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수종의 한방식물체, 버섯류 그리고 동충하초의 항
암활성 및 오배자의 항암성분
The Anticancer Activities of Some Kinds
of
Oriental Medicinal Plants, Mushrooms and Tochukasos,
and the
Anticancer Component from Galla rhois
1996년 2월
목
차
○ Abstract
○ 목 차
I. 서 론 1
II. 연 구 사
3
III. 재료 및 방법 13
1. 한방식물체, 버섯류, 동충하초의 항암활성 검색 13
1) 검색 시료 13
(1)
식물체 및 메탄올 추출물 13
(2) 버섯류 및 열탕추출 13
(3) 동충하초 와 그 배양액 18
2) 암세포주 18
3)
배지 및 시약 18
4) 항암활성 검정 19
(1) 세포배양 19
(2) 시료의 조제 19
(3) 항암활성검정
19
2. 오배자로 부터 항암성분의 분리 및 동정 21
1) 항암성분의 분리 및 정제 21
2) 활성성분의 화학구조 결정
22
3) 항암활성검정 22
IV. 결 과 23
1. 한방식물체, 버섯류, 동충하초의 항암활성 23
2. 오배자로 부터
항암성분의 분리 및 동정 27
3. Methyl gallate의 항암활성 36
V. 고 찰 37
VI. 인 용 문 헌
42
○ 초 록
○ 감사의 글
감사의 글
이
논문을 완성하기까지 도와주신 많은 분들께 감사를 전합니다.
먼저, 본 연구를 시작할때부터 논문을 완성하기까지 학문적 가르침과 격려를
베푸어주신 지도교수 안용준 교수님께 진심으로 감 사를 드립니다.
아울러 논문의 심사를 맡아 귀한 조언을 해주신 이인원 교수님, 김수언
교수님 그리고 많은 협동과정 참여 교수님들께 감사 를 드리며, 학부때부터 따뜻한 사랑과 관심으로 대해 주신 농생물학과 우건석 교수님, 부경생
교수님, 강석권 교수님, 유효석 교 수님, 이준호 교수님께도 깊이 감사를 드립니다.
본연구의 수행에 많은 도움과 조언을 해주신 임업연구원의
김준범 박사님, 이상길 선배님, 그리고 생물검정에 직접적인 도 움을 주신 한국화학연구소 약리활성연구실의 이정옥 박사님께도 감사를 드립니다.
힘들때마다 함께 얘기할 수 있었고 서로 아껴주었던 실험실 동기 석준 형과 순일이에게 고마움을 전하며, 박사과정에서도 훌륭한 결과를
기대합니다. 그리고 언제나 따뜻한 조언과 격려를 해주신 실험실 선배님들과 후배들, 그리고 이희권박사님, 이성 은 박사님에게도 깊은 감사를
드리며, 자질구레한 일의 도맡아 해주신 김지원, 정재은씨께도 심심한 감사의 뜻을 전합니다.
언제나 자식들에 대한 헌신적인 사랑을 보여 주신
사랑하는 부모님께 진심으로 감사를 드리며, 언제나 손자 손녀사랑이 지 극하신 할머님, 그리고 사랑하는 형님과 누나들에게도 고마움을 전하고
싶습니다.
끝으로, 오늘의 나를 있게 해 주신 주 하나님께 무한한 감사를 드리며, 삶의 길을 실천적으로 보여주신 정명석 선생님께도 감사를
드립니다. 그리고, 언제나 멀리 있지만 마음속을 채우고 있었던 '오손도손'의 선후배님들께도 감사의 뜻을 전합니다.
도와 주신 모든 분들께
다시한번 감사를 드리며, 여러분의 기대에 어긋남이 없이 언제어디서나 꼭 필요한 사람이 되도록 노 력하겠습니다.
초 록
16종 한방식물체의 메탄올 조추출물, 17종 버섯류의 열탕 조출출물, 12계통 동충하초 배양액으로부터 5종의 인간
고형암세 포주 A549 (Lung carcinoma), SK-OV-2 (Ovarian cancer), SK-MEL-2 (Melanoma),
XF-498 (CNS cancer), HCT-15 (Colon cancer)에 대하여 항암활성을 검색하여, 천연물 유래의 저독성 항암제를
개발하고자 하였다.
그 결과, 식물체에서는 옻나무과(Anacardiaceae)의 붉나무(Rhus chinensis)에 형성된
오배자(Galla rhois)와 삼백 초과(Saururacea)의 삼백초(Saururus chinensis)에서 매우 높은 활성을
나타내었고, 현호색과(Fumariaceae)의 현호색( Corydalis turrshaninovii), 운향과(Rutaceae)의
황백나무(Phellodendron amurense)와 콩과(Leuguminosae)의 조각자( Gleditis
sinensis)에서도 비교적 높은 활성이 나타내었으며, 버섯류에서는 송이과(Tricholomataceae)의 상황버섯(Arm
illariella mellea)과 구멍장이버섯과(Polyporaceae)의 등갈색미로버섯(Daedalea
dickinsi)이 비교적 높은 활성을 보여주었고, 동충하초에서는 Cordyceps kyushuensis에서 강한 활성을
보여주었다.
이들 중 강한 항암활성을 보인 오배자의 항암활성을 조사하였다. 오배자의 메탄올 추출 수율은 52%이었으며, 메탄올 추출 물
40 g을 유기용매로 순차분배하여 헥산층 2.3 g, 클로로포름층 0.7 g, 에틸아세테이트층 26.2 g 및 물층 10.8 g을 얻었으며,
이들 분배층에 대한 활성검정을 한 결과, 에틸아세테이트층에서 강한 활성이 났으며, 이 활성획분으로부터 항암활성 성분을 각종 크로마토그래피법,
HPLC를 이용하여 분리, 정제하였으며, EI-MS, 1H NMR,13C NMR, IR 및 UV
spectroscop y를 이용하여 그 구조를 동정한 결과, 활성 성분이 methyl gallate (methyl 3,4,5-trihydroxy
benzonate, C8H8 O5)임을 확인하였다.
Methyl gallate는
5종 인간 고형암세포주에 대하여 ED50 값이 4.3-8.5 μg/ml로 강한 항암활성을 보여
주었다.
주요어: 한방식물체, 오배자, 붉나무, 버섯, 동충하초, 항암활성, methyl
gallate.
The Anticancer Activities of Some Kinds of
Oriental Medicinal Plants, Mushrooms and Tochukasos,
and the Anticancer
Component from Galla rhois
In Hong Jeong
Abstract
For the development of new anticancer drugs from natural
resources, methanol extracts of 16 oriental medicinal pl ants, heat extracts of
17 mushrooms and cultures of 11 tochukaso strains were tested against five human
solid tumor cell lines, A549 (Lung carcinoma), SK-OV-2 (Ovarian cancer),
SK-MEL-2 (Melanoma), XF-498 (CNS cancer), HCT-15 (Colon cancer) by SRB
assay.
As the result, extracts of Galla rhois (Rhus chinesis,
Anacardiaceae) and Saururus chinensis (Sauru racea) among plants and
culture of Cordyceps kyushuensis among tochukaso strains showed the
strong activities ag ainst all five cell lines.
Among these active samples,
the extract of G. rhois was seleted for further fractionation and pulificaton.
The ex tract was sequentially partitioned with hexane, chloroform, ethyl acetate
and water, and the ethyl acetate fraction show ed the activity. The active
compounds was isolated from this fracton using open column chromatography and
high performan ce liquid chromatography. The structure of compound isolated was
comfirmed by electrom impact-mass spectrometry, 1 H NMR (400
MHz),13C NMR (100 MHz), IR spectrometry and UV spectrophotometry. The
comound were character ized as methyl gallate (methyl 3,4,5-trihydroxy
benzonate, C8H8O5).
Methyl gallate showed a
strong cytotoxic activity against five human solid cell lines (ED50,
4.3 to 8. 5 ㎍/㎖).
Key words : orental medicinal plant, Galla
rhois, Rhus chinensis, mushroom, tochukaso, anticancer activity, meth yl
gallate.
I. 서 론
과학기술
발전에 따른 생활수준의 향상과 의료기술의 발달로 인류의 수명은 급격히 연장되고 있음에도 불구하고 암으로 인한 사 망률은 계속 증가하고 있는
실정이다. 우리나라의 사망원인 통계자료를 보면, 85년의 15.1%이던 것이 1990년에는 20.1%, 1994년 에는 21.3%로 계속
증가추세에 있으며, 미국이나 일본과 마찬가지로 사망원인의 제1위를 차지하고 있다.
1940년부터 도입된 암치료에서의 화학요법제 개념이
1960년대에 이르러 암의 성질과 메카니즘 등에 대한 다양한 연구가 수행되 어짐에 따라 많은 발전을 이루게 되어 50여종의 항암제가 개발되어
암치료에 있어서 많은 기여를 해오고 있으나, 현재 쓰이고 있 는 각종 항암제들은 대개가 강한 독성을 보이고 있다. 또한 이들 항암제에 대한
암세포의 내성의 발현은 임상적인 면에서 한계를 보이고 있다. 그러므로, 보다 부작용이 적으면서도 좋은 효과를 갖는 항암치료제를 개발하는 것이
절실히 요구되는 실정이다. 한편, 암의 발생원인과 발생메카니즘을 해명하여 암을 예방, 치료하고자 하는 많은 연구가 진행되었고, 또한 면역학과
유전공학 분야의 많은 발전으로 인하여 암백신(Hellman등, 1987), 면역요법(Giampietri, 1981), 재조합 시토킨과 같은
생체분자에 의한 생 물학적 제제(Budd등, 1989) 등이 암예방 및 치료에 대한 보다 근본적인 가능성을 제시하고 있음에도 불구하고
암화학요법제 개발 에서와 마찬가지로 이 분야에서도 아직까지 만족할만한 치료제가 개발되지 않고 있다.
이러한 면에서 천연물로부터 항암성분의
탐색과 개발에 눈을 돌려 많은 업적이 축적되어 있을 뿐 아니라, 실용화에 이르고 있으 며, 또한 이들 천연물 유래의 항암성분을
선도화합물(lead compound)로 하여 새로운 계열의 항암제를 찾으려는 많은 노력이 경주 되고 있다. 천연자원은 오랫동안 암을 비롯한 많은
질병등의 예방 및 치료에 많이 사용되어 왔으므로 개발에 유리한 점을 갖추고 있다고 할 수 있겠다. 미국은 National Cancer
Institute (NCI)를 설립하여 항암 대량검색법을 개발하고 세계각지로부터 다양한 천연자원을 수집하여 항암검색을 실시해 오고 있다. 뿐만
아니라 국내에 있어서도 80년대부터 천연물로부터 유용한 항암물질을 개발하려는 많은 노력이 진행되고 있으나 아직 미진한 단계에 머물고 있다.
오늘날 물질특허를 비롯한 지적소유권의 보호가 강력히 요구되는 세계적인 추세속에서 국내 천연자원으로부터의 약리활성 물질 의 개발에 관한
연구는 절실하다고 할 수 있으며, 선진국과 국제경쟁력을 높이기 위해서도 신규 약리활성 물질의 개발에 대한 자체기술력의 확보가 무엇보다도
중요하다고 할 수 있겠다.
본 연구에서는 국내 산림자원의 고부가가치 창출을 통한 국제시장에서의 경쟁력 향상, 그리고 UR에의 효과적인 대응
및 국내 농 가의 소득증대를 도모하기 위하여 '장내세균 중 유해세균인 가스괴저균(Clostridium perfringens)에 대한
생육저해 활성 을 갖는 물질은 항암효과가 있다'는 실험적 근거를 통해 유해 장내세균에 대한 생육억제 효과를 보인 16종의 한방식물체와 산림
자원으로서 유용가치가 있는 버섯류 17종, 동충하초 11계통에 대하여 항암 스크리닝을 실시하고 그 약리활성 물질을 찾아내고자 수행하였다.
II. 연 구 사
과거의
주요 사망원인이었던 소아병과 전염성질환이 공중위생과 의료기술의 향상으로 치료가 가능해지자 노령인구가 급속히 증 가하였으며 암은 심장이나
혈액질환과 함께 대표적인 성인병으로 대두되기 시작하였다. 더우기 산업발달로 인한 환경의 오염으 로 각종 위험물질에 노출될 기회가 많아 지면서
암으로 인한 사망은 세계적으로 증가 추세에 있다(Franks, 1991). 미국의 경우, 장기간 역학조사를 바탕으로 85년 출생자의 암으로 인한
사망가능성 평가에서 남자의 경우 4명중 1명이, 여자의 경우 5명중 1명 이 암으로 사망할 것으로 추측하고 있으며, 1975년 출생자의
경우(남자 18%, 여자 16%)에 비하여 증가하였으며, 1930년 부터 198 5년 까지 암사망을 보면, 폐암, 유방암, 대장암 등을 중심으로
그 사망률이 크게 증가하여 왔으며, 특히 폐암의 경우 인구 10만 명당 암사망자의 수가 4명에서 72명으로 약 18배 이상
증가하였다(Ruddon, 1987). 우리나라의 경우, 통계청이 발표한 1994년 사 망원인통계 자료에 의하면 전체 사망자 중에서 각종 암으로
인한 사망자의 비율이 21.3%로서 사망자 5명중 1명에 해당하며, 1985 년(15.1%)에 비하여 40%이상 증가하였고, 계속 증가 추세에
있다. 이러한 암은 우리나라 전체 사망원인 중 제1위를 차지하는 국 민보건 문제 중 제일 중요한 질환이 되고 있다(통계청,
1994).
암은 환경적 요인인 발암원들(carcinogens)에 의한 정상세포들의 변형으로 발생되기 때문에 우리 몸 안의 어느 부위에서도
발생할 수 있으며, 발생부위에 관계없이 성장이나 전이속도 등 그 성격 또한 다양하다. 이러한 암세포는 일반적으로 성장인자(g rowth
factor)의 신호에 대한 의존도가 낮아 세포증식이 조절되지 않고(Sporn와 Roberts, 1985), 주변세포에 대한 접촉저해(cont
act inhibition)가 없으며, 분화의 특징이 결여되어 있다. 그리고 angiogenic factor를 분비하여 주위의 조직에 침투하여
전이(m etastasis)하는 특징을 갖는다(Liotta 등, 1991).
발암원에는 물리적 발암원(physical agents),
화학적 발암원(chemical carcinogen), 그리고 바이러스나 세균에 의한 감염성 발암원(infectious agent)들이 있으며,
이 중 대표적인 화학적 발암원들에 의한 암화(carcinogensis)는 Beremblum (1941)이 제창 한 two-stage
carcinogensis theory 즉, 시작단계(carcinogenic initiation)와 발암촉진단계(cancer promotion)의
두 단계로 진 행이 된다. 시작단계의 경우 발암원들(intiators)은 인체 주위 환경에서 접촉 또는 흡수되며 체내에서 정상 영양대사 경로가
아 닌 생체보호기구인 이물질대사 경로(xenobiotic metabolism)을 따라 대사하게 되며, 이들 대사경로를 거치는 과정에서 전자친화
력(electrophilicity)를 가진 반응성이 높은 발암원으로 변형되어 DNA와 공유결합한다. 발암원이 결합된 유전자는 돌연변이 현 상을
유발하여 암으로 발전하게 한다. 다음 단계는 발암촉진단계로서 발암원에 의하여 암이 유도되었지만 잠복상태에 머물러 전 혀 성장하지 않거나 서서히
성장을 하는 초기 암세포가 종양으로 발전하는 단계이다. 그러므로 암화는 화학적 발암원만의 단독 공격이 아닌 다른 인자, 즉 promotor가
필요하다. Promotor는 그 자신은 발암원이 아니며 초기화된 암세포의 분열을 촉진시키며, 정상세포의 특징인 분화를 방해하여 궁극적인 종양의
성장을 야기하게 하는 인자이다. 최근에는 암화를 조절하는데 있어서 init iator보다는 오히려 이들 promotor가 관여한다는 사실이 보고
되면서, 암의 예방을 위해서 promotor를 검출하려는 연구들이 수행 되고 있다.
이러한 암의 치료를 위하여 그동안 많은 노력이
경주되어 왔으나 그 치료율은 여전히 낮은 상태에 머물고 있는 실정이다. 그 가운데에서도 항암화학요법은 2차대전 중반에 출연하였으며,
mustard gas와 그 유사체들이 개발되어 당시 치료가 거의 불가능하 다는 백혈병의 치료에 대한 상당한 효과를 보인 것을
시작으로(Malpas, 1991), 항대사물질인 amenthopterin이 어린이의 lymphobl astic leukemia의 치료에 성공적
효과를 보이게 되면서 다양한 알킬화제(alkylating agents)와 항대사물질을 발견하려는 노력과 그들의 임상도입에 대한 연구가 진행되어
지난 40여년간 표 1에서 보는 바와 같이 50개여개의 항암제가 개발되어 현재 임상에 사 용되고 있다(Calabresi와 Gilman,
1991).
대부분의 항암제들은 세포증식에 작용하여 효능을 발휘한다. 세포증식은 매우 복잡하고 다양한 생화학 반응의 조합에 의해
이루어지고 있으나, 아주 질서정연하게 일어나며, 이들 일련의 반응의 한 주기를 세포주기라 하고, DNA를 합성하는 S기, 세포가 분열하는 M기,
그리고 준비기인 G1기와 G2기로 구성되어 있다. 그러나 각 phase별로 관련물질의 이상이 생기면 세포성장이 멈추 거나 무절제한 세포성장이
유발되어 암으로 발전하게 된다. 항암제들은 대개가 세포주기 중 어느 특정한 phase에 있는 세포에만 작용하는 phase-specfic
drug과 그렇지 않는 phase-nonspecific drug로 나누어 볼 수 있는데, phase-specific drug에는 S기에 작용하는
것으로 fluorouracil과 methotrexate등 항대사산물과 hydroxyurea, procarbazine이 있고, M기에 작용하는
것으로 vinca alkaloids, colchicine derivatives, podophyllotoxin 등이 있다. 그리고 G1기에는
bleomycin이, G2기에는 asparaginease가 특 이적으로 작용한다. Phase-nonspecific drug에는
cyclophosphamide, mechlorethamine의 알킬화제와 nitrosourea, daunorubicin, doxorubicin,
cisplatin 등이 있다(김, 1990).
이와 같이 대부분의 항암제가 정상세포와 암세포의 증식제어의 차이에 기인한 것은 전무한
상태이므로, 암세포에 대한 선택 성이 없고 정상세포에는 오히려 독성을 나타낸다. 비록 빠르게 증식하는 급성 백혈병이나 전립선암 등의 병에는
부작용에 불구하 고도 50-70%정도의 효과를 보이지만 폐암, 난소암과 같은 증식속도가 느리거나 거의 증식을 하지 않는 대부분의 고형암세포에는
독성만을 보일 뿐 그다지 치료효과는 보지 못하고 있다. 또한 치료초기에는 우수한 치료효과를 보이지만 점차 그 약제의 사용빈 도가 늘어남에 따라
효과가 약해지는 내성이 생겨나고 있으며, 그러한 내성을 갖는
Table 1. Chemotherapheutic agents useful
in neoplastic
disease
---------------------------------------------------------------------
Akylating agents Anti metabolites
Mechlorethamine
Methotrexate
Cyclophosphamide Fluorourcil
Melphalan Floxuridine
Uracil
mustard Azaribine
Chlorambucil Mercaptopurine
Triethylenemelamine
Azathoprine
Thiotepa Thioguanine
Hexamethylmelamine
Busulfan Natural
products
Carmustine Vinblastine
Lomustine Vincristine
Semustine
Vindesine
Streptozocin Etoposide
Dacarbazine
Teniposide
Dactinomycin(Actinomycin D)
Hormones and related agents
Daunorubicin
Aminoglutethimide Doxorubicin
Prednisone
Bleomycin
Hydroxprogesterone caproate
Plicamycin(Mithramycin)
Medroxyprogesterone acetate Mitomycin
Megestrol
acetate L-Asparaginase
Diethylstilbestradiol
Ethinylestradiol
Miscellaneous agents
Tamoxifen Cisplatin
Testosterone proponate
Hydroyurea
Fluoxylmesterone Procarbazine
Mitotane
암세포는 다른 약제에 대해서도
내성을 보여 치료에 어려움을 주고 있다. 따라서 암세포에 대한 선택성이 우수하고 독성이 적으 며 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발이
절실하다.
이러한 관점에서 구미, 일본등 선진국들은 오래 전부터 개발확률이 매우 낮은 화학적 합성에 의한 항암제의 개발에서, 인간에
효능이 뛰어나면서도 독성이 낮은 천연물(식물, 동물, 미생물)로부터 항암성분의 탐색과 개발에 주력하여 이미 많은 업적이 축적 되어 있을 뿐
아니라, 실용화에 이르고 있다(표 1). 또한, 천연물 유래의 항암성분을 선도화합물로 하여 새로운 항암제의 개발에 전력하고 있다. 예를 들면,
미국의 NCI는 1955년 Cancer Chemotherapy National Service Center (CCNSC)를 설립하고 아프리카,
마다가스타르, 중남미, 동아시아 등 세계 곳곳에서 시료를 채취하여 항암검색을 해 오고 있다(Suffness와 Douros, 1982). 그들은
1960년대까지는 발효물질을 주요 검색 대상으로 사용하였으나, podophylltoxin과 vinblastine, vincristine이
개발되면서 1982 년까지는 주로 식물체에 대하여 항암검색을 실시하였다. 약 35,000 여종의 식물로부터 114,000개의 식물엑기스에 대하여
항암검 색을 실시한 결과(Cordell 등, 1993), Taxus brebifolia로부터 taxol과 Camptotheca
acuminata로부터 camptotheci n이 발견되었다.
NCI는 또한 항암검색법을 세계적으로 제공해 왔는데, 초기에는
일차검색을 위해 L1210세포주를 사용하였으나, 1971년부터 198 5년까지 P388교체하여 사용하였다. 그러나 L1210과 P388세포주는
모두 증식이 빠른 세포이므로 고형암과 같은 증식이 느린 경우 에는 검색의 한계를 드러냈으며, 이러한 in vivo검색은 단시간
대량검색에도 부적당하였다. 1981년 이후 세포배양기술이 크게 발전하여 NCI는 1985년 항암 활성검색법을 in vivo에서
다양한 인간의 종양세포주를 이용한 in vitro 대량검 색으로 전환하였으며(Cragg 등, 1993), 적도 중심의 열대식물을
대상으로 하여 1991년까지 16,650종의 식물에서 33,300개 식물엑 기스를 제조하여 검색을 실시하여 오고 있다. In
vitro에서 다양한 세포주에 대한 활성을 검색한 후, 활성을 보이는 시료 는 곧 in vivo검색으로 이어지는데(Boyd,
1989), 이로써 질환에 특이적인 검색이 가능해졌다. 현재 NCI에서 사용하고 있 는 인간 암세포주는 7개 panel 60가지의 세포주로서,
한 종류의 표준배지에서 배양이 가능하고 세포성장이나 약물민감성 측면에 서 재현성이 있는 결과를 보이고 있다(Monks 등, 1989).
천연물 유래의 항암제 개발에 매우 유용한 자원이 되는 것은 식물체, 항생물질 그리고 효소 등이 있다. 이중 식물체로서 함유 하고 있는
활성 화합물은 주로 이차대사산물로 식물의 총 수와 같은 400,000개 정도로 추산되며(Swain, 1977), 최근까지 18,000 개 이상이
보고되고 있다(Harbone, 1988). 협죽도과에 속하는 Vinca rosea는 오래 전부터 민간전래약으로 사용되어 왔으 며,
1958년 Noble 등이 granulocytopenia와 골수암에서의 억제효과를 관찰하였고, Johnson (1982)은 급성 백혈병에 효능이
있음 을 발견하면서 vinblastine, vincristine, vinleurosine, vinrosidine 등의 알카로이드 화합물이
알려졌으며, 이들 중 vinblasti ne, vincristine이 임상에 중요하게 사용되고 있으며, 최근에는 이들의 반합성 유도체들이
개발되고 있다. Podophyllotoxin은 podophyllum peltatum에서 추출되었으며, 이 물질의 글루코사이드
반합성체인 etoposide와 teniposide는 다양한 인간암에 활성을 보여 주었다(Bender와 Chabner, 1982).
항생물질 관련 항암제에는 Streptomyces속에서 분리된 dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin,
bleomycins, plicamycin, mit omycin 등이 있다. Dactinomycin은 1940년 Waksman과 Woodruff에
의해서 분리된 actinomycin D 관련 항생물질로서 소아암등 많은 종양의 치료에 사용되고 있다. Anthracycline계 항생물질로서
Streptomyces peucetius에서 분리된 daunorubicin과 doxor ubicin은 1963년 DiMarco와
1969년 Arcarmone에 의해 분리되었는데, doxorubicin은 고형암을 포함하여 다양한 종양에 대해 치료 효과가 있는 반면,
daunorubicin은 급성 백혈병의 치료에 사용되고 있다. Bleomycins는 Umezawa(1973)에 의해 Streptomyces
v erticillus에서 분리되었으며, 피부나 머리, 목, 폐의 편평상피세포암을 포함한 다양한 종양에 효과가 있다.
Plicamycin는 1 962년 Rao에 의해 Streptomyces tanashiensis에서, mitomycin은 1958년
Wakaki에 의해 Streptomyces caespitosus 에서 분리되었다. Mitomycin은 aziridine ring과
urenthane, quinone을 가지고 환원적 알킬화반응을 하여 저산소증 세포에 선택 적 독성을 지니고 있다(Calabresi와 Parks,
****).
효소관련 항암제로는 L-asparaginase가 알려져 있는데, 초기에는 급성백혈병에만 한정적으로 작용한다고 생각되었으나
정상세포 에도 독성을 나타내며, 인슐린이나 알부민같은 분비단백질에도 손상을 주는 것으로 알려졌다(Wiemann과 Calabresi, 1985).
그 밖의 항암화학요법제로서 platinum과 결합되어 항암효과를 갖는 cisplatin과 ribonucleoside diphosphate
reductase의 활성 에 관여하는 hydroxyurea, 그리고 procarbazine, mitotane등이 임상에 사용되고 있다.
우리나라는 고려시대의 본초학(신, 1972), 조선시대의 동의보감(허, 1969)과 같은 저서가 발달하였으며, 한방에서 국산약초를
이용하여 종양의 치료제로 사용해 역사가 깊다고 할 수 있다. 이러한 천연물 유래 항암제 개발 분야에 있어서의 국내 연구동향은 체계적인 연구가
거의 이루어지지 않고 있으나, 90년대 들어와 우리나라의 암사망율이 현저히 증가하게 되면서, 암에 대한 관심 이 증대되었고 더불어 많은 연구가
진행되었다. 신규 항암물질 개발 분야에서도 한방식물체 및 다양한 국산 천연물에서 항암물질 을 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 서울대
의대 암연구소는 206예의 종양조직으로부터 38예의 종양세포주를 수립하 여 보고함으로써 한국인의 암세포에 대한 항암효과 검색을 가능하게
하였다(박 등, 1991).
식물체의 경우, 황(1978)에 의해 한국산 인삼(Panax ginseng)성분 중에, 황과
임(1978)에 의해 옻(Rhus verniciflua )의 성분 중에 항암작용이 있음이 보고되기 시작하였으며, 80년대에는 장
등이 AC glioma cell system (9ASK)에서 생약의 항 암작용을 검색하는 실험(1982a)과 P388 cell을 이용하여 생존
증감을 지표로 한 in vivo실험을 실시하였으며(1982b), 안 등(1985)이 L1210 세포 독성실험을 실시하면서 많은
발전을 하게 된다. 강 등(1987)은 당시 한방의료에서 종양환자에 투여되고 있는 반하(Pinellia ternata Tenore)
등 21종의 생약에 대해 면역세포, 특히 종약면역에 관여하는 NK 세포에 대한 파괴능 력 실험을 실시하여 이들 약제의 임상응용 가능성을 검토,
보고한 바 있다. 임 등(1987)이 colony formation 측정법을 이용한 P8 15암세포에 대한 감수성실험을 실시하여
공사인(Amomi Semen)등 7종의 생약에서 높은 감수성이 보임을 밝혀내는 등 다양한 방법 을 이용한 연구가 행하여졌다. 이(1989)등은
장미과(Rosaceae)에 속하는 사매(Duchesnea indica)의 함유물질 중 물추출물 에서 Sarcoma 180세포에 대한
항암성을 발견하고, 이 물질이 순수한 다당체나 단백질만이 아닌 gallic acid와 결합된 tannin계 물질임을 밝힌 바 있고, 또한 그
고분자물질 즉, tannin과 다당체 또는 단백질이 어떤 상태로 존재하는지와 단백질의 아미노산 조성을 밝혀냈다(1990). Lee
등(1991)은 민간요법에서 암치료에 사용되어 온 비파(Eriobotrya japonica)잎의 메탄올 추출 물 및 울솔릭산이
항돌연변이 효과, 고형암 저지 및 수명연장 효과를 나타낸다고 보고하였으며, 류 등(1992)은 울솔산의 암유전 자에 대한 발현억제효과를
검사하였다.
최근에는 leukemia 이외의 고형암 세포에 사용될 수 있는 항암제를 개발하고자 하는 연구에 초점이 모아지고 있다. 박과
김(19 92)은 고형암세포에 대해 효과적인 항암제를 찾기 위한 연구의 일환으로 human lung cancer인 A549 cell
culture system에서 32 종의 한방식물체의 세포독성 검색을 실시하여, 시호(Bupleurum falcatum),
지모(Anemarrhena asphodeloides), 독 할(Aralia cordata) 등 8종의 생약에서 활성이
있음을 보고하였다. 박 등(1993a)이 전통의학서와 생약학등의 문헌정보를 근거로 하여 선정한 80여종의 전통 약용식물체 추출물에 대한 3종류
인체 암세포주(SNU-1, SNU-C4, SNU-354)에 대한 항암활성을 검색하여 합환피(Albizzia julibrissin),
인진호(Artemisia capollaris)등 14종의 식물이 항암효과를 가진다고 보 고하였다. 이후로 현 등은 전통 상용 생약
이외에 전국 각지에서 채집한 130여종의 식물체 추출물의 두 종류 인체암세포주(SNU-1 , SNU-C4)에 대해 항암활성을
보고하였다(1994a, 1994b). 박(1993)은 한방식물체로부터 8종의 암세포주(A549, HCT15, MCF7, SK-O V-1,
K562, HL60, P388)에 대하여 항암활성을 갖는 성분을 분리하였는데, 지골피(Lycium chinensis Mill.)에서
ED50 0.026-0.6 μg/ml로 매우 강한 세포독성을 갖는 cardenolide 배당체인 periplocymarin
외 3종 화합물을, 독활에서 ED 50 3.5-4.4 μg/ml인 falcarindiol과 그 관련 화합물 5종을, 그리고
지모에서 ED50 1.7-7.3 μg/ml인 ste roid 배당체인 timosaponin A-III 외 1종과
norlignan인 hinokiresinol을 분리하였다. 이(1993)는 생약자원 325종의 A549, SK-O V-3 세포주에 대하여
세포독성 검정을 실시하였으며, 이 가운데 만형자(Viticis Fructus), 강진향(Dalbergiae Radix), 정력자(Le pidii
Semen), 석곡(Dendrobii Herba), 백렴(Ampelopsis Radix), 패장근(Patriniae Radix)을 선정하여
각각으로부터 5,3-dighydr oxy-3,6,7,4-tetramethyloxy flavone 외 10종의 화합물을 분리하였고, 그 유도체들을
합성하여 구조 활성관계를 살펴 보았는데, 만형자의 경우, 활성성분인 5,3-dighydroxy-3,6,7,4-tetramethyloxy
flavone은 골격에 치환된 OH기의 수와 그 위치가 활성에 중 요한 역할을 하며, 석곡의 경우는 aglycone에 당이 한 개 결합되어 있는
구조인데, 그 aglycone의 OH가 free한 상태로 존재해야 활성을 보이고, 5-hydroxy-3,7-dimethoxy-1,4-
phenanthraquinone은 그 높은 활성이 OH기의 메틸화 또는 아세틸화로 감소되는 것 으로 보아, 구조에서 OH기가 활성을 나타내는데
중요한 것으로 보고하고 있다.
한편, 한국산 고등균류에 대한 연구도 많이 수행되어 왔는데, Kim 등(1979)이
구름버섯(Coriolus versicolor), 표고버 섯(Lentinus edodes), 느타리버섯
(Pleurotus ostreatus)등의 자실체의 열수추출물이 sarcoma 180에 강한 저지력 이 있음을 밝힘으로써
시작되었다., 심(1980)은 구름버섯 배양균사체에서 분리한 항암성분인 단백결합 다당체의 SRBC (sheep red blood cell)에
대한 마우스 면역효과에서 비장 세포수와 용혈반 형성 세포수의 증가효과에 대하여 보고 하였고, 균사 배양액 내의 항암성분의 대량생산 가능성을
입증하였다. 그리고, 덕다리 버섯(Laetiporus sulphureus) (Kang 등, 1982)과 상황버
섯(Armillariella mellea) (김 등, 1983)의 균사체에서의 항암성분분석이 수행되었으며, 이 등(1986)은
Lyophyllum de castes의 배양균사로부터 항암성분인 단백다당체 Lyophyllan A를 분리하였다. 최근에는
만가닥버섯(Hypsizigus mamoreus )의 자실체로 부터 항암 단백다당체인 PS-K를 분리하였으며(박 등, 1993b),
영지버섯(Ganoderma lucidum)의 자실체 배양액으로부터 항암성 단백다당체를 분리하였다.(이 등, 1994a;
1994b). 현(1993)은 담자균류인 버들송이(Agrocybe cylindra cea)로부터 항암 활성을 탐색하여 쥐의
sarcoma 180에 대하여 70% 종양억제효과와 180% 수명연장효과를 보인 cylindan을 분 리하였으며, 이의 항암작용메카니즘 실험을
통해 암세포에 직접 세포독성을 나타내지 않고 면역세포들의 작용을 증강시키며, 암 으로 약화된 면역기능을 정상 회복시키는 면역조절물질로 작용함을
보고한 바 있다. 이처럼 단백다당체는 종양에 있어서 생체 고유의 방어력을 높여줌으로써 간접적으로 종양세포를 저지하고, 암세포나 병균을 직접
죽이는 대식세포의 수를 증가시킨다고 한 다.
그 밖에, 천연물로부터 항암성분을 분리해 내려는 노력 뿐만 아니라, 생약 추출물을 기존
항암제와 병용투여하여 항암제의 독 성을 낮추거나 활성을 증진시키고 내성을 극복하고자 하는 연구가 수행되고 있는데, 이 등(1991)은
울금(Curcuma domestica )의 항암성분인 (±)-ar-turmerone과 자근(Lithospermum
erythrohizon)과 황금(Scutellaria baicalensis)의 추출물을 기존에 임상에 이용되고 있는 8종의
항암제(vincristine sulfate, vinblastine sulfate, adriamycin, cisplatin, etopo side,
cytosine, arabinoside, bleomycin sulfate, cyclophosphamide)와 같이 병용투여한 결과, 대부분의
항암제에 대하여 단독 투여보다 항암작용 증진효과를 보고하였고, 은과 송(1994)도 유근피(Ulmi Cortex)의 부탄올분획과
항암제(mitomycin, cisplatin, 5-fluorouracil)를 병용투여하여 항암증진 효과와 함께 면역세포에 대한 부작용감소를
관찰하였다. 홍(1992)등은 생약복합제인 가미대보탕과 항암제인 cis-Platin 및 mitomycin C를 병용투여시에 항암효과
증진과 부작용의 경감효과를 보고하였고, 은 (1992)은 사군자탕(SKT)외 5종의 복합생약(SMT, SDT, SMS, BHT, HCT)의
mitomycin C와의 병용투여효과를 5종의 암세포(HepG2, A5 49, KHOS-Np, A431, HeLa)에 대하여 조사 보고하였다.
김 등(1994)은 황련(Coptis japonica)에서 분리해 낸 알카로이드인 berberine이 항암효과는 크지만 강한
독성때문에 사용이 불가능하지만, 파두(Croton tiglium)의 항암성분인 isoquanosin e과 함께 처리하면 높은 활성을
가지면서도, 독성은 그들 단독처리시 보다 40-60% 감소함을 보고하였다.
III. 재료 및 방법
1. 한방식물체, 버섯류, 동충하초의 항암활성 검색
1) 검색 시료
(1) 식물체 및 메탄올 추출물
실험식물체는 장내유해세균인
가스괴저균(Clostridium perfringens)에 대하여 생육저해활성이 있는 한방식물체로
옻나무과(Anacardiaceae)의 붉나무(Rhus chinensis)에서 형성된 충령(gall)인 오배자(Galla
rhois)외 15종을 서울소재 경 동시장 한약방에서 구입하여 사용하였고, 녹나무, 된장풀, 삼백초, 털머위 4종은
한라산에서 채집하여 사용하였다 . 이들 식물체의 학명, 과명, 채취부위는 표 2에 나타낸 바와 같다.
구입한 한방식물체는 잘 건조시킨 후
마쇄하여 분말로 만들고 나서, 각각의 분말시료 50 g씩을 취하여 500 ml Erlenmeyer flask에 넣고 메탄올 300 ml를 부어
잘 흔든 후에 실온 암실하에 방치하였다. 3일후 감압여과하고 회전진공농축기(EYELA au tojack NAJ-160, Japan)로 40℃에서
감압농축하여 메탄올 조추출물을 얻어 생물검정 시료로 이용하였다.
(2) 버섯류 및
열탕추출
흰회색광대버섯아재비(Amanita pseudoporphyria)외 16종의 버섯을 산림청 임업연구원에서
분양받았으며, 이들의 학명과 과명은 표 3에 나타낸 바와 같다.
각 건조시료는 잘 마쇄한 후 진탕기에 넣고, 70% 메탄올로 65℃에서,
2시간 동안 열탕추출한 후, 회전진공농축기로 40℃에서 감압농축하여 조추출물을 얻어 생물검정 시료로 이용하였다.
Table 2.
List of Plants species to be
tested
--------------------------------------------------------------------
Family name Koeran Scientific name Parts
name
collecteda
--------------------------------------------------------------------
옻나무과 Anacardiaceae 오배자 Galla rhois G
국화과 Asteraceae 털머위
Farfugium japonicum L
두충나무과 Eucommiaceae 두 충 Eucommia ulmoides
L
현호색과 Fumariaceae 현호색 Corydalis turrschaninovii R
지모과
Haemodoraceae 지 모 Anemarrhena asphodeloides R
으름덩굴과 Ladizabalaceae 목 통
Akebia quinata S
녹나무과 Lauraceae 녹나무 Cinnamomun camphora L
콩과
Leuguminosae 갈 근 Pueraria lobata R
″ 된장풀 Desmodium caudatum
L
″ 조각자 Gleditsia sinensis S
″ 황 기 Astragalas membranaceus
R
백합과 Liliaceae 맥문동 Liriope platyphylla R
방기과 Menispermaceae 방
기 Sinomenium acutum R
원지과 Polygonale 원 지 Polygala tatarinow
R
운향과 Rutaceae 황백나무 Phellodendron amurense S
삼백초과 Saururacea
삼백초 Saururus chinensis L
-------------------------------------------------------
---------------------
a R, root; S, stem; L, leaf; G,
gall.
Table 3. List of mushroom species to be
tested
--------------------------------------------------------------------
Family name Korean name Scientific name
--------------------------------------------------------------------
주름버섯과
Agaricaceae 갓버섯 Lepiota procera
광대버섯과 Amanitaceae 큰주머니광대버섯 Amanita
volvata
″ 암회색광대버섯아재비 Amanita pseudoporphyria
″ 흰가시광대버섯
Amanita virgineoides
″ 독우산광대버섯 Amanita virosa
꾀꼬리버섯과
Cantharellaceae 나팔버섯 Gomphus floccosus
″ 덕다리버섯 Laetiporus
sulphureus
″ 등갈색미로버섯 Daedalea dickinsii
″ 기와옷솔버섯 Trichaptum
fuscoviolaceum
″ 메꽃버섯부치 Microporus affinis
″ 말굽버섯 Fomes
fomentarius
″ 운지버섯 Coriolus versicolor
무당버섯과 Russulaceae
자주무당버섯 Russula violeipes
송이과 Tricholomataceae 잣버섯 Lentinus
lepideus
″ 혹깔대기버섯 Clitocybe gibba
″ 상황버섯 Armillariella
mellea
″ 표고버섯 Lentinus edodes
-------------------------------------------------------------------
(3)
동충하초 와 그 배양액
동충하초는 Cordyceps kyushuensis 외 2종 10 계통을 강원대 성재모 교수로부터
분양받았으며, 그 종류와 채집장 소, 기주는 표 4에 나타내었다.
Table 4. List of Tochukaso species
to be
tested
---------------------------------------------------------------------
Scientific
name Number Locality Host Order Host
Stage
---------------------------------------------------------------------
C.
kyushuensis C-4 Chiak-Mt. Lepidoptera Larva
C. militaris C-5
Bongmyung-li Lepidoptera Larva
C. militaris C-11 Chaeju-do Lepidoptera
Pupa
C. militaris C-8 Chiak-Mt. Lepidoptera Larva
C. militaris
C-9 Chiak-Mt. Lepidoptera Pupa
C. militaris C-10 Chiak-Mt.
Lepidoptera Pupa
C. militaris C-3 Seolak-Mt. Lepidoptera Pupa
C.
militaris C-1 Seolak-Mt. Lepidoptera Pupa
C. militaris C-7
Youngmoon-Mt. Lepidoptera Pupa
C. nutans C-2 Youngmoon-Mt. Hemiptera
Adult
C. nutans C-6 Seolak-Mt. Hemiptera
Adult
---------------------------------------------------------------------
각
균주는 PDA (potato dextrose agar)배지에서 저장하였으며, 군사배양은 Park (1996)의 방법에 따라 배양하였는데, 저장
된 각 균주를 Hamada 배지에 접종하고 28℃에서 7일간 배양하여 seeds를 만들고, 그 seeds를 omni-mixer로 균질화시켜 1
ml을 취 한 후 다시 Hamada배지에 접종, 28℃에서 7일간 배양하여 균사배양액을 얻었다. 균사배양액은 감암여과하여 균사체와 배양액을
분리하였으며, 배양액 2 L를 아세톤으로 활성화시키고, 증류수로 씻은 XAD-2 column (Amberite XAD-2 resin, 20-50
mesh, 5×60 cm, 500 g)에 흡착시키고, 증류수 2 L를 다시 흘려 보낸 후 메탄올 2 L를 흘렸다. 이 메탄올층을 회전진공농축기로
40℃에서 감 압농축한 후 생물검정에 이용하였다.
2) 암세포주
인체 고형암 세포주인 A549 (Lung
carcinoma), SK-OV-2 (Ovarian cancer), SK-MEL-2 (Melanoma), XF-498 (CNS cancer),
HCT-15 (Colon cancer)의 5종을 한국 화학연구소에서 분양받아 실험에 사용하였다.
3) 배지 및
시약
배지(Media for cell culture)는 Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)
Media 1640에 10% 송아지 혈청(fetal bovine s erum)과 penicillin-streptomycin 혼합용액을 첨가하여
사용하였으며, penicillin-streptomycin 혼합용액은 penicillin (10,000 units/m)과 streptomycin
(10 mg/ml)의 혼합액(SIGMA, P-0781)을 RPMI 1640배지에 100배 희석하여 사용하였다.
Trypsin-EDTA용액은 10배 농축용액(SIGMA, T-9395)을 PBS (phosphate buffered saline)로
10배 희석한 후 사용직전까지 냉동보 관하여 사용하였으며, SRB (sulforhodamine B) 염색용액(0.4%)은 (SIGMA,
S-9012) 1% 빙초산에 0.4%로 녹여 사용하였다.
TCA (trichloroacetic acid)고정액은 100% (6.1 N)
용액(SIGMA)을 증류수로 희석하여 50%와 80%용액을 사용하였다.
4) 항암활성 검정
(1)
세포배양
A549, SK-OV-2, SK-MEL-2, XF-498, HCT-15 세포주들은 10%의 송아지
혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 존재 하에서
1주일에 1-2회 계대배양하였다. 플라스크의 바닥에 부착되어 있는 세포 를 떼어내는 데는 0.25% Trypsin- 3 mM EDTA 용액을
PBS로 10배 희석한 용액을 사용하였다.
(2) 시료의 조제
각 식물체 추출물은 소량의 DMSO에
용해시킨 후, 실험용 배지로 원하는 농도만큼 희석하여 사용하였으며, 최종 DMSO의 농 도가 0.5%이하가 되도록 하였으며, 이 농도에서는
5종의 세포주에 부작용을 나타내지 않았다.
(3) 항암활성검정
항암활성검정은 SRB
assay법(Rubinstein 등, 1990; Skenhan 등, 1990)에 따라 검정하였다.
96- well plate (Nunc)의
각 well에 5-20 × 104 개의 세포밀도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 존재 하에서 24시간
배양하였다. 각 well의 배지를 aspiration하여 제거한 후, 서로 다른 농도로 준비한 시료가 포함된 배지를 200 μ l씩 각
well에 가하여 48시간 더 반응시켰다. 이 시점에 시료를 가하지 않은 Tz (time zero) plate를 지정해 두었다.
배양이
종료된 후, 50 μl의 cold 50% TCA를 위에서부터 천천히 가해주고 TCA가 바닥에 가라앉도록 잠시 기다린 후 조심스 럽게 냉장고로
옮겨 1시간동안 충분히 고정시키고 고정이 끝난 후에는 증류수로 5회 이상 세척하여 잘 건조시키고 나서 각 well 에 1% 빙초산에 녹인
0.4% SRB용액 100 ml을 가하여 상온에 30분이상 염색하였다. 염색이 끝난 후 1% 빙초산으로 5회 세척하여 잘 건조시키고 150
μl의 10 mM unbuffered Tris 용액으로 SRB dye를 잘 녹여내어 96-well plate용 microplate reader로
520 nM 에서 흡광도를 측정하였다.
대조군 흡광도(C), 시료처리군 흡광도(T), time zero에서의 흡광도(Tz)를 통해서
growth stimulation, net growth inhibit ion 및 net killing 등의 세포적 반응을 아래의 공식에 따라
산출하였다.
if) T≥Tz ％ GI (growth inhibition) = 100×[(T-Tz)/(C-Tz)]
T＜Tz ％
GI = 100 × (T-Tz)/Tz
각 시료의 ED50 값의 계산은 세포성장율과 시료농도를 이용하여
계산하였으며, 활성평가는 ED50이 20 μg/ml이하는 +++, 20-100 μg/ml의 경우는 ++, 100- 200
μg/ml의 경우는 +, 그리고 200 μg/ml이상의 경우는 -로 평가하였 다.
2. 오배자로 부터 항암성분의 분리 및 동정
1) 항암성분의 분리 및
정제
공시식물체의 1차 생물검정 결과 오배자의 메탄올 조추출물이 5종의 인체 고형암세포에 대하여 강력한 항암효과 때문에 오 배자의
항암활성 성분의 분리, 동정을 실시하였다.
서울소재 경동시장내 한약방에서 오배자를 구입하였으며, 구입한 오배자는 50℃에서 2일간
건조기에서 건조시킨 후 마쇄하 여 분말로 만들고 나서, 각각의 분말시료 500 g씩을 취하여 5000 ml Erlenmeyer flask에 넣고
메탄올 3000 ml를 부어 잘 흔든 후에 실온 암실하에 3일간 방치한 후 여과한 다음 여과액을 회전진공농축기로 감압농축하였다. 이 과정을 2회
반복하여 메탄올 조추출물을 250 g을 얻었다.
오배자 메탄올 조추출물 20 g을 증류수 800 ml에 녹여 2 L분액여두에 넣은 후
시료와 두가지 용매가 잘 섞이도록 흔들어 물층과 헥산층으로 분리하였으며, 약 30분후에 다른 분액여두를 이용해 헥산층은 뽑아내고, 물층에 새로운
헥산 800 ml를 부어 동일한 방법으로 2차의 헥산층을 뽑아내었다. 남아있는 물층에 클로로포름(Chloroform) 800 ml을 붓고 충분히
흔들어 물층과 클 로로포름층으로 분리하였으며, 약 40분 후에 클로로포름층을 뽑아내고, 물층에 새로운 클로로프름 800 ml를 부어 동일한
방법으 로 2차의 클로로포름층을 뽑아내었다. 마지막 단계로서, 남아있는 물층에 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 800 ml를 부어
상기와 같은 방법으로 에틸아세테이트층을 2회에 걸쳐 뽑아내었다. 이상과 같이 용매분획하여 헥산층, 클로로포름층, 에틸아세테이트 층 및 물층의
4획분을 얻은 후, 진공농축기로 농축하여 생물검정을 행하였다.
활성이 확인된 오배자의 에틸아세테이트 분획분 10 g을 메탄올 30 ml에
녹여 30 g의 실리카겔(70-230 mesh, Merck)과 함 께 섞은 후 메탄올을 완전히 휘발시켜 시료가 실리카겔에 흡착되게 하였다. 유리
칼럼(5.5 × 70 cm, PTTE end plate 부착)에 s ilica gel 600 g을 클로로포름으로 습식충진 시킨 후, 상층부에
클로로포름으로 녹인 시료를 5 ml 스포이드로 충진하였다. 용 출용매는 클로로포름/메탄올 = 99/1, 95/5, 90/10, 80/20,
70/30, 50/50, 20/80 (v/v)을 각각 2000 ml씩 순차적으로 흘렸고 마지 막은 메탄올로써 용출시켰으며, 용출속도는 분당 10
ml로 하였다. 각 분취시료는 박층크로마토그래피(Thin layer chromatograph y, TLC)에 의해 TLC plate
(SILC/UV254, 0.25 mm, MACHEREY-NAGEL, Germany)상에 전개된 spot patterm을 UV hand lamp
(UVG L-58, UV-254/356 nm, UVP Inc., USA)로 확인하였으며, 동일 spot으로 확인되면, 서로 합쳐 감압농축한 후
상기의 방법으로 항 암활성 검정을 행하였다.
칼럼크로마토그라피에 의해 분리된 각각의 활성획분은 먼저 UV spectrophotometer
(HP 8452A Diode Array Spectrophotom eter, Hewlett Packard)를 이용하여 최대 흡수파장을 검색한 후,
고속액체크로마토그라피(High performance liquid chromatograp hy)를 행하여 순수 분리, 정제하였다.
2) 활성성분의 화학구조 결정
최종정제된 오배자의 항암활성 성분은 MS (JEOL GSX 400, 70
eV), 1H (400 MHz) 및 13C (100 MHz) NMR (Brunker AMX-500),
FT-IR (Digilab, BIOLAD FT-80), UV (Unikon 942)등의 spectral techniques을 이용하여 화학구조를
결 정하였다.
3) 항암활성검정
분리, 정제된 활성성분의 5종의 인체 암세포주 A549, SK-OV-2,
SK-MEL-2, XF-498, HCT-15에 대한 항암활성은 앞에서 언급 한 SRB assay법을 이용하여 검정하였다.
IV. 결 과
1. 한방식물체, 버섯류, 동충하초의 항암활성
건조시료의 무게를 기준으로 산출한 16종 한방식물체의 메탄올 조추출물의 수율과 항암활성은 표 5에 나타내었다.
오배자( G. rhois)의 경우, 52%의 가장 높은 수율을 보여 주었으며, 그외 식물체들은 최저 1%(현호색 C.
turrschaninovii)에서 최 고 27%(황기 A. membranaceus)까지 수율을 나타내었다. 각 시료들의
조추출물의 5종의 인간 암세포주 A549, SK-OV-3, SK- MEL-2, XF498, HCT15에 대한 항암활성은 오배자(G.
rhois)와 삼백초(S. chinensis)는 ED50이 10 μg/ml이하의 값(+++)을 가지면서 매우
높은 활성을 보여 주었고, 현호색(C. turrschaninovii), 황백나무(P. amurense), 조각
자(G. sinensis)에서도 비교적 높은 활성(++)을 보여 주었다. 털머위(F. japonicum ),
지모(A. asphodeloides ), 녹나무(C. camphora), 방기(S. acutum)에서도
활성(+)을 보여주었다. 특히 지모는 5종의 암세포주 가운데 SK-MEL-2세포주에 대하여 상당히 높은 활성(+++)을 보이는 특징이
있었다.
버섯의 경우, 그 열탕수율과 항암활성은 표 6에 나타내었다. 수율은 최저 2.9%(기와옷솔버섯 T.
fuscoviolaceum)에 서 최고 29.7%(흰가시광대버섯 A. virgineoides)을 나타내었다. 항암활성은
상황버섯(A. mellea)과 등갈색미로버 섯(D. dickinsi)에서 비교적 높은 활성(++)을 보여 주었고,
기와옷솔버섯(T. fuscoviolaceum)과 운지버섯(C. v ersicolor)에서 약간의 활성(+)을 보였을
뿐, 대부분의 버섯에서 식물체에 비하여 보다 약하거나 거의 없었다.
동충하초 배양액의 경우는 대부분의 계통에서 항암활성을 보여 주지
않았으나, Cordyceps kyushuensis만이 매우 높 은 활성(+++)을 보여 주었다.
Table 5.
Yields and anticancer activities of methanol extracts of
Plants
---------------------------------------------------------------------
Yielda Anticanc er activityPlant species (%)
---------------------------------------
A549 S K-OV-3 SK-MEL-2 XF498
HCT15---------------------------------------------------------------------
Galla
rhois 52 +++b +++ +++ +++ +++
Farfugium japonicum 38
+ + ++ + ++
Eucommia ulmoides 12 + - + + +
Corydalis
turrschaninovii 1 ++ + ++ ++ ++
Anemarrhena asphodeloides 16 + +
+++ + +
Akebia quinata 17 - - - - -
Cinnamomun camphora 5 +
+ + + -
Pueraria lobata 15 - - - - -
Desmodium caudatum 7 +
- - - +
Gleditsia sinensis 10 ++ ++ ++ ++ ++
Astragalas
membranaceus 27 - - - - -
Liriope platyphylla 13 - - - -
-
Sinomenium acutum 7 + + + + +
Polygala tatarinow 20 + - ++
- +
Phellodendron amurense 15 ++ ++ ++ ++ ++
Saururus chinensis
4 +++ ++ +++ +++
+++
-----------------------------------------------------------------------------
a
(weight/dry weight of test material) × 100
b +++,
＜ED50 20 (μg/ml); ++, ED50 20-100 (μg/ml); +,
ED50 100-200 (μg/m l);
-, ＞ED50 200 (μg/ml).
Table 6. Yields and
antitcancer activities of extracts of
mushrooms
---------------------------------------------------------------------
Yielda Antican cer activityMushroom species (%)
---------------------------------------
A549 S K-OV-3 SK-MEL-2 XF498
HCT15---------------------------------------------------------------------
Lepiota
procera 8.6 -b - - - -
Amanita volvata 12.9 - - - -
-
Amanita pseudoporphyria 22.1 - - - - -
Amanita
virgineoides 29.7 - - - - -
Amanita virosa 5.7 - - - -
-
Gomphus floccosus 9.7 - - - - -
Laetiporus sulphureus 10.9
- - - - -
Daedalea dickinsii 11.5 ++ ++ ++ ++ ++
Trichaptum
fuscoviolaceum 2.8 - - + + +
Microporus affinis 3.1 - - - -
-
Fomes fomentarius 3.3 - - - - -
Coriolus versicolor 4.0 -
+ ++ - -
Russula violeipes 5.9 - - - - -
Lentinus lepideus
2.9 - - - - -
Clitocybe gibba 20.9 - - - - -
Armillariella
mellea 5.4 + ++ ++ ++ ++
Lentinus edodes 6.6 - - - -
-
-----------------------------------------------------------------------------
a
For explanation, see Table 5
b +++, ＜ED50 20
(μg/ml); ++, ED50 20-100 (μg/ml); +, ED50 100-200 (μg/m
l);
-, ＞ED50 200 (μg/ml).
Table 7. Anticancer activities of
tochukaso
species
---------------------------------------------------------------------
Anticancer activity T ochukaso species Number
---------------------------------------
A549 SK-OV-3 SK-MEL- 2 XF498
HCT15---------------------------------------------------------------------
C.
kyushuensis C-4 ++a ++ +++ ++ +++
C. militaris
C-5 - - - - -
C. militaris C-11 - - - - -
C. militaris
C-8 - - - - -
C. militaris C-9 - - - - -
C. militaris
C-10 - - - - -
C. militaris C-3 - - - - -
C. militaris
C-1 - - - - -
C. militaris C-7 - - - - -
C. nutans C-2
- - - - -
C. nutans C-6 - - - -
-
-----------------------------------------------------------------------------
a
+++, ＜ED50 20 (μg/ml); ++, ED50 20-100 (μg/ml); +,
ED50 100-200 (μg/m l);
-, ＞ED50 200 (μg/ml).
2. 오배자로부터 항암성분의 분리 및 동정
오배자의 메탄올 조추출물이 인체 세포주 A549, SK-OV-2, HCT-15, XF-498, SK-MEL-2에
대하여 다른 시료에 비하여 탁월한 항암활성을 보였기 때문에 오배자로부터 항암활성성분을 분리 동정하였다.
오배자의 메탄올 조추출물 40
g을 순차적으로 분획, 농축하여 헥산층 2.3 g, 클로로포름층 0.7 g, 에틸아세테이트층 26.2 g 및 물층 10.8 g을 얻었으며(그림
1), 이 가운데 생물검정 결과, 에틸아세테이트층에서 5종 암세포주에 대하여 강한 항암효과 를 보였다(표 8).
활성을 보인
에틸아세테이트층 10 g을 취하여 chloroform/methanol계로 silica gel open chromatography하여 5개의
분획을 얻었다. RE2와 RE4에서 강한 활성을 보여 주었으므로, RE2는 silica gel open chromatography
(chloroform:methanol = 20:1, v /v)하고, 분취용 HPLC를 실시하여 백색결정의 화합물 A (26 mg)를 정제하였다.
Galla rhois methanol extract (40 g)
| partition with water
(800 ml)
| and n-hexane (800 ml x 2)
+----------+----------+
| Water
fr.
| | CHCl3 (800 ml x 2)
| +--------+-----------+
| |
Water fr.
| | | EtOAc(800 ml x 2)
| | +-------+-------------+
| | |
|
Hexane fr. CHCl3 fr. EtOAc fr. Water fr.
2.3 g 0.7 g 26.2 g
10.8 g
Figure 1. Solvent partition of methanol extract of Galla
rhois.
Table 8. Anticancer activities of fractions of methanl extract of
Galla
rhois
---------------------------------------------------------------------
Anticancer activity*Fracti ons
--------------------------------------------
A549 SK-OV-3 SK-MEL-2 XF498 HCT
15---------------------------------------------------------------------
Hexane
Fr. ++a ++ ++ ++ ++
Chloroform Fr. ++ ++ ++ ++ ++
Ethyl
acetate Fr. +++ +++ +++ +++ +++
Water Fr. - - - -
-
---------------------------------------------------------------------
a
+++, ＜ED50 20 (μg/ml); ++, ED50 20-100 (μg/ml); +,
ED50 100-200 (μg/m l);
-, ＞ED50 200 (μg/ml).
Ethyl acetate fraction, 10
g
SiO2 gel column
chr.
(CHCl3:MeOH,
gradient)
RE1
RE2
500
mg
RE3
RE4
RE5
SiO2
gel column
chr.
(CHCl3:MeOH=20:1)
RE21
RE22
100
mg
RE23
prep. HPLC λ=280nm
MeOH:H2O=3:7,
v/v
Compound A
26 mg
Figure 2. Isolation
procedure of Compound A from ethyl acetate fraction.
정제된 항암활성을 가진 화합물
A의 EI-MS data는 그림 3에, 1H NMR (acetone δ6, 200 MHz) data는 그림 4에,
13C NMR (acetone δ6, 50 MHz) data는 그림 5에, IR (KBr)의 spectrum data는 그림
6에, UV spectrum은 그림 7에 나타낸 바와 같다. 이러한 스펙트럼 자료를 통하여 화합물 A가 methyl gallate (methyl
3,4,5-trihydroxy benzoate, C8 H8O5)임을 판명할 수
있었고, 그 분자구조는 그림 8과 같다.
Methyl gallate
(C8H8O5)
mp: 200℃
Rf : 0.59
(CHCl3:MeOH=10:1)
UV (MeOH) λmax nm (ε): 2.087
(4203)
IR (KBr, cm-1): 3320-3591(OH)
MS (EI, 70 eV,
m/z, % int.): 184[M+] (45), 153 (100), 125 (33), 107 (13), 79
(62), 78 (15).
1H NMR (200 MHz, acetone, δ ppm): 7.18 (1H,
Ar-H), 3.86 (3H, -COOCH3)
13C NMR (50
MHz, acetone δppm): 164.98 (C7), 146.32 (C3,C4), 139.62 (C4), 121.30 (C1),
109.97 (C2,C 6), 52.28 (C8)
3. Methyl gallate의 항암활성
오배자의
에틸아세테이트층에서 분리한 methyl gallate의 5종 인간 암세포주 A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498, HCT15에
대 한 항암활성 검정결과는 표 9에 나타내었다.
Methyl gallate는 ED50값이 폐암세포주(A549)의 경우
6.7 μg/ml, 난소암세포주(SK-OV-3)의 경우 8.5 μl/ml, 피부암세포주(SK-MEL-2)의 경우 4.3 μg/ml,
중추신경계암세포주(XF-493)의 경우 6.0 μg/ml, 결장암(HCT-15)의 경우 4.5 μg/m l로 대부분의 고형암 세포주에 대하여
4.3-8.5 μg/ml로 매우 높은 활성을 나타내었다.
Table. 9 Net growth as % of control
of methyl
gallate
---------------------------------------------------------------------
CONC( g/ml) A549 SK-OV-3 SK-MEL-2 XF-493 HCT-15
---------------------------------------------------------------------
0.0025
93.6 111.3 100.3 104.5 110.4
0.025 94.5 109.6 99.1 106.0 110.8
0.25 91.2
109.5 92.7 103.1 107.1
2.5 81.8 98.2 72.3 92.2 80.4
25 16.7 6.8 -24.7
-20.6 -39.4
50 -31.1 -17.8 -38.5 -49.9
-79.4
---------------------------------------------------------------------
ED50
6.7 8.5 4.3 6.0
4.5
---------------------------------------------------------------------
V. 고 찰
본 연구는 한방식물체 13과 16종, 버섯류 5과 17종,
동충하초 1과 3종 11계통 등 총 44개의 시료를 구입하거나 채집하여 5 종의 인간 고형암세포주(A549, SK-OV-2, SK-MEL-2,
XF-498, HCT-15)에 대한 항암활성 조사를 하여 천연물 유래의 저독성 항암제 를 개발하고자 하였다.
암의 발생은 산업발달로 인한
발암원에 대한 노출기회가 늘어나고 의학의 발달로 암의 발병확률이 높은 노년기까지의 수명 연장되어 계속 증가하여 왔다. 또한, 인플루엔자, 결핵,
폐렴 등의 전염성 질환으로 인한 사망율이 매우 높았던 과거에는 별로 주목을 받지 못하다가 공중위생이 개선되고, 백신이나 항생제들이 개발되면서
전염성 질환이 어느 정도 정복되자, 많은 관심의 대상이 되었다(Cooper, 1992). 그동안 암을 치료하고자 하는 연구가 많이 수행되었으며,
그 대표적인 치료법이 항암화학요법이다 . 항암요법제를 통한 암의 치료는 수술요법이나 방사선치료와 함께 항암치료에서 중요한 분야를 차지하고
있으며, 현재 50여종의 항암제가 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 암의 치료와 예방을 위해서 개발된 이들 항암제등은 증식속도가 빠른 혈액암
세포의 경우 상당한 치료효과를 보이는 반면 증식속도가 느린 고형암의 세포에서는 뚜렷한 효과를 보이고 있지 못하는 한계를 가지고 있으며, 암세포
외에 분열이 빠른 골수세포도 파괴시키는 등의 정상세포에 대한 부작용도 수반하고 있으며, 또한 많은 항암제가 세포막을 통과하지 못하거나 통과하는
경우에도 분자가 파괴되어 약효가 감소되는 문제점등이 있다. 따라서, 기존 항암제와 다 른 새로운 항암제의 개발이 절실히 요청되고 있으며,
최근에는 기존 항암제의 임상적 시도와 새로운 항암제 개발을 위한 전임상 시험방법 확립을 위한 연구들이 활발히 수행되고 있다(Stuffness,
1991).
항암제의 개발을 효과적으로 수행하려면 많은 후보물질이 확보 가능해야 하며 치료하고자 하는 질환에 대한 이들 많은 후
보물질들의 효능여부를 빠르고 정확하게 결정할 수 있는 효율적인 생물활성 검색 체계가 필수적이다. 후보물질의 원천은 화학적 합성에 의한
유기화합물의 검색, 천연 동·식물이나 미생물 생성 대사물의 검색, 그리고 기존 약재들의 구조적 혹은 기능적 유도 체의 합성등으로 크게 대별될 수
있다. 현재 세계적으로 항암제 분야 뿐만 아니라 아직 별다른 치료법이 개발되어 있지 않은, 많 은 난치성 성인 질환의 치료를 위해 언제
지구상에서 사라질지도 모르는 귀중한 천연물 자원으로부터 미지의 약효성분을 검색, 발견하여 신약으로 개발하려는 노력이 매우 활발히 전개되고 있다.
특히 기존 항암제들의 한계와 전체 질병에서 암이 차지하는 비중과 그 심각성때문에 항암제 분야에서는 더욱 두드러지고 있다. 또한 천연물로부터
신의약품을 개발하려는 것은 전통의학 정 보를 이용하여 오랫동안 축적되어 온 임상 경험을 바탕으로 하기 때문에 많은 가능성을 가지고 있으며, 현재
임상에서 사용하고 있는 항암제 중에는 천연물에서 유도된 것으로 Vinca alkaloids 및 유도체인 vinblastine,
vincristine, vindesmine과, p odophyllotoxin 유도체인 etoposide, teniposide, 그리고
Taxus brevifolia에서 얻어진 taxol이 있으며, 임상실험 중인 것으로는 ellipticine,
homoharritonine 등이 있다(Cragg 등, 1993).
본 연구에서 16종 한방식물체의 메탄올 조추출물과 17종 버섯류의
열탕 조추출물로부터 5종의 인간 암세포주 A549, SK-OV- 3, SK-MEL-2, XF498, HCT15에 대한 항암활성을 검색하여 천연물
유래의 항암제 개발의 기초자료를 얻기 위하여 실시한 결과, 식 물체에서는 오배자(G. rhois)와 삼백초(S.
chinensis)가 매우 높은 활성을 나타내었고, 현호색(C. turrschaninovii ), 황백나무(P.
amurense)와 조각자(G. sinensis)에서도 비교적 높은 활성을 나타냈으며, 버섯류에서는 상황 버섯(A.
mellea)과 등갈색미로버섯(D. dickinsi)이 비교적 높은 활성을 보였고, 동충하초에서는 Cordyceps
ky ushuensis가 높은 활성을 보였다. 이 가운데 오배자는 박과 김(1992)의 A549세포주를 이용한 한방식물체의 세포독성
검색에 서 높은 항암효과가 있음이 밝혀져 있으며, 박 등(1993a)도 위암(SNU-1), 대장암(SNU-4), 간암(SNU-354)을 이용한
대한 전통약용 식물체의 항암활성 검색에서 항암활성을 확인한 바 있다. 삼백초의 경우 본 실험에서는 강한 활성을 나타내었으나, 박과 김(199
2)의 실험에서는 활성이 약한 것으로 나타나 서로 다른 결과를 보여 주었으며, 현호색의 경우는 본 실험의 결과와 같이 항암활성 을 갖고 있음이
확인되어 있으나(박 등, 1993), 그 항암성분은 밝혀져 있지 않은 상태이며, 황백나무의 경우는 그 성분 가운데 높은 항암효과를 갖는
berberine이 함유되어 있는데(문, 1991), 본 실험의 결과도 berberine에 의한 것이 아닌가 생각한다. 상황 버섯에서 항암활성
성분으로 단백다당체가 이미 분리된 바 있으며(김 등, 1983), 이외 여러 버섯에서도 항암성 단백다당체가 밝 혀진 바 있다(심, 1980; 박
등, 1993b; 이 등, 1994a). 동충하초에서는 항암활성이 많이 발견되었으나(Park, 1994), Cordycep s
kyushuensis의 항암활성에 대해서는 알려져 있지 않았다. 그리고 조각자와 등갈색미로버섯의 항암활성에 관한 연구도 되어 있지 않은
상태이나, 본 실험에서는 그 활성이 확인되어 추후에 항암활성 성분을 밝히는 실험들이 진행되어야 하겠다.
본 연구에서는 강한 항암활성이
확인된 오배자로부터 항암 성분을 분리하고자 하였다. 오배자는 한방식물체 중 옻나무과(A nacardiaceae)에 속하는 오배자나무 또는
붉나무(Rhus chinensis L.)에 오배자면충(Schelchtendalia chinensis)이 기생함으로
형성된 충영(gall)을 말하며, 수렴약, 피멎이약, 토혈, 각혈, 장출혈, 설사 때 복용하는 전통 한방약제로 알려져 있 는 것으로(문,
1991), 성분으로는 tannin이 50-60% 들어 있으며 주로 Penta-m-digalloyl-β-D-glucoside로
구성되어 있고 약간의 몰식자산, 수지, 기름이 함유되어 있다. 옻나무과에 속하는 식물체의 성분에 대한 연구는 많이 수행되어 왔으나 붉나무 의
약리활성에 관한 연구는 거의 없는 상태이며, 다만 신 등(1992a, 1992b)에 의해 붉나무 추출물의 항산화 효과가 보고된 바 있 을
뿐이다.
오배자의 항암효과는 박과 김(1992), 그리고, 박 등(1993a)의 screening 결과에서도 보고 되었듯이 강하게
나타났으나, 그 활성성분에 대해서는 아직 밝혀져 있지 않아서 본 연구에서는 오배자의 메탄올 추출물로부터 항암활성 성분으로 판명되는 methy l
gallate가 분리되었으며, 이 methyl gallate는 5종의 인간 암세포주에 대하여 ED50 값은 4.3-8.5
μg/ml으로 아주 높은 활성을 보여주었다.
그러나 오배자의 성분가운데 gallotannin은 쉽게 가수분해되어 gallic acid를
생성할 수 있으며, 오배자의 추출에 있어 메 탄올이 이용되었으므로 분리된 methyl gallate가 추출 및 분리과정에서 생성된
artifact일 가능성 또한 간과할 수 없겠다.
Methyl gallate는 triphenol화합물로서 이들 화합물들이 가지는
세포독성은 이미 보고된 바 있으며, in vitro에서 autoxidation에 의한 세포외부의 toxic oxygen
species의 생성에 의해 독성을 나타낸다고 알려져 있다(Passi, 1987). Nakagawa ( 1995)는 쥐의 hepatocytes에
대하여 propyl gallate와 그 관련 화합물들의 세포독성을 조사하였는데, 이들 화합물들은 세포내에 서 ATP의 급격한 감소를 야기하여
미토콘드리아의 기능을 저해하며 결국 세포를 죽게 한다고 보고하였으며, 이들 화합물간의 1 m M 농도에서 세포독성을 비교하여 그 결과 octyl
gallate, dodecyl gallate, butyl gallate가 아주 강한 독성을 나타내고, propyl gallate와 methyl
gallate, ethyl gallate는 보다 낮은 독성을, gallic acid가 가장 낮은 독성을 갖고 있음을 보고하였다. 결국 ,
methyl gallate는 세포내에서 propyl gallate와 같은 메카니즘으로 ATP의 급격한 감소를 야기하여 세포독성을 나타냄을 알 수
있다. Methyl gallate는 세포독성 이외에 antiasthmatic활성(Dorsch 등, 1992),
antimicrobial활성(Saxena 등, 1994), antiviral 활성이 보고된 바 있으며(Kane, 1988), 또한 장내
유해세균에 대하여 강한 생육억제효과가 있음이 보고된 바 있다(권, 1994). 권(1994)은 Salmonella typhimurium
2균주를 이용하여 methyl gallate의 돌연변이원성 실험를 실시한 결과 돌연변이원성 이 없음을 보고하였는데, 이는 methyl
gallate의 임상에 도입가능성을 제시해 주고 있다.
항암활성이 확인된 오배자의 국내 생산량을 보면, 1991년 550,000톤($
1,300,000)이 생산되고 있으며, 이중 80%인 430,000 톤($ 205,000)정도가 수출되고 있다. 선진국들이 자국에서 자생하는
자원식물로부터 기능성 생리활성물질의 개발에 주력하고 있 고, 한방식물에 대한 관심의 증대로 식품 및 의약품에의 이용을 연구하고 있는 상황에서4,
국산 자원의 개발은 매우 중요하다고 할 수 있겠으며, 오배자에서의 항암활성은 국산 자원에 대한 고부가가치 부여와 외국 자원과의 경쟁력의 증대에
크게 기여하리라 고 본다. 향후, 오배자에서 분리된 항암성분인 methyl gallate의 in vivo실험을 통한 임상도입 방안의
연구와 그리고, 아 직 정확하게 규명되어 있지 않는 오배자의 형성 메카니즘의 규명, 오배자면충의 대량사육법의 확립, 외국산과 약리효과 비교에
의한 차별화 등의 연구가 더 이루어진다면 국가의 수출증대와 농가의 소득향상, 국제수지 향상에 크게 기여하리라고 생각한다.
VI. 인
용 문 헌
Bender, E. A. and B. A. Chaber. 1982.
Tubulin binding agent. In Pharmacologic Principles of Cancer Treatment.
B. A. Chaber ed. W. B. Saunders Co. Philadelphia. pp. 256-268.
Berenblum, I.
1941. The mechanism of carcinogenesis: a study of the significance of
carcinogenic action and related phe nomena. Cancer Res. 1:807.
Boyd,
M. R. 1989. Status of implementation of the NCI Human tumor cell line in
vitro primary drug screen. Pro c. Am. Assoc. Cancer Res.
30:652.
Budd, G. T., B. Osgood, B. Barna, J. M. Boyett, J. Finke, S. V.
Medendrop, S. Murth, C. Nobak, J. Sergi, R. Tubbs an d R. M. Bukouski.1989.
Phase I clinical trial of interlukin 2 and alpha interferon : Toxicity and
immunologic effects. Cancer Res. 49:6432-6436.
Calabresi, P. and A.
G. Gilman. 1991. Chemotheraphy of neoplastic disease . In the Pharmacological
basis of therapeu tics. 8th ed. A. G. Gilman, T. W. Rall, A. S. Nies, P.
Taylor. eds. pp.1202-1263.
장일무, 지형준. 1982a. 한국산 생약의 약리작용 및 독성연구(제3보). 세포독성 및
Glioma(9ASK)에 항암작용. 생약학회지. 13: 55-61.
장일무, 김제훈, 한대석.1982b. 한국산 생약의 약리작용 및
독성연구(제4보). 급성독성 및 항암작용. 생약학회지. 13:62 -69.
Cooper, G. M. 1992. In
Elements of Human Canccer, Johons and Bertlett, Boston. p.3.
Cordell,
G. A., A. D. Kinghorn and J. M. Pezzuto. 1993. Separation, structure elucidation
and bioassay of cytotoxic nat ural products. In Bioactive Natural
Products: Detection, Isolation and Structure Determination. S. M. Colegate
an d R. J. Molyneux eds. CRS Press. Boca Raton. PP.195-220.
Cragg, G. M., M.
R. Boyd, J. H. Cardellina II, M. R. Grever, S. A. Schepetz, K. M. Snader and M.
Suffness. 1993. The ro le of plants in the NCI drug discovery and development
program. In Human Medicinal Agents from Plants. A. D. King horn and M. F.
Balandrin eds. America Chemical Society. Washington, D.C.
pp.534-553.
Dimarco, A. 1975. Daunomycin and adriamycin. In Antineoplastic
and Inmunosuppressive Agents. A. C. Sartorelli an d D. G. Johns eds. Berlin.
pp.593-614.
Dorsch, W., M. Bittinger, A. Kaas, A. Muller, B. Kreher and H.
Wagner. 1992. Antiasthmatic effects of Galphimia glau ca, gallic acid,
and related compounds prevent allergen- and platielet-activating factor-induced
bronchial obstructi on as well as bronchial hyperreactivity in guinea pigs.
Int. Arch. Allergy. Immunol. 97:1-7.
은재순. 1992. 항암제 mitomycin C의 부작용에
대한 수종 복합생약의 영향. 생약학회지. 23:248-258.
은재순, 송원영. 1994. 암세포주에 대한 유근피 n-BuOH 분획과
항암제의 병용효과. 생약학회지. 25:114-152.
Franks, L. M. 1991. What is cancer? In
Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer. 2nd ed. Fra
nks, L. M. and Teich, N. M. eds. Oxford Univ. Press. Oxford. pp. 1-30.
Giampietri, A. 1981. Drug-mediated increase of tumor immunogenicity in vivo
for a new approach to experimental cancer i nnunotherapy, Cancer Res.
41:681-687.
Harborne, J. B. 1988. The plant and its biological adaptation to
the environments. In Introducton to Ecological Bioc hemistry. J. B.
Harborne ed. Academic Press. London. pp.1-41.
Hellman, K., D. Phil and S. K.
Carter 1987. Fundamental of cancer chemotheraphy, McGraw Hill Book Company, New
York. p. 64.
허준. 1969. 동의보감 . 동의보감 국역위원회 역편. 남산당
홍남두, 김종우, 김남제, 김진식. 1992.
생약복합제제와 항암제의 병용투여에 관한 연구(제2보). cis-platin 및 mitomycin-C와 가미대보탕의 병용투여에 의한 부작용
경감효과. 생약학회지. 23:89-95.
현진원. 1993. 버들송이의 항암성분에 관한 연구. 서울대학교 박사학위논문. pp.
70-119.
현진원, 임경화, 신진이, 성민숙, 원용진, 김영식, 강삼식, 장일무, 우원식, 백우현, 김형자, 우은란, 박호근,
박재갑. 1994a. 전통 약용식물 및 각종 식물의 항암효과에 대한 연구. 생약학회지. 25:171-177.
현진원, 임경화, 신진이,
성민숙, 오재환, 양용만, 원용진, 김영식, 강삼식, 장일무, 백우현, 김형자, 우은란, 박호근, 박재갑. 1994b. 전통 약용식물 및 각종
식물의 항암효과에 대한 연구(II). 생약학회지. 25:382-387.
Johnson, L. S. 1982. Plant alkaloids.
In Cancer Medicine. 2nd ed. J. F. Holland and E. Frei eds. Lea &
Febig er. Philadelphia. pp.910-919
Kane, C. J. M., J. H. Menna, C. C. Sung
and Y. C. Yeh. 1988. Methyl gallate, methyl-3,4,5-trihydroxy benzonate, was a p
otent and highly specific inhibitor of herpes simplex virus in vitro. II.
antiviral activity of methyl gallate an d its derivatives. Biosci. Rep.
8:98-99.
Kang, C. Y., C. O. Lee, K. S. Chung, E. C. Choi and B. K. Kim. 1982.
An antitumor component of Laetiporus sulphureus and its immunostimulating
activity. Arch. Pharm. Res. 5:39-43.
강윤호, 김병운, 하윤문, 박재경, 남상윤, 최규철,
최용묵. 1987. 수종의 생약에 대한 항암효과의 실험적 연구(I). 생약학회지. 18:118-126.
Kim, B. K. E. K.
Park and M. J. Shim. 1979. Studies on constituents of higher fungi of
Korea(XXIV). Antineoplastic acti vities of Coriolus versicolor(Fr.)
Quel, Pleurotus ostreatus (Fr.) Kummer and Lentinus edodes (Berk )
Sing. Arch. Pharm. Res. 2:145-151.
김정한, 이상준, 한영복, 문정조, 김종배. 1992.
Isoquanosine과 berberine 1 : 1 혼합물의 항암효과. 약학회지. 38:174-178.
김진숙, 최응칠, 김혜령,
이종철, 이정옥, 정경수, 심미자, 김병각. 1983. 한국산 고등균류의 성분(제37보). 뽕나무버섯(Arm illariella
mellea)의 항암성분. 한국균학회지. 11:151-157.
김노경. 1990. 종양학. 종양 내과학의 원리. 서울대출판부.
pp. 149-159.
김선희. 1994. 암세포의 부착저해물질의 탐색 및 그들의 항암활성. 충남대학교 박사학위논문. pp.
122-127.
권정현. 1994. 오배자면충에 의해 형성된 오배자의 농약활성 및 약리활성. 서울대학교 석사학위논문.
pp.59-64.
Lee, C. K., S. W. Park, H. Y. Chung, S. S. Suh and K. Y. Park.
1991. Mechanism of antitumor effect of ursolic acid from Eriobotrya
japonica. J. Kor. Cancer Assoc. 23:13.
이정옥, 김형수, 최응칠, 김병각. 1986.
한국산 고등균류의 성분 및 배양에 관한 연구(제55보). Lyophyllum decastes의 항암성분 및 배양. 생약학회지.
17: 23-34.
이인란, 한승혜, 한용남, 정가진. 1990. 한국전통 생약의 약리활성과 활성물질에 관한 연구(VII). 사매의 항암성
고분자 물질. 생약학회지. 21:186-192.
이인란, 위승원, 한용남. 1989. 한국전통 생약의 약리활성과 활성물질에 관한
연구(VI). 사매의 Tannin계 물질. 생약학회지. 20 :110-116.
이권행, 정훈, 이준우, 한만덕, 최경숙, 오두환.
1994b. Ganoderma lucicum IY009로 부터 분리된 항암성 다당류의 정제 및 구조분석. 산업미생물학회지.
22:190-196.
이권행, 이정옥, 이준우, 정훈, 한만덕, 정준호, 오두환. 1994a. Ganoderma lucicum
IY009로 부터 분리된 항암성 다당류 의 약리 및 독성. 산업미생물학회지. 22:182-189.
이유희. 1993. 수종의
항암생약으로부터 활성성분의 분리와 그 유도체의 항암효과. 충남대학교 박사학위논문. pp.153-155.
이윤영, 유관희, 김삼용, 안병준.
1991. 백혈병 세포주에 대한 (±)-ar-turmerone, 자근 및 황금추출물에 의한 항암제의 세포독 성 증강효과. 약학회지.
35:203-215.
Liotta, L. A., P. S. Steeg and W. G. Stetler-Stevenson. 1991.
Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of posit ive and negative
regulation. Cell. 64:327-336.
Malpas, J. S. 1991. Chemotheraphy. In
Introduction to the cellular and Molecular Biology of cancer. 2nd ed. L.
M . Franks and N. M. Teich eds. Oxford Univ. Press. Oxford. pp. 451-469.
Monks, A., D. A. Scudiero, P. Skehan and M. R. Boyd. 1989. Implementation f
a pilot-scale high flux anticancer drug scr een utilizing disease oriented
panels of human tumor cell lines in culture. Proc. Am. Assoc. Cancer Res.
30:607.
문관심. 1991. 약초의 성분과 이용. 일월서각. 서울.
Nakagawa, Y. and S. Tayama.
1995. Cytotoxicity of propyl gallate and related compounds in rat hepatocytes.
Arch. Tox icl. 69:204-208.
Noble, R. L., C. T. Beer and J. H. Cutts.
1958. Futher biologlcal activitiess of vincaleukoblastine-an alkaloid isolate d
from Vin rosea (L.). Biochemi. Pharmcol. 1:347-348.
박재갑, 정유미,
박규주, 양한광, 노동영, 김선회, 오승근, 이건욱, 박용현, 최국진, 김진복, 김수태, 허대석, 방영주, 박선양, 김병국, 김노경, 최규완,
김정룡, 고창순, 안효섭, 최영민, 강순범, 신희철, 이효표, 김승욱, 이상훈, 이한구, 왕규창, 정희원, 김현집, 한대희, 성숙환, 김주현,
이은식, 이상은, 최 황, 이종옥, 김시황, 김영균, 김광현, 민양기, 유영석, 박명희, 박성회, 김용일. 1991. 서울대학교(SNU) 세포주
수립에 관한 연구 : 1989년 11월-1990년 8월. 대한 암학회지 23: 169-180.
박재갑, 현진원, 임경화, 신진이,
원용진, 이영득, 신국현, 장일무, 우원식. 1993a. 전통 약용식물의 항암효과에 대한 연구. 생 약학회지.
24:223-230.
박성미, 진미림, 김진숙, 최응칠, 김병각. 1993b. 한국산 고등균류 만가닥버섯의 항암성분. 약학회지.
37:490-498.
Park, S. J. 1996. Pharmacological activities of Cordyceps
militaris and mushrooms to intestinal microorganisms. M. S. Thesis. Seoul
National University. Seoul.
박신영. 1993. 지골피와 독할의 세포독성 성분. 서울대학교 박사학위논문. pp.
158-159.
박신영, 김진웅. 1992. 생약으로부터 항암성분의 검색 및 분리(I). 생약학회지.
23:264-267.
Passi, S., M. Picardo and M. Nazzaro-Porro. 1987. Comparative
cytotoxicity of phenols in vitro. Biochem. J. 245: 537-542.
류태형, 박성미,
박건영, 정해영, 하재청, 이정규. 1992. 생쥐에서 종양세포의 암유전자발현에 대한 울솔산의 효과. 약학회지.
36:529-537.
Rubinstein, L. V., R. H. Shoemaker, K. D. Paull, R. M. Simon, S.
Tosini, P. Skehan, D. A. Scudiero, A. Monks and M. R. Boyd. 1990. Comparison of
in vitro anticancer drug screening data generated with a tetrazolium assay
versus a protein as say against a diverse panel of human tumor cell lines. J.
Natl. Cancer Inst. 82:1113-1118.
Ruddon, R. W. 1987. The epidemiology of
human cancer. In Cancer Biology. 2ed. Oxford Univ. Press. Oxford.
pp.25-67.
Saxena, G., A. R. McCutcheon, S. Farmer, G. H. Towers and R. E.
Hancock. 1994. Antimicrobial constituents of Rhus gl abra. J.
Ethnopharmacol. 42:95-99.
심미자. 1980. 한국산 고등균류의 성분 및 배양에 관한 연구(XXV). 구름버섯
항암성분의 면역촉진 효과. 한국균한회지. 8:115-1 16.
신동화, 최 웅, 장영상, 신재익. 1992a. 식용유지에 대한 붉나무의
항산화 효과. 식품과학기술지. 24:320-325.
신동화, 이연재, 장영상, 강우석. 1992b. 붉나무 추출물과 몇가지
synergist를 첨가한 기름 튀김 식품의 저장 안전성 비교. 식 품과학기술지. 24:547-551.
신길우. 1978. 신씨 본초학.
수문사
Skehan, P., R. Storeng, D. A. Scudiero, A. Monks, J. McMahon, D. T.
Visca, J. Warren, H. Bokesch, S. Kenney and M. R. B oyd. 1990. New colorimetric
cytotoxicity assay for anticancer drug screening. J. Natl. Cancer Inst.
82:1107-1112.
Sporn, M. R. and A. B. Roberts. 1985. Autocrine growth factors
and cancer. Science. 313:745-747.
Stuffness, M. and J. Douros. 1982.
Currents status of the NCI plant and animal product program. J. Nat.
Prod. 45 :1-14.
Stuffness, M. and J. M. Pezzuto. 1991. Assays related to
cancer drug discovery. In Method in Plant Biochemistry, vol 6. Assays for
bioactivity. K. Hostettmann ed. Academic Press. London. P.71
Swain, T. 1977.
Secondary compounds as protective agents. Ann. Rev. Plant Physiol.
28:479-501.
통계청. 1994. 사망원인 통계년보
Umezawa, H. 1973. Studies on
bleomycin;chemixtry and the biological action. Biomedicine.
18:459-475.
Wiemann, M. C. and P. Calabresi. 1985. Pharmacology of
antineoplastic agents. In Medical Oncology. P. Calabresi, P. S. Schein
and S. A. Rosenberg des. Macmillan Publishing Co. New York. pp.292-362.
임재훈,
우홍정, 김병운, 하윤문, 이승훈, 남상윤, 최용묵. 1987. 수종의 생약에 대한 항암효과의 실험적 연구(II). 약물에 대 한 암세포의
감수성분석. 생약학회지. 18:127-153.
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