성이 증가되어 식품에 대한 부정적 요인으로 작용하고 있 다. 현재와 같은 수준으로 합성 농약을 사용한다고 할 때 환경, 인체건강, 야생동물, 경제식물과 곤충 그리고 우리의 식량과 사료작물의 안전성을 손상시킴으로써 발생되는 경 제적 손실은 물론 생태계의 교란은 예측하기 어려운 실정 이다. 그러므로 인류는 인축 및 환경에 부작용이 적은 천 연물로부터 새로운 살충성분을 찾고자 많은 노력을 하였 다. 본 과제에서는 여러 생리활성 천연물 소재 중에서 국 내 생산량이 많고 살충·살균 효과가 뛰어나며 대량 생산 까지 실용화가 가능한 것을 선택하여 생물농약으로 개발 식물추출물을 이용한 생태계친화형 살충제 및 항균제 개발 이 인 화 | 조선대학교 환경공학부 교수 Korea Institute of Environmental Science and Technology NewsLetter 15 수 행 과 제 소 개 하고자 한다. 이러한 관점에서 천연물의 일종이며 국내에서 쉽고 풍 부하게 재료를 구할 수 있으며 살충력과 살균력이 우수한 은행나무 잎과 무화과 잎, 목초액(목재 건류물) 및 죽초액 (대나무 건류물)을 이용한 환경 친화적이면서도 인체와 가축에 무해한 살충·살균제 및 기피제(Repellent)를 개발 하고자 한다. 은행잎에 대한 성분은 Flvonol계와, Ginkgo Acid, Polyphenol류로 대별되며 은행잎으로부터 성분을 추 출하는 방법에 따라 조성물이 크게 달라진다. 일반적으로 제약 성분으로 이용되는 것은 Ginkgo Acid 및 Flavonol이 며 Poly phenol은 정제과정에서 배제된다. 은행잎 추출물 을 농약으로 이용하기 위해서는 은행잎으로부터 활성 물 질을 추출하고 이들 물질을 사용목적에 알맞게 최적화 하 는 것이 매우 중요한 과정이다. 2. 연구방법 환경친화형 무독성 살충제 및 항균제의 개발 일환으로 국내에 생산량이 많으며 병충해와 도시 매연에 강하다고 알려진 은행잎과 다양한 분야에 이용되고 있는 무화과잎 과 목·죽초액으로부터 추출방법을 달리하여 얻은 다양 한 식물추출물을 인류가 주식으로 하는 농작물에 유해한 병충해 유발균 미생물에 대한 항균작용에 대하여 박테리 아 Escherichia coli(AB1157), 곰팡이로 Aspergillus oryzae var. oryzae (KCTC 6095), 병충해 유발균으로는 오이 및 토마토의 시드름병의 원인균인 Pseudomonas corrugata (KACC10141), Pseudomonas syringae (KACC10396) 와 Ralstonia solanacearum(KACC 10475) 대상으로 항생물질 감수성 시험법과 Colony Counting Method, Optical Density Method 등을 이용하여 항균성 검증하고, Dermatophagoidees, Tetranychus Urticae, Spodoptera Litura, Plutella Xylostella, Myzus Persicae에 대하여 다양한 식물추출물을 leaf disk 법 과 유묘검정법 에 의하여 살충효과를 검증하고, 항 진균작용에 대하여 덩굴쪼김병 유발균 Fusarium Oxysporum, F. cucumerium, F. melonis 등에 적용한다. 또한 외류 돌림병을 일으 키는 Phytophthora Capsici, P. melonis 등의 원인균에 대 한 성분 농도별항균실험 실시하여 진균에 대한 살균력을 검증한다. 해충에 대해서는 가정에 서식하는 Dermatophagoi- dees Pteronyssinus와 과채류에 주로 유해한 Tetranychus Urticae, Spodoptera Litura, Plutella Xylostella, 그리고 Myzus persicae에 대하여 살충실험을 한다. 이러한 결과를 바탕으로 식물추출물을 성분별로 분석하 고 방출활성성분를 분획하여 작용물질과 그 메카니즘을 규명하여 최적조건의 제형화 및 방출속도제어를 통해 가 정용이나 농업용으로의 무독성 살충제를 개발하고자 한다. 또한, 식품의 유통과정이나 장기보존에 따른 부패방지를 위하여 식품보존제, 종이보존제, 허브향 첨가에 의한 제품 의 다용도화 및 고급화, 직물의 부패방지, 그리고 항균코 팅제 등을 개발하고자 한다. 그리고, 세포독성실험과 피부특성변화도를 측정하여 항 균성 및 항진균성 세제 및 화장품 첨가제를 개발하고자 한다. 또한, 차후에 식물세포를 이용한 대량 배양법 개발 및 대량생산 공정 개발 및 독성 테스트 및 검증 테스트를 거쳐 최종적으로 실용화 하고자 한다. 3. 연구개발결과 가. 식물추출물의 항균성 검증 1. 병충해유발균에 대한 항균성 검증 4종의 병충해 유발균에 대한 Paper Disc Test 결과 Clean Zone Size는 은행잎 추출물(80℃중탕추출물;1.2cm, 메탄올추출물;0.9cm, 에틸아테이트추출물;1.5cm), 무화 과잎추출물(80℃중탕추출물;1.1cm, 메탄올추출물;1.2cm, 에틸아테이트추출물;0.9cm), 목초액;1.9cm, 죽초액 ;1.7cm로 목초액으로부터 증식저지환이 가장 크게 나타 났다<표 1>. 2. 식품첨가제로서의 항균성 검증 은행잎중탕추출물(GLW80), 에틸아세테이트추출물 (GLEAT), 목초액, Sorbic Acid를 이용하여 쇠고기내 총 세균수에 대한 항균실험으로 Colony Counting 결과 무처리군에 비하여 목초액;82.80%, GLEAT; 73.44%, 1% Sorbic Acid;66.33%, GLW80;64.36%로 중탕추출물 16 KIEST NewsLetter 2005 신년호 수 행 과 제 소 개 을 제외한 나머지 모두 0.1% Sorbic Acid 보다 높은 항 균력을 나타냈다 <그림 1>. 나. 비듬균(T.beigelli)에 대한 항진균성 검증 비듬균(T. beigelli)에 대해서는 colony counting 결과 무처리군에 비해 양성대조군인 Amphotericin B(0.25㎍/ ㎖)에서의 Colony 가 발생하지 않았으며 0.025㎍/㎖에 서 무처리군의 35% 생존율을 보인 반면, 은행잎중탕추 출물(GLW80;0.017㎍/㎖)은 2.9% 낮은 생존율을 보였 다<사진1> 다. 동물용 피부 상재균 살균효과 측정 5마리의 애완견 모두에게 효과가 상당히 우수한 것으로 나타났으며, 화학제품의 피부병 예방샴푸에 비해 초기에는 효과가 미미하였으나 2회이상 계속 적용시 피부병의 완치 면에서는 더욱 우수한 것으로 나타났다 <표 2> 적용 애완견중 D는 타사의 피부병예방삼푸를 사용후에도 치료가 되지 않은 것인데 상기 샘플을 사용한후 완치가 된 것으로 보아 균의 내성이 발생하지 않는 것으로 판단된다. 라. 세포벽 형태변화(Transmission Electron Microscope) 토마토에 풋마름병(Bacterial wilt) 유발하는 Ralstonia solanacerum을 이용하여 은행잎 에틸아세테이트추출물 Note “+++ : very strong(1.8cm이상), +++ : strong(1.4-1.7cm), ++ : medium(1.1-1.3cm), + : Weak(0.8-1.0cm)”“GLW80 : 80℃ water extract from Ginkgo biloba leaves, GLMT : methanol extract from Ginkgo biloba leaves, GLEAT : ethylacetate extract from Ginkgo biloba leaves, FLW80 : 80℃ water extract from Ficus carica leaves, FLMT : methanol extract from Ficus carica leaves, FLEAT : ethylacetate extract from Ficus carica leaves” <표 1> Antimicrobial acivity for pathogenic microorganics against a plant extracts <그림 1> The antimicrobial effect of Ginkgo biloba leaves extracts 〔GLEAT, GLW80〕Wood flavor and 0.1% Sorbic acid for the total microorganics examined by serial dilution method. <사진 1> Antifungal activities for T. beigelli against various extracts obtained from Ginkgo biloba leaves. Left pannel ; non treat, Middle pannel ; Amphote ricin B(0.025 ㎍/㎖), Right pannel ; GLW80(0.017㎍/㎖) Extracts Bacteria Burkholderia glumal Xanthomonas campestris pv. oryzae Pseudomonas lacrymans Ralstonia solanacerum GLW80 GLMT GLEAT FLW80 FLMT FLEAT Wood Bamboo flavor flavor ++ + +++ + ++ + ++++ ++++ ++ ++ + ++ + + +++ +++ ++ + + + ++ + +++ +++ ++ + +++ ++ ++ + ++++ +++ (GLEAT)을 King’s B broth 50㎖에 균 1㎖과 은행잎 추출 물 4㎖을 가하여 최적생육조건에서 24시간 동안 배양 한 후 원심분리 시켜 희석액으로 세포 세척 후 세포만을 16000, 28000 배율로 세포 형태변화를 관찰한 사진이다. 무 처리한 균과 처리한 균을 비교해 보면 팽윤에 의해 세포 의 크기가 증가한 것으로 볼 수 있고, 스트레스로 인한 세 포벽에 변형이 일어난 것을 볼 수 있다 <사진 2>. 마. 살충효과 1. 집먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 집먼지진드기(D.p)에 대한 다양한 은행잎추출물 중 처리 48시간 경과후 bilobalide; 91.6%, 80℃중탕추출물 (GLW80);82.8%, 메탄올추출물(GLMT);57.8%, 에틸아세 Korea Institute of Environmental Science and Technology NewsLetter 17 수 행 과 제 소 개 <표 2> Antimicrobial effect of pets skin flora treated by ginkgobiloba leaves extracts directly. <사진 2> Comparison for morphological changes by transmission electron microscope for the cell of Ralstonia solanacerum after Ginkgo biloba leaves extract trea ted a) is before treated × 16000 b) is after treated × 16000 c) is treated × 28000 (5: 심한 진무른상태, 4: 가피 및 강한 홍반, - 1: 홍반, 0: 완치) 구 분 1회측정 2회측정 3회측정 4회측정 5회측정 비 고 A 5 5 4 2 1 미세홍반 B 4 3 1 0 0 완치 C 5 4 3 2 0 완치 D 4 4 4 2 0 완치 E 4 3 1 0 0 완치 평균 4.4 3.8 2.6 1.2 0.2 <그림 2> Acaricide effect of Dermatophagoides pteronyssinus against a Ginkgo biloba leaves extracts 테이트추출물(GLEAT);55%, 대조군(Putaltrin);65%의 살 비율로 은행잎 성분인 Bilobalide가 강한 살비효과가 있는 것 으로 나타났으며, 80℃중탕이 추출 효율이 좋은 것으로 나타 났다<그림2>. 2. 점박이응애, 담배거세미나방, 배추좀나방, 복숭아혹진딧물 은행잎중탕추출물(GLW80;0.017㎍/㎖)에 의한 점박이응애 의 살비율은 처리 72시간 경과후 10배희석액;99.3%, 20배 희석액;90.7%, 산란억제율은 10배희석액;63.4%, 20배희석 액;46.6%로 강한 살비율을 나타냈다<표 3>. 4. 기술개발 효과 및 적용분야 가. 기술개발효과 은행잎추출물, 무화과잎추출물, 목초액, 그리고 죽초액 으로부터 병충해유발균에 대한 높은 항균성을 확인했으며, 점박이응애에 대한 95%이상의 살비율을 나타내는 은행잎 추출공정개발과 제형을 통하여 80%정도의 살충효과를 얻 었다. 또한, 비듬균(T.beigelli)에 대한 항진균성을 확인했으 며, 육류에 대한 항균성 검증으로 인한 식품보존효과를 확 인했다. 나. 적용분야 병충해유발균에 대한 항균성 및 항진균성, 농산물 유해 해충과 응애류에 대한 살충율, 육류에 대한 항균성, 그리 고 세포독성실험과 피부특성변화 등의 실험을 통하여 얻 은 결과로 인해 인체 무독성 가정용 살충제(집진드기용, 바퀴벌레 퇴치제 등),농업용 생물농약(양액첨가형, 노지 살포형, 농산물 보존제), 화장품 및 세제 첨가제, 식품용 항균제, 직물류 코팅제, 종이 보존제 등에 이용될 수 있을 것이다. 18 KIEST NewsLetter 2005 신년호 수 행 과 제 소 개 1 94.1 100.0 4.2 4.7 2 91.1 95.9 4.4 5.4 3 86.7 98.9 2.2 4.3 Ave. 90.6 98.3 3.6(69.7%) 4.8(63.4%) 1 74.4 86.7 5.6 6.7 2. 73.3 78.5 7.8 5.3 3 68.9 77.0 9.8 8.9 Ave. 72.2 80.7 7.7(35.3%) 7.0(46.6%) 1 3.3 3.7 10.5 16.7 2 1.1 1.9 11.6 12.2 3 1.1 2.2 13.5 10.4 Ave 1.9 2.6 11.9 13.1 Tetranchus urticae (점박이 응애) Mortality(%) Laying eggs number Within 24 hours Within 72 hours Within 24 hours Within 72 hours Experiment times & Average** Extract & Dilution (GLW80 10X)* (GLW80 20X) Control <표 3> The experimental results of killing and laying eggs inhihitory effects for tick (Tetranches urticae) Note “GLW80 : 80℃ water extracts from Ginkgo biloba leaves(17.4㎎/㎖)” 다. 활용실적 은행잎 추출물의 농축액에 대하여 GLP 수준의 경구투 여, 피부 및 안점막 등에 대한 안정성검증을 실시하여 무 독성 판정을 받았다. 은행잎 추출물에 대해서 조성물 특허 및 용도에 대하여 아래와 같이 특허를 출원하였거나 등록 하였다. 상품으로서 응애류와 집먼지 진드기에 대한 친환경농약 으로서 복합비료현태로 판매될 예정이며 탈모와 비듬방지 용 기능성 샴푸 및 비누가- 개발되어 사람용과 애완동물 용 시작품이 생산되고 있다. 은행잎 추출물을 사용하여 20명을 대상으로 피부 특성 변화를 관찰한 결과 피부가 보습력이 증가하고, 멜라닌색 소의 감소와 함께 피지분비가 감소하여 이러한 결과를 활 용하여 화장품으로서의 개발을 추진하고 있다. Ginkgo biloba 추출액은 농도 의존적으로 Acetylcholinesterase 효소 활성도를 억제하였으며 효소활성도를 50%억제하는 농도는 1.5mg/㎖였다. 이상의 결과로부터 Ginkgo biloba 잎 물추출물의 acetylcholinesterase 활성도 억 제 효능으로 살충 및 방충효과를 설명할 수 있으며 은행 잎의 콜린 기능의 항진효능은 기억력 상실과 치매 등에 응용될 수도 있다. 5. 결론 및 향후 전망 본 과제를 통하여 개발되거나 개발된 생태계 친화적 농 약은 국내 농산물의 합성농약의 생태계 잔류량를 줄여 궁 극적으로 먹이사슬에 의한 농축현상을 감소시키는 효과를 얻는다. 국내의 농약사용량은 1999년 22,000톤 이며, ha당 농약사용량은 10.4kg으로 미국의 3.3배 서독의 4배에 달한 다. 개발된 생물농약의 사용으로 유기염소계 농약분을 대 체하면 BHC 기준 평균 잔류 농약량을 2005년까지 현재의 1/10수준인 0.001ppm이하로 줄일 수 있을 것으로 예상된다. 특히 토양이나 수중생태계의 농약의 유출량의 경우 1차적 으로 시설원예단지 사용분과 채소류 사용분을 대체하면 현재의 수십 ㎍/g 수준에서 수 ㎍/g 이하로 줄여 환경부 하를 크게 감소시키는 효과가 있다. 장기적으로는 곡류, 과 채류, 우유 및 육류류 등의 농축산물에서의 잔류농약량을 제로화하여 농산품의 안전성 확보에 기여할 것으로 기대 되고 은행잎 추출물을 이용한 애완동물용 비듬 및 피부병 예방샴푸가 실험결과 우수한 효과를 보였다. 애완동물의 시장이 급속하게 확대되어 가고 있는 현 상황에서 볼 때 애완동물의 냄새를 제거 및 완화 시켜주어 애완동물과 인 간의 거리를 가깝게 해줄 수 있는 제품이라고 판단되며, 제품의 사용감 및 제품 상용화 과정에서 동물용 샴푸 효 과 테스트 결과에 기인하여 제품을 개발하여 애완동물 시 장에 큰 영향을 미칠 것으로 사료된다. Korea Institute of Environmental Science and Technology NewsLetter 19 수 행 과 제 소 개 <표 4> 특허출원 현황 구 분 내 용 현 황 일 자 특 허 은행잎 추출물 및 그의 용도 출 원 2002. 10. 18 특 허 은행잎에서 분리한 비듬치료 및 탈모방지용 샴푸 조성물 출 원 2003. 09. 16 특 허 은행잎 추출물과 그 제조방법 및 용도 등 록 2003. 12. 30 국제특허 Composition of Comprising Terpenlactone compounds 출 원 2004. 9. 10